Tải bản đầy đủ

Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus oryzae sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase và xác định tính chất lý hóa của nó

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
























ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM




NGUYỄN HỮU QUÂN




TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE
SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ XÁC ĐỊNH
TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA NÓ



LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC






HÀ NỘI-2009




Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
























ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM



NGUYỄN HỮU QUÂN



TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE
SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ XÁC ĐỊNH
TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA NÓ

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Quyền Đình Thi

Thực hiện tại: Viện Công nghệ Sinh học
Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam



HÀ NỘI-2009




Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

LỜI CẢM ƠN
Trƣớc hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Quyền Đình Thi
trƣởng phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Phó viện trƣởng Viện Công nghệ
sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hƣớng ý tƣởng
nghiên cứu, tận tình hƣớng dẫn nghiên cứu, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện
về hóa chất cũng nhƣ trang thiết bị nghiên cứu để tôi hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đỗ Thị Tuyên, CN. Đào Thị Tuyết và
tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học
đã tận tình hƣớng dẫn thí nghiệm, thƣờng xuyên chỉ bảo kiến thức chuyên
môn, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi học tập và rèn luyện
trong suốt quá trình thực tập.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong khoa Sinh trƣờng
ĐHSP - Đại học Thái Nguyên đã giảng dạy và tạo điều kiện chu đáo cho tôi
trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận.
Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những ngƣời
thân đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập để tôi có đƣợc kết
quả nhƣ ngày hôm nay.
Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự
giúp đỡ quí báu đó !

Thái Nguyên, tháng 10 năm 2009
Học Viên



Nguyễn Hữu Quân

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 2
1.1. ĐỊNH NGHĨA ......................................................................................... 2
1.2. NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI............................................................. 2
1.2.1. Nguồn gốc ............................................................................................ 2
1.2.2. Phân loại enzyme ................................................................................. 3
1.3. CẤU TRÚC ............................................................................................. 5
1.3.1. Cấu trúc bậc nhất .................................................................................. 5
1.3.2. Cấu trúc không gian ............................................................................. 6
1.4. CƠ CHẾ XÚC TÁC ................................................................................ 8
1.5. Khái quát về Aspergillus oryzae ............................................................ 10
1.6. Ứng dụng .............................................................................................. 11
1.6.1. Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy ...................................... 11
1.6.2. Trong công nghiệp chế biến thực phẩm .............................................. 12
1.6.3. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi ................................... 13
1.6.4. Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ .................................... 14
1.6.5. Trong công nghệ sử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh .............. 14
1.7. ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG
SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE ......................................... 16
1.7.1. Nguồn carbon ..................................................................................... 16
1.7.2. Nguồn nitrogen .................................................................................. 17
1.7.3. Nhiệt độ nuôi cấy ............................................................................... 18
1.7.4. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng ........................................................... 18
1.8. TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENZYME ............................................... 19
1.8.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ ..................................................................... 19
1.8.2. Ảnh hƣởng của pH ............................................................................. 20
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

1.8.3. Ảnh hƣởng của các ion kim loại ......................................................... 20
1.8.4. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ và các chất tẩy rửa ......................... 21
Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ...................................... 22
2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT ........................................................ 22
2.1.1. Chủng giống ....................................................................................... 22
2.1.2. Thiết bị ............................................................................................... 22
2.1.3. Hóa chất ............................................................................................. 22
2.1.4. Dung dịch và đệm phá tế bào ............................................................. 23
2.1.5. Môi trƣờng ......................................................................................... 24
2.2. PHƢƠNG PHÁP ................................................................................... 25
2.2.1. Nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme ......................................................... 25
2.2.2. Định tính endo-β-1,4-glucanase.......................................................... 25
2.2.3. Xác định hoạt tính endo-β-1,4-glucanase............................................ 25
2.2.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng lên khả năng sinh
tổng hợp endo-β-1,4-glucanase .................................................................... 27
2.2.5. Tinh sạch sơ bộ endo-β-1,4-glucanase ................................................ 29
2.2.6. Điện di SDS-PAGE ............................................................................ 30
2.2.7. Xác định tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase ........................... 30
2.2.8. Các phƣơng pháp sinh học phân tử ..................................................... 32
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 36
3.1. Sàng lọc chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-
glucanase cao ............................................................................................... 36
3.2. Phân loại chủng nấm sợi A. oryzae VTCC-F-045 dựa vào đoạn gene 28S
rRNA............................................................................................................ 37
3.3. Tối ƣu các điều kiện sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase ..................... 39
3.3.1. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian ........................... 39
3.3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất cảm ứng ........................................... 40
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

