Tải bản đầy đủ

Chiết xuất và phân lập thành phần saponin trong rễ thân cây sâm vũ diệp (panax bipinnatifidus seem ) thu hái ở tây bắc

dP
ha
r

KHOA Y DƢỢC

ma
cy
,V
NU

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

ĐẶNG THỊ THUỲ

an

CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP THÀNH PHẦN

ne


SAPONIN TRONG THÂN RỄ CÂY SÂM VŨ DIỆP

ici

(PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.)

oo

lo

fM

ed

THU HÁI Ở TÂY BẮC

Co

py

rig

ht

@

Sc
h

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC

HÀ NỘI - 2018


KHOA Y DƢỢC

dP
ha
r

ĐẶNG THỊ THUỲ

ma
cy
,V
NU

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP THÀNH PHẦN

an

SAPONIN TRONG THÂN RỄ CÂY SÂM VŨ DIỆP

ne

(PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.)

ed

ici

THU HÁI Ở TÂY BẮC

lo

fM

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC

oo

Khoá: QH.2013.Y

Sc
h

Ngƣời hƣớng dẫn:
1. TS. NGUYỄN HỮU TÙNG

Co

py

rig

ht

@

2. ThS. NGUYỄN THỊ HOÀNG ANH

HÀ NỘI - 2018


ma
cy
,V
NU

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện khoá luận tôi đã nhận đƣợc rất nhiều sự giúp đỡ từ
các thầy cô, bạn bè và gia đình.

Lời đầu tiên, với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời

cảm ơn đến TS. Nguyễn Hữu Tùng, giảng viên bộ môn Hoá dƣợc và Kiểm nghiệm

dP
ha
r

thuốc Khoa Y Dƣợc Đại học Quốc gia Hà Nội, ngƣời thầy đã hết lòng chỉ bảo,
hƣớng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học.
Tôi cũng xin bày tỏ sự biết ơn chân thành đến các thầy cô trong Khoa Y

Dƣợc Đại học Quốc gia Hà Nội, nhất là Ths. Nguyễn Thị Hoàng Anh, đã tạo điều

an

kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và làm khoá luận.

ne

Và tôi cũng xin cảm ơn chị Thuỷ- Khoa Dƣợc trƣờng Đại học y dƣợc Thái
Nguyên, chị Huệ và các bạn Phƣợng, Chuyên, Phƣơng- Khoa Y Dƣợc trƣờng Đại

ici

học Quốc gia Hà Nội đã luôn đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian qua.

ed

Lời cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ở bên tôi giúp đỡ

fM

động viên tôi trong học tập và cuộc sống.

lo

Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên không thể tránh khỏi những thiếu
sót. Tôi rất mong nhận đƣợc những ý kiến đóng góp của quý thầy cô và các bạn.

Co

py

rig

ht

@

Sc
h

oo

Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 09 tháng 05 năm 2018
Sinh viên
Đặng Thị Thuỳ


ma
cy
,V
NU

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC HÌNH
DANH MỤC CÁC BẢNG

ĐẶT VẤN ĐỀ ...........................................................................................................1

dP
ha
r

Chƣơng 1 - Tổng quan ..............................................................................................2
1.1. Tổng quan chung về sâm vũ diệp ...............................................................2
1.1.3. Đặc điểm thực vật, bộ phận dùng ...........................................................2
1.1.4. Phân bố và sinh thái ................................................................................3
1.1.5. Tác dụng dƣợc lý ....................................................................................3
1.1.7.

Thành phần hoá học ................................................................................4

an

1.2. Tổng quan các phƣơng pháp sắc ký ..........................................................6
1.2.1. Sắc ký cột ................................................................................................6
1.2.2. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ..........................................................................7
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ........................................................8

ne

1.2.3.

ici

1.3. Tổng quan về các phƣơng pháp xác định cấu trúc...................................9
1.3.1. Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) ................................9
Phƣơng pháp phân tích khối phổ (MS) .................................................10

ed

1.3.2.

lo

fM

Chƣơng 2 - Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu ............................................11
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ................................................................................11
2.2. Phƣơng tiện nghiên cứu ............................................................................11
2.2.1. Dung môi, hoá chất ...............................................................................11
2.2.2.

