Tải bản đầy đủ

BÁO CÁO TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY CHỦNG TRICHODERMAHARZIANUM THU NHẬN ENZYME CELLULASE THEO PHƯƠNG PHÁP QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM

Tài nguyên, năng lượng và môi trường vì sự phát triển bền vững

TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY CHỦNG TRICHODERMA
HARZIANUM THU NHẬN ENZYME CELLULASE THEO PHƯƠNG
PHÁP QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM
Nguyễn Hoàng Anh, Nguyễn Thúy Hương.
Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh
Mail: hoanganh3789@gmail.com
Đến tòa soạn ngày:
Nhận đăng ngày:
TÓM TẮT
Enzyme cellulase có nhiều ứng dụng quan trọng trong xử lý môi trường nhằm tạo phân bón
hữu cơ vi sinh và đã được ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp. Để thu nhận cellulase trong môi
trường lên men bán rắn, Chúng tôi đã lựa chọn chủng Trichoderma harzianum là nguồn sinh
tổng hợp enzyme cellulase. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành tối ưu điều kiện nuôi cấy
theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm nhằm thu nhận lượng enzyme cellulase cao nhất.
Trong đó: độ ẩm, pH, tỷ lệ giống, D-glucose, ammonium sulphate được xác định là các yếu tố
tác động đáng kể nhất (p<0.05). Sau khi sàng lọc, các yếu tố đã được tối ưu hóa bằng phương
pháp đáp ứng bề mặt (RSM) – phương án cấu trúc có tâm (CCD). Phương pháp RSM-CCD đã
được thực hiện và tìm ra giá trị tối ưu của 5 yếu tố là độ ẩm (60.68%), pH (5.25), tỷ lệ giống
(0.55%), D-glucose (0.44%) và ammonium sulphate (0.90%) cho hoạt tính enzyme cellulase là

cao nhất. Thử nghiệm nuôi cấy với điều kiện của mô hình, hoạt tính cellulase thu được đạt
98.08% so với kết quả thu được từ mô hình.
Từ khóa:Trichoderma harzianum, enzyme cellulase, RSM-CCD, Plackett-Burman, optimization
culture condition.
1. MỞ ĐẦU
Nấm Trichoderma được biết đến như là một tác nhân điều khiển sinh học trên đối tượng
bệnh hại cây trồng.Nấm Trichoderma là đuối tượng được quan tâm vì khả năng đối kháng mạnh,
phổ đối kháng rộng đối với các loại nấm gây bệnh trên cây trồng, khả năng kích thích phát triển
bộ rễ và khả năng phân giải chất xơ.Một trong những vũ khí mạnh của chúng phải kể đến là khả
năng tổng hợp enzyme ngoại bào rất hiệu quả, tham gia trực tiếp vào quá trình phá hủy vách tế
bào nấm bệnh.Hệ enzyme mà chúng có khả năng sản sinh ra là chitinase, β-glucanase, cellulase
có tác động lên sự sinh trưởng và phát triển của nấm bệnh [1]. Những nhóm enzyme này được
ứng dụng rất nhiều trong nông nghiệp để phòng trừ nấm bệnh và kích thích sự phát triển bộ rễ
nhờ kết hợp với các loại vi khuẩn vùng rễ phân giải chất xơ, chitin, ligin…tạo điều kiện cho cây
trồng dễ hấp thu. Việc nuôi cấy Trichoderma để thu enzyme và mang lại hiệu quả kinh tế vẫn
1