3.3.3. Ảnh hƣởng của nguồn carbon ............................................................. 41
3.3.4. Ảnh hƣởng của nồng độ carbon .......................................................... 43
3.3.5. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen .......................................................... 44
3.3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ nitrogen ....................................................... 45
3.3.7. Nhiệt độ nuôi cấy ............................................................................... 46
3.3.8. Ảnh hƣởng của pH nuôi cấy ............................................................... 47
3.4. Tinh sạch sơ bộ endo-β-1,4-glucanase ................................................... 48
3.5. Tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase ............................................ 50
3.5.1. Nhiệt độ phản ứng tối ƣu .................................................................... 50
3.5.2. pH phản ứng tối ƣu ............................................................................. 51
3.5.3. Độ bền nhiệt ....................................................................................... 52
3.5.4. Độ bền pH .......................................................................................... 54
3.5.5. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ ....................................................... 55
3.5.6. Ảnh hƣởng của một số chất tẩy rửa .................................................... 56
3.5.7. Ảnh hƣởng của ion kim loại ............................................................... 57
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 59
KẾT LUẬN .................................................................................................. 59
KIẾN NGHỊ ................................................................................................. 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 61
TIẾNG VIỆT ............................................................................................... 61
TIẾNG ANH ................................................................................................ 64
PHỤ LỤC .................................................................................................... 69


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Thiết bị đƣợc sử dụng trong thí nghiệm ....................................... 22
Bảng 2.2. Các hóa chất đƣợc sử dụng trong thí nghiệm ............................... 23
Bảng 2.3. Danh sách các dung dịch và đệm đƣợc sử dụng trong thí nghiệm 23
Bảng 3.1. Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của 35 chủng A. oryzae .............. 37
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của nguồn carbon đến khả năng sinh tổng hợp endo-β-
1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 42
Bảng 3.2. Tóm tắt quá trình tinh sạch endo-β-1,4-glucanase từ chủng A.
oryzae VTCC-F-045 ..................................................................................... 49
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của ion kim loại lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của
chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................................................... 57
Bảng 4.1. Đƣờng chuẩn glucose................................................................... 69
Bảng 4.2. Trình tự nucleotide của đoạn gene 28S rRNA từ chủng A. oryzae
VTCC-F-045 ................................................................................................ 69
Bảng 4.3. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian ..................... 70
Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của nồng độ CMC tới khả năng sinh endo-β-1,4-
glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 70
Bảng 4.5. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon tới khả năng sinh endo-β-1,4-
glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 71
Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của nồng độ lactose tới khả năng sinh endo-β-1,4-
glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 71
Bảng 4.7. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen tới khả năng sinh endo-β-1,4-
glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 72
Bảng 4.8. Ảnh hƣởng của nồng độ bột đậu tƣơng tới khả năng sinh endo-β-
1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 72
Bảng 4.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy tới khả năng sinh endo-β-1,4-
glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 72
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Bảng 4.10. Ảnh hƣởng của pH nuôi cấy tới khả năng sinh endo-β-1,4-
glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 73
Bảng 4.11. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng tới hoạt tính endo-β-1,4-
glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 73
Bảng 4.12. Ảnh hƣởng của pH phản ứng tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase
của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................................... 74
Bảng 4.13. Độ bền nhiệt của endo-β-1,4-glucanase...................................... 75
Bảng 4.14. Độ bền pH của endo-β-1,4-glucanase......................................... 76
Bảng 4.15. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase
của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................................... 77
Bảng 4.16. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ tới hoạt tính endo-β-1,4-
glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 77
Bảng 4.17. Ảnh hƣởng của ion kim loại tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase
của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................................... 78