Thiết bị, dụng cụ ...................................................................................12

Sc
h

oo

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ..........................................................................12
2.3.1. Phƣơng pháp xử lý và chiết mẫu ..........................................................12
2.3.2. Phƣơng pháp phân lập và tinh chế các hợp chất hoá học .....................12
2.3.3. Phƣơng pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất ..........................12

@

2.3.4. Phƣơng pháp phân tích định tính các hợp chất bằng sắc ký lỏng hiệu
năng cao ..............................................................................................................13

Co

py

rig

ht

Chƣơng 3- Kết quả thực nghiệm và bàn luận ......................................................13
3.1. Chiết xuất và tinh chế các hợp chất saponin từ thân rễ SVD ...............13
3.1.1. Chiết xuất và phân lập ..........................................................................13
3.1.2. Kiểm tra độ tinh khiết hai chất phân lập đƣợc bằng SKLM .................15
3.2. Xác định cấu trúc của 2 saponin phân lập đƣợc.....................................16
3.2.1. Hợp chất số 1 ........................................................................................16
3.2.2. Hợp chất số 2 ........................................................................................19


ma
cy
,V
NU

3.3. Phân tích định tính và dấu vân tay hoá học của các hợp chất bằng sắc
ký lỏng hiệu năng cao ..........................................................................................22

Chƣơng 4 - Bàn luận ...............................................................................................23
4.1. Về xử lý chiết mẫu và phân lập chất tinh khiết ......................................23
4.2. Xác định cấu trúc các hợp chất ................................................................24
4.3. Xây dựng dấu vân tay sắc ký dƣợc liệu SVD bằng HPLC ....................24

dP
ha
r

Chƣơng 5 - Kết luận và kiến nghị ..........................................................................25
5.1. Kết luận ......................................................................................................25
5.2. Kiến nghị ....................................................................................................26
TÀI LIỆU THAM KHẢO

Co

py

rig

ht

@

Sc
h

oo

lo

fM

ed

ici

ne

an

PHỤ LỤC


ma
cy
,V
NU

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
13

C-NMR

Carbon 13 nuclear magnetic resonance
DEPT

IR

Infrared

HPLC

High performance liquid chromatography

1

Proton nuclear magnetic resonance

H-NMR

Mass spectrum

NMR

Nuclear magnetic resonance

Rf

Retardation factor

RP18

Reversed Phase 18

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

TLC

Thin layer chromatography

UV

Ultra violet

VIS

Visible

ht

@

Sc
h

oo

lo

fM

ed

ici

ne

an

MS

rig
py
Co

dP
ha
r

DEPT


ma
cy
,V
NU

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Tên hình

Trang

Hình 1. Cấu trúc hoá học của 10 saponin tách đƣợc từ thân rễ
SVD

Hình 2. Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái tại
Hình 3. Sơ đồ chiết phân đoạn lỏng-lỏng

dP
ha
r

Sapa, Lào Cai 15/07/2016

Hình 4. Sơ đồ phân lập sắc ký 2 hợp chất tinh khiết từ phân
đoạn BuOH
phun thuốc thử H2SO4 10% /EtOH

an

Hình 5. Sắc ký đồ của chất số 1 và số 2 phân lập đƣợc sau khi

14
15
15

Hình 7. Cấu trúc hóa học của hợp chất số 2

22

Hình 8. Sắc ký đồ HPLC của hai saponin phân lập đƣợc 1

23

ici

ne

19

ed

fM
lo
oo
Sc
h
@
ht
rig
py

11

Hình 6. Cấu trúc hóa học của hợp chất số 1

(A), 2 (B) và cao butanol của SVD

Co

5


Tên bảng

ma
cy
,V
NU

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1. Các hợp chất saponin đã phân lập từ SVD

Bảng 2. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR, DEPT của hợp chất
số 1

Co

py

rig

ht

@

Sc
h

oo

lo

fM

ed

ici

ne

an

dP
ha
r

Bảng 3. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất số 2

5

16
19


ma
cy
,V
NU

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là vùng đất của nhiều các loài thảo dƣợc quý đặc biệt là các loài
thuộc chi sâm. Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) là một cây thuốc quý
thuộc chi Sâm (Panax) đang đƣợc sử dụng trong các bài thuốc truyền thống và có

