Tải bản đầy đủ

NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG QUY TRÌNH bảo QUẢN LẠNH VAN TIM TRÊN THỰC NGHIỆM

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

MẦU VĂN CẢNH

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG QUY TRÌNH BẢO QUẢN LẠNH VAN
TIM TRÊN THỰC NGHIỆM

LUẬN VĂN THẠC SỸ

HÀ NỘI – 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

MẦU VĂN CẢNH

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG QUY TRÌNH BẢO QUẢN LẠNH VAN
TIM TRÊN THỰC NGHIỆM


Chuyên ngành:
Mã số:

LUẬN VĂN THẠC SỸ

Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS Ngô Duy Thìn
2. PGS.TS Nguyễn Lai Thành

HÀ NỘI – 2017


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ..................................................................................................1
Chương 1: TỔNG QUAN...............................................................................3
1.1. Bảo quản lạnh sâu van tim, mạch máu..................................................3
1.1.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến mô, tế bào trong quá trình bảo quản lạnh....3
1.1.2. Phương pháp bảo quản lạnh van tim, mạch máu.............................5
1.2. Quy trình bảo quản lạnh sâu mô van tim trên thực nghiệm tại Labo
công nghệ mô ghép - Đại học Y Hà Nội...............................................8
1.2.1. Mổ lấy tim lợn.................................................................................8
1.2.2. Phẫu tích lấy van tim.......................................................................8
1.2.3. Quy trình xử lý và bảo quản lạnh sâu van tim.................................9
1.3. Giải phẫu, mô học van tim và khả năng thải ghép...............................10
1.3.1. Cấu trúc đại thể.............................................................................10
1.3.2. Cấu trúc hiển vi.............................................................................14
1.3.3 Khả năng thải ghép của mô van tim...............................................20
1.4. Khả năng sống của tế bào mô van tim.................................................21
1.4.1. Khả năng sống của nguyên bào sợi...............................................21
1.4.2. Khả năng sống của tế bào nội mô.................................................23
1.5. Tình hình nghiên cứu bảo quản van tim trên thế giới và ở Việt Nam. .26
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..............28
2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu.......................................28
2.2. Phương pháp nghiên cứu......................................................................28
2.2.1. Phân nhóm nghiên cứu..................................................................28
2.2.2. Mô hình nghiên cứu......................................................................29
2.2.3. Cách thức tiến hành.......................................................................29
2.2.4 Đánh giá kết quả.............................................................................32
2.2.5. Đạo đức trong nghiên cứu.............................................................35


CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ...............................................................................36
3.1 Kết quả nghiên cứu ứng dụng qui trình bảo quản van tim trên thực
nghiệm.................................................................................................36
3.1.1. Kết quả lấy mẫu nghiên cứu..........................................................36
3.1.2 Kết quả thực hiện qui trình kiểm tra vi khuẩn van tim ngay sau khi lấy...38
3.1.3. Kết quả thực hiện qui trình xử lý trước khi bảo quản lạnh...........38
3.1.4. Kết quả thực hiện qui trình bảo quản lạnh....................................39
3.2. Kết quả đánh giá chất lượng van tim sau bảo quản..............................40
3.2.1. Kết quản xét nghiệm vi sinh..........................................................40
3.2.2. Hình thái đại thể............................................................................41
3.2.3. Hình thái vi thể mô van tim các nhóm bảo quản...........................42
3.2.4. Hình thái siêu vi thể......................................................................45
3.2.5. Chất lượng sống tế bào mô van tim...............................................47
Chương 4: BÀN LUẬN.................................................................................48
4.1. Bàn luận về kết quả thực hiện quy trình xử lý và bảo quản mô van tim....48
4.1.1. Lấy và xử lý van tim trước bảo quản............................................48
4.1.2. Phương pháp bảo quản..................................................................53
4.2. Chất lượng van tim sau bảo quản.........................................................54
4.2.1. Chất lượng mô van tim sau bảo quản...............................................54
4.2.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng mô van tim sau bảo quản. 60
KẾT LUẬN....................................................................................................64
KHUYẾN NGHỊ............................................................................................65
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
CPA

: Cryoprotectant agents /Chất bảo vệ lạnh.

DMEM

: Dulbecco’s modified Eagle’s medium.

DMSO

: Dimethylsulphoxide.

FBS

: Fetal bovine serum / Huyết thanh bào thai bò.

H.E

: Hematoxyline Eosin.

M199

: Medium 199/ Môi trường 199

RPMI-1640

: Roswell Park Memorial Institute medium 1640

TEM

: Transmission electron microscopy/ Hiển vi điện tử xuyên


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Kết quả thực hiện qui trình lấy mô van tim trên lợn ......................37
Bảng 3.2 Kết quả thực hiện qui trình kiểm tra vi khuẩn ...............................38
Bảng 3.3. Kết quả thực hiện qui trình xử lý trước khi bảo quản................... 39
Bảng 3.4. Kết quả thực hiện qui trình xử lý trước khi bảo quản ...................39
Bảng 3.5. Kết quả thực hiện qui trình rã đông sau bảo quản......................... 39
Bảng 3.6. Kết quả cấy khuẩn các mẫu van tim bảo quản trong các bước lấy
tim, xử lý van tim và bảo quản. ......................................................40
Bảng 3.7. Kết quả cấy nấm các mẫu van tim bảo quản trong các công đoạn lấy
tim, xử lý van tim và bảo quản. ......................................................40
Bảng 3.8. Tổng hợp kết quả quan sát cấu trúc đại thể van tim của các nhóm
nghiên cứu...................................................................................... 41
Bảng 3.9: Tổng hợp kết quả quan sát cấu trúc vi thể van tim của các nhóm
nghiên cứu trên tiêu bản nhuộm H.E và nhuộm Masson. ..............44
Bảng 3.10: Kết quả tỷ lệ sống của nguyên bào sợi mô van tim ở các nhóm
bảo quản lạnh sâu........................................................................... 47