Tài nguyên, năng lượng và môi trường vì sự phát triển bền vững

đang là vấn đề được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh
tổng hợp enzyme là nhiệt độ, pH, độ ẩm, tỷ lệ giống, nguồn dinh dưỡng cacbon, nitơ.
Việc tối ưu hóa các yếu tố trên trong quá trình lên men bán rắn để xây dựng mô hình nhằm
thu được lượng enzyme cao và tăng quy mô sản xuất có ý nghĩa quan trọng trong việc ứng dụng
vào quy mô công nghiệp. Một phương pháp hiệu quả, chi phí thấp, cho phép nghiên cứu sự
tương tác và đông thời tiên đoán được giá trị tối ưu của các yếu tố. Thiết kế thí nghiệm theo thí
nghiệm Plackett-Burman [2] đã được đưa ra và sử dụng rộng rãi để sàng lọc thành phần môi
trường. Sau bước sàng lọc ban đầu, thí nghiệm tối ưu theo phương pháp RSM-CCD được dung
để tối ưu hóa giá trị các yếu tố nghiên cứu. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tối ưu hóa điều
kiện nuôi cấy theo thiết kế Plackett-Burman và RSM-CCD để dự đoán khả năng sinh tổng hợp
enzyme cellulase cực đại của chủng nấm Trichoderma harzianum.
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu
Chủng vi sinh vật: chủng nấm Trichoderma harzianum được cung cấp bởi bộ môn Công
nghệ Sinh Học, Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia Tp.HCM.
Môi trường nuôi cấy:
PDA (Potato D-glucose Agar): dùng để phân lập, giữ giống và nhân giống chủng T.
harzianum.
Môi trường lên men bán rắn: cám trấu theo tỷ lệ (3:1) [3], thành phần dinh dưỡng cacbon
và nitơ thay đổi tùy theo thiết kế thí nghiệm.
Hóa chất: CMC (carboxyl methyl cellulose) của Ấn Độ.
Bố trí thí nghiệm:
Kiểm tra sơ bộ khả năng thủy phân CMC của enzyme thô
Chủng T. harzianum sau khi nhân giống cấp 1 được bổ sung vô môi trường lên men bán rắn
để thu enzyme thô. Kiểm tra hoạt tính enzyme cellulase bằng việc đo đường kính vòng thủy
phân [4].
Thiết kế thí nghiệm tìm yếu tố ở tâm và sàng lọc các yếu tố
Để thiết kế thí nghiệm sàng lọc theo Plackett-Burman, trước tiên tìm thí nghiệm tại tâm của
8 yếu tố cần khảo sát là tỷ lệ giống, nhiệt độ, độ ẩm, pH, D-glucose, Lactose, Pepton,
ammonium sulphate theo bảng 1.
Các mức
Mức 1
Mức 2
Mức 3
Mức 4
Mức 5
Mức 6
Mức 7

2

Bảng 1. Mức khảo sát của 8 yếu tố để tìm thí nghiệm tại tâm
Tỷ lệ giống
Nhiệt độ
Độ ẩm
pH D-glucose Lactose Pepton
(% w/w)
(0C)
(%)
(% w/w) (% w/w) (% w/w)
0.1
25
40
3.0
0.1
0.6
0.8
0.4
29
45
3.5
0.4
0.8
1.0
0.7
33
50
4.0
0.7
1.0
1.2
1.0
37
55
4.5
1.0
1.2
1.4
1.3
60
5.0
1.3
1.4
1.6
65
5.5
70
6.0

(NH4)2SO4
(% w/w)
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4


Tài nguyên, năng lượng và môi trường vì sự phát triển bền vững

Sau khi tìm thí nghiệm tại tâm của 8 yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme
cellulase của chủng T. harzianum, chúng tôi tiến hành sàng lọc các yếu tố ban đầu và thí nghiệm
được thiết kế theo ma trận Plackett-Burman [2] bảng 2. Mục tiêu để sàng lọc các yếu tố quan
trọng ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase. Mức thấp (-1), mức cao (+1) của
8 yếu tố được liệt kê trong bảng 3.
Bảng 3. Mức khảo sát của các yếu tố

Giá trị các yếu tố
Tên yếu tố

Thấp (-1)

Cao (+1)

Nhiệt độ

25

37

pH

4.0

6.0

Độ ẩm

50

70

Tỷ lệ giống

0.1

1.3

D-glucose

0.1

0.7

Lactose

0.6

1.4

Pepton

0.8

1.6

(NH4)2SO4
0.6
1.2
Bảng 2. Ma trận thiết kế Plackett-Burman
Thứ
Các biến
tự Độ Nhiệt pH Tỷ lệ D- Lac Pep (NH )
4 2
TN ẩm độ
giống gluc -tose -ton SO4
-ose
1