dP
ha
r

tiềm năng để phát triển thành sản phẩm chăm sóc sức khỏe nhƣ các loài khác cùng
chi. Gần đây sâm vũ diệp đƣợc thuần hoá và bƣớc đầu đƣợc trồng thử nghiệm ở một
số địa phƣơng nhƣ Hà Giang và Lào Cai [1; 13]. Về mặt y học, thân rễ sâm vũ diệp
đã đƣợc sử dụng làm thuốc bổ và có mặt trong một số bài thuốc truyền thống của
các dân tộc vùng núi Tây Bắc.
Ở Việt Nam và thế giới, tổng quan tài liệu thấy rằng không có nhiều các

an

nghiên cứu về thành phần hoá học và tác dụng sinh học của dƣợc liệu sâm vũ diệp.
Vì vậy, việc nghiên cứu một cách có hệ thống về thành phần hoá học và tác dụng
sinh học để thu thập thêm bằng chứng khoa học và nâng cao hiệu quả sử dụng loại
dƣợc liệu quý này hứa hẹn nhiều kết quả có giá trị khoa học và thực tiễn. Năm 2017

fM

ed

ici

ne

vừa qua, nhóm nghiên cứu của Khoa Y Dƣợc Đại học Quốc Gia Hà Nội đã thực
hiện nghiên cứu bƣớc đầu về thành phần hoá học của thân rễ cây sâm vũ diệp thu
hái ở Sapa, Lào Cai với 3 hợp chất phân lập đƣợc từ phân đoạn ít phân cực ethyl
acetat [7; 8]. Tiếp nối nghiên cứu trên chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu
thành phần saponin của thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) trồng ở
Tây Bắc”. Kết quả của đề tài sẽ góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu thành phần hoá

lo

học, từ đó làm tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn nhƣ định tính định lƣợng cũng
nhƣ nghiên cứu về tác dụng sinh học của loài sâm này.

Sc
h

oo

Mục tiêu của đề tài bao gồm:
1. Chiết xuất và phân lập các hợp chất saponin chính ở phân đoạn n-butanol
của thân rễ của sâm vũ diệp.

@

2. Xác định cấu trúc hoá học của các saponin phân lập đƣợc
3. Xây dựng dấu vân tay sắc ký sâm vũ diệp bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
Đề tài này là một phần trong đề tài cấp Nhà nƣớc thuộc Chƣơng trình Tây
Bắc “Ứng dụng các giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu

ht

và tạo sản phẩm từ hai loài cây Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam

Co

py

rig

thất hoang (Panax stipuleanatus H. Tsai et K.M.)”, mã số: KHCN-TB.07C/13-18.

1


ma
cy
,V
NU

Chƣơng 1 - Tổng quan

1.1. Tổng quan chung về sâm vũ diệp
1.1.1. Tên khoa học, tên đồng danh
Sâm vũ diệp còn có tên khác là vũ diệp tam thất, hoa diệp tam thất, trúc tiết
nhân sâm, tam thất lá xẻ, sâm hai lần xẻ, phan xiết (Dao), hoàng liên thất, nữu tử
thất, tam thất lá lông chim, hƣơng sơn tam thất (Trung Quốc) có tên khoa khoa học

dP
ha
r

là Panax bipinnatifidus Seem. [1; 12].
Một số tên đồng danh của SVD:
Aralia bipinnatifida (Seem.) C. B. Clarke; Aralia quinquefolia (L.) Dec. et
Plan.var.major Burk; Aralia quinquefolia (L.) Dec.et Plan.var.elegantior Burk;
Panax pseudoginseng Wall.var.bipinnatifidus (Seem.) Li; Panax pseudoginseng
Wall. var. major (Burk.) Li; Panax major Ting ex Pei; Panax pseudoginseng Wall.

ne

an

spp. Himalaicus Hara; Panax pseudoginseng Wall.var.elegantior (Burk) Hoo et
Tseng; Panax Japonicus Mey.var.bipinnatifidus (Seem.) Wu et Feng [12].
1.1.2. Vị trí phân loại [2]
Trong hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan (1987), SVD thuộc chi

ed

ici

Nhân sâm (Panax L.), họ Ngũ gia bì (Araliaceae)
Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)

fM

Phân lớp Hoa hồng (Rosidae)

Chi Nhân sâm (Panax L.)

oo

lo

Bộ Hoa tán (Apiales)
Họ Ngũ gia bì (Araliaceae)

