Tải bản đầy đủ

BÀI 4: MỞ ĐẦU SINH HỌC PHÂN TỬ VÀ ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG Y DƯỢC

BÀI 4: MỞ ĐẦU SINH HỌC PHÂN TỬ VÀ
ỨNG DỤNG CNSH TRONG Y DƯỢC
1. Mở đầu sinh học phân tử:
1.1. Kỹ thuật PCR;
Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) là phương pháp khuếch đại nhanh
nhiều bản sao các đoạn DNA mà không qua tạo dòng. Phương pháp này được Kary B.
Mullis đưa ra năm 1985. Phương pháp PCR được thực hiện hoàn toàn trong các eppendoff
có độ nhạy cao và trong thời gian ngắn ta có thể thu nhận rất nhiều bản sao DNA. Kỹ thuật
PCR có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: chẩn đoán, xét nghiệm các tác nhân vi
sinh vật gây bệnh, xác định giới tính của phôi, giải mã di truyền, tạo giống mới với các đột
biến định hướng, nghiên cứu sự tiến hoá của sinh vật ở mức độ phân tử,….

a. Nguyên tắc
Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp DNA dựa
trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của
khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp
mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này.
Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của
đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primer này được kéo dài để
hình thành mạch mới. Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA
polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản

sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận
đoạn DNA này cho các mục đích khác nhau bằng các thao tác trên gel.
Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối
thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt làm trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các
primer bổ sung chuyên biệt.


Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lăp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước như
sau:
Bước 1: (Biến tính tách đôi sợi DNA, denaturation)
Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử (92
0
– 96 C) trong vòng 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành 2 mạch
đơn. Chính 2 mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp 2 mạch bổ sung
mới.

Bước 2: (bắt cặp, annealing)
Trong bước này ở nhiệt độ được hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các
primer, cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao
động trong khoảng 54 – 65 0C. Tùy thuộc vào Tm của các primer mà thời gian bắt cặp kéo
dài từ 30 – 60 giây.
Mồi xuôi bắt cặp và gắn ở đầu 3’ của mạch khuôn 5’3’. Mồi ngược bắt cặp và gắn ở
đầu 3’ của mạch khuôn 3’5’


Bước 3: (kéo dài, elongation – extension)
Nhiệt độ được tăng lên 72 0C giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Dưới tác
động của DNA polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào primer theo nguyên tắc bổ
sung với mạch khuôn. Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA
khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút.

Sự khuếch đại này có thể được tính như sau:
Tổng lượng DNA khuếch đại = m x 2n
m: Là số bản sao của chuỗi mã hóa.
n: Là số chu kỳ.
Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân bản thành hai bản sao;
và nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30 - 40 lần thì từ một DNA đích đã nhân bản
được thành 230 đến 240 bản sao, tức là đến hàng tỷ bản sao.


 Đọc kết quả PCR:
Điện di trên gel agarose để phân loại DNA theo kích thước
Là hiện tượng dịch chuyển các vật thể mang điện tích dưới tác động của điện trường.
Điện di trên gel (gelelectrophoresis) áp dụng trong sinh học phân tử DNA, RNA, Protein
dựa trên các đặc điểm vật lý của chúng như kích thước, khối lượng, hình dạng hay điện tích
của chúng.
Kĩ thuật này sử dụng một bản gel đóng vai trò là thể nền để phân tách các phân tử, và
các chất nhuộm khác nhau (ethidium bromide, xanh coomassie, bạc…) để phát hiện vị trí
các phân tử gel sau khi điện di.
Một dung dịch đệm (buffer) để dẫn điện và tạo điện trường đều. Khi các phân tử
tích điện được đặt trong một điện trường, chúng sẽ dịch chuyển hướng đến cực dương
(+) hoặc cực âm (-) tùy theo điện tích của chúng.
Trong điện trường, DNA tích điện âm sẽ di chuyển về cực dượng, đoạn DNA có kích
thước ngắn di chuyển nhanh hơn so với đoạn kích thước lớn. Trong khi điện di, ethidium
bromide sẽ đan xen vào cấu trúc sợi đôi DNA và làm sợi đôi DNA phát sáng khi quan sát
dưới đèn UV


b. Các yếu tố ảnh hưởng
DNA mẫu (DNA khuôn): khuôn DNA rất quan trọng, ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu quả
PCR. Phản ứng PCR tối ưu với các đoạn khuôn hoàn toàn tinh sạch, hiệu quả PCR tỷ lệ
thuận với độ tinh sạch của DNA khuôn. Trình tự DNA khuôn không nên quá lớn <1kb
Enzyme: enzyme DNA polymerase càng mạnh, phản ứng PCR càng triệt để. Tùy các
đặc tính của enzyme, tùy thuộc nguồn gốc tách chiếc enzym hiệu quả các phản ứng PCR
khác nhau. Taq polymerase là enzym được sử dụng phổ biến, vì enzym này không bị phá
vỡ ở nhiệt độ biến tính. Taq polymerase được tách chiết từ vi khuẩn sống ở suối nước
nóng.
Primer: mồi là yếu tố quan trọng nhất quyết định hiệu quả của yếu tố PCR. Độ dài của
đoạn mồi khoảng từ 17-30 Nu. Chọn mồi cần tính toán đảm bảo Tm của mồi xuôi và mồi
ngược không chênh lệch nhau quá lớn (primer có Tm cao hơn sẽ bắt cặp không đặc hiệu,
còn primer có Tm thấp hơn sẽ không thể lai được với DNA). Các mồi có trình tự nucleotid
để chỉ có thể bắt cặp bổ sung ở hai đầu của các mạch khuôn, nếu mồi bắt cặp giữa khuôn
thì PCR không thành công. Hai đoạn mồi không được có trình tự Nu bổ sung lẫn nhau.
Nồng độ các loại nucleotide (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) (các deoxynucleotide
triphotphat): Nồng độ thường được sử dụng là 20 – 200 μM. Sự mất cân bằng trong thành
phần các loại nucleotide sẽ làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase.
Nồng độ MgCl2: Mg2+ rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme Taq
polymerase, làm tăng Tm của DNA mạch kép. Mg2+ là Co – factor của Taq polymerase nên
nếu lượng Mg2+ quá thấp thì Taq polymerase sẽ không thể hoạt động bình thường trong
giai đoạn kéo dài hạn chế quá trình kéo dài. Ngược lại nồng độ Mg 2+ cao sẽ có thể làm cho
hiện tượng bắt cặp giả xảy ra ổn định và cho ra sản phẩm với số lượng quá lớn nhưng mức
độ chuyên biệt thấp.
Dung dịch đệm: cung cấp môi trường hoạt động cho enzyme DNA polymerase.


c. Ứng dụng của PCR
Hiện nay thành tựu của PCR mở ra nhiều triển vọng cho sinh học phân tử với nhiều
ứng dụng trong sinh học, y khoa, nông nghiệp, kiểm nghiệm vi sinh vật gây bệnh: thực
phẩm, bệnh phẩm, mỹ phẩm, nước, phát hiện pháp y...
Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chăn nuôi:
Chẩn đoán bệnh trên tôm là phương thức quản lý bệnh hiệu quả hơn. Bệnh đốm
trắng trên tôm, Bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm.
Người ta sử dụng PCR bằng cách sử dụng bộ mồi để phát hiện sự hiện diện của gen
mã hóa chất độc alpha của Clostridium perfringens một tác nhân gây bệnh phân bố rộng
gây ra nhiều bệnh của con người và động vật.
Ứng dụng trong y học
Xác định quan hệ huyết thống
Phát hiện và nghiên cứu các tác nhân gây bệnh
Chuẩn đoán và nghiên cứu các bệnh lý di truyền, một số bệnh ung thư
Pháp y, điều tra hình sự…