-1

-1

-1

-1

-1

-1

-1

-1

2

1

1

1

-1

1

-1

-1

-1

3

-1

-1

1

-1

1

1

-1

1

4

1

-1

1

1

-1

-1

-1

1

5

1

-1

1

1

1

1

1

-1

6

-1

1

1

1

-1

-1

1

1

7

-1

1

-1

1

1

1

-1

1

8

-1

1

1

-1

-1

1

1

-1

9

1

1

-1

-1

1

-1

1

1

10

-1

-1

-1

1

1

-1

1

-1

11

1

-1

-1

-1

-1

1

1

1

12

1

1

-1

1

-1

1

-1

-1

Bảng 4. Thiết kế thực nghiệm RSM-CCD

3


Tài nguyên, năng lượng và môi trường vì sự phát triển bền vững

14

-2

0

0

0

0

15

1

1

-1

-1

-1

16

0

0

0

-2

0

17

-1

1

-1

-1

1

18

0

0

0

0

0

19

0

-2

1

0

0

20

0

0

-2

0

-2

21

0

2

0

0

0

22

2

0

0

0

0

23

1

-1

0

-1

-1

24

1

-1

1

-1

1

25

-1

1

1

1

-1

26

1

1

-1

-1

1

27

0

0

0

0

0

Bảng 5. Các mức của ma trận thực nghiệm RSM-CCD
Thí nghiệm Plackett-Burman sẽ
cho kết quả các yếu tố có mức độ ảnh
Yếu
Tên
Phạm vi
Mức
hưởng lớn đến khả năng sinh tổng hợp
tố
nghiên -2 -1 0
1
2
enzyme cellulase của chủng T.
cứu
harzianum. Các yếu tố ảnh hưởng lớn
đến
X1
pH
4.0-6.0 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0
kết quả là pH, độ ẩm, tỷ lệ giống, DX2
Độ ẩm
50-70 50 55 60 65 70 tiến
glucose, (NH4)2SO4. Sau đó chúng tôi
hành thí nghiệm với ma trận thực
X3 Tỷ lệ giống 0.1-1.3 0.1 0.4 0.7 1.0 1.3
nghiệm RSM-CCD theo bảng 4, các
X4 D-glucose 0.1-0.7 0.1 0.25 0.4 0.55 0.7
mức như trong bảng 5.Hàm đáp ứng
X5 (NH4)2SO4 0.6-1.2 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4
được lựa chọn là hoạt tính enzyme (Y,
UI/gCPE) mô hình hóa được biểu diễn bằng phương trình bậc 2:

