Tải bản đầy đủ

Nghiên cứu quan hệ di truyền của một số giống đậu xanh địa phương [Vigna radiata (L.) Wilczek ]

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

1
MỞ ðẦU

I. LÝ DO CHỌN ðỀ TÀI
ðậu xanh [Vigna radiata (L.) Wilczek] là một trong ba cây ñậu ñỗ chính
trong nhóm các cây ñậu ăn hạt, ñứng sau ñậu tương và lạc. Ngoài ra, nó còn là
một trong những mặt hàng xuất khẩu. ðậu xanh cũng chính là cây trồng có vị
trí quan trọng trong nền nông nghiệp của nhiều nước, trong ñó có Việt Nam.
Trồng ñậu xanh không những cung cấp nguồn thực phẩm giàu ñạm, ñáp
ứng nhu cầu về dinh dưỡng của con người và vật nuôi, mà còn có tác dụng
cải tạo và bồi dưỡng ñất do rễ của cây ñậu xanh có các nốt sần chứa một số
loài vi sinh vật cố ñịnh ñạm sống cộng sinh.
Vấn ñề ñặt ra là cần nghiên cứu chọn tạo các giống ñậu xanh có chất
lượng tốt, phục vụ nhu cầu trong nước cũng như xuất khẩu. Hiện nay, việc
nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng nói chung và ñậu xanh nói riêng nhờ
chỉ thị phân tử ñã và ñang ñược áp dụng rộng rãi. Các nhà khoa học ñã sử
dụng một số kỹ thuật sinh học phân tử như RAPD, AFLP, RFLP, SSR…ñể

xác ñịnh quan hệ di truyền của cây trồng nhằm tạo cơ sở khoa học cho công
tác chọn tạo giống cây trồng. Trên thế giới, kỹ thuật RAPD ñã ñược nhiều
tác giả sử dụng ñể nghiên cứu quan hệ di truyền của một số giống ñậu xanh
như: Afzal và ñtg (2004), Betal và ñtg (2004), Lakhanpaul và ñtg (2000)...
[25], [27], [37]. Ở Việt Nam, kỹ thuật RAPD cũng ñã ñược các tác giả Chu
Hoàng Mậu, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, ðiêu Thị Mai Hoa sử dụng ñể xác
ñịnh quan hệ di truyền của các giống ñậu xanh ñột biến, các giống ñậu xanh
chịu hạn, các giống chín tập trung và không tập trung ở ñậu xanh [4],
[16], [21].
Nhằm tạo cơ sở cho việc lựa chọn giống ñậu xanh có chất lượng tốt
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

2
phục vụ công tác lai tạo giống, chúng tôi lựa chọn và tiến hành nghiên cứu ñề
tài: “Nghiên cứu quan hệ di truyền của một số giống ñậu xanh ñịa
phương [Vigna radiata (L.) Wilczek ]”.
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
- Nghiên cứu mối quan hệ di truyền của 14 giống ñậu xanh.
3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Tách chiết DNA tổng số của 14 giống ñậu xanh.
- Sử dụng kỹ thuật RAPD ñể xác ñịnh quan hệ di truyền của các giống
ñậu xanh nghiên cứu.
- Sử dụng phần mềm NTSYSpc version 2.0 ñể xử lý số liệu.
















Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

3
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. CÂY ðẬU XANH
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây ñậu xanh
Cây ñậu xanh [Vigna radiata (L.) Wilczeck) thuộc ngành
Magnoliophyta, lớp Magnoliopsida, bộ Fabales, họ Fabaceae, chi Vigna. Chi
Vigna là một trong những chi lớn trong họ ðậu, bao gồm 7 chi phụ: Vigna,
Haydonia, Plactropic, Macrhyncha, Ceratotropic, Lasiospron,
Sigmaidotrotopis. ðậu xanh theo quan ñiểm lấy hạt của nhân dân ta bao gồm
các loài thuộc hai chi phụ là Ceratotropic, còn ñược gọi là nhóm ñậu châu Á,
bao gồm 16 loài hoang dại và 5 loài trồng trọt là V. radiata, V. mungo, V.
aconitifolia, V. angularis, V. umbellata [6], [14].
ðậu xanh có bộ NST 2n = 22, là loại cây ăn hạt, thân thảo. Theo
Vavilov, ñậu xanh có nguồn gốc từ Ấn ðộ, ñược phân bố rộng rãi ở các nước
ðông và Nam Á, khu vực ðông Dương. Dạng dại của V. radiata cũng ñược
tìm thấy ở Madagasca, bên bờ Ấn ðộ Dương, ðông Phi [16].

1.1.2. ðặc ñiểm nông sinh học của cây ñậu xanh
ðậu xanh là loại cây trồng cạn thu quả và hạt, bao gồm các bộ phận rễ,
thân, lá, hoa, quả, hạt.
Rễ ñậu xanh thuộc loại rễ cọc, bao gồm rễ cái và rễ con. Rễ cái sâu
khoảng 20 - 30 cm, có khi sâu tới 70 - 100 cm [6]. Rễ phụ thường gồm 30 -
40 cái, dài khoảng 20 - 25 cm. Trên rễ phụ có nhiều lông hút do biểu bì rễ
biến ñổi thành, có vai trò tăng cường sức hút nước và các chất dinh dưỡng cho
cây. ðặc biệt, do rễ ñậu xanh có khả năng sống cộng sinh với vi khuẩn cố
ñịnh ñạm Rhizobium nên từ các kẽ nhánh rễ, nhất là ở sát rễ cái hình thành
những nốt sần. Các nốt sần có khả năng cố ñịnh nitơ, thường có kích thước
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