 Các kỹ thuật ứng dụng PCR trong phân loại phân tử và xác định di truyền:
Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA – đa hình các đoạn DNA
được khuếch đại ngẫu nhiên): các sinh vật có bộ gen giống nhau hoàn toàn khi nhân gen
bằng máy PCR với các mồi ngẫu nhiên, kết quả thu được các đoạn DNA hoàn toàn giống


nhau về kích thước và cấu trúc. Điện di kết quả nhân gen thu được điện di đồ gồm những
băng vạch DNA ở những vị trí giống nhau trên bảng gel. Khi bộ gen của các mẫu kiểm tra có
sự khác nhau cho kết quả khác nhau trên điện di đồ.
Kỹ thuật này có ưu điểm: thực hiện nhanh, dễ làm và ít tốn kém giúp xác định tính đa
dạng sinh học và nguồn gốc di truyền của các giống động vật, thực vật và vsv.
Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism DNA – đa hình chiều dài
các đoạn DNA cắt ngẫu nhiên bởi các enzyme giới hạn): xử lý các mẫu DNA bằng cùng 1
cặp enzym giới hạn, các bộ gen có cấu trúc khác nhau tạo nên số lượng đoạn cắt có chiều
dài khác nhau, còn những bộ gen hoàn toàn giống nhau tạo nên các đoạn cắt hoàn toàn
giống nhau, kết quả trước khi đọc phải tiến hành lai Southern blot (Hiểu một cách đơn
giản, Southern blot là quá trình chuyển các phân tử ADN từ gel agarose lên một màng và
nhờ đó giúp các nhà nghiên cứu định vị trình tự ADN bên trong một hỗn hợp phức tạp. Ví
dụ: Southern Blot có thể được sử dụng để xác định vị trí một gen cụ thể trong toàn bộ hệ
gen).
Ứng dụng: sử dụng để chọn lọc trực tiếp các cá thể mang gen lặn mong muốn không
cần phân tích lai qua nhiều thế hệ. Phát hiện quan hệ liên kết giữa các gen hoặc các đặc
điểm do nhiều gen kiểm soát. Kiểm tra sự phân ly di truyền của một số tính trạng theo quy
luật Melden: kiểm tra gen xác định màu hoa.
Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism DNA – đa hình chiều dài
các đoạn DNA được khuếch đại chọn lọc): Cắt DNA bằng enzym giới hạn có bổ sung các
adaptor đặc hiệu tạo nên các đoạn có đầu mút giống nhau, đặc trưng có các mồi đã chọn
trước. Nhân đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR ngắt quãng với 2 loại mồi khác nhau, đọc kết quả
bằng các phần mềm thông dụng không cần tiến hành lai, do vậy việc thực hiện nhanh hơn
so với RFLP.
Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeats – khuếch đại các đoạn lặp lại đơn giản): sử
dụng các mồi đơn giản để khuếch đại các đoạn DNA lặp lại. Dựa vào kết qủa thu được về
độ dài các đoạn lặp DNA khác nhau, số lượng các đoạn lặp DNA khác nhau giữa các giống
động vật, thực vật, và VSV có thể xác định được mức độ đa dạng di truyền của các mẫu so
sánh (kỹ thuật SSR nghiên cứu sự khác biệt giữa bộ gen của cây đu đủ đực và cây đu đủ
cái). Kỹ thuật SSR có thể phát hiện nhanh sự khác biệt DNA giữa các cá thể, dễ thực hiện và
ít tốn kém
Kỹ thuật PCR ngược: được cải tiến dựa trên kỹ thuật PCR chuẩn để nhân các gen (các
đoạn DNA) từ mạch khuôn mà mRNA. Phương pháp này được sử dụng để phân lập 1 đoạn
DNA cạnh 1 trình tự đã biết trong DNA genome.
1.2. Phương pháp giải trình tự DNA theo Sanger (phương pháp Dideoxy)
Giải trình tự DNA là xác định chính xác trình tự chuỗi DNA của 1 vùng quy định trên
NST
Giải trình tự ADN theo phương pháp Sanger được phát triển bởi nhà hoá sinh học
người Anh Fred Sanger và cộng sự vào năm 1977. Phương pháp này thường được sử dụng
để giải trình tự các đoạn ADN ngắn dưới 900 base


Thành phần: Giải trình tự ADN theo Sanger thực hiện các bước giống kỹ thuật PCR.
Do đó thành phần của phản ứng cũng bao gồm những chất cần thiết để nhân bản DNA, hay
cho phản ứng chuỗi polymerase (PCR), sao chép DNA trong ống nghiệm.
 DNA cần giải trình tự
 Một enzyme DNA polymerase: xúc tác phản ứng kéo dài mạch.
 Một DNA primer (mồi), là một đoạn ngắn của DNA sợi đơn kết hợp với DNA mẫu và
hoạt động như một “khởi đầu” cho polymerase
 4 loại Deoxy nucleotide DNA (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
 4 loại Dideoxy nucleotide của cả 4 loại bazo nito (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP) được
đánh dấu đồng vị phóng xạ P32 hoặc S35

Quy trình:
Thực hiện đồng thời 4 phản ứng tổng hợp DNA trong 4 ống nghiệm khác nhau. Mỗi
ống nghiệm là hỗn hợp gồm: DNA cần giải trình tự, DNA mồi, enzyme DNA polymerase, 1%
ddNTP đánh dấu đồng vị phóng xạ cho mỗi phản ứng và 4 loại dNTP.
Phương pháp này thực hiện bằng việc sử dụng các deoxy nucleotide đã bị chỉnh sửa
làm mất nhóm hydroxyl ở đầu 3’ của phân tử đường. Nhóm 3’-OH đóng vai trò cho phép
gắn thêm một nucleotide mới vào chuỗi. Khi một ddNTP được thêm vào chuỗi, vì không có
nhóm 3’-OH nên một nucleotide không được thêm vào, phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại.
Enzyme polymerase xúc tác phản ứng gắn các dNTP vào mạch đơn của DNA để kéo dài
mạch ở vị trí 3’-OH và dừng lại nếu gắn các ddNTP vào chuỗi. Trong một phản ứng chứa cả
dNTP và ddNTP nên sau phản ứng tổng hợp, hình thành các đoạn DNA có độ dài khác nhau
do ddNTP gắn ngẫu nhiên làm dừng phản ứng. Dựa vào sự sai khác về độ dài các đoạn DNA
hiển thị trên bản gel sau điện di để xác định trình tự trong gene.


Sản phẩm của 4 ống nghiệm được điện di hiện hình đồng vị phóng xạ trên cùng một
bản gel để quan sát các band DNA. Căn cứ vào vị trí các vạch quan sát được trên bản gel
mà xác định trình tự các nucleotide trong gel theo chiều 5’ – 3’ đọc từ dưới lên trên.