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc không gian từ trên xuống (A) và từ bên sang (B) của
Cel12A từ H. grisea ....................................................................................... 7
Hình 1.2. Cấu trúc vùng liên kết enzyme - cơ chất của Cel12A từ H. grisea .. 8
Hình 1.3. Cơ chế thủy phân cellulose (A) và phức hệ cellulose (B) của
cellulase ......................................................................................................... 9
Hình 1.4. Sự thủy phân của 3 loại enzyme trong phức hệ cellulase .............. 10
Hình 1.5. Cấu trúc bộ gene của A. oryzae .................................................... 11
Hình 2.1. Đƣờng chuẩn glucose ................................................................... 26
Hình 2.2. Quy trình tinh sạch endo-β-1,4-glucanase từ chủng A. oryzae
VTCC-F-045 ................................................................................................ 29
Hình 3.1. Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của một số chủng A. oryzae ........ 36
Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm PCR từ khuôn DNA của chủng A. oryzae (A);
Sản phẩm Plasmid (B) và Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng XhoI và XbaI
(C). ............................................................................................................... 38
Hình 3.3. Cây phân loại chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................... 39
Hình 3.4. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian của chủng A.
oryzae VTCC-F-045 ..................................................................................... 40
Hình 3.5. Ảnh hƣởng của nồng độ CMC đến khả năng sinh tổng hợp endo-β-
1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 41
Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ lactose đến khả năng sinh tổng hợp endo-
β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................... 44
Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen đến khả năng sinh tổng hợp endo-β-
1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 45
Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nồng độ bột đậu tƣơng đến khả năng sinh tổng hợp
endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................. 46
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình 3.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới khả năng sinh tổng hợp enzyme endo-
β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................... 47
Hình 3.10. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng tới khả năng sinh tổng hợp endo-β-
1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 48
Hình 3.11. Sắc kí đồ trên cột Sephadex G100 (A) Điện di đồ SDS-PAGE của
chủng A. oryzae VTCC-F-045 (B) ................................................................ 49
Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính endo-β-1,4-
glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 51
Hình 3.13. Ảnh hƣởng của pH phản ứng lên hoạt tính endo-β-1,4-glucanase ở
chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................................................... 52
Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của
chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................................................... 53
Hình 3.15. Ảnh hƣởng của pH lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A.
oryzae VTCC-F-045 ..................................................................................... 54
Hình 3.16. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ lên độ bền endo-β-1,4-glucanase
của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................................... 55
Hình 3.17. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của
chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................................................... 56
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
g
Microgram
l
Microliter
APS Ammonium persulphate
Cel Cellulose
CMC Carboxyl methyl cellulase
cs Cộng sự
EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid
kb Kilobase
kDa Kilo Dalton
M Marker (thang protein chuẩn)
MTK Môi trƣờng khoáng
MW Molecular Weight
OD Optical density
PCR Polymerase chain reaction
SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis
TEMED N,N’,N,N’- Tetramethyl ethylene diamine
Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane
U Unit
v/v Volume/volume
w/v Weight/volume
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
1
MỞ ĐẦU
Endo-β-1,4-glucanase là một trong ba dạng của cellulase. Chúng thuộc
nhóm enzyme thủy phân, có khả năng phân cắt liên kết β-1,4-glucosidie một
cách ngẫu nhiên bên trong phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và
một số chất tƣơng tự khác có cầu nối β-glucan. Endo-β-1,4-glucanase phân
giải mạnh mẽ cellulose vô định hình.
Endo-β-1,4-glucanase đƣợc sinh tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác nhau
nhƣ động vật (thuộc các nhóm thân mềm, lợn, gà); thực vật (mầm của các hạt
ngũ cốc nhƣ đại mạch, yến mạch, lúa mì, mạch đen) và vi sinh vật. Tuy nhiên,