4
4 - 5 mm, có màu ñỏ, hồng hay nâu. Nốt sần bé hơn, dạng que, ruột màu xanh
hoặc ñen. Tuy nhiên, bộ rễ của cây ñậu xanh yếu hơn nhiều so với các cây
ñậu ñỗ khác nên khi gặp úng dễ bị thối
[14], [16], [22].
Thân ñậu xanh thuộc loại thân thảo, mọc thẳng ñứng hoặc hơi nghiêng,
thân yếu có lớp lông mịn màu nâu sáng, chiều cao trung bình từ 40 - 70 cm,
ñường kính trung bình từ 8 - 12 mm. Thân cây gồm 7 - 8 ñốt. Thân phân cành
muộn và trung bình có từ 2 - 5 cành, một số giống có tới 9, 10 cành tùy giống
và ñiều kiện chăm sóc [14].
Lá thuộc lá kép, mọc cách, lá chét có 3 thùy với các hình dạng như hình
ôvan, thuôn dài, lưỡi mác, chẻ thùy. Trên thân chính của cây có 7 - 8 lá, cả 2
mặt trên và dưới của lá ñều có lông bao phủ. Số lượng lá, kích thước và hình
dạng lá có thể thay ñổi tùy giống, ñất trồng và thời vụ. Diện tích của các lá
tăng từ các lá phía dưới lên các lá giữa thân rồi giảm dần lên các lá phía ngọn.
Chỉ số diện tích lá (m
2
lá/m
2
ñất) có ảnh hưởng lớn ñến hiệu suất quang hợp
và năng suất thu hoạch [10], [22].
Hoa ñậu xanh ñược hình thành trên các trục hoa. Mỗi trục hoa có thể
phát triển thành 2 hàng hoa mọc ñối nhau, các hoa trên hàng xếp liên tục với
nhau tạo cho trục hoa có hình dạng co rút. Hoa ñậu xanh là hoa lưỡng tính,
mọc thành chùm trên trục hoa. ðậu xanh là loại cây sinh trưởng vô hạn, hoa
có màu tím hoặc vàng nhạt với công thức hoa là K5C5A10G1. ðậu xanh là
loài thực vật tự thụ phấn cao, tỷ lệ hoa thành quả chỉ từ 10 - 25 %. Thụ tinh
xong, tràng hoa rụng, quả hình thành và phát triển [14].
Quả ñậu xanh thuộc loại quả giáp, hình trụ, dạng tròn, hơi dẹt, dài từ
8 - 10 cm, ñường kính từ 4 - 6 mm, có 2 gân nổi rõ dọc theo 2 bên cạnh quả.
Quả chín có màu vàng, nâu hoặc màu ñen. Cũng như các bộ phận khác ở cây
ñậu xanh, trên vỏ quả ñậu xanh thường bao phủ một lớp lông dài khoảng
0,3 - 0,4 mm. Những giống thuộc nhóm kháng virus gây bệnh khảm vàng và
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

5
sâu ñục quả thì mật ñộ lông khá dày, màu trắng. Mỗi cây có từ 8 - 35 quả, mỗi
quả có từ 8 - 15 hạt [16], [22].
Hạt ñậu xanh có hình trụ, thuôn, tròn ñều, có màu xanh bóng, xanh xám,
vàng, xanh mốc, hoặc ñen xám… nằm ngăn cách nhau bằng những vách xốp
của quả. Khối lượng hạt ñược biểu thị bằng g/1000 hạt và khối lượng nghìn hạt
có thể dao ñộng từ 25 - 70 g. Số hạt trên quả và khối lượng hạt có tương quan
thuận với năng suất. ðậu xanh là cây trồng ngắn ngày, trồng vào mùa ấm áp,
nhiệt ñộ tối ưu cho cây sinh trưởng và phát triển từ 20 - 30
0
C [11], [16].
1.1.3. Tầm quan trọng của cây ñậu xanh
Cây ñậu xanh là loại cây trồng có giá trị kinh tế cao. Hạt ñậu xanh là
nguồn thực phẩm giàu ñạm (khoảng 24 - 28%), ngoài ra, còn có lipid khoảng
1,3%, glucid 60,2% và các chất khoáng như Ca, Fe, Na, K, P… cùng nhiều
loại vitamin hoà tan trong nước như vitamin B1, B2, C,… Protein ñậu xanh
chứa ñầy ñủ các amino acid không thay thế như leucine, isoleucine, lysine,
methyonine, valine…. Hạt ñậu xanh không chỉ phù hợp với nhu cầu tiêu dùng
trong nước mà còn là mặt hàng xuất khẩu có giá trị. Hạt ñậu xanh ñược dùng
ñể chế biến ra nhiều loại thực phẩm ngon, bổ, hấp dẫn như các loại bột dinh
dưỡng, các loại bánh, chè, xôi ñỗ và một số ñồ uống…. Lá non và ngọn của
cây ñậu xanh có thể ñược dùng ñể làm rau, muối dưa. Thân, lá xanh có thể
dùng làm thức ăn cho vật nuôi
[14], [22].
Ngoài ra, ñậu xanh còn có giá trị trong y học. Theo sách “Nam dược thần
hiệu” của danh y Tuệ Tĩnh và “Bản thảo cương mục” của Lý Thờ Trân thì vỏ
hạt ñậu xanh có vị ngọt, tính mát, không ñộc nên có tác dụng giải nhiệt, giải
bách ñộc [15].
Cây ñậu xanh có thời gian sinh trưởng ngắn, khả năng sinh trưởng mạnh,
mỗi chu kỳ sinh trưởng kéo dài từ 60 - 90 ngày. Mặt khác, yêu cầu kỹ thuật
canh tác ñơn giản, vốn ñầu tư ít, thu hồi nhanh, có thể trồng nhiều vụ trong
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