Ưu nhược điểm:
Giải trình tự Sanger có thể thực hiện với các đoạn DNA tương đối dài (khoảng 900 cặp
base). Tuy nhiên, giải trình tự DNA theo phương pháp Sanger là tốn kém và không hiệu quả
cho các dự án có quy mô lớn hơn, như trình tự toàn bộ hệ gen hay metagenome.
 Giải trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động:
Nguyên tắc chung của phương pháp này dựa trên cơ sở của phương pháp Dideoxy.
Máy đọc trình tự trên cả 2 mạch đơn, do vậy có thể phát hiện và giảm các nhầm lẫn do kỹ
thuật. Có 2 loại mồi xuôi và mồi ngược được sử dụng cho mỗi mạch đơn DNA. Chùm tia
laser đánh dấu vị trí và thời gian đi qua của các nucleotide, từ đó tổng hợp được trình tự
sắp xếp của gen.
1.3. Công nghệ DNA tái tổ hợp
1.3.1. Giới thiệu
Trước áp lực của sự gia tăng dân số; nguồn tài nguyên như đất, nước ngày càng khan
hiếm..., nhu cầu về lương thực của nhân loại ngày càng tăng, đòi hỏi các quốc gia phải tìm
kiếm các giải pháp về công nghệ sinh học trong canh tác nông nghiệp. Đáp ứng với những
thách thức đó, cây trồng biến đổi gen sẽ là 1 hướng đi tất yếu, là "chìa khóa" để đảm bảo
an ninh lương thực, đảm bảo cho nền sản xuất nông nghiệp bền vững trước tác động của
biến đổi khí hậu và thiên nhiên.
Cây trồng biến đổi gen (Genetically Modified Crop - GMC) là loại cây trồng được lai
tạo ra bằng cách sử dụng các kỹ thuật của công nghệ sinh học hiện đại, hay còn gọi là kỹ
thuật di truyền, công nghệ gen hay công nghệ DNA tái tổ hợp, để chuyển một hoặc một số
gen chọn lọc để tạo ra cây trồng mang tính trạng mong muốn.
Năm 2013, 27 quốc gia trên thế giới canh tác đại trà cây trồng công nghệ sinh học (19
quốc gia đang phát triển và 8 quốc gia phát triển), trong đó dẫn đầu là Hoa Kỳ (70,1 triệu
hecta), Brazil (40,3 triệu hecta), Argentina (24,4 triệu hecta); Ấn Độ (11 triệu hecta) và
Canada (10,8 triệu hecta). Trong 18 năm (1996 - 2013), diện tích đất canh tác cây trồng


công nghệ sinh học trên toàn cầu đã tăng liên tục tới hơn 100 lần (từ 1,7 triệu hecta vào
năm 1996 lên 175,2 triệu hecta trong năm 2013) (Hình 1). Điều này cho thấy đối với cây
trồng, đây là công nghệ được ứng dụng với quy mô lớn nhất và tốc độ nhanh nhất trên thế
giới. Các loại cây trồng công nghệ sinh học được trồng nhiều nhất hiện nay trên thế giới là
đậu tương, bông, ngô và cải dầu
Chuyển gen (transgenesis) là đưa một đoạn DNA ngoại lai vào genome của một cơ thể
đa bào, sau đó đoạn DNA ngoại lai này sẽ có mặt ở hầu hết các tế bào và được truyền lại
cho thế hệ sau. Vì vậy khái niệm chuyển gen chỉ được sử dụng cho thực vật và động vật.
Nấm men, vi khuẩn và tế bào nuôi cấy mang một đoạn DNA ngoại lai được gọi là các tế bào
tái tổ hợp (recombinant cell) hoặc tế bào biến nạp (transformed cell).
Để thực hiện thành công liệu pháp chuyển gen thì vector chuyển gen có vài trò rất
quan trọng.

1.3.2. Vector chuyển gen
Vector chuyển gen là một đoạn phân tử DNA nhỏ có khả năng mang 1 đoạn DNA
ngoại lai cần thiết và khi xâm nhập vào TB chủ thì có khả năng tự tái bản không phụ thuộc
vào sự sao chép của TB chủ. Vector chuyển gen được sử dụng để khuếch đại số lượng bản
sao của một gen hay trình tự DNA nhất định, chuyển các gen ngoại lai vào TB hoặc sản xuất
protein với số lượng lớn từ các gen tách dòng.


Đặc điểm:
 Vector phải tồn tại trong TB chủ qua nhiều thế hệ và ít gây xáo trộn cho TB vật chủ.
 Vector phải có kích thước càng nhỏ càng tốt để dễ xâm nhập vào TB vi khuẩn và sao
chép nhanh.
 Vector chuyển gen phải có điểm khởi đầu sao chép (Ori) để tự sao chép mà tồn tại
độc lập trong TB vật chủ.
 Có các gen chỉ thị mang đặc điểm cho phép dễ dàng phát hiện, nhận biết chúng trong
TB vật chủ. Thường các vector có chứa gen kháng chất kháng sinh hoặc gen tổng hợp
chất màu dễ phát hiện trên môi trường thạch.
 Đảm bảo sự di truyền bền vững của DNA tái tổ hợp
 Có các đoạn trình tự nhận biết cho enzym giới hạn nhận biết để cắt rời làm chỗ lắp
ráp đoạn gen ngoại lai vào. Các trình tự này thường nằm xa điểm khởi đầu sao chép
để tránh bị cắt nhầm.
Ứng dụng:
 Tạo dòng (cloning) và khuếch đại (amplification) một đoạn trình tự của DNA (nhiều
bản sao giống nhau).
 Nghiên cứu sự biểu hiện của 1 đoạn trình tự DNA
 Đưa gen vào các TB VSV hoặc các động thực vật
 Sản xuất RNA
 Sản xuất protein từ gen được tạo dòng
Các loại vector tách dòng:
a. Vector tách dòng là plasmid
Ưu điểm: cấu trúc đơn giản, kích thước nhỏ. Dễ tinh sạch, dễ phân tích đoạn tái tổ
hợp. Có thể nhân lên với số lượng lớn, tốc độ nhanh. Một số plasmid có chứa các gen
kháng thuốc tiện lợi cho việc theo dõi và phát hiện sự có mặt của plasmid tái tổ hợp trong
vi khuẩn chủ.
Nhược điểm: đôi khi hiệu suất biến nạp vào TB chủ thấp. Không hiệu quả khi biến nạp
ở Eukaryote. Không tách dòng được các phân đoạn DNA kích thước lớn >10kb
Plasmid được cải tiến qua 3 thế hệ:
Thế hệ thứ nhất là các plasmid tự nhiên và ngày nay hầu như không còn sử dụng như
pSC1001, ColE1, ….
Plasmid thế hệ thứ hai được cấu tạo phức tạp hơn, tập hợp các đặc tính quý của
nhiều plasmid tự nhiên, hoặc gắn thêm các gen chỉ thị tạo nên 1 plasmid mới. Một trong
những plasmid thế hệ thứ hai được sử dụng rộng rãi là plasmid pBR322.
pBR322 có kích thước 4363bp mang 2 gen kháng chất kháng sinh Ap R – kháng apicilin,
TcR – kháng tetracilin, và 20 vị trí nhận biết của enzyme giới hạn. Trong số đó có 11 gen
nằm trong các gen kháng chất kháng sinh, khi 1 gen lạ được gắn tại các vị trí gen đó làm
mất khả năng kháng chất kháng sinh tương ứng. (thêm vào môi trường nuôi cấy chất
kháng sinh tương ứng, những TB có mang vector chuyển gen sẽ kháng kháng sinh và tồn
tại được, những TB không hợp với vector sẽ bị chết)