nguồn thu enzyme chủ yếu vẫn từ vi sinh vật. Vi sinh vật sinh enzyme hết sức
đa dạng nhƣ nấm sợi (Aspergillus niger, A. oryzae, A. aculeatus, Trichoderma
viride) và vi khuẩn (thuộc họ Bacillus).
Endo-β-1,4-glucanase đƣợc ứng dụng rộng rãi vào nhiều ngành khác
nhau nhƣ công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy; công nghiệp chế biến thực
phẩm; công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi; công nghiệp chế biến dung
môi hữu cơ; hay công nghiệp xử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh.
Với tiềm năng ứng dụng to lớn của endo-β-1,4-glucanase và nguồn vi
sinh vật tổng hợp enzyme rất đa dạng, đồng thời nhằm tận dụng các phế phụ
phẩm trong nông nghiệp, chúng tôi đã chọn đề tài:
Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus oryzae sinh tổng hợp
endo-β-1,4-glucanase và xác định tính chất lý hóa của nó
Với mục tiêu: a) Tuyển chọn chủng nấm A. oryzae sinh tổng hợp endo-β-
1,4-glucanase cao; b) Tối ƣu điều kiện sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase
ngoại bào từ chủng A. oryzae và xác định tính chất hóa lý của endo-β-1,4-
glucanase.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. ĐỊNH NGHĨA
Endo-β-1,4-glucanase hay CMCase là một trong ba dạng cellulase.
Chúng thuộc nhóm enzyme thủy phân liên kết β-1,4-glucoside bên trong phân
tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số cơ chất tƣơng tự khác để
giải phóng ra cellulosedextrin, cellobiose và glucose. Enzyme này thể hiện
hoạt tính mạnh mẽ trên cellulose vô định hình.
1.2. NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI
1.2.1. Nguồn gốc
Endo-β-1,4-glucanase đƣợc thu từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau
nhƣ động vật (các nhóm thân mềm, lợn, bò, gà); thực vật (trong hạt ngũ cốc
nảy mầm là đại mạch, yến mạch, lúa mì, mạch đen) và vi sinh vật (nấm sợi,
nấm men, xạ khuẩn và vi khuẩn). Tuy nhiên, vi sinh vật là nguồn thu enzyme
chủ yếu vì thời gian sống ngắn nên thu đƣợc nhiều lần trong năm và chủ động
sử dụng nguồn nguyên liệu rẻ tiền để nuôi cũng nhƣ dễ dàng điều khiển có
định hƣớng nguồn enzyme hoặc gia tăng lƣợng enzyme. Ngày nay, cùng với
sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kỹ thuật nên dễ dàng áp dụng các phƣơng
pháp sinh học phân tử để tạo ra những chủng mới mang những đặc điểm nổi
bật mà các đối tƣợng động vật, thực vật ít áp dụng nhƣ gây đột biến nhân tạo.
Trong vi sinh vật, rất nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc và một
số loài nấm men có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase.
Các loài vi khuẩn cả hiếu khí lẫn kị khí đều có khả năng sinh endo-β-1,4-
glucanase nhƣ Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. pumilis (Gordon et
al.,1973), Acidothermus cellulobuticus (Bergquist et al., 1999, Nguyễn Lan
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3
Hƣơng and Hoàng Đình Hòa, 2003). Ngoài ra còn có các loài ƣa kiềm nhƣ
Cephalosporium sp. RYM-202 (Kang and Rhee, 1995).
Các nhóm xạ khuẩn thuộc chi Actinomyces griseus (Nguyễn Đức Lƣợng
and Đặng Vũ Bích Hạnh, 1999, Lê Thị Thanh Xuân et al., 2005) và
Streptomyces reticuli cũng có khả năng tổng hợp mạnh enzyme.
Các loại nấm mốc thuộc chi Aspergillus nhƣ A.niger (Coral et al., 2002,
Hoàng Quốc Khánh et al., 2003, Omojasola and Jilani, 2008), A. candidus
(Hong et al., 2001, Milala et al., 2009), A. flavus (Ojumu et al., 2003),
A. fumigatus (Dahot and Noomrio, 1996), A. oryzae và các chủng
Trichoderma (Claeyssens et al., 1989, de la Mata et al., 1992, Cao Cƣờng and
Nguyễn Đức Lƣợng, 2003) đều có khả năng sinh enzyme. Các nhóm thuộc
chi Penicillium (Claeyssens et al., 1989, Bhat et al., 1990, Trịnh Đình Khá,
2006, Chinedu et al., 2008) cũng có khả năng tổng hợp enzyme cao.
1.2.2. Phân loại enzyme
1.2.2.1. Phân loại theo hội đồng danh pháp quốc tế
Endo-β-1,4-glucanase hay CMCase (EC 3.2.1.4) là một trong ba dạng
enzyme của hệ cellulase, thuộc nhóm enzyme thủy phân liên kết -1,4-glucoside
bên trong phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số cơ chất tƣơng
tự khác để giải phóng ra cellulosedextrin, cellobiose và glucose (Chellapandi et
al., 2008).
Dựa trên đặc tính cấu trúc, endo-β-1,4-glucanase đƣợc gọi là
endoglucanase hoặc 1,4--D-glucan-4-glucanohydrolase hay CMCase (EC
3.2.1.4). Endo-β-1,4-glucanase thuộc vào dạng 1 của phức hệ celulase. Dạng
2 là exoglucanase, gồm 1,4--D-glucan-4-glucanohydrolase (giống nhƣ cello
dextrinase) (EC 3.2.1.74) và 1,4--D-glucan cellobiohydrolase (cellobio
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
4
hydrolase) (EC 3.2.1.91). Dạng 3 là -glucosidase hoặc -glucoside
glucohydrolase (EC 3.2.1.21). Endoglucanase thủy phân ngẫu nhiên bên trong
phân tử cellulose tạo ra các loại oligosaccharide có chiều dài khác nhau.
Exoglucanase thủy phân các liên kết ở đầu khử và đầu không khử của chuỗi
cellulose để giải phóng ra glucose (glucanohydrolase) hoặc cellobiose
(cellobiohydrolase) (Lee et al., 2002).
1.2.2.2. Phân loại theo đặc điểm phân tử
Endo-β-1,4-glucanase đƣợc phân chia dựa vào đặc điểm phân tử nhƣ
khối lƣợng phân tử, điểm đẳng điện và cấu trúc tinh thể.