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Sơ đồ biểu thị các nguyên nhân gây chết tế bào trong quá trình bảo
quản lạnh........................................................................................ 4
Hình 1.2. Cơ chế vật lí về sự biến đổi của tế bào tại các mức nhiệt độ khác
nhau trong bảo quản lạnh............................................................... 5
Hình 1.3: Các loại chất bảo vệ lạnh và tỷ lệ sống của tế bào sau rã đông 0 giờ
và 72 giờ......................................................................................... 7
Hình 1.4: Hệ thống các van tim.......................................................................10
Hình 1.5: Hình vẽ lá van tim cắt dọc ..............................................................14
Hình 1.6: (a) Cắt dọc gốc động mạch chủ từ lá van đến tâm nhĩ. (b) Hình ảnh
phóng to 3 lớp. F: lớp sợi; S: lớp xốp lamina; R: lớp gốc.............14
Hình 1.7: Hình ảnh sợi collagen và sợi chun của lá van động mạch chủ trên
kính hiển vi quang học (A) và hiển vi điện tử quét (B)............... 15
Hình 1.8. Hình ảnh tiêu bản nhuộm H-E các lớp lá van tim ..........................16
Hình 1.9: Hình ảnh nhuộm hóa mô miễn dịch của mô van động mạch chủ với
kháng thể của tế bào cơ trơn alpha-actin. Các mũi tên chỉ các sợi
cơ.................................................................................................. 20
Hình 2.1 Sơ đồ mô hình nghiên cứu ...............................................................29
Hình 2.2: Lấy một trong ba lá van làm mẫu nghiên cứu ................................30
Hình 2.3: Sơ đồ lấy mẫu van tim nghiên cứu .................................................30
Hình 3.1: Hình ảnh đại thể mô van tim trước bảo quản và sau bảo quản lạnh ...41
Hình 3.2: Hình ảnh vi thể mô van tim sau bảo quản 3 tháng trong môi trường
có FBS. .........................................................................................42
Hình 3.3: Hình ảnh vi thể mô van tim sau bảo quản 6 tháng .........................43
Hình 3.4: Hình ảnh hiển vi điện tử xuyên mô van tim sau bảo quản 3 tháng. 45
Hình 3.5: Hình ảnh hiển vi điện tử xuyên mô van tim sau bảo quản 6 tháng.......... 46
Hình 3.6. Sợi collagen mô van tim bảo quản lạnh 3 tháng. ..........................46
Hình 3.7: Hình ảnh nhuộm Trypan Blue nguyên bào sợi mô van tim trước và
sau bảo quản................................................................................. 47


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Các bệnh lý về tim mạch, trong đó có bệnh về van tim đang gia tăng trên
thế giới. Mỗi năm có gần 300.000 người cần thay van tim, dự báo lên tới
850.000 người trước năm 2050 [1]. Có 2 loại van tim được sử dụng thay thế
van bệnh lý hiện nay đó là: van cơ học và van sinh học bao gồm: van nhân tạo
sinh học từ động vật và van đồng loài (homograft). Thực tế, van sinh học được
ưu tiên sử dụng ở các trung tâm phẫu thuật tim mạch trên thế giới [2]. Ví dụ tại
Đức, năm 2008 trong tổng số 12000 bệnh nhân có tới 78% bệnh nhân ghép van
sinh học, 21% là ghép van cơ học và chỉ 1% van được sửa[3].
Van nhân tạo sinh học có nguồn gốc từ động vật như lợn, bò..., đã qua
các khâu xử lý, có ưu điểm là ít phải sử dụng thuốc chống đông, nhưng lại có
thời gian sử dụng rất ngắn, chỉ khoảng 6-8 năm ở người trẻ tuổi. Để giải quyết
tình trạng này, nhiều nhà khoa học đã sử dụng van tim từ người cho chết não,
còn tế bào sống để ghép đồng loài. Trong giai đoạn đầu là kỹ thuật ghép van
tim tươi – tức là lấy van + bảo quản tươi + sử dụng trong vòng 2 tuần. Tuy
nhiên, việc lấy và ghép van tim tươi từ người cho chết não thường bị động, mô
van tim chỉ sống được trong một thời gian rất ngắn. Vì vậy việc chuẩn bị bệnh
nhân để ghép phải hết sức khẩn trương. Trong nhiều trường hợp kích thước van
tim của người cho và người nhận không phù hợp. Để khắc phục hiện tượng
này, nhằm chủ động được nguồn cho và nguồn nhận, nhiều nhà khoa học trên
thế giới đã nghiên cứu quy trình bảo quản van tim phục vụ cấy ghép đồng loài.
Việc bảo quản van tim, mạch máu nhằm giúp cho các bác sỹ lâm sàng luôn có
được nguồn van tim dự trữ với để có thể sử dụng một cách chủ động và phù
hợp với kích cỡ, chủng loại của từng bệnh nhân cần thay thế. Van tim lấy từ
đồng loài vừa không cần dùng thuốc chống đông, lại có thể sử dụng được tới
trên 20 năm mới thoái hóa, có ưu thế vượt trội các van tim nhân tạo khác.