6
một năm. Do ñó, cây ñậu xanh có thể ñược trồng xen, trồng gối, luân canh
trên nhiều loại ñất canh tác khác nhau
[22].
Trồng cây ñậu xanh còn có tác dụng cải tạo và bồi dưỡng ñất. Nhờ hệ
rễ ñậu xanh có các nốt sần chứa các vi khuẩn cộng sinh thuộc chi Rhizobium
có khả năng cố ñịnh nitơ từ khí trời, cung cấp một phần ñạm cho cây và ñể lại
lượng ñạm ñáng kể trong ñất sau khi thu hoạch. Vì vậy, ñất sau khi trồng ñậu
xanh sẽ trở nên tơi xốp và giàu dinh dưỡng hơn [22].
1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT ðẬU XANH
1.2.1. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống ñậu xanh
Ngay từ khi con người biết trồng trọt thì các phương pháp chọn lọc khác
nhau ñã ñược ứng dụng nhằm tạo ra những cây trồng theo ý muốn. Ngày nay,
với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, ñặc biệt trong lĩnh vực công nghệ
sinh học, chọn giống cây trồng bằng phương pháp sinh học phân tử ñã ñem lại
những kết quả ñáng tin cậy và thay thế dần cho phương pháp chọn giống cổ
truyền. Phương pháp chọn tạo giống cây trồng nhờ chỉ thị phân tử ñã ñược áp
dụng bởi nó có ưu ñiểm là nhanh chóng ñánh giá ñược bộ gen của các giống
cây trồng với ñộ chính xác cao. Một hướng nghiên cứu ứng dụng sinh học
phân tử trong chọn tạo giống ñậu xanh là việc xây dựng bản ñồ di truyền phân
tử. Gần ñây, nhiều bản ñồ di truyền phân tử ñã ñược công bố bao gồm các chỉ
thị phân tử RFLP, RAPD và một số chỉ thị khác [16].
Hiện nay, công tác chọn tạo giống ñậu xanh trên thế giới ñược tiến hành
theo một số hướng chính: tạo giống cho năng suất cao, tạo giống nâng cao
chất lượng [6], tạo giống có khả năng chống chịu tốt, tạo giống có khả năng
kháng sâu, bệnh hại [28], [34].
Cùng với việc áp dụng sinh học phân tử vào nghiên cứu ñậu xanh của
các nước trên thế giới, ở Việt Nam bước ñầu cũng có nhiều ứng dụng và ñã
thu ñược những kết quả khá quan trọng.
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

7
Từ sau cách mạng tháng 8 - 1945, chúng ta ñã xây dựng ñược nhiều
trạm nghiên cứu thí nghiệm về ñậu ñỗ nói chung và về ñậu xanh nói riêng ở
nhiều nơi khác nhau như ở ðịnh Tường (Thanh Hoá), Mai Nham (Vĩnh
Phúc), Pú Nhung (Lai Châu), Thất Khê (Cao Bằng) và ñã tiến hành thu thập,
chọn tạo ra nhiều giống mới với các ñặc tính ưu việt hơn trước.
Từ những năm 1980 ñến nay, nước ta có thêm nhiều cơ sở nghiên cứu về
ñậu xanh như: Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam, Viện cây
lương thực thực phẩm, các trường ðại học Nông nghiệp, ðại học Khoa học
Tự nhiên cùng nhiều cơ sở nghiên cứu khoa học khác. Các trung tâm này ñã
tập trung và ñi sâu vào hai hướng nghiên cứu cơ bản trong sản xuất ñậu ñỗ nói
chung và ñậu xanh nói riêng là:
- Chọn tạo giống thích hợp cho từng vùng sinh thái, từng mùa vụ khác
nhau, giống có năng suất cao, phẩm chất tốt, có khả năng chống chịu ñiều
kiện ngoại cảnh bất lợi, ñặc biệt là các giống có giá trị thương mại cao [17].
- ðưa cây ñậu xanh vào hệ thống trồng trọt nhằm cải tiến hệ thống trồng
ñộc canh hoá ở các vùng và cải tạo các vùng ñất bị thoái hoá [17].
Trong tương lai, với sự phát triển ngày càng mạnh của khoa học kỹ
thuật, các loại cây trồng nói chung và cây ñậu xanh nói riêng sẽ còn ñược
nghiên cứu kỹ hơn, sâu hơn ñể có thể ñáp ứng ñược nhu cầu sử dụng ñậu
xanh ngày càng lớn của con người.
1.2.2. Tình hình sản xuất ñậu xanh
Trên thế giới, tình hình sản xuất ñậu xanh ngày một tăng. ðặc biệt, trong
những năm gần ñây, do nhu cầu của con người về dinh dưỡng protein thực vật
tăng nhanh ñã làm thúc ñẩy việc sản xuất ñậu xanh trên thế giới phát triển
mạnh. Bangladesh, Ấn ðộ, Pakistan, Philipin, Srilanca, ðài Loan, Thái Lan
ñược coi là các trọng ñiểm về diện tích, năng suất và sản lượng, là những
cường quốc về ñậu xanh trên thế giới [14].
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