Dựa theo đặc tính và trình tự amino acid chứa gốc nitơ tự do, nhóm
enzyme thủy phân cellulose đƣợc chia làm 3 nhóm là Cel-1, Cel-2 và Cel-3.
Trong đó Cel-1 và Cel-3 là endo-β-1,4-glucanase (EC 3.2.1.4) có khối lƣợng
là 62 kDa và 34 kDa. Cel-1 và Cel-3 có trình tự amino acid chứa gốc nitơ tự
do là QQVGTTADAH và QELAQYDSAS. Trình tự amino acid của Cel-1
giống với endo-β-1,4-glucanase CelB, là enzyme thuộc họ 7 cellulase và có
độ tƣơng đồng 72% với cellobiohydrolase I và exo-cellobiohydrolase I. Trình
tự amino acid của Cel-3 có độ tƣơng đồng 90% với endo-β-1,4-glucanase
CelA, là enzyme thuộc họ 12 cellulase. Khối lƣợng phân tử của Cel-1 và
Cel-3 giống với CelB và CelA. Cel-2 là β-glucosidase (EC 3.2.1.21) có khối
lƣợng phân tử là 120 kDa và trình tự amino acid chứa gốc nitơ tự do của
Cel-2 chƣa đƣợc xác định (Yamane et al., 2002).
Khi nghiên cứu trên A. niger về hai gene mã hóa cellobiohydrolase
(CbhA và CbhB) (Gielkens et al., 1990) cho thấy, cả hai enzyme này đều
thuộc nhóm 7 của glycosyl hydrolase (GH7); trong đó CbhB bao gồm cấu
trúc cellulose-bindingomin (CBD) với sự xúc tác riêng bởi các amino acid
giàu liên kết peptide; còn CbhA chỉ gồm sự xúc tác, thiếu CBD và liên kết
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
5
peptide. Sự phiên mã của gene CbhA và CbhB đƣợc cảm ứng bởi D-xylose. Ở
chủng A. kawachi, (Hara et al., 2003) đã phát hiện ba gene mã hóa
endoglucanase là cel5A, cel5B và cel61A. Trong đó, cel5A và cel61A có liên
kết CBD1; còn cel5A và cel5B thuộc glycosyl hydrolase nhóm 5 (GH5),
cel5B có cấu trúc rất giống cel5A, nhƣng thiếu CBD1 và sự liên kết. Cel5A
gồm 4 đoạn intron, cel5B gồm 5 đoạn intron, còn cel61A thuộc nhóm GH61
không có intron.
Dựa vào cấu trúc bậc một cơ bản, phức cellulase đƣợc chia làm 6 họ là
A, B, C, D, E và F (Henrissat et al., 1989). Dựa vào trung tâm xúc tác phức
cellulase đƣợc chia ra làm 9 họ A, B, C, D, E, F, G, H và I (Gilkes et al.,
1991). Hiện nay, cellulase đƣợc xếp thành 12 họ khác nhau là 5, 6, 7, 8, 9,
(10), 12, 44, 45, 48, 61 và 74. Trong đó, họ 9 chứa cellulases của vi khuẩn
(hiếu khí và kỵ khí), nấm, thực vật và động vật (protozoa và mối); họ 7 gồm
hydrolase nấm và họ 8 gồm hydrolase vi khuẩn (Lee et al., 2002).
1.3. CẤU TRÚC
Endo-β-1,4-glucanase đƣợc tạo ra từ các loài khác nhau có thành phần
cấu tạo và cấu trúc khác nhau. Endo-β-1,4-glucanase từ nấm A. oryzae có
khối lƣợng phân tử khoảng 34 kDa và 62 kDa (Yamane et al., 2002), chủng
A. oryzae KBN616 là 31 kDa và 53 kDa (Kitamoto et al., 1996), chủng
Trametes hirsuta khoảng 40,6 kDa (Nozaki et al., 2007), chủng A. terreus
M11 khoảng 25 kDa (Gao et al., 2008).
1.3.1. Cấu trúc bậc nhất
Nghiên cứu của Nozaki và cs (2007) cho thấy, endo-β-1,4-glucanase
thuộc họ 5 (GH 5) chứa CBM ở đầu nitơ, có trọng lƣợng phân tử khoảng
44 kDa và đƣợc gọi là ThEG. ThEG từ chủng Trametes hirsuta là một chuỗi
polypeptide có chứa 384 amino acid và có độ tƣơng đồng cao với En-1 từ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
6
chủng Irpex lacteus (73%); EG từ chủng Humicola grisea (46%) và EglB từ
chủng A. niger (49%).
Ở chủng A. oryzae KBN616, Kitamoto và cs (1996) đã nhân dòng phân
tử, tinh sạch và mô tả đặc điểm của 2 gene mã hóa endo-β-1,4-glucanase là
CelA và CelB. Gene CelA gồm 877 pb với 2 đoạn intron. Protein do CelA mã
hóa gồm 239 amino acid và đƣợc xếp vào họ cellulase H. Gene CelB chứa
1248 bp không chứa đoạn intron. Protein do CelB mã hóa gồm 416 amino
acid và đƣợc xếp vào họ cellulase C. Sau khi tinh sạch, protein của CelA và
CelB có khối lƣợng phân tử khoảng 31 kDa và 53 kDa.
Ở chủng nấm chịu nhiệt Humicola grisea, (Sandgren et al., 2003) đã có
những nghiên cứu chi tiết về cấu trúc Cel12A, enzyme này thuộc họ 12
(GH 12) endoglucanase là một chuỗi polypeptide gồm 224 amino acid cấu tạo
nên các chuỗi α, β và các vùng nối.
1.3.2. Cấu trúc không gian
Phân tử Cel12A đƣợc cấu tạo bởi 15 chuỗi β tạo thành 2 phiến gấp nếp β
là A và B. Phiến A gồm 6 chuỗi β (A1-A6) và phiến B gồm 9 chuỗi β
(B1-B9). Hai phiến này xếp chồng lên nhau thành hình bánh kẹp. Bề mặt lõm
của phiến B tạo nên khe dài 35 Å để liên kết với cơ chất, khe này chạy dọc bề
mặt của enzyme. Trung tâm hoạt động của enzyme là hai gốc glutamyl 120 và
205 ở chủng H. grisea. Sáu gốc phía ngoài phân bố phía trên phân tử giống
nhƣ gài các amino acid tự do. Hai trong số các gốc đó nằm ở đầu nitơ. Các dải
xoắn β đƣợc nối với nhau bởi các vùng nối, có 4 vùng nối với các gốc từ
29-32, 40-47, 92-96 và 165-169; các vùng này nối tiếp tƣơng ứng với chuỗi β:
B2 đến A2, A2 đến A3, A5 đến B5 và A6 đến B7. Ba gốc cysteine là C175,
C206 và C216 đƣợc định vị trên chuỗi β là A6, B4 và A4. Các chuỗi bên tập
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
7
trung trong lõi giữa hai phiến β, nơi mà bề mặt xúc tác đƣợc tăng lên
(Hình 1.1).
Gốc cysteine 175 nằm ở chuỗi β A6 trên phiến nhỏ A và tạo ra mấu lồi ở
bề mặt của enzyme gần cấu trúc xoắn α. Chuỗi bên ở trong lõi giữa hai phiến
β, liên kết với 6 amino acid T85, T123, A144, F175, I177 và F180 bằng lực
vanderval. Liên kết giữa các amino acid có kích thƣớc từ 3,5 đến 4,1 Å
(Hình 1.2A). Gốc cysteine 206 nằm gần trung tâm xúc tác Glu 205 trên chuỗi
B4. Đầu của chuỗi bên ở lõi phiến β, nơi có hệ thống tƣơng tác chặt chẽ với
các chuỗi bên của 8 gốc Q34, W52, W54, S63, P65, Y91, A98 và T204; cùng
với sự tách rời giữa các nguyên tử trong chiều dài từ 3,3-4,9 Å (Hình 1.2B).
Gốc cysteine 216 nằm trên chuỗi A4 ở phiến A, phiến này làm tăng bề
mặt xúc tác của enzyme. Gốc cysteine này có chuỗi bên trong vùng lõi bên
dƣới điểm hoạt động, nơi tƣơng tác với chuỗi bên của 5 gốc W48, V87, W89,
F214 và F219 có kích thƣớc từ 3,3 đến 4,8 Å (Hình 1.2C).