2

Trên thế giới hiện có nhiều qui trình bảo quản van tim, mạch máu với nhiều mục
đích khác nhau. Để có thể sử dụng trên lâm sàng, van tim sau bảo quản lạnh cần
phải đảm bảo yêu cầu không biến đổi cấu trúc hình thái cũng như khả năng
sống của tế bào. Nhằm nghiên cứu, ứng dụng qui trình bảo quản lạnh van tim và
đánh giá hiệu quả của nó thông qua chất lượng van tim sau bảo quản, chúng tôi
tiến hành đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng quy trình bảo quản lạnh van tim
trên thực nghiệm” với hai tiêu:
1. Nghiên cứu ứng dụng quy trình bảo quản lạnh van tim trên thực nghiệm.
2. Bước đầu đánh giá chất lượng mô van tim lợn sau bảo quản lạnh sâu.
Đây là một phần của đề tài cấp Bộ y tế đã phê duyệt : “Nghiên cứu xây dựng
quy trình lấy, bảo quản và ghép van tim đồng loại”.


3

Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Bảo quản lạnh sâu van tim, mạch máu[50]
Bảo quản lạnh sâu mô, tế bào là đưa chúng vào trạng thái đông lạnh
trong một thời gian dài. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng mọi chuyển hóa đều
ngừng lại khi mô, tế bào ở điều kiện nhiệt độ rất thấp. Tại điều kiện này, mọi
enzym phân hủy protein đều bất hoạt, do đó mô, tế bào không bị phá hủy. Ở
âm 196 độ C (nhiệt độ của ni tơ lỏng), mọi phản ứng đều không thể xảy ra,
các hoạt động bên trong tế bào đều ngừng lại. Có nhiều khái niệm về bảo
quản lạnh sâu, tuy nhiên đa phần đều lấy mốc dưới - 40 độ C.
1.1.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến mô, tế bào trong quá trình bảo quản lạnh
Trong quá trình bảo quản lạnh, hai yếu tố dẫn đến tổn thương và gây
chết tế bào:
-

Yếu tố vật lí: các tinh thể đá với nhiều góc cạnh có thể đâm trực

tiếp bào màng tế bào. Sự mất nước trong và ngoài tế bào làm cho tế bào co
nhỏ, lắng đọng các chất hòa tan.
-

Yếu tố sinh học: tế bào không được nuôi dưỡng khi đã ra khỏi cơ


4

thể.
Hình 1.1. Sơ đồ biểu thị các nguyên nhân gây chết tế bào trong quá trình
bảo quản lạnh
Về cơ chế vật lí, tại -10 độ C màng tế bào bắt đầu thay đổi, nước từ
trong tế bào thoát ra khoảng gian bào. Ở khoảng nhiệt độ từ -10 độ C đến -30
độ C, nếu tốc độ làm mát tế bào diễn ra chậm (theo các nghiên cứu là khoảng
0,15-1.70C/phút) nước thoát ra khoảng gian bào nhiều do tăng áp lực thẩm
thấu, tế bào mất nước rất nặng, dẫn đến kích thước tế bào giảm đi và lúc này
các tinh thể đá được hình thành ở khoảng gian bào.
Nếu tốc độ làm lạnh tế bào đủ chậm, khoảng 1 độ C/phút, tế bào cũng
mất nước nhưng không quá nhanh, thể tích tế bào cũng giảm đi nhưng ít hơn.
Và để giữ được thể tích của tế bào cần phải cho thêm các chất bảo vệ lạnh.
Nếu tốc độ làm lạnh nhanh (5- 10 độ /phút hoặc hơn), nước bên trong tế
bào không bị mất đi nhanh, mà bị giữ lại trong tế bào, dẫn đến hình thành các
tinh thể đá ở cả trong và ngoài tế bào (hình 1.2). Như vậy, muốn duy trì thể
tích tế bào cũng như tránh hình thành tinh thể đá cả trong và ngoài tế bào cần


5

có một tốc độ làm lạnh hợp lí, không quá nhanh và không quá chậm và phù
hợp với từng loại mô gọi là hạ nhiệt độ theo chương trình. Hiện có khá nhiều
chương trình hạ nhiệt độ đang áp dụng trên thế giới cho từng loại mô, tế bào.