Plasmid thế hệ thứ ba là các plasmid đa năng (polycloning plasmid), chuyên dụng có
kích thước rất nhỏ và có một đoạn đa liên kết (polylinker), hoặc điểm đa tách dòng
(multiple cloning site). Đoạn đa liên kết là đoạn polynucleotide tổng hợp, mang một chuỗi
các vị trí nhận biết của nhiểu loại enzym giới hạn. Nhóm plasmid này là các plasmid pUC,...
Điển hình là pUC18 được cải tiến từ pBR322, kích thước 2686 bp mang gen ApR và 1
phần gen lacZ. Ưu điểm của nhóm này là coskichs thước nhỏ, vùng polylinker cho phép gắn
bất kỳ 1 trình tự DNA lạ nào, gen lacZ giúp dễ dàng phát hiện vector tái tổ hợp một cách rất
đơn giản, bằng cách quan sát màu sắt khuẩn lạc trên môi trường thạch.

b. Vector tách dòng là phage
Ưu điểm: Khả năng xâm nhập TB chủ nhanh. Có thể tách dòng ở cả prokaryote và
eukaryote. Có thể mang gắn các đoạn DNA kích thước 30kb. Dễ bảo quản do các hạt virus
bền ở nhiệt độ lạnh (4oC)
Nhược điểm: Kích thước lớn hơn plasmid, nên phân tích phức tạp hơn. Số bản sao
phage hình thành trong mỗi TB thấp hơn số bản sao của plasmid.
Trong số các phage dùng làm vector thì phage lambda (λ) có nhiều ưu thế nhất, bởi lẽ
ở phần giữa của bộ gen có chứa một số gen không quan trọng và không liên quan với sự tái
bản của nó, nên thuận lợi cho việc xen đoạn ADN mong muốn vào đây. Các phage không
chứa các gen kháng thuốc cho nên việc theo dõi phage tái tổ hợp được xác định dựa vào
các vết tan dương tính trên nền vi khuẩn. ADN của nó có dạng mạch thẳng kép có hai đầu
bổ trợ sợi đơn dài 12 nucleotide (đầu cos). Có nhiều loại phage được sử dụng như: EMBL3,
EMBL4, λGEM11, phage Bluescipt M13…
Phage Bluescript M13 thường được sử dụng làm vector tách dòng do nó có ADN sợi
đơn chứa 10 gen, có kích thước khoảng 6400 bp và chỉ xâm nhiễm vào E.coli.


c. Vector tách dòng là cosmid
Cosmid là vector nhân tạo, ghép nối từ một plasmid với đoạn trình tự cos của phage
λ. Trên cosmid có các vùng giới hạn có thể cài lắp DNA lạ và 1 gen chống chịu ampiciline.
Trình tự cos điều khiển đóng gói DNA của phage. Vector tách dòng là cosmid cho phép cài
gắn đoạn DNA có kích thước lớn 40 - 50 kb.
Cosmid có khả năng xâm nhiễm TB vi khuẩn lớn, nhận đoạn cài có kích thước lớn.
Trong TB chủ nó tự nhân bản như plasmid. Do đó chúng được dùng để tách dòng từ những
gen lớn để tạo ngân hàng genome. Những vi khuẩn mang vector này có khả năng chống
chịu với môi trường có ampiciline
Ứng dụng cosmid để tách dòng cũng rất khó khăn và vất vả.

d. Vector tách dòng là Ti plasmid
Ti-plasmid được tìm thấy trong tất cả các dòng A.tumefaciens gây độc, có kích thước
khoảng 200-250 kb. Người ta đã xác định được Ti-plasmid có 4 vùng tương đồng: vùng TDNA (transferred DNA), vùng gây độc (vir - virulence) liên quan đến sự hình thành khối u
trong khi 2 vùng khác liên quan đến sự tiếp hợp và sự tái bản của plasmid trong
Agrobacterium.
Vùng T-DNA của ti plasmid được nghiên cứu rất kỹ. Đó là một đoạn DNA có kích
thước 25 kb trong đó chứa gen mã hóa cho sinh tổng hợp auxin, cytokinin (hoocmon thực
vật), opine (các dẫn xuất không bình thường của acid amin) và các gen gây khối u
(oncogenes). Trong Ti-plasmid, vị trí của T-DNA được giới hạn bằng RB và LB. Ngoài T-DNA.
Cơ chế gây bệnh của các Agrobacterium là sau khi xâm nhiễm vào tế bào, chúng gắn
đoạn T-DNA vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật, dẫn đến sự rối loạn các chất sinh
trưởng nội sinh, tạo ra khối u (trường hợp A. tumefaciens) hoặc rễ tơ (trường hợp A.
rhizogenes). Khả năng chuyển gen này đã được khai thác để chuyển gen ngoại lai vào bộ
máy di truyền của tế bào thực vật theo ý muốn.


e. Vector tách dòng là virus của TB Eukaryote
Thường sử dụng là các loại virus SV40 Simian virus, adenovirus, retrovivus, virus
herpes… các vector trong nhóm này được sử dụng cho tách dòng và chuyển gen ở TB động
vật, thực vật bậc cao.

Sử dụng vector retrovirus để tạo động vật chuyển gen; cơ chế hoạt động của vector adenovirus
1.3.3. Enzym giới hạn (Restriction Enzyme – RE)
Enzyme giới hạn hay còn gọi là enzyme cắt giới hạn có vai trò rất quan trọng trong sự
phát triển của công nghệ sinh học. Chúng là có bản chất là protein những có khả năng nhận
diện chính xác một đoạn trình tự ADN ngắn và cắt chính xác phân tử ADN ở vị trí đặc hiệu.
Bởi vậy nói không ngoa rằng enzyme cắt giới hạn cùng với ligase đã tao nên ngành công
nghệ ADN tái tổ hợp.
TB vi khuẩn bị nhiễm phage thường bị phage phá hủy. Có 1 số chủng vi khuẩn bị
nhiễm phage nhưng không bị phage tiêu diệt, do DNA của phage bị cắt thành từng đoạn


nhỏ nhờ 1 số loại enzyme trong TB những enzyme đó gọi là enzyme giới hạn có khả năng
cắt DNA phage ở những vị trí nhất định thành những đoạn ngắn.
Các RE có đặc tính cắt DNA không đặc hiệu loài, nghĩa là RE tách chiếc từ vi khuẩn có
thể cắt DNA của TB động vật, thực vật, và vi khuẩn khác ở cùng vị trí giới hạn hay điểm giới
hạn. Số lượng và kích thước đoạn cắt dài hay ngắn, tùy thuộc vào số lượng điểm giới hạn
trên phân tử DNA. Bản đồ trình tự các vị trí cắt bởi enzyme giới hạn gọi là bản đồ giới hạn.
Mỗi loại enzyme giới hạn hoạt động tốt trong những điều kiện nhất định về nhiệt độ
và dung dịch đệm thích hợp. Tiến hành phản ứng của các enzyme giới hạn cần thực hiện
trong một thể tích càng nhỏ càng tốt để RE tiếp xúc tốt với cơ chất.
 Tên gọi các enzyme giới hạn:
Tên gọi của enzyme giới hạn thường có 3 hoặc 4 chữ xuất phát từ tên của vi sinh vật
mà từ đó, enzyme được xác định và chiết tách.
- Chữ cái đầu (viết hoa) là chữ đầu của tên giống của vi khuẩn từ đó enzyme được
trích li.
- Chữ thứ 2 và thứ 3 (viết thường) là chữ đầu tên loài của vi sinh vật.
- Đôi khi có chữ thứ 4 chỉ chủng sinh vật.
- Chữ số la mã chỉ thứ tự RE được phát hiện (có thể có nhiều RE được phát hiện từ
một chủng).