Sc
h

1.1.3. Đặc điểm thực vật, bộ phận dùng
Cây thân thảo sống nhiều năm. Thân rễ dài có nhiều đốt và những vết sẹo do
thân rụng hàng năm để lại. Thân khí sinh mảnh, cao 20-30 cm, thƣờng đơn độc,

ht

@

mọc thẳng, rỗng giữa, có vạch dọc, thƣờng lụi tàn vào mùa đông, mọc chồi thân
mới từ giữa tháng 2 đến đầu tháng 3 dƣơng lịch. Lá kép chân vịt, gồm 2-3 cái mọc
vòng. Lá chét 5-7 (ít khi 3) thuôn, dài 2,5-14 cm, rộng 1,5-4 cm, gốc tròn, đầu thuôn

Co

py

rig

thành mũi nhọn, xẻ thuỳ không đều, mép có răng cƣa, có lông.
Cụm hoa tán đơn, mọc ở ngọn; cuống cụm hoa 5-10 cm; cụm hoa có từ 2090 hoa; cuống hoa mảnh dài 1-1,5 cm. Hoa màu trắng đục, mọc thành tán đơn ở
ngọn thân, 5 cánh hoa, bầu 2-3 ô. Quả mọng, hình cầu hơi dẹt, đƣờng kính 0,6-1,2
cm, khi chín màu đỏ, có chấm đen to ở đầu, chứa 1-2 hạt. Hạt hình cầu hoặc gần

2


ma
cy
,V
NU

cầu, màu xám trắng; vỏ cứng, có rốn hạt [1; 5; 12; 13]. Bộ phận dùng: dƣợc liệu là

thân rễ SVD [1].
1.1.4. Phân bố và sinh thái
Trong tự nhiên SVD phân bố ở Trung Quốc, Ấn Độ, Nepan (vùng cận
Hymalaya) và dãy núi Hoàng Liên Sơn, Tây Bắc nƣớc ta. Sapa ở Việt Nam cũng là

dP
ha
r

điểm phân bố cuối cùng của SVD ở phía nam. Năm 1973, cây đã đƣợc phát hiện ở
núi Hàm Rồng, sát thị trấn Sapa, ở độ cao 1600 m. Hiện nay vùng phân bố của Sâm
vũ diệp đã bị thu hẹp dần, từ độ cao khoảng 1800 m trở lên, cây đƣợc coi là cực
hiếm. Gần đây SVD đã đƣợc thuần hoá và bƣớc đầu đƣợc trồng thử nghiệm ở một
số địa phƣơng ở Hà Giang, Lào Cai. Đây là một loài quý hiếm và đang đứng trƣớc
nguy cơ tuyệt chủng cao ở Việt Nam [1; 13].

SVD là loài thân thảo ƣa bóng và đặc biệt ƣa ẩm, thƣờng mọc rải rác hay tập

ne

an

trung dƣới tán rừng ẩm, gần nhƣ quanh năm có sƣơng mù. Hàng năm vào cuối
tháng 2 và đầu tháng 3 từ phần đầu mầm rễ phân nhánh ngang nằm sát mặt đất sẽ
mọc lên một hoặc một vài chồi thân (tuỳ thuộc vào số lƣợng đầu mầm ở rễ). Chồi
này thƣờng sinh trƣởng nhanh trong vòng một tháng đã ra lá và gần đạt đƣợc chiều

ed

ici

cao cực đại. Đến tháng 4, mỗi thân mang lá có thể cho ra một cụm hoa. Quả xanh
quan sát đƣợc vào cuối tháng 4-6, đến tháng 7 quả đã chín và rụng xuống quanh gốc
cây mẹ. Do quả chín đúng vào thời kỳ có lƣợng mƣa lớn tháng 7-8 nên hạt giống

fM

thƣờng bị cuốn trôi, ảnh hƣởng đến khả năng tái sinh tự nhiên của SVD. Sau khi
quả chín, từ tháng 9-10, toàn bộ phần thân trên mặt đất tàn lụi qua mùa đông, để lộ

lo

những vết sẹo thân rễ khá rõ. Đó là dấu hiệu giúp ta xác định tuổi của cây [1].