Hình 1.2. Cơ chế vật lí về sự biến đổi của tế bào tại các mức nhiệt độ khác
nhau trong bảo quản lạnh.
1.1.2. Phương pháp bảo quản lạnh van tim, mạch máu (các mô giàu
collagen nói chung)
Căn cứ vào các yếu tố ảnh hưởng đến mô trong quá trình bảo quản (các
tinh thể đá gây tổn thương, nước thoát ra ngoài làm tế bào mất nước, lắng
đọng các chât hòa tan, thiếu dinh dưỡng) để duy trì cấu trúc mô và giữ cho tế
bào sống, cần tác động vào ba yếu tố trên:
+ Hạn chế sự hình thành các tinh thể đá, tác nhân gây tổn thương tế bào.
+ Hạn chế sự mất nước, gây lắng đọng các chất hòa tan trong tế bào.
+ Cung cấp các chất dinh dưỡng nuôi tế bào
Để khắc phục nguyên nhân hình thành tinh thể đá và mất nước trong tế
bào, người ta cho vào dung dịch bảo quản chất bảo vệ lạnh (cryoprotectant) vì
người ta thấy rằng bình thường, các phân tử nước phân bố đều khắp trong mô,
khi nhiệt độ hạ thấp, chúng thường tập trung lại với nhau để tạo thành các tinh


6

thể đá. Nhiệt độ càng thấp, tinh thể đá càng to. Khi cho chất bảo vệ lạnh
người ta thấy khi nhiệt độ xuống thấp, kể cả rất thấp, các phân tử nước cũng
không tập trung lại với nhau nên không thể hình thành các tinh thể đá và cũng
giảm khả năng mất nước, lắng đọng chất hòa tan trong tế bào. Hiện nay có
nhiều chất bảo vệ lạnh khác nhau như glycerol, DMEM.
Ngoài chất bảo vệ lạnh, kỹ thuật làm lạnh thì giai đoạn rã đông cũng rất
quan trọng tránh tái hình thành tinh thể đá. Hiện phương pháp rã đông nhanh
đang được áp dụng phổ biến.
Cho đến nay có nhiều công trình nghiên cứu trên động vật và đánh giá
trên người về bảo quản lạnh van tim, mạch máu. Có thể tóm tắt các qui trình
đó gồm các bước sau:
a.

Khử trùng:

Hiện tại, phương pháp khử trùng phổ biến là ngâm trong dung dịch
chứa kháng sinh và môi trường dinh dưỡng. Dung dịch này gồm hai thành
phần: diệt khuẩn và nuôi dưỡng tế bào.
b. Làm lạnh:
Đây là giai đoạn hạ nhiệt độ ban đầu rất quan trọng. Qui trình này
thường tiến hành bằng thiết bị hạ nhiệt độ theo chương trình có kiểm soát.
Thông thường tốc độ hạ nhiệt độ 1 độ C/ phút nhằm hạn chế tối đa sự hình
thành tinh thể đá để không gây tổn thương tế bào, mô, đảm bảo khả năng sống
cao nhất cho tế bào, đặc biệt là nguyên bào sợi – nguồn sản xuất chính
collagen.
Trước khi hạ nhiệt độ, mô van tim phải được xử lí loại bỏ hết dung dịch
ban đầu, thay vào đó là dung dịch có thêm chất bảo vệ lạnh (cryoprotectant)
như glycerol, dimethyl sulfoxide. Hiện nay có nhiều chất bảo vệ lạnh được sử
dụng trên thế giới với tỷ lệ sống của tế bào sau rã đông khác nhau (hình 1.3).


7

Hình 1.3: Các loại chất bảo vệ lạnh và tỷ lệ sống của tế bào sau rã đông 0
giờ và 72 giờ
c.Bảo quản dài ngày
Sau khi mô van tim được làm lạnh theo chương trình sẽ được chuyển
vào môi trường lưu giữ dài ngày chờ sử dụng trên lâm sàng. Nhiệt độ bảo
quản dài ngày có thể dao động từ -85 độ C bằng máy lạnh cơ học hoặc -135
độ C trong hơi ni tơ lỏng hoặc trong ni tơ lỏng -196 độ C tùy thuộc vào thời
gian bảo quản và điều kiện kinh tế.
d. Rã đông
Rã đông cũng là một giai đoạn quan trọng để tránh tái xuất hiện tinh thể
đá. Thông thường các mô sau bảo quản cần tế bào sống thường áp dụng
phương pháp rã đông nhanh. Thời gian rã đông phụ thuộc vào kích thước mô
và dung dịch bảo quản chứa mô, nếu túi đựng van động mạch chủ hoặc động
mạch phổi kèm dung dịch có khối lượng 100ml, thời gian rã đông khoảng 1215 phút trong môi trường nước 37 độ C.
Yêu cầu của mô sau bảo quản lạnh:
- Về mặt sinh học: phải còn tế bào sống, trong đó chú ý đến nguyên bào
sợi - nguồn sản sinh collagen đầy đủ chủng loại, kích thước - thành phần