 Các loại enzyme giới hạn:
Hiện nay phát hiện có hàng nghìn enzyme giới hạn được ly trích từ vi khuẩn. Dựa vào
khả năng nhận biết và cắt trình tự đặc hiệu khoảng 4 – 7 cặp nucleotide người ta chia
enzyme giới hạn thành 3 loại:
Loại 1: gồm các enzyme giới hạn nhận biết được trình tự đặc hiệu (vị trí giới hạn) di
chuyển dọc theo DNA, đến cách vị trí giới hạn khoảng 1000 - 5000 nucleotide cắt tại đó và
giải phóng độ vài chục nucleotide.
Loại 2: gồm các enzyme giới hạn nhận biết các vị trí giới hạn cắt ngay tại đó. Loại này
được sử dụng nhiều trong kỹ thuật gen và công nghệ DNA tái tổ hợp.
Loại 3: gồm các enzyme giới hạn nhận biết vị trí giới hạn và cắt ở vị trí cách đó khoảng
20 nucleotide về phía trước.
 Các kiểu cắt của RE
Mỗi enzyme giới hạn nhận biết và cắt đặt hiệu một đoạn DNA ở những vị trí nhất
định. Có hai kiểu cắt khác nhau là cắt tạo đầu bằng và cắt tạo đầu so le.

 Một số loại enzyme dùng trong kỹ thuật gen
Enzyme polymerase: xúc tác các quá trình tái bản DNA, phiên mã tổng hợp RNA. Có
nhiều loại enzyme DNA polymerase:
Enzyme DNA polymerase I (pol I): là enzyme được tách chiết từ E.coli. vai trò: xúc tác
tổng hợp 1 mạch đơn DNA mới, đồng thời có vai trò sửa chữa sai sót trong tái bản DNA và
thùy phân liên kết giữa các nucleotide. ứng dụng: chủ yếu để xác định trình tự DNA bằng
phương pháp Dideoxy ribonucleotide, tổng hợp mẫu dò có độ phóng xạ cao, thiết kế các
vector mạch đơn…
Enzyme T4 DNA polymerase: có nguồn gốc từ phage T4 xâm nhiễm E.coli, có khả năng
thủy phân các liên kết nucleotide.
Enzyme Taq polymerase: ly trích từ vi khuẩn Thermus aquaticus. Thường được sử
dụng trong nhân gen nhân tạo bằng máy PCR
Enzyme RNA polymerase: được tách chiết từ phage xâm nhiễm E.coli. Chức năng xúc
tác phiên mã tổng hợp RNA từ mạch khuôn của phân tử DNA
Emzyme ligase: là enzyme xúc tác hình thành các liên kết nối 2 đoạn acid nucleotide
với nhau. DNA ligase xúc tác nối các đoạn DNA, RNA ligase xúc tác nối các đoạn RNA
Enzyme nuclease: là enzyme cắt DNA (DNase) và enzyme cắt RNA (RNase). Gồm
những loại sau: enzyme DNase I; nuclease S1; RNase A…
Các nuclease có khả năng phân cắt phân tử DNA hoặc RNA. Có ba kiểu phân loại các
nuclease sau:
Dựa vào bản chất của cơ chất mà nó tác dụng, người ta chia nuclease làm hai loại


- Deoxyribonuclease (DNase), cơ chất của nó là DNA
- Ribonuclease (RNase), cơ chất của nó là RNA
Dựa theo kiểu liên kết mà enzyme thủy phân, người ta cũng chia ra làm hai loại
- Nuclease "a": Thuỷ phân đặc hiệu liên kết phosphodiester giữa cacbon (C3’) và
nhóm phosphate.
- Nuclease "b": Thuỷ phân đặc hiệu liên kết phosphoester giữa cacbon (C5’) và nhóm
phosphate (Hình 4-1).
Dựa theo hoạt tính enzyme, người ta cũng chia ra làm hai loại exonuclease và
endonuclease
Exonuclease: Cắt các liên kết phosphoester từ hai đầu của chuỗi poly- nucleotide và
từ đó cắt dần từng nucleotide, chúng đòi hỏi là phải có nhóm OH (3’) hoặc OH (5’) tự do ở
hai đầu chuỗi.
Endonuclease: Thường thuỷ phân liên kết phosphoester ở vị trí bất kỳ bên trong
chuỗi và tạo ra các oligonucleotide.

1.3.4. Kỹ thuật DNA tái tổ hợp
Kỹ thuật tái tổ hợp DNA là một môn kỹ thuật tiến hành đối với DNA, công nghệ này
phát triển từ những năm 70 của thế kỷ XX, còn được gọi là genetic engineering hay nhân
bản phân tử. Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học phân tử, khái niệm và phương
pháp tái tổ hợp DNA cũng ngày càng được hoàn thiện.
Công nhệ tái tổ hợp DNA là tập hợp các kỹ thuật tạo nên các phân tử DNA tái tổ hợp
để nhằm đưa các gen mong muốn mới vào các TB hoặc cơ thể sống. Như vậy có thể nói các
GMO đều là sản phẩm của công nghệ DNA tái tổhopwjg, hay công nghệ DNA tái tổ hợp là
cơ sở tạo nên các GMO .
DNA tái tổ hợp là DNA được tạo ra từ hai hay nhiều nguồn vật liệu di truyền khác
nhau. Phân tử DNA lai nhau được ghép nối từ các đoạn DNA của các cá thể khác nhau
trong loài hoặc các loài khác nhau gọi là DNA tái tổ hợp.
Các bước cơ bản của kỹ thuật tái tổ hợp DNA gồm có: Phân lập gen (tách chiết DNA,
RNA) -> Tạo DNA tái tổ hợp -> Chuyển DNA tái tổ hợp vào TB nhận -> Tách dòng chứa DNA
tái tổ hợp
Phân lập gen (tách chiết DNA, RNA)
Tách chiết DNA là kỹ thuật cơ bản trong hầu hết các phòng thí nghiệm phân tử, di
truyền và sinh học nói chung. Phân tử DNA sau tách chiết cần đảm bảo được số lượng và