Hình 1.1. Cấu trúc không gian từ trên xuống (A)
và từ bên sang (B) của Cel12A từ H. Grisea (Sang et al., 2003)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
8


Hình 1.2. Cấu trúc vùng liên kết enzyme - cơ chất của Cel12A từ H. Grisea
1.4. CƠ CHẾ XÚC TÁC
Endo-β-1,4-glucanase thủy phân ngẫu nhiên bên trong phân tử cellulose
tạo ra các loại oligosaccharide có chiều dài khác nhau. Tuy nhiên, để thủy
phân cellulose thành glucose thì cần có sự hiệp đồng của các dạng enzyme
trong phức hệ cellulase. Mỗi dạng enzyme trong phức hệ cellulase sẽ thủy
phân phân tử có liên kết β-1,4-glucosidie theo những cách khác nhau.
Ban đầu, endo-β-1,4-glucanase thủy phân sơ bộ các liên kết 1,4-β-glucan
của sợi cellulose để tạo nên các phần tử nhỏ hơn (sợi cellobiose). Sau đó các sợi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
9
này sẽ chịu tác động của exoglucanase ở đầu khử và đầu không khử để giải
phóng ra glucose (Lee et al., 2002) (Hình 1.3).


Hình 1.3. Cơ chế thủy phân cellulose (A)
và phức hệ cellulose (B) của cellulase (Lee et al., 2002)
Ngoài ra, endo-β-1,4-glucanase cùng các enzyme khác nhƣ exo-β-1,4-
glucozidase (cellobiase) sẽ tham gia thủy phân cellulose theo cơ chế ban đầu
endo-β-1,4-glucanase tác động vào vùng vô định hình trên phân tử cellulose
và tạo ra các đầu mạch tự do. Sau đó, exo-β-1,4-glucosidase sẽ cắt từng đoạn
cellobiose. Kết quả tạo ra các cello oligosacharide mạch ngắn, cellobiose và
glucose. Các cellobiase sẽ thủy phân tiếp tạo thành glucose (Hình 1.4).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
10