Sc
h

oo

1.1.5. Tác dụng dƣợc lý
SVD có tác dụng gây động dục, hƣớng sinh dục, liều thấp có tác dụng làm
giảm thời gian ngủ do phenobarbital, tăng sức dẻo dai cho cơ thể và tán huyết [1].
Năm 2016, nhóm nghiên cứu Trung Quốc đã công bố kết quả sàng lọc hoạt
tính diệt tế bào ung thƣ từ 57 cây trong cơ sở dữ liệu y học cổ truyền Trung Quốc,

ht

@

Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) là một trong số những loài thể hiện hoạt
tính ức chế sự phát triển của các tế bào ung thƣ [24].
Sâm vũ diệp có tác dụng ức chế ngƣng tập tiểu cầu trên in vitro ở các phân

py

rig

đoạn và các mức liều: phân đoạn tổng, phân đoạn n-butanol, phân đoạn ethylacetat
có tác dụng ở các mức liều: 0,5 mg/mL, 1 mg/mL, 2 mg/mL, 5 mg/mL, phân đoạn
ether ở các mức liều 1-2-5 mg/mL [15].

Co

1.1.6. Tính vị và công dụng

3


ma
cy
,V
NU

Sâm vũ diệp có vị đắng, ngọt, tính hơi ấm, có tác dụng dƣỡng huyết, hoạt lạc,

chỉ huyết, tán ứ.
Theo đông y, SVD có tác dụng bổ, chữa thiếu máu, xanh xao, gầy yếu, nhất là
đối với phụ nữ sau đẻ. SVD còn đƣợc dùng cầm máu, tán ứ, tiêu sƣng. Dùng ngoài, rễ
phơi khô, tán bột mịn, rắc chữa chảy máu và làm vết thƣơng mau lành. Rễ cây SVD

dP
ha
r

còn đƣợc ngâm rƣợu rồi chiết dƣới dạng tinh sâm dùng rất tốt, có tác dụng kích thích
sinh dục. Ngoài ra nhân dân ở vùng trồng còn tận dụng cả thân và lá nấu cao, cao này
pha với nƣớc hoặc rƣợu để uống cũng có tác dụng nhƣ rễ. Ở Trung Quốc, SVD là
thuốc chữa hƣ lao thổ huyết, chảy máu cam, đòn ngã tổn thƣơng [1; 5].
1.1.7. Thành phần hoá học
Rễ SVD chứa saponin triterpen thuộc nhóm oleanan gồm những chất nhƣ:
chikusetsusaponin IV, zingibrosid R1, ginseninosid Ro, Rb1, Rd, Re, Rg1, và Rg2

an

[1].

ne

Năm 1989, nhóm nghiên cứu Trung Quốc đã công bố 13 saponin từ lá của loài
sâm vũ diệp Panax japonicus var. bipinnatifidus (Seem.) Wu et Feng thu hái ở dãy núi
Tần Lĩnh, Thiểm Tây, Trung Quốc. Trong đó có hai saponin mới là bipinnatifidusoside

ed

ici

F1 và F2 và 11 saponin đã biết trƣớc đó gồm ginsenoside F1, F2, F3, Rg2, Re, Rd,
Rb1, Rb3, 24S-pseudoginsenoside F11, panasenoside và majoroside F1. Cấu trúc của
hai saponin mới đã đƣợc xác định là dammar-25(26)-ene-3-beta, 12 beta, 20(S), 24

fM

zeta-tetraol-(20-O-beta-D-glucopyranosyl)-3-O-beta-D-glucopyranosyl (1-2)-beta-Dglucopyranoside (bipinnatifidusoside F1) và dammar-22(23)-ene-3-beta, 12 beta, 20

lo

(S), 24-zeta-tetraol-(20-O-beta-D-glucopyranosyl)-3-O-beta-D-glucopyranosyl (1-2)-

Sc
h

oo

beta-D-glucopyranoside (bipinnatifidusoside F2) [26].
Năm 2002, nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự đã chỉ ra rằng trong
thân rễ của SVD có chứa hai nhóm chất chính là polyacetylen, saponin cùng với
acid béo, acid amin. Đồng thời bằng cách thuỷ phân saponin rồi kết tinh sapogenin
toàn phần thu đƣợc acid oleanolic [9; 10].

ht

@

Năm 2011, nhóm nghiên cứu Việt Nam-Hàn Quốc phân lập đƣợc 10 saponin
khung oleanan từ dịch chiết MeOH của rễ cây SVD (hình 1), bao gồm 3 hợp chất
mới bifinoside A-C (1-3) và 7 hợp chất đã biết bao gồm nacrissiflorine methyl este

Co

py

rig

(4), chikusetsusaponin IVa (5), pseudoginsenoside RP1 methyl este (6),
stipuleanoside R1 (7), pseudoginsenoside RT1 methyl este (8), mormordin IIe (9)
và stipuleanoside R2 methyl este (10) [25].