8

chính của các mô van tim, mạch máu và là yếu tố quyết định khả năng hoạt
động của các cơ quan này.
- Về mặt cơ học: Không biến đổi cấu trúc, giữ được độ bền.
1.2. Quy trình bảo quản lạnh sâu mô van tim trên thực nghiệm tại Labo
công nghệ mô ghép - Đại học Y Hà Nội.
1.2.1. Mổ lấy tim lợn
Thời gian lấy van tim được giới hạn trong thời gian thiếu máu nóng,
tương đương thời gian chết não trên người. Các công đoạn bộc lộ tim, bộc lộ
và phẫu tích các mạch máu lớn, cắt các cuống mạch của tim và cuối cùng là
lấy tim ra khỏi lồng ngực và đóng gói. Các bước trên phải thực hiện trong
điều kiện vô trùng. Đóng gói tim trong dung dịch lạnh, đẳng trương, vô trùng,
bọc hai lần túi và đặt vào một hộp nhựa có nước đá được thiết kế đặc biệt cho
việc giữ, bảo quản và vận chuyển về lab bảo quản. Thời gian bảo quản theo
cách này có thể kéo dài từ 4 - 6 tiếng.
1.2.2. Phẫu tích lấy van tim
Quá trình phẫu tích lấy van tim được đảm bảo đầy đủ qui định vô trùng
như trong một cuộc mổ. Trong quá trình phẫu tích, tim được giữ lạnh (110oC) và ẩm để tránh bị khô và tổn thương các thành phần cấu tạo. Sau khi
van động mạch chủ được bộ lộ, cắt rời giải phóng động mạch chủ ra khỏi tim.
Loại bỏ hết cơ tâm nhĩ trái và lá sau van hai lá ra khỏi động mạch chủ. Để lại
lá trước van hai lá còn dính với gốc động mạch chủ. Thả vào dung dịch huyết
thanh mặn đẳng trương lạnh 4 oC. Cắt lọc, làm sạch mô liên kết, mô mỡ và cơ
tim khỏi động mạch chủ và động mạch phổi. Để lại một lớp cơ tim mỏng
2mm. Rửa sạch nhiều lần bằng dung dịch huyết thanh mặn đẳng trương, rồi
đo các kích thước cần thiết. Xét nghiệm vi sinh mẫu mô gửi cấy khuẩn, cấy
nấm. Đóng gói van tim trong dung dịch lạnh, đẳng trương, vô trùng, bọc hai


9

lần túi và đặt vào một hộp nhựa có dung dịch huyết thanh mặn đẳng trương
lạnh được thiết kế đặc biệt cho việc giữ, bảo quản và vận chuyển van tim.
1.2.3. Quy trình xử lý và bảo quản lạnh sâu van tim
1.2.3.1. Xử lý van tim trước bảo quản
Van tim được rửa nhiều lần bằng dung dịch nước muối đẳng trương.
Ngâm van trong dung dịch RPMI 1640 có bổ sung hỗn hợp kháng sinh
vancomycin 50 µg/ml, amikacin 100 µg/ml, amphotericin B 20 µg/ml ở 4oC
trong 24 tiếng, mức dịch đảm bảo ngập toàn bộ mô. Rửa lại mô bằng nước
muối đẳng trương lạnh vô khuẩn Đánh giá chất lượng van tim sau phẫu tích:
qua xét nghiệm vi sinh mẫu được cấy khuẩn, cấy nấm
1.2.3.2. Bảo quản lạnh sâu van tim
Van tim sau khi xử lý được thả vào dung dịch bảo quản lạnh. Dung dịch
được sử dụng là dung dịch có môi trường RPMI 1640 lạnh 4 oC, bổ sung hỗn
hợp kháng sinh penicilin 10.000UI/ml, streptomycin 10.000 µg/ml,
Amphotericin B 0.125 µg/ml và DMSO là chất bảo vệ lạnh, thêm 10% FBS.
Việc bổ sung DMSO vào dung dịch bảo quản lạnh được tiến hành qua 4 bước
với nồng độ tăng dần: 2,5%, 5%, 7,5%, 10%. Mỗi nồng độ lưu trong thời gian
5 phút. Tổng thời gian mô ủ với dung dịch bảo quản lạnh ở điều kiện 4 oC là
20 phút. Van tim được đóng gói 2 lớp túi vô trùng và đưa vào máy hạ nhiệt độ
theo chương trình. Tốc độ hạ nhiệt trung bình -1 oC/phút tới nhiệt độ của thiết
bị bảo quản. Bảo quản lâu dài tại -135 oC trong hơi nitơ lỏng.
2.2.4.4. Rã đông van tim
Quy trình rã đông được sử dụng là kỹ thuật rã đông nhanh. Mô bảo
quản lấy ra khỏi hơi nitơ được dìm trong bể nước được duy trì 37 oC cho tới
khi tan đá hoàn toàn.Mô sau khi đã rã đông sẽ được loại bỏ dung dịch bảo
quản lạnh chứa chất bảo vệ lạnh bằng cách rửa trong các dung dich có nồng
độ DMSO giảm dần (7,5%, 5%, 2,5% và 0 %). Mỗi nồng độ rửa trong 5 phút.
Tổng thời gian để loại bỏ DMSO là 20 phút.


10

1.3. Giải phẫu, mô học van tim và khả năng thải ghép
Mỗi quả tim có 4 van: van hai lá, van ba lá, van động mạch chủ và van
động mạch phổi (hình 1.4). Tuy nhiên trên thực tế lâm sàng thường chỉ chỉ sử
dụng các van động mạch chủ và động mạch phổi để ghép đồng loại (hình 1.5).
Cả hai van đều có đa số các cấu trúc giống nhau và có ít sự khác biệt về mô
học. Tuy nhiên, sự khác nhau về cơ học của cả hai van nên cũng có những
khác biệt rất nhỏ [11], van động mạch phổi được sử dụng thay thế cho van
động mạch chủ trong thủ thuật Ross [12]. Dưới đây chúng tôi xin trình bày
cấu trúc mô học của van động mạch chủ.