Hình 1.4. Sự thủy phân của 3 loại enzyme trong phức hệ cellulase

1.5. Khái quát về Aspergillus oryzae
A. oryzae thuộc chi Aspergillus, họ Trichocomaceae, bộ Eurotiales, lớp
Eurotiomycetes, ngành Ascomycota và thuộc giới nấm (Kitamoto, 2002).
Bào tử của A. oryzae có màu vàng hoa cau, không chứa độc tố aflatoxin.
A. oryzae tiết ra môi trƣờng các enzyme thủy phân nhƣ cellulase, pectinase,
xylanase và hemicellulase khi sống trên môi trƣờng có nguồn cơ chất tƣơng
ứng cellulose, pectin, xylan và hemicellulose. Nên A. oryzae đã đƣợc ứng
dụng rất rộng rãi trong quá trình sản xuất, chế biến đồ ăn và trong công
nghiệp sản xuất các enzyme. Ở Nhật Bản A. oryzae đƣợc sử dụng trong quá
trình sản xuất thức ăn nhƣ xì dầu, rƣợu sakê và trong công nghiệp sản xuất
enzyme nhƣ amylase, protease, hemicellulose, cellulase, oxidoreductase,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
11
lipase, phytase và pectinase. Ở Việt Nam A. oryzae đƣợc sử dụng chủ yếu
trong quá trình làm tƣơng.
Năm 2001, bộ gene di truyền của A. oryzae đã đƣợc phân tích và giải mã.
Hệ gene gồm 8 nhiễm sắc thể với 12 ngàn gene và 37 triệu cặp base (Galagan
et al., 2005, Machida et al., 2005) (Hình 1.5).

Hình 1.5. Cấu trúc bộ gene của A. Oryzae (Machida et al., 2005)