4


ma
cy
,V
NU
dP
ha
r
an
ne

ici

Hình 1. Cấu trúc hoá học của 10 saponin tách được từ rễ SVD
Năm 2017, Đỗ Văn Hào và cộng sự đã phân lập đƣợc 3 hợp chất từ phân

ed

đoạn ethylacetat của thân rễ SVD. Các hợp chất đó là β-sitosterol, oleanolic acid và

fM

daucosterol [7].

Bảng 1. Các hợp chất saponin đã phân lập từ SVD
[25]

2

Zingibrosid R1

[26]

Ginsenoside Ro

[26]

4

Ginsenoside F1

[26]

5

Ginsenoside F2

[26]

6

Ginsenoside F3

[26]

7

Ginsenoside Rb1

[26]

8

Ginsenoside Rd

[26]

9

Ginsenoside Rg1

[26]

10

Ginsenoside Rg2

[26]

11

Ginsenoside Rb3

[26]

oo

Chikusetsusaponin IV

Sc
h
@
ht
rig
py

TLTK

1
3

Co

Hợp chất

lo

STT

5


Ginsenoside Re

[26]

13

24-S-pseudoginsenoside F11

14

Panasenoside

15

Majoroside F1

16

Bipinnatifidusoside F1

17

Bipinnatifidusoside F2

18

Bifinoside A

19

Bifinoside B

20

Bifinoside C

21

Nacrissiflorine methyl este

22

Pseudoginsenoside RP1 methyl este

23

Pseudoginsenoside RT1 methyl este

[25]

24

Stipuleanoside R1

[26]

25

Stipuleanoside R2 methyl este

26

Mormordin IIe

ma
cy
,V
NU

12

[26]
[26]
[26]
[26]
[26]
[25]
[25]
[25]
[25]

[26]
[25]

ed

ici

ne

an

dP
ha
r

[25]

fM

Nhƣ vậy cho tới hiện tại đã có 26 hợp chất saponin đƣợc phân lập từ SVD
Nhận xét chung: qua các nghiên cứu về thành phần hoá học của SVD chúng

lo

tôi thấy rằng saponin chiếm hàm lƣợng chủ yếu trong thân rễ SVD. Do đó chúng tôi
lựa chọn nghiên cứu thành phần saponin, cụ thể là ở phân đoạn n-butanol (phân

oo

đoạn giàu saponin nhất).

Sc
h

1.2. Tổng quan các phƣơng pháp sắc ký
1.2.1. Sắc ký cột

@

Pha tĩnh là những hạt có kích thƣớc tƣơng đối lớn (50-150 µm), đƣợc nạp
trong cột thuỷ tinh. Mẫu chất cần phân tích đƣợc đặt trên đầu cột, phía trên pha tĩnh
(có một lớp thuỷ tinh che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi
giải ly đƣợc đặt trên cao. Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phần bên dƣới cột đƣợc

rig

ht

hứng vào những lọ nhỏ đặt ngay ống dẫn ra của cột. Phƣơng pháp này thƣờng làm
cho quá trình tách bị chậm, hiệu quả thấp so với sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Tuy

Co

py

vậy sắc ký cột cũng có ƣu điểm là pha tĩnh và các dụng cụ dễ kiếm, có thể triển khai
với một lƣợng mẫu tƣơng đối lớn. Các bƣớc thực hiện sắc ký cột gồm:

6


ma
cy
,V
NU

+ Lựa chọn chất hấp phụ: pha tĩnh là silicagel loại thƣờng, hợp chất không

phân cực đƣợc giải ly khỏi cột trƣớc, hợp chất phân cực đƣợc giải ly sau. Với 2
phân tử không phân cực, phân tử nào có trọng lƣợng phân tử lớn sẽ có tính phân cực
mạnh hơn phân tử kia, nó bị pha tĩnh giữ laị trong cột nên di chuyển ra khỏi cột
chậm hơn so với các phân tử nhỏ, và cũng có khi nó ở lại lâu hơn trong cột so với