chất lượng để đáp ứng được các phân tích sau đó. Hiện nay trên thị trường có sẵn rất
nhiều bộ kít tách chiết ADN khá tiện dụng
Cho đến nay đã có rất nhiều quy trình tách chiết DNA được đưa ra và báo cáo thành
công bởi nhiều nhà nghiên cứu. Đối với mỗi loại mô, tế bào quy trình tách chiết có thể sẽ
khác nhau. Dù vậy thì nguyên lý tách chiết ADN từ tế bào vẫn gồm các bước cơ bản sau:
1. Phá màng: nghiền tế bào, mô trong dung dịch chất tẩy (SDS) và proteinase để phá
vỡ màng tế bào, màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường đồng thời phân hủy các protein
liên kết với DNA. Chất tẩy là phân tử lưỡng cực, sẽ kết hợp với protein màng và các phân
tử phospholipid làm phá vỡ cấu trúc màng. Chất tẩy ion hóa có tác dụng phá màng mạnh,
chất tẩy không ion hóa có tác dụng phá màng nhẹ hơn.
2. Loại bỏ protein: Sau khi phá vỡ tế bào, DNA sẽ được trộn lẫn với các thành phần
khác của tế bào chủ yếu là protein trong dung dịch. Việc quan trọng lúc này là tách DNA ra
khỏi thành phần protein của tế bào. Để thực hiện bước này người ta chủ yếu sử dụng hỗ
hợp Phenol/Chloroform. Phenol-Chloroform không tan trong nước nhưng có khả năng làm
biến tính protein. Do đó, protein sẽ bị tủa lại khi gặp phenol. Trong khi đó DNA thì không bị
tủa bởi phenol nên vẫn tan trong nước. Khi ly tâm phenol/Chloroform nặng sẽ lắng xuống
dưới, protein tủa sẽ nằm tại danh giới của nước và phenol, còn DNA thì nằm lại trong pha
nước ở phía trên. Thu pha nước chứa DNA này để thực hiện các bước tiếp theo.
3. Tủa và thu DNA: Sau bước tủa protein, DNA thu được nằm trong dung dịch với
dung môi là nước. Sử dụng Ethanol hoặc Isopropanol để tủa DNA trong dung dịch. Sau đó
ly tâm để thu cặn DNA. Cặn DNA này có thể được rửa trong Ethanol 70% một hoặc hai lần
để làm sạch mẫu. Tiếp theo để cho bay hơi cồn và huyền dịch hóa cặn DNA thu được trong
đệm.

Tạo DNA tái tổ hợp
Chuẩn bị vector: Các vector được sử dụng trong các phương pháp tách dòng truyền
thống dựa trên các plasmid và tạo ra một vị trí chèn DNA bằng cách cắt giới hạn bởi các
enzym chuyên biệt.
Chuẩn bị đoạn chèn: Các đoạn chèn để tách dòng có thể là DNA hệ gen, một phần của
một plasmid khác hoặc một đoạn DNA thẳng. Bất kể loại DNA có nguồn gốc từ đâu, bước
đầu tiên trong quá trình chuẩn bị chèn thường là thực hiện quá trình cắt giới hạn nhằm tạo
ra các đầu tương thích để ghép nối tiếp vào vector. Sử dụng enzym cắt cùng loại với enzym
cắt vector để tạo ra các đầu nối tương ứng.


Gắn kết: Sau khi có được các đoạn quan tâm, một phản ứng gắn có thể được set up
để gắn đoạn chèn vào vector. Enzim phổ biến nhất được sử dụng để Gắn là T4 DNA ligase,
enzyme này tạo liên kết giữa các nhóm 5 ′ phosphate và 3 ′ OH ở các đầu DNA.

Chuyển DNA tái tổ hợp vào TB nhận (biến nạp)
Biến nạp là một quá trình xảy ra tự nhiên trong đó các tế bào vi khuẩn nhận lấy DNA
ngoại lai với tần số thấp. Trong các ứng dụng sinh học phân tử, quá trình này được khai
thác và cải thiện để đưa các plasmid vào bên trong vi khuẩn đã được gây khả biến.
Một phương pháp để biến nạp tế bào vi khuẩn là điện biến nạp. Trong kỹ thuật này,
các tế bào vi khuẩn được gây biến nạp bằng sốc điện và plasmid tái tổ hợp được xử lý bằng
một dòng điện để tạo ra lỗ trên màng tế bào vi khuẩn để hấp thụ plasmid.
Vi khuẩn biến nạp sau đó được cấy trên đĩa thạch với một loại kháng sinh thích hợp
và sàng lọc (bằng cách sàng lọc xanh trắng hoặc phương pháp khác) để chọn ra các khuẩn
lạc mang plasmid chứa đoạn chèn mong muốn.


Tách dòng chứa DNA tái tổ hợp
Sản phẩm biến nạp chứa hỗn hợp các tế bào không có vector, vector không có phần
chèn, chỉ chứa đoạn chèn và vector được gắn thành công với phần chèn. Vi khuẩn không
có vector sẽ thiếu gen kháng kháng sinh và sẽ không phát triển, trong khi vi khuẩn biến nạp
với vector (có hoặc không có chèn) tồn tại được trên môi trường thạch kháng sinh do gen
kháng kháng sinh biểu hiện. Do đó, kháng kháng sinh cho phép sàng lọc vi khuẩn mang
plasmid tái tổ hợp nguyên vẹn.
Để xác định xem các khuẩn lạc được biến nạp có chứa phần chèn hay không, một số
phương pháp có thể được sử dụng, trong đó phổ biến nhất là sàng lọc xanh trắng và sàng
lọc dương tính. Sàng lọc xanh trắng phụ thuộc vào việc biến nạp một chủng vi khuẩn biểu
hiện gen lacZ đột biến (lacZΔM15) nên không thể mã hóa peptide alpha của betagalactosidase, nhưng được bù đắp bởi vector mang gen. Các tế bào biến nạp được cấy trên
môi trường tăng trưởng bao gồm một chất cảm ứng phiên mã cho biểu hiện lacZ, IPTG và
cơ chất tạo màu của LacZ là X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl–D-galactopyranoside). Trong
sàng lọc xanh/trắng, LacZ sẽ thủy phân X-gal, tạo ra chất màu xanh lam và do đó khuẩn lạc
có màu xanh. Khi một đoạn DNA chèn vào làm phá vỡ gen lacZα trên vector, không có LacZ
đầy đủ được hình thành và các khuẩn lạc biến nạp có màu trắng

Công nghệ DNA tái tổ hợp cũng được ứng dụng để tạo ra nhiều sản phẩm thương
mại, chẳng hạn: thuốc, hormone, enzyme và các giống cây trồng-vật nuôi. Một nền công
nghiệp hoàn toàn mới, công nghiệp công nghệ sinh học, đã phát triển chung quanh việc sử
dụng các kỹ thuật này để tạo ra các sản phẩm mới. Trong y học, các kỹ thuật tái tổ hợp
DNA được dùng để thăm dò bản chất của ung thư, chẩn đoán các bệnh di truyền và nhiễm
trùng, sản xuất thuốc và điều trị các rối loạn di truyền.