8
Trung tâm nghiên cứu và phát triển rau quả châu Á ñã có một bộ sưu tập
giống ñậu xanh với khoảng 6000 mẫu giống, trong ñó có những giống cho
năng suất cao từ 18 - 25 tạ/ha. Gần ñây, một số nước láng giềng của Việt Nam
như Thái Lan, Philipin, Trung Quốc,… ñã chọn ra ñược những giống ñậu
xanh cho năng suất từ 10 - 12 tạ/ha trở lên, hạt to, màu hạt ñẹp, thời gian sinh
trưởng ngắn, chín tập trung, có sức chống chịu tốt với các ñiều kiện cực ñoan
của môi trường [14], [24].
Tính ñến năm 2001, Ấn ðộ là nước ñứng ñầu thế giới trong việc sản xuất
ñậu xanh với diện tích gần 2887000 ha (chiếm trên 70% diện tích ñậu xanh
toàn cầu), sản lượng ñạt trên 1 triệu tấn, tiếp theo là Trung Quốc (diện tích
772000 ha, sản lượng 0,891 triệu tấn). Trung Quốc là nước có năng suất sản
xuất ñậu xanh cao nhất, ñạt 1,15 tấn/ha. Thái Lan là nước ñứng ñầu thế giới
về xuất khẩu ñậu xanh, chiếm khoảng 40% sản lượng ñậu xanh xuất khẩu trên
thế giới. Những nước nhập nhiều ñậu xanh là Nhật Bản (80 tấn/năm), Hoa Kỳ
(50 tấn/năm) (Nguồn : FAOSTAT 2002) [24].
Ở Việt Nam, cây ñậu xanh cũng ñược trồng từ lâu ñời ở các vùng ñồng
bằng, trung du và miền núi trên khắp cả nước. Tuy nhiên, nó vẫn chỉ ñược xem
như một loại cây trồng phụ nhằm tận dụng ñất ñai, lao ñộng dư thừa,… Vì thế,
năng suất sản xuất ñậu xanh còn chưa cao. Từ năm 1991 - 1995 năng suất sản
xuất ñậu xanh ñạt từ 5,5 tạ/ha ñến 12 tạ/ha. Từ năm 1996 - 2000 năng suất dao
ñộng trong khoảng 15 - 20 tạ/ha. ðến năm 2000, Việt Nam có diện tích và sản
lượng ñậu xanh ñứng thứ 6 trên thế giới [7], [8], [9], [10], [11].
1.3. NGHIÊN CỨU QUAN HỆ DI TRUYỀN Ở ðẬU XANH
1.3.1. Một số phương pháp sinh học phân tử trong phân tích quan hệ di
truyền ở thực vật
1.3.1.1. Kỹ thuật RAPD
Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA - ña hình các
ñoạn DNA ñược khuếch ñại ngẫu nhiên) do William phát minh năm 1990,
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

9
Welsh và cộng sự hoàn thiện năm 1991. Kỹ thuật này cho phép phát hiện tính
ña hình các ñoạn DNA ñược nhân bản ngẫu nhiên bằng việc sử dụng mồi ñơn
chứa trật tự nucleotide ngẫu nhiên [19]. ðến nay, kỹ thuật này ñã và ñang
ñược ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của sinh học phân tử. Người ta
ñã sử dụng kỹ thuật này ñể thiết lập bản ñồ di truyền, ñánh giá hệ gen của
giống và sự ña dạng di truyền của tập ñoàn giống [27], [53].
* Nguyên lý
Kỹ thuật RAPD có cơ sở là kỹ thuật PCR, nhưng sử dụng mồi ngẫu
nhiên ñể nhân bản những ñoạn DNA hoàn toàn ngẫu nhiên trong hệ gen.
* Thành phần phản ứng
Cũng tương tự phản ứng PCR, các yếu tố cần thiết ñể tiến hành phản ứng
RAPD bao gồm:
- DNA khuôn (DNA template) với nồng ñộ 5 - 50 ng trong 20 - 25 µl.
DNA khuôn là vật liệu khởi ñầu cho phản ứng RAPD, ñược tách từ các mẫu:
virus, vi khuẩn, tế bào thực vật, ñộng vật…. DNA có ñộ tinh sạch, có thể là
sợi ñơn, sợi ñôi, mạch vòng hoặc mạch thẳng. DNA khuôn ñược khuếch ñại
dưới dạng thẳng có hiệu quả hơn dạng vòng. Kích thước DNA khuôn nhỏ hơn
3 kb cho kết quả tốt nhất [5].
- ðoạn mồi (primer): chỉ sử dụng một mồi ñó là một oligonucleotide có
trật tự nucleotide ngẫu nhiên và có chiều dài 8 - 10 nucleotide (thường sử
dụng mồi dài 10 nucleotide). Nhiệt ñộ gắn mồi trong phản ứng RAPD
thấp (32
0
- 40
0
C). Nồng ñộ mồi phải thích hợp ñể ñảm bảo kết quả phản ứng
(phù hợp với lượng DNA cần tổng hợp) tạo nên lượng sản phẩm cần thiết.
Nếu nồng ñộ mồi quá cao có thể làm cho hiệu quả phản ứng kém chính xác,
do mồi bám vào các vị trí không ñặc hiệu. Nếu nồng ñộ mồi quá thấp sẽ
không ñảm bảo ñủ lượng sản phẩm RAPD. Nồng ñộ mồi thích hợp ñể
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