1.6. Ứng dụng
Với khả năng thủy phân liên kết β-glucoside, endo-β-1,4-glucanase đƣợc
ứng dụng rộng rãi vào nhiều ngành công nghiệp khác nhau nhƣ công nghiệp
sản xuất giấy và bột giấy, công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp sản
xuất thức ăn chăn nuôi, công nghiệp chế biến dung môi hữu cơ, hay công
nghiệp xử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh.
1.6.1. Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy
Trong công nghiệp sản xuất bột giấy và giấy, bổ sung các loại enzyme
trong khâu nghiền bột, tẩy trắng và xeo giấy có vai trò rất quan trọng. Nguyên
liệu ban đầu chứa hàm lƣợng cao các chất khó tan là lignin và một phần
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
12
hemicellulose, nên trong quá trình nghiền để tách riêng các sợi gỗ thành bột
mịn gặp nhiều khó khăn. Trong công đoạn nghiền bột giấy, bổ sung
endoglucanase sẽ làm thay đổi nhẹ cấu hình của sợi cellulose, tăng khả năng
nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng lƣợng cho quá trình nghiền cơ học.
Trƣớc khi nghiền hóa học, gỗ đƣợc xử lý với endoglucanase và hỗn hợp các
enzyme hemicellulase, pectinase sẽ làm tăng khả năng khuếch tán hóa chất
vào phía trong gỗ và hiệu quả khử lignin.
Trong công nghệ tái chế giấy, các loại giấy thải cần đƣợc tẩy mực trƣớc khi
sản xuất các loại giấy in, giấy viết. Endoglucanase và hemicellulase đã đƣợc
dùng để tẩy trắng mực in trên giấy. Kỹ thuật này mở ra triển vọng đầy hứa hẹn
trong ngành công nghiệp giấy và bột giấy (Đặng Thị Thu et al., 2004).
1.6.2. Trong công nghiệp chế biến thực phẩm
Trong quá trình sản xuất các loại nƣớc quả và nƣớc uống không cồn dựa
trên việc trích li dịch quả từ thịt nghiền. Các loại quả sau khi tách vỏ bỏ hạt
đƣợc nghiền, thu đƣợc thịt quả nghiền có dạng dịch nhuyễn. Từ thịt quả
nghiền đã ép bã thu đƣợc dịch quả. Dịch này thƣờng chứa các thành phần tế
bào thịt quả và các thành phần của polysaccharide làm cho dịch quả có độ
nhớt cao. Để tăng hiệu suất trích li dịch quả, giảm bớt độ nhớt, tăng mức cảm
quan nƣớc quả và giảm bớt một số công đoạn, việc bổ sung endoglucanase rất
quan trọng. Enzyme này là điểm mấu chốt cải thiện hiệu suất dịch hóa. Sự kết
hợp của glucanase và pectinase sẽ phá hủy hoàn toàn màng tế bào. Trong quá
trình sản xuất, ở giai đoạn dịch hóa bổ sung hỗn hợp các enzyme cellulase,
hemicellulase sẽ đem lại hiệu quả của chế phẩm, làm cho độ đồng thể của
nƣớc quả có thịt sẽ tốt hơn.
Trong công nghệ sản xuất bia, các chế phẩm enzyme amylase, protease
và glucanase đã đƣợc sử dụng để ngăn chặn sự tạo thành các diacetyl, do đó
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
13
giảm lƣợng diacetyl đƣợc tạo thành, rút ngắn thời gian cần thiết để ủ bia.
Trong dịch lên men có chứa một lƣợng β-glucan, chất này ảnh hƣởng tới khả
năng lọc và gây đục cho bia (Đặng Thị Thu et al., 2004).
Trong quá trình sản xuất cà phê ở Việt Nam, cà phê chủ yếu đƣợc sản
xuất bằng phƣơng pháp khô, phƣơng pháp này cho chất lƣợng cà phê không
cao. Để tiến hành nâng cao chất lƣợng cà phê, phƣơng pháp lên men đã đƣợc
áp dụng. Đó là quá trình sử dụng phức hệ enzyme cellulase và pectinase để xử
lý bóc vỏ cà phê và làm tăng khả năng ly trích dịch quả. Trong khâu bóc vỏ,
cellulose gây hiện tƣợng thẫm mầu, làm giảm chất lƣợng sau khi sấy, đồng
thời cản trở cho việc bóc vỏ. Khi sử dụng chế phẩm A. niger có tên thƣơng
mại là Biovina-09 có hoạt tính pectinase và cellulase cho thấy số lƣợng cà phê
đƣợc bóc vỏ tăng, hạt cà phê đƣợc bóc vỏ bằng chế phẩm không còn nhớt nhƣ
hạt không sử dụng chế phẩm enzyme và hiệu suất bóc vỏ khá cao. Trong quá
trình ly trích dịch quả, cellulose và pectin cản trở sự thoát các chất hòa tan
trong tế bào ra ngoài tế bào. Khi sử dụng chế phẩm Biotin-09 hiệu suất trích
ly cao hơn mẫu không sử dụng là 46% (Nguyễn Đức Lƣợng, 2003).
1.6.3. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi
Nguồn thức ăn cung cấp năng lƣợng cho gia súc và gia cầm chủ yếu là
ngũ cốc và phụ phẩm của ngũ cốc. Ngoài protein, lipit, chất dinh dƣỡng cung
cấp năng lƣợng chủ yếu của ngũ cốc và phụ phẩm là carbohydrate. Trong đó,
các polysaccharide gồm cellulose, β-glucan là các chất chứa cầu nối β-1,4
glucoside. Các chất này làm tăng độ nhớt trong ruột, cản trở tế bào vách ruột
hấp thụ các chất dinh dƣỡng. Các chất này có trong vách tế bào thực vật, ngăn
trở các enzyme nội sinh tiếp cận với các chất dinh dƣỡng nhƣ protein, tinh bột
và lipit có trong bào chất, từ đó cản trở sự tiêu hóa, hấp thụ các chất dinh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
14
dƣỡng này. Bổ sung β-glucanase trực tiếp vào thức ăn sẽ cho phép tăng khả
năng hấp thu và chuyển hóa thức ăn của động vật.
Việc ứng dụng phức hệ cellulase trong phân giải các nguồn thức ăn giàu
cellulose nhƣ rơm, rạ, bã mía, bã khoai, bã sắn đã và đang đƣợc triển khai ở
nhiều nƣớc, trong mọi lĩnh vực nhƣ sản xuất protein đơn bào làm thức ăn cho
gia súc. Trong lĩnh vực này, nấm sợi thƣờng đƣợc sử dụng lên men các nguồn
phế thải giàu cellulose tạo ra sinh khối protein chứa hàm lƣợng các amino acid
cân đối, các vitamin và tạo hƣơng thơm có lợi cho tiêu hóa của vật nuôi (Đặng
Thị Thu et al., 2004, Vũ Duy Giảng, 2009).
1.6.4. Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ
Trong giai đoạn đƣờng hóa của quá trình sản xuất ethanol, amylase là
thành phần chính trong quá trình thủy phân tinh bột. Tuy nhiên, bổ sung một
số enzyme phá hủy thành tế bào nhƣ cellulase, hemicellulase có vai trò quan
trọng, giúp tăng lƣợng đƣờng tạo ra và đẩy nhanh tốc độ tiếp xúc của tinh bột
với amylase, dẫn tới hiệu suất thu hồi rƣợu tăng lên 1,5% (Đặng Thị Thu et
al., 2004).
1.6.5. Trong công nghệ sử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh
Rác thải là nguồn chính gây nên ô nhiễm môi trƣờng dẫn tới mất cân
bằng sinh thái và phá hủy môi trƣờng sống, đe dọa tới sức khỏe và cuộc sống
con ngƣời. Thành phần hữu cơ chính trong rác thải là cellulose, nên việc sử
dụng công nghệ vi sinh trong xử lý rác thải cải thiện môi trƣờng rất có hiệu
quả. Hiện nay, có rất nhiều những nghiên cứu về việc sử dụng cellulase do
các chủng vi sinh vật tiết ra nhằm thủy phân cellulose trong rác thải.
Sau khi nghiên cứu sản xuất cellulase của một số chủng vi sinh vật ƣa
nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải (Lý Kim Bảng et al., 1999) đã tuyển chọn đƣợc
3 chủng xạ khuẩn, 4 chủng vi khuẩn ƣa nhiệt trong bể rác thải có khả năng

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×