Hình 1.4: Hệ thống các van tim
1.3.1. Cấu trúc đại thể
Van động mạch chủ cùng với các đơn vị cấu trúc khác cấu tạo nên gốc
động mạch chủ. Nó là phần kết nối giữa tâm thất trái với động mạch chủ lên, ở vị
trí vòng van nhĩ thất phải, vòng van nhĩ thất trái và khối cơ tâm thất dày lồi ra


11

[14]. Van động mạch chủ bao gồm các cấu trúc: vòng van, mép van, tam giác gian
lá van (interleaflet triangles), xoang Valsalva, liên kết ống-xoang và các lá van.
1.3.1.1. Vòng van
Vòng van có dạng bán nguyệt, nơi các lá van gắn vào thành động mạch
chủ, vòng van tạo thành một cấu trúc tương tự như vương miện, cắt ngang
qua nơi giao nhau của tâm thất động mạch này[18, 19]. Tuy nhiên, vòng van
là một cấu trúc dạng sợi hoàn toàn gắn với trung gian của xoang động mạch
chủ ở phía xa, trong khi ở phía gần nó được gắn vào vách cơ và màng ở phía
trước (hình 1.8), tam giác sợi ở phía bên và dưới động mạch chủ ở phía sau.
Ba phần ở phía trên của vòng van được gọi là mép van.
1.3.1.2. Mép van
Mép van là nơi các chỏm của vòng van hình vương miện (vùng 2 lá van
gắn với thành động mạch chủ ở phía trên liên kết ống- xoang), ở vị trí phía
trên của 3 vùng tam giác (tam giác gian lá van).Ở vùng này, 2 lá van khớp
song song với thành động mạch chủ một đoạn ngắn.Mép van ở giữa lá có
động mạch vành phải và động mạch vành trái ở đằng trước và đối diện với
mép van tương ứng của van động mạch phổi.Mép van ở giữa lá van động
mạch vành phải và lá van không có động mạch vành nằm ở phía trước-phải và
một mép van nằm giữa lá van động mạch vành trái và van không chứa động
mạch vành thì thường ở vị phía sau-phải của gốc động mạch chủ.Mép van là
cấu trúc sợi và neo giữ các lá van.
1.3.1.3. Tam giác gian lá van
Ba vùng ở giữa ranh giới giải phẫu và đỉnh của vòng van hình vương
miện được gọi là tam giác gian lá van (inerleaflet triangles). Chúng là phần
phình ra, nơi dòng máu từ tâm thất đến và tiếp đến chỗ nối của xoang hình
ống ở vùng mép van [15]. Tam giác ở giữa xoang vành phải và xoang vành
trái đối diện với van động mạch phổi và đáy của nó nằm trên thành phần


12

đường ra của thất phải.Trường hợp van động mạch phổi đóng chặt chiếm 50
% số trường hợp do dây chằng van hình phễu. Tam giác nằm ở giữa xoang
động mạch vành phải và xoang không có động mạch vành giáp với nhĩ phải
và liên tiếp trực tiếp với phần gần của vách màng. Trong khu vực này, nơi hệ
thống dẫn truyền có mối quan hệ mật thiết với gốc động mạch chủ. Các nhánh
của bó His đến từ phía trước của nút nhĩ thất, đi xuyên qua phần xơ trung tâm
ở ngay dưới mép dưới của phần màng của vách liên thất, ở phần đỉnh của
phần cơ của vách liên thất dưới tam giác này. Cuối cùng, tam giác ở giữa
xoang vành trái và xoang không chứa động mạch vành thì liên tiếp trực tiếp
với phần thấp của van động mạch chủ và lá trước của van hai lá.Tam giác này
chia tách 3 xoang này trong một van bình thường.
1.3.1.4. Xoang Valsalva
Phía động mạch chủ của vòng van động mạch chủ bao gồm ba chỗ
phình gần như đối xứng.Chúng được giới hạn ở từ chỗ gắn của các lá van cho
đến liên kết ống-xoang.Ở phía đáy, hệ thông cơ tâm thất hợp nhất một phần,
thành của các xoang này bản thân nó là chủ yếu được cấu tạo từ thành động
mạch chủ, mặc dù nó mỏng hơn thành động mạch bình thường.Hai trong số
các xoang là chỗ đi ra của động mạch vành ở một vị trí đặc biệt và có ảnh
hưởng quan trọng tới dòng chảy của động mạch vành. Thông thường, các
xoang này được gọi tên theo lỗ động mạch vành: xoang động mạch vành phải,
xoang động mạch vành trái, xoang không có động mạch vành là xoang lớn
nhất trong đa số các trường hợp[20]. Lỗ ra của động mạch vành ở quả tim
bình thường có thể xuất hiện ở nhiều vị trí khác nhau [21].
1.3.1.5. Liên kết ống-xoang
Gờ ở phía trên cùng của xoang valsava (xoang động mạch chủ giới hạn
trong 3 lá van tổ chim) gọi là liên kết ống-xoang.Nó được xác định là điểm
chuyển tiếp từ gốc động mạch chủ đến động mạch chủ lên. Vị trí này cực kỳ