10
tiến hành phản ứng thường là 0,1- 0,5 µM. Mồi ñược thiết kế ñảm bảo các
yêu cầu sau:
+ Trình tự mồi phải có tính ñặc hiệu cao, bắt cặp tuyệt ñối với ñầu mạch
khuôn, không có cấu trúc “kẹp tóc”, giàu G và C (chiếm 60%).
+ Nhiệt ñộ gắn mồi thấp hơn nhiệt ñộ nóng chảy (Tm) của mồi từ 1
0
- 2
0
C [1],
[2], [19].
- Taq-polymerase: là một enzyme quan trọng, có vai trò quyết ñịnh ñến
phản ứng PCR. ðây là loại enzyme chịu ñược nhiệt ñộ cao trong các loại
enzyme. ðặc ñiểm của chúng là có khả năng kéo dài mồi ñể tạo một sản phẩm
có chiều dài 8 - 13 kb. Taq-polymerase ñược tách chiết từ chủng vi khuẩn ở
suối nước nóng Thermus aquaticus, không bị mất hoạt tính ở nhiệt ñộ biến
tính DNA (92
o
- 95
0
C). Taq - polymerase có hoạt tính ở dải nhiệt ñộ cao, tồn
tại ở nhiệt ñộ ủ 95
0
C kéo dài. Enzyme này có hoạt tính cao ở 72
0
- 80
0
C làm
cho phản ứng xảy ra nhanh, hiệu quả và chính xác [1], [19].
- dNTP: là các nucleotide tự do ñược sử dụng làm nguyên liệu cho phản
ứng RAPD, gồm bốn loại: dATP, dTTP, dGTP, dCTP. Nồng ñộ dNTP mỗi
loại thường dùng trong các phản ứng RAPD khoảng 50 - 200 µM. Nếu nồng
ñộ các loại dNTP quá ít thì tạo sản phẩm ít không ñủ ñể phát hiện, ngược lại,
nồng ñộ dNTP quá cao thì phản ứng khó thực hiện [1], [19].

- Dung dịch ñệm: là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng ñến
chất lượng và hiệu quả của phản ứng. Dung dịch ñệm của phản ứng phải
ñảm bảo thành phần các chất cần thiết cho hoạt ñộng của enzyme như:
MgCl
2
, KCl, Tris HCl...
Thành phần của dung dịch ñệm của phản ứng bao gồm:
Tris HCl 10mM (pH = 8.3 ở nhiệt ñộ phòng)
KCl 50mM
MgCl
2
1,5mM khi ủ ở nhiệt ñộ phòng.
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

11
Nồng ñộ MgCl
2
có thể dao ñộng từ 0,5 - 5mM. Thành phần này ñóng
vai trò quan trọng ñến khả năng bắt cặp và gắn các mồi với mạch khuôn
[1], [5], [19].
* Chu kỳ phản ứng
Phản ứng RAPD ñược tiến hành qua các giai ñoạn sau:
- Giai ñoạn biến tính DNA: Ở nhiệt ñộ 95
0
C trong 30 - 60 giây làm cho
các liên kết hydro giữa 2 mạch bị ñứt. Khi ñó DNA sợi ñôi tách thành 2 sợi
ñơn tạo ñiều kiện cho sự bắt cặp mồi.
- Giai ñoạn tiếp hợp mồi: Nhiệt ñộ hạ xuống 32
0
- 40
0
C, mồi bám vào
ñầu 3

OH của mạch khuôn DNA và bắt ñầu quá trình tổng hợp sợi mới.
- Giai ñoạn tổng hợp: Nhiệt ñộ ñược nâng lên 72
0
C thì các ñoạn mồi ñã
bắt cặp với các mạch ñơn sẽ ñược kéo dài với sự tham gia của Taq -
polymerase.
Một chu kỳ trên xảy ra, 1 ñoạn DNA ñược nhân lên thành 2, các ñoạn
DNA ñược nhân tiếp tục ñược coi là mạch khuôn ñể tổng hợp cho chu kì sau.
Vậy, sau n chu kỳ thì sẽ tạo ra 2
n
các ñoạn DNA giống hệt ñoạn DNA khuôn
ban ñầu. Phản ứng RAPD có thể thực hiện 40 - 45 chu kỳ.
1.3.1.2. Kỹ thuật RFLP
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism - ña hình ñộ dài các
ñoạn cắt giới hạn) là kỹ thuật sử dụng các endonuclease giới hạn cắt DNA hệ
gen ở trình tự nhận biết ñặc trưng tạo ra hàng loạt ñoạn DNA có ñộ dài xác
ñịnh, số lượng các ñoạn phụ thuộc vào số ñiểm nhận biết trong hệ gen. Sử
dụng kỹ thuật RFLP có thể xác ñịnh một tính trạng ở trạng thái ñồng hợp
hoặc dị hợp trong một cá thể. Vì vậy, RFLP là một chỉ thị tin cậy trong phân
tích liên kết và chọn giống. Tuy nhiên, kỹ thuật này có nhược ñiểm là tốn kém
và mất thời gian. Kỹ thuật này ñòi hỏi phải có một lượng DNA lớn (50 - 200 ng
từ mỗi cá thể) [13].
Bằng kỹ thuật RFLP, Young và ñtg (1992) ñã thành công
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