2. Ứng dụng CNSH trong y dược
Cho đến nay, có lẽ thành tựu công nghệ sinh học được thể hiện rõ nét nhất là ở lĩnh
vực y học như liệu pháp protein và liệu pháp gen để chữa trị một số bệnh hiểm nghèo (ung
thư, nhiễm virus và hiện đang thử nghiệm chữa trị bệnh AIDS...) cũng như để chẩn đoán
bệnh (viêm gan, sốt xuất huyết, sán lá gan...) và phòng bệnh (vaccin). Ngày nay, với những
công cụ của kỹ thuật gen, ngành y không chỉ dựa vào các triệu chứng lâm sàng mà còn có
khả năng tác động thẳng vào các nguyên nhân sâu xa của bệnh đó là sự bất thường của
gen. Công nghệ sinh học đã xâm nhập vào hầu như mọi lĩnh vực của y học, trong đó đáng
kể nhất là lĩnh vực chẩn đoán và phòng ngừa với việc tạo ra các bộ kit chẩn đoán bệnh
bằng phương pháp PCR và các DNA vaccin có hiệu quả cao. Lĩnh vực sản xuất thuốc chữa
bệnh như interferon, insulin, interleukin, hormone sinh trưởng ở người... ngày càng phát
triển mạnh và trở thành một ngành công nghiệp quan trọng. Đặc biệt, liệu pháp gen mặc
dù thành tựu còn ít nhưng đã mở ra những triển vọng to lớn trong việc chữa trị những
bệnh di truyền và bệnh nan y.
Việc phòng và chữa bệnh đã và sẽ đóng vai trò thiết yếu trong việc cải thiện chất
lượng đời sống. Giảm giá chăm sóc y tế là rất quan trọng, người ta tính rằng 1 đồng EURO
chi cho tiêm chủng có thể tiết kiệm được 21 – 29 EURO chữa bệnh. Thị trường vaccin thế
giới vào khoảng 3 tỷ EURO/năm và tăng trưởng của thị trường này khoảng 9,7% năm, các
sản phẩm CNSH được dự kiến tăng 15% năm.
Các sản phẩm DNA tái tổ hợp có giá trị trong y tế là: interferon, hormon sinh trưởng
người, insulin… Gần đây khoa học đang sử dụng công nghệ ARNi để sản xuất ARN ngắn có
khả năng điều trị bệnh HIV, kiểm soát các bệnh virut, bệnh ung thư ở người.
CNSH y dược
Đặc trưng cơ bản
Kháng thể đơn dòng/ sử dụng trong Sản xuất bằng công nghệ TB lai
chuẩn đoán bệnh.
(hybridoma)
Ví dụ: các bệnh đường sinh dục, ung
thư, các bệnh virus như viêm gan B…
Mẫu dò DNA (DNA probes): dùng Sản suất bằng công nghệ gen
trong chuẩn đoán bệnh
Ví dụ: bệnh kala-aser, bệnh buồn ngủ,
bệnh sốt rét…
Vaccin tái tổ hợp (viêm gan B; vaccin Sản suất bằng công nghệ gen
phòng bệnh virus ở gia súc lợn, thỏ,
trâu, bò…) như lở mồm long móng
Các loại thuốc chữa bệnh có giá trị Sản xuất chủ yếu bằng các vi khuẩn
như insulin, interferon, hormon sinh chuyển gen
trưởng người và bò, erythropoietin…
Liệu pháp gen (trị liệu gen) chữa các Đưa các gen bình thường vào cơ thể
bệnh di truyền
thay thế chức năng của các gen bệnh
bằng nhiều kỹ thuật khác nhau đang
được nghiên cứu cải tiến


Sinh con theo giới tính chọn lọc bằng
cách tách riêng các tinh trùng mang
NST X, Y và thụ tinh TB trứng bằng 1
loại tinh trùng
Xác đinh phả hệ hoặc tội phạm, xác
định mộ liệt sĩ chưa rõ nguồn gốc
thông qua phân tích DNA của họ
2.1.

Có thể dẫn đến mất cân bằng giới tính
trong dân số

Xác định chính xác quan hệ họ hàng,
dòng tộc bằng phân tích DNA máu,
TB, tóc…

Vaccin
Vaccin là sản phẩm được chế tạo từ các vi sinh vật (virut, vi khuẩn, nấm men) hoặc
các kháng nguyên đặc hiệu, được đưa vào cơ thể người gây miễn dịch chủ động nhằm
phòng nhiễm khuẩn do các vi sinh vật tương ứng gây ra. Thuật ngữ vaccin E.Jenner dùng
đầu tiên bắt nguồn từ chữ Latinh “vacca” (con bò) để chỉ chất chế từ vảy đậu bò dùng
chủng cho người nhằm phòng bệnh đậu mùa. Sau này, L.Pasteur dùng thuật ngữ vaccin
rộng rãi để ghi nhớ công trình có ý nghĩa lịch sử của E.Jenner.
Nhờ công nghệ DNA tái tổ hợp người ta đã sản xuất được protein vỏ của một số loại
virus như virus bệnh dại và viêm gan B. Sản xuất vaccin kỹ thuật gen là một lĩnh vực phát
triển mạnh hiện nay của công nghệ DNA tái tổ hợp. Đây là loại vaccin được bào chế từ vi
khuẩn đã được chuyển gen mã hóa tổng hợp một protein kháng nguyên của một loại
virus hay một loại vi khuẩn gây bệnh nào đó. Hiện nay, các loại DNA vaccin tái tổ hợp
được sử dụng cho người bao gồm vaccin viêm gan B, vaccin dại kiểu mới, vaccin tả kiểu
mới, vaccin sốt rét và vaccin bệnh phong. Virus viêm gan B có vỏ ngoài lypoprotein. Kháng
nguyên bề mặt là protein chính của vỏ ngoài, được phát hiện trong máu người bị nhiễm.
Người ta biến nạp gen tổng hợp kháng nguyên của virus viêm gan B vào vi khuẩn E. coli
sau đó sản xuất sinh khối ở quy mô lớn các vi khuẩn E. coli mang gen tái tổ hợp này, biến
E. coli thành “nhà máy” sản xuất kháng nguyên để làm vaccin.
Bên cạnh đó, mô hình sản xuất vaccine dựa trên cơ sở thực vật (vaccine thực phẩm)
cũng có tiềm năng ứng dụng rất lớn. Bằng cách chuyển một loại gen kháng nguyên của
virus hoặc vi khuẩn vào tế bào thực vật, gen này sẽ hoạt động trong cơ thể và biến thực
vật thành nơi sinh ra kháng nguyên. Khi những kháng nguyên này đi vào cơ thể người thì
hệ thống miễn dịch của người sẽ tự động sinh ra kháng thể đặc hiệu tương ứng. Như vậy,
thay vì tiêm chủng theo phương thức thông thường người ta có thể ăn những hoa quả có
kháng nguyên được sử dụng làm vaccine.
Phân loại
 Vaccin bất hoạt (Vaccin chết) chứa các vi sinh vật đã bị diệt hoặc các ngoại độc tố của
chúng đã được giảm độc không còn khả năng gây bệnh (tác nhân bất hoạt nhiệt, bức xạ,
siêu âm, hoá chất như formalin, phenol, beta probiolactol, merthiolate). Những tác
nhân này phải có tác dụng làm giảm độc và bảo vệ kháng nguyên. Các vaccine được sản
xuất theo phương thức này tương đối an toàn và kích thích các kháng thể chống lại các
protein bề mặt của tác nhân gây bệnh.