4


Y= b0 + b1x1 + b2x2 +
b3x3 + b4x4 + b12x1x2 + b13x1x3 + b14x1x4 + b23x2x3 + b24x2x4 + b34x3x4 + b11x12 + b22x22 + b33x32 +
b44x42
Phương trình này là cơ sở để xác định các giá trị tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng nói
trên.Trong đó, b1, b2, b3, b4 là các hệ số bậc 1; b11, b22, b33, b44 là các hệ số bậc 2; b12, b23, b13, b14,
b24, b34 là các hệ số tương tác của từng cặp yếu tố; x1, x2, x3, x4, x11, x22, x33, x44, x12, x23, x13, x14,
x24, x34 là các biến độc lập.
Số liệu được phân tích bằng phần mềm Statgraphics Centurion.Từ kết quả phân tích, xác
định mức tối ưu của các yếu tố cho khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase cao nhất.
2.2. Phương pháp
Phương pháp vi sinh
Khảo sát các điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến quá trình lên men bằng phương pháp tối ưu
đơn yếu tố, các kết quả của thí nghiệm trước là tiền đề cho các thí nghiệm tiếp theo. Tối ưu toàn
phần các yếu tố bằng phương pháp RSM-CCD.
Phương pháp hóa sinh
Phương pháp thu enzyme thô: Lấy 10g môi trường lên men đem hòa tan trong 40ml đệm
natri acetate 5M, sau đó lắc trên máy lắc vòng (200 vòng/phút trong 60 phút ở nhiệt độ thường).
Dịch enzyme được tách ra bằng cách lọc qua giấy lọc. Sau đó, dịch này được ly tâm (5000
vòng/phút trong 15 phút) để thu enzyme thô.
Phươn pháp xác định hoạt tính enzyme cellulase: Hoạt tính enzyme cellulase được xác định
dựa trên phản ứng với cơ chất CMC. Enzyme cellulase sẽ thủy giải CMC ở pH 5 và 40 0C. Sau
phản ứng thủy phân sẽ tạo ra một lượng đường khử, đường khử sẽ phản ứng với DNS (axit 3,5 –
dinitrosalicylic) và được xác định bằng máy đo mật độ quang ở bước song 540nm [5].
Phương pháp phân tích số liệu: Các thí nghiệm được thực hiện 3 lần, số liệu được phân
tích bằng phần mềm Statgraphics Centurion XV.I.
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Chủng nấm được nuôi cấy trên môi trường PDA với thời gian khoảng 96h, sau đó chúng
được thu và bổ sung vào môi trường cơ bản với những tỷ lệ khác nhau theo như bố trí thí
nghiệm. thời gian nuôi cấy là 96h.
3.1. Kết quả kiểm tra sơ bộ khả năng thủy phân CMC của enzyme thô
Enzyme cellulase thủy phân CMC sẽ tạo vùng không màu xung quanh. Đường kính vòng
không màu (ngoài cùng) so với mẫu đối chứng (ĐC) là đáng kể và đồng nhất giữa các mẫu khảo
sát. Từ kết quả này, chúng tôi khẳng định chủng T. harzianum có khả năng sinh tổng hợp
enzyme cellulase, là cơ sở cho những thí nghiệm sau.


Hình 1. Vòng thủy phân CMC bằng enzyme thô

3.2. Kết quả thí nghiệm ở tâm của các yếu tố
Sau khi tối ưu từng yếu tố bằng phương pháp cổ điển để tìm thí nghiệm tại tâm, ta thu được
kết quả như trong bảng 6. Các điểm tại tâm là tỷ lệ giống 0.7%, pH 5, độ ẩm 60%, nhiệt độ
290C, hàm lượng pepton 1.2%, (NH4)2SO4 1.0%, lactose 1.2%, D-glucose 0.4%. Kết quả khảo sát
của Sibtain Ahmed (2012) và L. Kredics (2003) cũng cho thấy pH tối ưu là 5 [6,7]. Nhiệt độ
290C cũng là nhiệt độ tối ưu trong nghiên cứu của Ikram-Ul-Haq (2006) và Kannan Neethu
(2012) [8,9]. Trong nghiên cứu của M. Rubeena và cộng sự (2013) cho thấy môi trường bổ sung
0.5% D-glucose sẽ hoạt tính enzyme cellulase tối ưu [10].
Bảng 6. Kết quả khảo sát các điểm tâm
Các mức Tỷ lệ giống
(% w/w)

pH

Độ ẩm
(%)

Nhiệt độ
(0C)

Pepton

(NH4)2SO4

Lactose

D-glucose

(% w/w)

(% w/w)

(% w/w)

(% w/w)

Mức 1 2.47±0.07 1.34±0.06 2.46±0.09 4.57±0.08 2.22±0.09 2.06±0.07 3.01±0.08 3.76±0.07
Mức 2 3.47±0.06 2.03±0.04 2.94±0.14 5.67±0.06 3.28±0.13 4.15±0.11 3.86±0.12 5.35±0.06
Mức 3 4.04±0.15 2.14±0.07 4.26±0.15 5.19±0.14 4.49±0.21 5.29±0.14 3.47±0.07 3.56±0.08
Mức 4 3.13±0.07 3.02±0.12 4.36±0.17 5.19±0.12 3.43±0.14 4.32±0.13 5.10±0.13 3.15±0.07
Mức 5 2.81±0.05 4.32±0.14 4.58±0.19
Mức 6