12
trong việc lập bản ñồ kháng mọt ở ñậu xanh [54]. Với kỹ thuật RFLP và
RAPD, Lambrides C. J. và ñtg ñã lập ñược bản ñồ gen của ñậu xanh [38].
1.3.1.3. Kỹ thuật AFLP
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism - ña hình ñộ dài các
ñoạn ñược nhân bản chọn lọc) là kỹ thuật kết hợp của RFLP và PCR. Kỹ
thuật này cho phép phát hiện một cách có chọn lọc các ñoạn DNA hệ gen ñã
ñược cắt bởi enzyme giới hạn và gắn với ñoạn tiếp hợp.
Về nguyên tắc, kỹ thuật AFLP tương tự như kỹ thuật RAPD, chỉ có ñiểm
khác biệt là mồi trong phản ứng AFLP gồm hai phần: phần cố ñịnh dài
khoảng 15 bp chứa vị trí nhận biết của enzyme giới hạn, phần thay ñổi dài
khoảng 2 - 4 bp. Sản phẩm PCR ñược ñiện di trên gel polyacrylamide có ñộ
phân giải cao. Sự ña hình ñược xác ñịnh bởi sự có mặt hay vắng mặt của một
phân ñoạn DNA.
Kỹ thuật AFLP có ưu ñiểm là phân tích ña hình di truyền trong khoảng
thời gian ngắn, lượng DNA ñòi hỏi ít, cho sự ña hình cao. Kỹ thuật này ñược
ñánh giá là nhanh chóng và có hiệu quả trong việc xác ñịnh tính ña dạng di
truyền ở cây trồng, như lúa, lạc…[49].
1.3.1.4. Kỹ thuật SSR
SSR (Simple Sequence Repeats - trình tự lặp lại ñơn giản) hay còn gọi là
vi vệ tinh (microsatellites). Kỹ thuật này ñược Litt và Luty phát triển năm
1989 dựa trên nguyên tắc của phản ứng PCR. Trong cấu trúc hệ gen của sinh
vật nhân chuẩn tồn tại một loạt các trình tự nucleotide lặp lại, chúng ñặc trưng
cho loài. SSR gồm 2 - 5 nucleotide lặp lại nhiều lần. Thông thường, các SSR
có mặt chủ yếu ở các vùng dị nhiễm sắc của NST, như vùng tâm ñộng hoặc
các ñầu mút. Chúng giữ vai trò quan trọng trong việc ñiều hòa hoạt ñộng của
các gen, góp phần làm tăng tính ổn ñịnh cơ học của NST trong các quá trình
phân bào và có thể chứa ñựng những thông tin di truyền liên quan ñến sự xác
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

13
ñịnh giới tính ở cả ñộng vật và thực vật. Do sự khác nhau về số lượng
nucleotide trong mỗi ñơn vị lặp lại mà sự ña hình về ñộ dài của SSR ñược
nhân bản sẽ ñược phát hiện sau quá trình ñiện di trên gel agarose hay
polyacrylamide. SSR là công cụ hữu ích trong phân tích hệ gen và chọn giống
cây trồng, do khả năng phát hiện tính ña hình rất cao. Song chỉ thị này có
nhược ñiểm là sự phức tạp trong thiết kế mồi và giá thành thiết kế mồi cao.
Trong thực tế, chỉ thị này ñã ñược sử dụng ñể nghiên cứu một số tính trạng
liên quan ñến năng suất, bệnh hại, xác ñịnh giới tính, phân tích quan hệ di
truyền, lập bản ñồ gen…[48]. Nguyễn Vũ Thanh Thanh ñã sử dụng kỹ thuật
SSR ñể nghiên cứu tính ña dạng di truyền của một số giống ñậu xanh chịu hạn
khác nhau [21].
1.3.1.5. Bản ñồ QTL
Bản ñồ QTL (Quantitative Trait Loci - bản ñồ các locus tính trạng số lượng)
xác ñịnh mối liên kết giữa các chỉ thị phân tử với một tính trạng hình thái ñang ñược
quan tâm. Qua bản ñồ QTL có thể xác ñịnh ñược những vùng trên NST có liên
quan ñến một tính trạng hình thái. ðể lập bản ñồ QTL, cần tiến hành:
- Xác ñịnh cặp lai
- Lai và tạo quần thể cho lập bản ñồ
- Theo dõi sự phân ly của các chỉ thị trong quần thể
- Xử lý thống kê và lập bản ñồ.
Lập bản ñồ QTL nhằm xác ñịnh vị trí, hiệu quả gen và hoạt ñộng của các
locus liên quan trong tương tác gen và tương tác QTL với môi trường, từ ñó
chọn lọc nhờ sự trợ giúp của chỉ thị phân tử (MAS - Marker Assisted
Selection). Sholihin và ñtg (2002) ñã nghiên cứu lập bản ñồ QTL liên kết với
tính chịu hạn ở ñậu xanh [49]. Bản ñồ QTL liên quan tới khối lượng hạt ñậu
xanh ñã ñược Humphry và ñtg (2005) mô tả [34].
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