 Vaccin giảm độc lực (Vaccin sống nhược độc) chứa vi khuẩn hoặc virut đã được giảm
độc bằng cách cấy chuyền hoặc xử lý sao cho mất khả năng gây độc hoặc bị biến chủng
không còn khả năng gây độc nữa nhưng còn khả năng miễn dịch.
 Vaccin tách chiết là vaccin công nghệ cao, loại chỉ tách lấy một phần vách (vỏ) chứa
thành phần kháng nguyên đặc thù Polysaccharide của vi khuẩn (vaccin não mô cầu,
vaccin phế cầu), vaccin chứa thành phần kháng nguyên virus (vaccin virus viêm gan B
được điều chế từ HBsAg có trong huyết tương những người nhiễm kháng nguyên này).
Những vaccin chết có ưu điểm không có nguy cơ nhiễm trùng. Những bất lợi bao gồm:
giá thành thường cao, nguy cơ mẫn cảm, một lịch chủng ngừa nhiều lần và lặp lại.
 Vaccin tái tổ hợp (vaccin công nghệ mới): Là những vaccin được sản xuất dựa vào kỹ
thuật di truyền và công nghệ gen, như vaccin viêm gan B tái tổ hợp.
Có nhiều hướng khác nhau để sản xuất vaccine cho một loại bệnh, điển hình là
vaccine bệnh thương hàn hiện nay. Ở Anh có ba loại vaccine khác nhau đã được cấp bản
quyền. Một là vaccine từ tế bào hoàn chỉnh bị giết chết, loại thứ hai là dịch chiết vỏ
polysaccharide của bệnh thương hàn, và loại thứ ba là chủng Salmonella typhi sống nhược
độc.
Vaccin tái tổ hợp phòng viêm gan B – Hepatitis B virus

Vaccin không phải là virus viêm gan đã bị làm yếu mà chỉ là 1 đoạn gen của virus này.
Khi tiêm chủng, gen HBS tạo ra từ các loài nấm men tái tổ hợp có thể gây biểu hiện miễn
dịch với virus viêm gan B. Nghiên cứu độc tính của vaccin tái tổ hợp cho thấy độ an toàn
cao.


2.2.

Kháng thể đơn dòng
Kháng thể là những phân tử protein được sản xuất bởi những những tế bào lympho B
khi có sự kích ứng đáp ứng miễn dịch bởi kháng nguyên trên cơ thể vật chủ
Có hai loại kháng thể :
- Kháng thể đa dòng: Tập hợp các kháng thể đặc hiệu với các epitope khác nhau trên
một kháng nguyên cho trước. Trong đáp ứng miễn dịch, cơ thể tổng hợp nhiều kháng thể
tương ứng với các epitope của cùng một kháng nguyên đáp ứng như vậy gọi là đa dòng.
- Kháng thể đơn dòng: chỉ nhận biết một epitope trên một kháng nguyên cho sẵn. Tất
cả các kháng thể đơn dòng cùng một dòng thì giống hệt nhau và được sản xuất bởi cùng
một dòng tương bào.
Các kháng thể có tính kết hợp đặc hiệu với các kháng nguyên đã kích ứng tạo ra
chúng. Đây chính là cơ sở của các phản ứng bảo vệ của cơ thể chống lại tác nhân gây bệnh
và của các kỹ thuật chuẩn đoán miễn dịch. Sự tạo thành kháng thể phụ thuộc vào bản chất
của kháng nguyên (protein, polysaccharide…), phương pháp gây miễn dịch (chất bổ trợ,
đường xâm nhập, số lần xâm nhập,…) và phụ thuộc vào cơ thể vật chủ (tình trạng sức
khỏe, tình trạng miễn dịch, dinh dưỡng, tuổi,…)
Các tế bào lympho B là các tế bào sản xuất kháng thể. Mỗi dòng tế bào lympho B chỉ
có thể sản xuất một loại kháng thể tương ứng với yếu tố kháng nguyên mà chúng nhận
diện được. Do mỗi kháng nguyên có nhiều yếu tố kháng nguyên khác nhau nên đáp ứng
miễn dịch sẽ tạo thành nhiều loại kháng thể khác nhau, trong trường hợp này ta có kháng
thể đa dòng (polyclonal antibody)
Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng dựa trên nguyên lý sử dụng tế bào lai (giữa
tế bào ung thư myeloma với tế bào lympho B của hệ miễn dịch ở động vật hoặc người) để
sản xuất kháng thể. Kháng thể đơn dòng có rất nhiều ứng dụng quan trọng trong y học:
phát hiện kháng nguyên, ức chế phản ứng đào thải khi ghép cơ quan, chẩn đoán sự hình
thành khối u, định hướng thuốc chữa bệnh bằng kháng thể đơn dòng, sử dụng kháng thể
đơn dòng để tinh sạch protein...
Sản xuất kháng thể đơn dòng
Kỹ thuật tế bào lai hybridoma (lai giữa tế bào myeloma với tế bào lympho B) đã mở
ra một phương thức mới trong miễn dịch học, để sản xuất vaccine hàng loạt. Người ta đã
tạo ra một loại tế bào lai có thể phân bào liên tục trong điều kiện nuôi cấy, đồng thời lại có
khả năng sản sinh ra kháng thể, từ đó kháng thể được sản xuất ra với khối lượng rất lớn.
Kháng thể này đặc trưng cho một dòng tế bào, nên được gọi là kháng thể đơn dòng. Quá
trình trên chính là hiện tượng lai tế bào, tức là khả năng dung hợp giữa một loại tế bào có
khả năng tái bản, sinh sản phát triển không ngừng với một loại tế bào có chức năng tạo ra
kháng thể


Ứng dụng của kháng thể đơn dòng
Kháng thể đơn dòng có công dụng đặc biệt quan trọng, được sử dụng để chẩn đoán
bệnh truyền nhiễm, bệnh di truyền, dị ứng, rối loạn miễn dịch. Dùng kháng thể đơn dòng là
phương tiện rất nhạy và đơn giản để chẩn đoán có thai, các bệnh lao, phong...
Kháng thể đơn dòng cũng được sử dụng để chống thụ thai, làm triệt sinh ở gia súc.
Kháng thể đơn dòng còn được dùng để chẩn đoán di căn ung thư nếu có gắn thêm đồng vị
phóng xạ.
Phương pháp sử dụng kháng thể đơn dòng đã nhanh chóng thay thế các phương
pháp miễn dịch học và huyết thanh học truyền thống trong các xét nghiệm, như:
- Xác định lượng hormone để đánh giá chức năng nội tiết.
- Phát hiện một số protein có ý nghĩa để chẩn đoán khối u.
- Xác định vi khuẩn và virus gây bệnh.
- Phát hiện trong máu các cầu thủ, các chất kích thích bị cấm sử dụng, kiểm tra nồng
độ thuốc trong máu và các tổ chức cơ thể nhằm bảo đảm liều thuốc dùng không quá
ngưỡng gây độc.
Kháng thể đơn dòng còn được dùng để ức chế phản ứng đào thải khi cấy ghép cơ
quan (ghép thận, truyền tủy...). Gần đây nhất, kháng thể đơn dòng còn được dùng để phát
hiện bệnh AIDS (hội chứng suy giảm miễn dịch).
2.3. Liệu pháp gen
Đối với loại bệnh di truyền, bệnh do đột biến gen người ta phải cần đến sự can thiệp
của liệu pháp gen, một hướng chữa bệnh gắn liền với các kỹ thuật tiên tiến trong lĩnh vực
công nghệ sinh học hiện đại như các vi thao tác gen, sửa đổi thay thế gen...
Liệu pháp gen (gene therapy) thực chất là phương pháp chữa bệnh bằng gen. Có
nhiều khái niệm khác nhau về liệu pháp gen, nhưng cách hiểu chung nhất là tập hợp các
biện pháp để sử dụng các gen cần thiết (còn gọi là gen trị liệu) nhằm mục đích chữa bệnh
cho con người


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×

×