3.09±0.09 3.58±0.09

Mức 7

2.29±0.10 2.33±0.08

3.49±0.12 3.58±0.09 2.32±0.08 1.29±0.05

3.3. Kết quả sàng lọc các yếu tố quan trọng
Ma trận Plackett-Burman thu được hoạt
tính enzyme từ 0.66 – 7.12 (UI/g) (Bảng 7). Giá
trị ảnh hưởng của từng yếu tố lên khả năng sinh
tổng hợp enzyme được tính toán bằng phần mềm
Statgraphics Centurion (đồ thị 4.20).Yếu tố nào có
giá trị ảnh hưởng dương hoặc âm lớn nhất sẽ ảnh
hưởng tới hoạt tính enzyme Trichoderma sinh ra.
Năm yếu tố có giá trị ảnh hưởng lớn sẽ ảnh hưởng
tới khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase là: độ
ẩm, D-glucose, pH, tỷ lệ giống, ammonium
sulphate. Căn cứ hệ số ảnh hưởng, chúng tôi thấy
rằng tỷ lệ giống có tác động mạnh nhất đến khả
năng sinh tổng hợp enzyme cellulase (65.16), tiếp

Bảng 7. Kết quả sàng lọc các yếu tố
Thứ tự
Hoạt tính (UI/g)
TN
Thực nghiệm
Mô hình
1

7.12

7.25

2

2.68

2.96

3

3.58

3.23

4

0.66

0.62

5

1.16

1.29

6

2.34

2.38

7

1.10

1.46

8

6.02

5.98

9

2.79

2.52

10

4.45

4.33

11

3.49

3.76

12

2.80

2.45


đến là độ ẩm (45.71), ammonium sulphate (37.78), D-glucose (16.67) và cuối cùng là pH (10.6).
Các yếu tố nhiệt độ (2.78), peptone (1.99) và lactose (1.33) có ảnh hưởng không đáng kể đến
khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của Trichoderma.
Chúng tôi chọn độ ẩm, D-glucose, pH, ammonium sulphate và tỷ lệ giống là những yếu tố
ảnh hưởng mạnh nhất đến khả năng sinh tổng
hợp
enzyme cho thiết kế thí nghiệm RSM-CCD.
Mức độ Độ tin
Tên
yếu8.Mức
tố độ ảnh hưởng và độ tin cậy
Bảng
ảnh hưởng cậy

3.4. Tối ưu hóa giá trị các yếu tố

Lactose

1.33

0.3319b

D-Glucose

16.67

0.0266a

Pepton

1.99

0.2532b

Sau khi sàng lọc các yếu tố chính ảnh
39.78
0.0081a
Ammonium sulphate
hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme
cellulase, chúng tôi tiến hành tối ưu hóa giá trị
các
65.16
0.004a
Tỷ lệ giống
yếu tố ảnh hưởng theo RSM-CCD, xử lý bằng
phần
45.71
0.0066a được
mềm StatGraphics Centurion. Hàm đáp ứng
Độ ẩm
Đồlàthịhoạt
1.Mức
ảnh hưởng
lựa chọn
tínhđộenzyme
(Y),của
X1các
, X2yếu
, X3tố
,
X4,
2.78
0.1943b
Nhiệt độ
X5 lần lượt là pH, độ ẩm, tỷ lệ giống, hàm
lượng D-glucose, hàm lượng ammonium
10.6
0.0473a
pH
sulphate (NH4)2SO4.Sau khi phân tích phương
sai
(ANOVA) phương trình hồi quy được dùng như là một mô hình để tiên đoán hoạt tính enzyme
cellulase sinh ra.
Bảng phân tích (ANOVA) phân tích từng thành phần riêng biệt và tương tác giữa các yếu
tố.Sau đó kiểm tra ý nghĩa thống kê của từng yếu tố. Trong trường hợp này có 11 yếu tố (yếu tố
(a)
) có độ tin cậy nhỏ hơn 0.05, cho thấy rằng có sự sai khác đáng kể với mức độ tin cậy là 95%.
Các yếu tố nào có p>0.05 sẽ bị loại ra khỏi phương trình hồi quy. Phương trình hồi quy có
dạng:
Y= 5.2768 - 0.298192 X5 + 0.330013 X1 - 0.439467 X32 + 0.426711 X3 X5 + 0.273125 X3
X4 - 0.478048 X1 X3 - 0.592205 X22- 0.58372 X52- 0.341008 X4 X5 - 0.461741 X42 - 0.591569 X12
Bảng 9. Mức độ ảnh hưởng và độ tin cậy của các yếu tố tối ưu
Tên yếu tố