14
1.3.2. Tình hình nghiên cứu quan hệ di truyền ở cây ñậu xanh sử dụng kỹ
thuật RAPD
Kỹ thuật RAPD ñược sử dụng khá phổ biến trong phân tích và xác ñịnh
mối quan hệ di truyền giữa các loài hay giữa các cá thể nhằm phục vụ công
tác lai tạo, chọn giống hoặc phân loại thực vật.
Ở Việt Nam, quan hệ di truyền ở cây ñậu xanh cũng ñã ñược nghiên cứu,
tuy nhiên số lượng các nghiên cứu chưa nhiều. Chu Hoàng Mậu (2001) sử
dụng các mồi ngẫu nhiên ñể nghiên cứu sự ña hình DNA của các dòng ñậu
xanh ñột biến so với giống gốc [16].
ðiêu Thị Mai Hoa (2006) cũng sử dụng kỹ thuật RAPD với 12 mồi ngẫu
nhiên ñể xác ñịnh mức ñộ tương ñồng di truyền của 57 giống ñậu xanh có thời
gian chín quả khác nhau, tạo cơ sở cho việc chọn giống có thời gian chín
ngắn, chín tập trung. Kết quả thu ñược 121 băng DNA nhân bản, trong số ñó
có 88 băng (73%) thể hiện sự ña hình. Từ ñây, thiết lập ñược cây phát sinh
chủng loại [4].
Nguyễn Vũ Thanh Thanh ñã sử dụng kỹ thuật RAPD với 20 mồi ngẫu
nhiên, trong ñó có 18 mồi thể hiện tính ña hình và kỹ thuật SSR với 10 mồi
ngẫu nhiên ñể nghiên cứu sự ña dạng di truyền của các giống ñậu xanh có khả
năng chịu hạn khác nhau. Kết quả nhận ñược 79 phân ñoạn DNA với 18 mồi
RAPD và 91 phân ñoạn với 10 mồi SSR. Từ ñó thiết lập biểu ñồ hình cây xác
ñịnh quan hệ di truyền của các giống ñậu xanh [21].
Trên thế giới, việc áp dụng kỹ thuật RAPD ñể nghiên cứu quan hệ di
truyền có phần ña dạng hơn. Năm 1998, Santalla M. và ñtg nghiên cứu tính ña
dạng di truyền ở cây ñậu xanh bằng kỹ thuật này với 60 mồi ngẫu nhiên.
Kết quả ñiện di cho thấy tổng số có 246 phân ñoạn DNA ñược khuếch ñại,
trong ñó có 229 phân ñoạn thể hiện tính ña hình [47]. Cũng trên ñậu xanh,
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

15
Saini A. và ñtg ñã sử dụng các mồi ngắn (10 nucleotide) trong phản ứng
RAPD và ñể ñánh giá quan hệ di truyền của 46 giống ñậu xanh [45].
Năm 2000, Lakhanpaul và ñtg sử dụng kỹ thuật RAPD nhằm phân tích
ña hình DNA của các giống ñậu xanh Ấn ðộ. Nhóm tác giả sử dụng 21 mồi
ngẫu nhiên và thu ñược 267 băng DNA, trong ñó 64% là ña hình [37].
Betal và ñtg (2004) ñã sử dụng 14 giống ñậu xanh cùng 14 mồi ngẫu
nhiên ñể phân tích mối quan hệ di truyền nhờ kỹ thuật RAPD. Kết quả cho
thấy các giống có năng suất cao có liên quan chặt chẽ với tính trạng mùi thơm
của hạt. Kết quả nghiên cứu của tác giả cũng chỉ ra rằng tính trạng năng suất
có mối liên quan với ñặc ñiểm hình thái như chiều cao cây, kích cỡ và màu
sắc hạt [27] .
Afzal và ñtg (2004) nghiên cứu sự ña dạng di truyền của tập ñoàn giống
ñậu xanh nhờ kỹ thuật RAPD. Trong nghiên cứu này, tác giả sử dụng 21
giống ñậu xanh với 34 mồi ngẫu nhiên kết quả thu ñược tổng số 204 phân
ñoạn DNA ñược nhân bản, trong ñó có 75% phân ñoạn thể hiện tính ña hình.
Sự tương ñồng di truyền nhận ñược trong nghiên cứu này có thể ñược sử dụng
ñể chọn dòng bố mẹ phục vụ mục ñích chọn giống [25].
Năm 2006, Karuppanapandian T. và ñtg ñã xác ñịnh quan hệ di truyền
của các giống ñậu xanh (Vigna radiata L.) ñược lựa chọn từ những vùng khác
nhau ở Nam Tamil Nadu (Ấn ðộ) bằng kỹ thuật RAPD với 20 mồi ngẫu
nhiên. Kết quả thu ñược 200 ñoạn gen khuếch ñại khác nhau, trong ñó có 83%
thể hiện sự ña hình [36].
* Ngoài ra, việc ứng dụng kỹ thuật RAPD ñể nghiên cứu quan hệ di truyền
cũng ñã ñược nhiều nhà khoa học khai thác có hiệu quả trên nhiều ñối tượng
thực vật khác như: cà phê, ngô, chè, lạc, lúa, các cây họ ñậu…
Orozco C. và ñtg (1994) ñã ứng dụng kỹ thuật RAPD ñể khảo sát mối
quan hệ di truyền và tiến hóa của các giống cà phê ñược lai tạo từ các loài bố,
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