13

quan trọng bởi vì phình gốc động mạch chủ ở mức này đã được chứng minh
là nguyên nhân làm suy yếu khả năng chịu áp lực của động mạch chủ [22].
1.3.1.6. Các lá van
Van động mạch chủ có 3 lá van. Chúng cấu tạo bởi 4 phần: vùng bản lề,
phần bụng (belly), bề mặt lá van (coating surface), phần bờ ngoài có 1 cục
nhỏ gọi là cục của van bán nguyệt (Arantius). Cục Arantius ở chính giữa bờ tự
do bề mặt van. Phần hai bên còn lại và của cục Arantius là một cấu trúc hình
liềm mỏng gọi là “lannula”. Cấu trúc lannula này cấu tạo gồm mép mỏng ở
bờ tự do và tiếp nối với vùng nơi mà ba lá van gặp nhau và đóng chặt hoàn
toàn. Lannula gắn với thành của gốc động mạch chủ tại vùng mép van.Phần
chính của mỗi lá van là bụng van (belly).Tại vùng này các lá van hầu như
trong (mờ).Về mặt đại thể, sự sắp xếp điển hình của cấu trúc collagen của mỗi
lá van đã được xác định. Đặc điểm này phù hợp với sự khám phá của
Clarkand và cộng sự, họ đã thực hiện đo chiều dày lá van lúc lá van trùng và
lúc van căng [23, 24]. Họ chứng minh được chiều dày của van tim loài người
thay đổi trong khoảng 1.76-1.77 mm lúc van trùng, và 1.50-1.75mm lúc van
căng. Phần mà lá van gắn với vòng xơ của van có hình lưỡi liềm hay bán
nguyệt được gọi là vùng bản lề (hinge). Ở vùng này, lá van gắn với toàn bộ
cấu trúc hình tròn của thành động mạch chủ và khối tâm thất.Cấu trúc bó sợ
collagen khá dày của lá van được khớp nối với vòng xơ quanh van, mục đích
là truyền áp lực từ các lá van tới thành động mạch chủ. Nhìn vào kích thước
của lá van, lá van không có lỗ động mạch vành có vẻ rộng hơn các lá van có
lỗ động mạch vành trái và phải, mặc dù vậy hầu hết sự khác biệt này là không
đáng kể và chỉ mang tính chất thống kê [25-27].


14

1.3.2. Cấu trúc hiển vi
Lá van
Cơ tim
Thành xoang
Thân động mạch chủ

Lớp động mạch
Lớp sợi
Lớp xốp
Lớp thất

Hình 1.5: Hình vẽ lá van tim cắt dọc

Hình 1.6: (a) Cắt dọc gốc động mạch chủ từ lá van đến tâm nhĩ.
(b) Hình ảnh phóng to 3 lớp. F: lớp sợi; S: lớp xốp lamina; R: lớp gốc[49]
Mô van tim có cấu trúc vi thể là mô sợi, giàu collagen. Thành phần
chính gồm các sợi liên kết và tế bào liên kết, trong đó collagen đóng vai trò
chính, một ít sợi chun. Về tế bào, các nguyên bào sợi có vai trò rất quan trọng,


15

chúng như những nhà máy tạo ra các sợi collagen.Các tế bào nội mô lót bề
mặt các lá van.Vì vậy, trong quá trình bảo quản, việc giữ nguyên cấu trúc các
sợi collagen cũng như sự sống của nguyên bào sợi là rất quan trọng.
Sợi collgen tạo ra bộ khung của van tim, chiếm 50% khối lượng mô
van tim, tồn tại ở 2 dạng chủ yếu là collagen typ I chiếm 74%, collagen typ II
chiếm 24 %. Các sợi collagen sắp xếp song song với nhau, có khả năng co
giãn và biến đổi thích nghi với hoạt động chức năng của mô van tim trong kỳ
tâm thu cung như tâm trương (hình 1.10)

Hình 1.7: Hình ảnh sợi collagen và sợi chun của lá van động mạch chủ
trên kính hiển vi quang học (A) và hiển vi điện tử quét (B)
Sợi chun chiếm 13% khối lượng mô van tim, cùng với sợi collagen
tạo thành mạng lưới cấu trúc bền vững. Các sợi chun sắp xếp theo mọi
hướng khác nhau, giúp tăng sức bền và đàn hồi của mô van tim (hình
1.10). Các sợi chun giúp mô van tim giãn ra trong thời kỳ tâm thu và co
lại trong thời kỳ tâm trương.
Nguyên bào sợi là loại tế bào phổ biến và quan tọng nhất, chúng phân ố
đều khắp ở mô van tim (hình 1.11). Chúng có dạng hình thoi với nhiều nhánh
bào tương dài ngắn khác nhau. Nhân tế bào hình trứng, to và sáng màu, chất
nhiễm sắc mịn, hạt nhân rõ. Bào tương rất giàu lưới nội bào có hạt và bộ


16

Goolgi thể hiên khả năng tổng hợp protein rất mạnh, chủ yếu là collagen –
cấu trúc lên các sợi collagen.

Tế bào nội mô

Nguyên bào sợi

Hình 1.8. Hình ảnh tiêu bản nhuộm H-E các lớp lá van tim
Tế bào nội mô che phủ ở mặt ngoài lá van và các cấu trúc khác tạo
thành 1 lớp liên tục (hình 1.11). Chúng có dạng dẹt, phần chứa nhân phình ra
ở chính giữa. Bào tương chứa lưới nội bào có hạt, ít ty thể, nhiều không bào
vi ẩm. Màng bào tương chứa nhiều vết lõm siêu vi. Các tế bào lớp nội mô
không gắn liền với nhau, mà chúng chỉ tiếp xúc hoặc chờm lên nhau ở rìa tế
bào. Các tế bào nội mô có khả năng phân chia bằng gián phân hoặc trực phân,
và có chức năng tạo ra hệ thống ống để máu và bạch huyêt lưu thông. Thêm
nữa sự toàn vẹn của lớp tế bào nội mô giúp chống lại quá trình đông máu nội
sinh và sự lắng đọng cholesterol.
1.2.2.1. Vòng van
Các lá van động mạch chủ gắn với thành xoang valsava thông qua
mạng lưới giàu collagen có tên là vòng xơ của van [29]. Cắt qua cấu trúc này
ở xoang không có lỗ đổ động mạch vành, nơi không có cơ tim hỗ trợ cho
xoang, ta thấy có sự xuất hiện cấu trúc sụn. Vùng này các lớp cấu tạo nên lá