Mức độ ảnh
hưởng

Độ tin cậy

Tên yếu tố

Mức độ ảnh
hưởng

Độ tin cậy

X3

0.72

0.4204b

X2X2

69.44

0.0000a

X2

0.14

0.7188b

X2X5

0.34

0.5749b

X5

17.22

0.0032a

X2X4

5.28

0.0506b

X4

5.4

0.0486b

X1X2

0.86

0.3811b

X1

21.1

0.0018a

X5X5

67.47

0.0000a

X3X3

38.24

0.0003a

X4X5

15.02

0.0047a

X2X3

2.01

0.1944b

X1X5

0.26

0.6207b

X3X5

23.51

0.0013a

X4X4

42.22

0.0002a

X3X4

9.63

0.0146a

X1X4

0.49

0.5050b

X1X3

29.51

0.0006a

X1X1

69.29

0.0000a


Hệ số hồi quy (R2) tính được là 0.972545. Điều này thể hiện rằng có 97.2547% số liệu thực
nghiệm tương thích với số liệu tiên đoán theo mô hình. Giá trị R 2> 0.75 thể hiện mô hình tương
thích với thực nghiệm có nghĩa là sự tương quan rất chặt chẽ giữa các yếu tố thí nghiệm và hoạt
tính sinh ra.
Phương trình hồi quy tìm được cho thấy cả 5 yếu tố pH, độ ẩm, tỷ lệ giống, D-glucose và
ammonium sulphate đều ảnh hưởng đến khả năng sinh sinh tổng hợp enzyme cellulase của nấm
T. harzianum.
Trong đó:
pH ban đầu của môi trường tỷ lệ thuận với hàm mục tiêu Y theo dạng hàm bậc một với cơ
số dương và tỷ lệ nghịch theo hàm hai với cơ số âm. Mức độ ảnh hưởng theo hàm bậc một
(21.1), hàm bậc hai (69.29). Điều này cho thấy pH lựa chọn chưa thích hợp cho sự tăng trưởng
và phát triển của nấm mốc. Dựa vào kết quả xác định tọa độ điểm tối ưu thì pH thích hợp là
5.25. Lý giải cho điều này là do trong quá trình sinh trưởng của chúng đã làm tăng pH môi
trường, cộng với sự tương tác và ảnh hưởng lẫn nhau của các yếu tố đã làm thay đổi pH môi
trường. Từ điểu này cho thấy khoảng pH thích hợp cho sự sinh tổng hợp enzyme của chủng T.
harzianum là từ 5.0-5.5.
Độ ẩm ban đầu của môi trường tỷ lệ nghịch với hàm mục tiêu Y theo dạng hàm bậc hai với
cơ số âm. Mức độ ảnh hưởng theo hàm bậc hai (69.44). Điều này cho thấy độ ẩm có tác động ức
chế lại tốc độ tăng trưởng và khả năng sinh tổng hợp enzyme của nấm mốc. Có thể giải thích
như sau: nấm Trichoderma là vi sinh vật hiếu khí, nên trong quá trình tăng trưởng, chúng tiêu
thụ oxy phục vụ cho quá trình hô hấp của tế bào. Quá trình hô hấp của tế bào được bắt đầu từ
đường phân, kế đến là chu trình CREP và cuối cùng là chuỗi vận chuyển electron. Trong quá
trình đó, các phân tử cacbonhydrate bị phân giải đến CO2 và nước, đồng thời năng lượng được
giải phóng dưới dạng ATP và nhiệt năng [11].
C6H12O6 + 6O2 -> 6CO2 + 6H2O + năng lượng (ATP + nhiệt)
Do trong quá trình hô hấp có tạo ra nhiệt năng và nước, nên khi quan sát quá trình tăng
trưởng của nấm mốc, chúng tôi nhận thấy môi trường nóng dần lên và có nhiều giọt nước bám