16
mẹ ở các vùng sinh thái khác nhau, làm cơ sở cho việc ghép cặp lai với mục
ñích tạo con lai có ñặc ñiểm quý [41].
Trên ñối tượng là các cây họ ñậu, Doldi M. L. và ñtg (1997) sử dụng 33
mồi ngẫu nhiên ñể phân nhóm 18 giống ñậu tương có ñặc tính chín sớm. Kết
quả ñã phân nhóm ñược một số giống có hàm lượng protein cao, sử dụng cho
chương trình nghiên cứu nhằm mục ñích nâng cao hàm lượng ñạm các giống
ñậu tương thích nghi với ñiều kiện Châu Âu [30]
Ranade R. và ñtg (2001) sử dụng 40 mồi ngẫu nhiên ñể nghiên cứu ñặc
ñiểm của 12 giống ñậu ñen (black gram). Kết quả phân tích sản phẩm RAPD
chỉ ra ñược một số băng ñặc hiệu tương ứng với các mồi ngẫu nhiên ñể phân
biệt một số giống trong nhóm nghiên cứu [44].
Năm 2003, Jorge và ñtg ñã ñánh giá sự tương ñồng di truyền giữa các
giống chè ở Hy Lạp nhờ kỹ thuật RAPD. Họ sử dụng 25 mồi ngẫu nhiên ñể
khuếch ñại các ñoạn DNA của 7 giống chè. Kết quả cho 282 băng, trong ñó
có 195 băng thể hiện tính ña hình. Nghiên cứu cho thấy những giống chè ở
Hy Lạp có thể hiện tính ña dạng di truyền [35].
Paulo .S (2004) xác ñịnh mối quan hệ di truyền của 81 giống ngô (Zea
mays) ở phía Nam Brazil nhờ chỉ thị RAPD. Trong nghiên cứu này, tác giả sử
dụng 32 mồi ngẫu nhiên và kết quả thu ñược 225 băng, trong ñó có 184 băng
thể hiện tính ña hình (chiếm 72,2%). Từ kết quả này, cây phả hệ ñược thành
lập bằng cách sử dụng phần mềm UPGMA. Kết quả nghiên cứu này sẽ ñược
sử dụng ñể chứng minh và duy trì nguồn gen từ ngô [42].
Dey N. và ñtg (2005) nghiên cứu tính ña dạng di truyền của 38 dòng lúa
thơm và 2 dòng ñối chứng. Nhóm tác giả ñã tiến hành phản ứng RAPD với 5
mồi ngẫu nhiên. Kết quả khuếch ñại ñược 44 băng DNA, với kích thước từ
500 - 3500 bp. Trong 44 băng có 41 băng thể hiện tính ña hình [29].
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

17
Subramanian V. và ñtg (2006) ñã nghiên cứu tính ña hình DNA ở cây lạc
nhờ kỹ thuật RAPD. Nhóm tác giả ñã sử dụng 48 mồi ngẫu nhiên và xác ñịnh
ñược 7 mồi (14,6%) ña hình. Tổng số băng DNA ñược tạo ra từ 7 mồi ñó là
408 băng, trong ñó có 27 băng thể hiện tính ña hình [51].
Awan F. S. (2007) sử dụng kỹ thuật RAPD ñể xác ñịnh mối quan hệ di
truyền của 7 giống lúa mì ở Pakistan (6 giống nhập nội và 1 giống khác). Kết
quả có 112 băng DNA ñược tạo ra từ 15 mồi ngẫu nhiên, trong ñó có 50 băng
thể hiện tính ña hình, mối tương ñồng di truyền là 86,2 - 93%. ðiều này cho
biết mối quan hệ gần gũi của các giống lúa mì này [26].
Venkata C. L. và ñtg (2007) ñã xác ñịnh tính ña hình DNA ở 21 giống
chuối ở Nam Ấn ðộ nhờ chỉ thị RAPD và ISSR. Phản ứng RAPD ñược thực
hiện với 50 mồi và ISSR với 12 mồi. Kết quả thu ñược 641 băng DNA, có
kích thước 200 - 3100 bp, trong ñó có 382 băng thể hiện tính ña hình, tương
ứng với 60% tính ña dạng sinh học [52].
Raghunathachari P. và ñtg ñã xác ñịnh ñược sự ña dạng di truyền của 18
giống lúa nhờ kỹ thuật RAPD. Họ sử dụng 10 mồi và thu ñược 144 băng
DNA, trong ñó các băng thể hiện tính ña hình chiếm 95,1% [43].
Năm 2008, Trương Quang Vinh và ñtg ñánh giá sự ña hình DNA của
một số giống khoai tây nhập nội và của Việt Nam bằng kỹ thuật RAPD. Kết
quả, phân tích ña hình 8 giống khoai tây thu ñược 78 băng DNA, có kích
thước từ 0,25 - 3 kb, ñược tạo ra từ 14 mồi ngẫu nhiên, ñã xác ñịnh có 11 mồi
cho tính ña hình. Hệ số sai khác di truyền giữa 8 giống khoai tây nghiên cứu
từ 4,5 - 31,1% [23].
* Kỹ thuật RAPD không những ñược ứng dụng ở thực vật, mà hiện nay kỹ
thuật này ñược ứng dụng trên nhiều ñối tượng khác nhau.
Sử dụng kỹ thuật RAPD ñể ñánh giá dịch tả phân tử gữa các chủng V.
cholerae: 25 chủng phân lập trong vụ dịch tả năm 2002 ở Việt Nam ñược chia
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

18
thành 5 dòng vi khuẩn tả khác nhau. Phổ biến nhất là dòng vi khuẩn có kiểu
mẫu RAPD giống với hai chủng chuẩn typ huyết thanh Inaba và Ogawa ñã
từng gây bệnh ở Việt Nam trước năm 2002. Kết quả chỉ ra rằng, chủng Vibrio
cholerae gây bệnh ở Việt Nam có quan hệ di truyền rất gần với các chủng gây
ñại dịch tả 6 và 7 dựa trên phân tích trình tự nucleotide của hai gen housekeeping
mã hoá cho hemolysin (hlyA) và malat dehydrogenaza (mdh) [18].
Nguyễn Thị Thanh Bình và ñtg (2004) ñã phân tích tính ña dạng di
truyền của 8 giống tằm dâu nuôi ở Việt Nam bằng kỹ thuật RAPD với 5 mồi
ngẫu nhiên. Kết quả thu nhận ñược 67 băng DNA, trong ñó có 41 (61,2%)
băng ña hình. Kết quả phân tích NTSYS-SIMQUAL cho thấy các giống tằm
nghiên cứu có mối tương ñồng di truyền trong khoảng 0,547 ñến 0,984 [3].
















Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×

×