17

van có sự sắp xếp khá điển hình. Lớp tâm nhĩ và tâm thất được chia làm hai
và lớp collagen giữa là cấu trúc hình nêm. Lớp tâm thất nối liền với lớp nội
tâm mạc và bất cứ nơi nào lớp áo trong động mạch tiếp nối luôn với thành
xoang Valsava.Các mạch máu nhỏ nằm ở lớp mô liên kết.Bên trong vòng xơ
của van đều chứa các sợi đàn hồi và sợi collagen.Ngoài ra các cẩu trúc thần
kinh cũng được phát hiện.
1.2.2.2. Mép van
Các lực trên lá van đang đóng được truyền tới vòng van chủ yếu qua hệ
thống sợi collagen.Hầu hết các sợi bắt nguồn từ đường mép van.Các sợi của lớp
trung gian được định hướng xuyên tâm trong vùng mép van. Tại đây, các sợi
không chỉ xâm nhập vào lớp tế bào nội mô của gốc động mạch chủ mà còn lan
tỏa vào lớp áo giữa nơi chúng bám vào. Sự sắp xếp đặc biệt này tạo điều kiện tối
ưu để chuyển áp lực từ lá van tới thành động mạch chủ [30].
1.2.2.3. Tam giác gian lá van
Các tam giác gian lá van không bị giới hạn bới hệ thống cơ tâm thất,
nhưng được giới hạn bởi một thành xơ mỏng của động mạch chủ giữa các
phần phình ra của xoang.Tam giác giữa xoang vành trái và xoang không vành
hình thành một phần của hệ van chủ - hai lá.Nó là mô xơ và tương đương với
cấu trúc của van hai lá.Tam giác giữa xoang không có lỗ vành và xoang vành
phải ở bên trong phần màng của vách ngăn cũng được làm từ mô sợi. Ngược
lại tam giác giữa xoang vành phải và trái ở vùng phễu dưới động mạch phổi
(nón động mạch) được hỗ trợ bởi các mô cơ trừ ở vùng đỉnh là các sợi xơ [16,
18]. Các nghiên cứu gần đây chứng minh rằng các tam giác gian lá van có thể
thể hiện đặc tính tế bào xương và các protein có thể co rút lại như vimentin,
desmin and sợi actin cơ trơn, và các cấu trúc có thể tham gia điều hòa hoạt
động của gốc động mạch chủ [31].


18

1.2.2.4. Xoang Valsalva
Các động mạch nối với tim bằng các vòng xơ động mạch (arterial fibrerings). Nó có cấu trúc mô học giống gân. Những cấu trúc giống gân này
không có ranh giới rõ về cấu trúc giải phẫu và phôi thai, chúng nối giữa tim
và động mạch chủ. Do đó các xoang được sắp xếp với các thành phần khác
nhau. Tuy nhiên phần lớn nhất của cả 3 xoang được sắp xếp tương tự với cấu
trúc 3 lớp áo của thành động mạch chủ: lớp áo trong, áo giữa, áo ngoài. Lớp
trong cùng của lớp áo trong được lát bởi các tế bào nội mô sắp xếp theo
hướng của mạch máu. Các mô liên kết được sắp xếp theo hướng tương tự tế
bào nội mô. Lớp này được ngăn với áo trong bởi các sợi chun. Lớp giữa bao
gồm các cấu trúc xếp hình tròn: tế bào cơ trơn, các sợi đàn hồi, sợi collagen
typ II, III và các proteoglycan. Lớp áo ngoài được phân cách với lớp trong bởi
các sợi chun. Tương tự với lớp áo trong, các thành phần của lớp ngoài được
xếp theo chiều dọc và bao gồm các sợi collagen typ I. Mặc dù thành của các
xoang chủ yếu được sắp xếp theo cách này, độ dày của thành vẫn mỏng hơn
nhiều so với động mạch chủ lên [32].
1.2.2.5. Liên kết ống-xoang
Liên kết ống-xoang có cách sắp xếp tương tự về thành phần mô học so
với các xoang và động mạch chủ lên.Tuy nhiên, đường kính của thành liên kết
ống-xoang dày hơn so với đường kính thành xoang.Thực tế này cho thấy chỗ
gờ lên này là phần trên của gốc động mạch chủ.
1.2.2.6. Các lá van
Các lá van động mạch chủ được che phủ một lớp liên tục các tế bào nội
mạc với bề mặt trơn nhẵn ở phía buồng thất và các gờ ở phía động mạch (hình
1.11).Những tế bào này liên kết với nhau bởi những mối nối. Trái ngược với
sự sắp xếp các tế bào màng trong ở nơi khác, sự sắp xếp các tế bào nội mạc
này là theo chiều ngang, không thành hàng theo chiều dòng máu [33]. Giữa bề


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×

×