trên thành bình. Điều này sẽ làm thay đổi độ ẩm môi trường, cụ thể sẽ làm tăng độ ẩm, làm cho
độ ẩm không được ổn định gây ức chế lại sự tăng trưởng và phát triển của nấm mốc.
Tỷ lệ giống tỷ lệ nghịch với hàm mục tiêu Y theo dạng hàm bậc hai với cơ số âm. Mức độ
ảnh hưởng theo hàm bậc hai (38.24). Dựa vào kết quả xác định tọa độ điểm tối ưu thì tỷ lệ giống
thích hợp là 0.55%.Từ kết quả này cho thấy, tỷ lệ giống có tác động mạnh đến khả năng sinh
tổng hợp enzyem của nấm. Mật độ giống quá dày sẽ xảy ra tình trạng cạnh tranh dinh dưỡng
trong quá trình tăng trưởng, do đó sẽ hạn chế sự tăng trưởng và khả năng sinh tổng hợp enzyme
của nấm mốc. Vì vậy, cần điều chỉnh lại tỷ lệ giống sao cho phù hợp, để đảm bảo sự tăng trưởng
và phát triển của nấm mốc.
Hàm lượng carbon (D-glucose) bổ sung vào môi trường tỷ lệ nghịch với hàm mục tiêu Y
theo dạng hàm bậc hai với cơ số âm. Mức độ ảnh hưởng theo hàm bậc hai (42.22). Dựa vào kết
quả xác định tọa độ điểm tối ưu thì hàm lượng D-glucose thích hợp là 0.44%. Điều này cho thấy
hàm lượng đường D-glucose bổ sung vào môi trường chưa phù hợp, vì thế đã có tác động ức chế
lại sự sinh tổng hợp enzyme của nấm mốc. Hàm lượng D-glucose bổ sung vào trong môi trường
chưa đủ cho sự phát triển và sinh tổng hợp enzyme, ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình hình thành
sợi nấm trong sự phát triển và các đại phân tử trong sự sinh tổng hợp enzyme.
Hàm lượng nitơ (ammonium sulphate (NH4)2SO4) bổ sung vào môi trường tỷ lệ nghịch với
hàm mục tiêu Y theo dạng hàm bậc hai cơ số âm. Mức độ ảnh hưởng theo hàm bậc hai (67.47).


Dựa vào kết quả xác định tọa độ điểm tối ưu thì hàm lượng ammonium sulphate thích hợp là
0.9%. Điều này cho thấy hàm lượng ammonium sulphate bổ sung vào môi trường chưa phù hợp,
vì thế đã có tác động ức chế lại sự sinh tổng hợp enzyme của nấm mốc. Như đã giải thích bên
trên thì nếu tăng hàm lượng cơ chất vượt
quá một giới hạn nhất định thì hoạt tính
enzyme sẽ giảm do 2 nguyên nhân: thứ
nhất cơ chất nhiều sẽ tạo áp lực làm giảm
quá trình sinh tổng hợp enzyme, thứ hai cơ
chất tăng trong khi năng lực tiết tối đa
không đổi làm hoạt tính enzyme giảm.
Điều này làm cho sự tăng trưởng của nấm
mốc bị giảm.
Với những ứng dụng hiện nay của
Trichoderma trong nông nghiệp thì việc
tạo ra chủng có khả năng sinh tổng hợp
enzyme cao, thời gian tăng trưởng ngắn và kinh tế là vấn đề đã và đang được nghiên cứu rộng
rãi.Với những kết quả tiền đề này, chúng tôi sẽ tiếp tục nghiên cứu để tìm ra những điều kiện tối
ưu nhất và hiệu quả nhất.
4. KẾT LUẬN

Biểu đồ 2. Mặt đáp ứng của hoạt tính theo
tỷ lệ giống – độ ẩm

Từ 8 yếu tố ban đầu tỷ lệ giống, nhiệt độ, độ ẩm, pH, D-glucose, lactose, pepton,
(NH4)2SO4, chúng tôi đã sàng lọc và chọn được 5 yếu tố: pH là 5.25; độ ẩm là 60.68%; tỷ lệ
giống là 0.55%; D-glucose là 0.44% và (NH4)2SO4 là 0.9%. Hoạt tính enzyme cellulase cực đại
dự đoán theo mô hình là 5.47 UI/g.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Christian P. Kubicek and Gary E. Harman – Trichoderma and Gliocladium, Taylor & Francis
Ltd, 1998, pp. 278.
[2] Plackett RL Burman JP – The design of optimum multifactorial experiment, Biometrika,
1946, 37, pp. 305-325.
[3] Trần Thị Thanh Thuần và Nguyễn Đức Lượng – Nghiên cứu enzyme cellulase và pectinase
từ chủng Trichoderma viride và Aspergillus niger nhằm xử lý nhanh vỏ cà phê, Sciense &
technology development, 12, 13 (2009) 50-56.
[4] Laurent P.L Buchon, J.F.G Michel, N.Orange – Production of pectate lyase and cellulase by
Chyrseomonas luteola strain MFCL0 depends on the growth temperature and the nature of
the culture medium: evidence for two critical temperature, App.And Env. Micro, 66 (2000)
1538-1543.
[5] Nguyễn Đức Lượng, Cao Cường – Thí nghiệm công nghệ sinh học, tập 1 – Thí nghiệm hóa
sinh học, Đại học Quốc gia Tp.HCM
[6] Sibtain Ahmed Syeda Sana Imdad, Amer Jamil – Comparative study for the kinetics of
extracellular xylanases from Trichoderma harzianum and Chaetomium
thermophilum,Electronic Journal of Biotechnology, 15, 3 (2012) 1-8.
[7] Kredics.L,Manczinger L. Z. Antal, Z. Pe´Nzes, A. Szekeres, F. Kevei and E. Nagy – Invitro
water activity and pH dependence of mycelial growth and extracellular enzyme activities of


Trichoderma strains with biocontrol potential, Journal of Applied Microbiology, 96 (2004)
491–498.
[8] Ikram-Ul-Haq Kiran Shahzadi, Uzma Hameed, Muhammad Mohsin Javed and M.A Qadeer –
Solid State Fermentation of cellulase by locally isolated Trichoderma harzianum for
exploitation of agricultural byproducts, Pakistan Journal of biological sciences, 9, 9(2006)
1779-1782.
[9] Kannan Neethu, Rubeena M., S. Sajith, S. Sreedevi, Prakasan Priji, K. N. Unni, M. K. Sarath
Josh, V. N. Jisha, S. Pradeep, Sailas Benjamin – A novelstrain of Trichoderma viride shows
complete lignocellulolytic activities, Advances in Bioscience and Biotechnology, 3 (2012)
1160-1166.
[10] Rubeena M., Kannan Neethu, S. Sajith, S. Sreedevi, Prakasan Priji, K. N. Unni, M. K.
Sarath Josh, V. N. Jisha, S. Pradeep, Sailas Benjamin – Lignocellulolytic activities of a novel
strain of Trichoderma harzianum,Advances in Bioscience and Biotechnology, 4 (2013) 214221.
[11] Bùi Trang Việt – Sinh học tế bào, Đại Học Quốc Gia TpHCM (2005) tr. 434.



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×

×