dP
ha
r

phân tử tuy có tính phân cực.
+ Lựa chọn dung môi: Mẫu sắc ký đƣợc hoà tan hoàn toàn trong dung môi
phù hợp với nồng độ 10 mg/ml, gọi là dung dịch mẫu (A). Chuẩn bị 4-6 tấm bản
mỏng 2,5x10 cm. Chấm lên những tấm bản này mỗi tấm khoảng 2-5 µl dung dịch
(A). Mỗi bản mỏng đƣợc triển khai với một loại dung môi giải ly khác nhau, kế đó
phát hiện bằng đèn UV hay thuốc thử. Với đơn dung môi sẽ dễ dàng thấy đƣợc

dung môi nào phù hợp. Từ kết quả đó, tìm một hỗn hợp dung môi, trong đó một

ne

an

dung môi phân cực và một dung môi kém phân cực.
+ Nạp chất hấp phụ dạng khô vào cột: dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng trên
giá, cho dung môi loại kém phân cực nhất vào khoảng 2/3 chiều cao cột. Cho chất
hấp thụ dạng khô vào thẳng trong cột, đều đặn, mỗi lần một lƣợng nhỏ, vừa cho vừa

ed

ici

gõ nhẹ vào thành cột. Khi lớp chất hấp phụ đạt đƣợc chiều cao khoảng 2 cm trong
cột, thì mở nhẹ khoá ở bên dƣới để cho dung môi chảy ra, hứng vào một bình trống
để bên dƣới cột, dung môi này sẽ đƣợc rót lại lên đầu cột. Sau khi nạp xong, cho

fM

dung môi chảy qua chất hấp phụ vài lần đến khi chất hấp phụ trong cột đồng nhất.
+ Nạp mẫu: Mẫu ở dạng lỏng cho trực tiếp lên đầu cột sắc ký. Nếu mẫu dạng

lo

rắn thì hoà tan chất vào trong một lƣợng nhỏ dung môi. Loại dung môi cho khởi đầu

Sc
h

oo

sắc ký.
+ Hứng và gom dịch rửa giải: quá trình rửa giải, dịch rửa đƣợc hứng bằng
ống thuỷ tinh. Dịch rửa giải trong các ống đƣợc gom lại dựa vào kết quả phân tích
sắc ký lớp mỏng [4; 6; 16;18].
1.2.2. Sắc ký lớp mỏng (TLC)

ht

@

Nguyên tắc:
Dựa vào hệ số phân tách khác nhau của chất cần phân tích giữa 2 pha: pha
động và pha tĩnh. Chất cần phân tích đƣợc hấp phụ (hoặc phân bố hoặc trao đổi ion)

Co

py

rig

trên pha tĩnh, pha động chạy qua pha tĩnh đồng thời kéo theo chất cần phân tích.
Các thành phần sau khi đƣợc phân tách riêng biệt khỏi hỗn hợp đƣợc lƣu giữ trên
pha tĩnh.
Sau đó có thể nhận biết chất cần phân tích bằng ánh sáng thƣờng (nếu các
chất phân tích có màu) hoặc soi huỳnh quang ở các bƣớc sóng 254 nm, 366 nm

7


ma
cy
,V
NU

hoặc phun thuốc thử hiện màu hoặc quét lên bề mặt bản mỏng thiết bị densitometer
(một thiết bị đo cƣờng độ phản xạ ánh sáng tử ngoại hặc khả kiến của chất cần phân
tích). Tuỳ thuộc bản chất của chất cần phân tích ta có thể sử dụng một trong các
phƣơng pháp trên để phát hiện vết chất trong hỗn hợp cần phân tích.
Các đại lƣợng đặc trƣng

dP
ha
r

+ Hệ số lƣu giữ Rf
Đại lƣợng đặc trƣng cho mức độ dịch chuyển của các chất phân tích là hệ số
lƣu giữ Rf. Trị số của nó đƣợc tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách dịch chuyển của
chất phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động:
(1)

Trong đó:

là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm)

động (cm) (đo trên cùng đƣờng đi của vết)

an

là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha

:

ici

+ Hệ số lƣu giữ tƣơng đối

ne

có giá trị dao động giữa 0 và 1

là đƣờng đi của chất phân tích (cm)

ed

Trong đó:

(2)

là đƣờng đi của chất chuẩn (cm)
càng gần 1 thì chất phân tích và chất chuẩn càng đồng nhất)

fM

(giá trị

oo

lo

[4; 6; 16; 17].
1.2.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
a. Nguyên tắc của HPLC

Sc
h

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một kĩ thuật phân tích dựa trên cơ sở sự phân
tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động
dƣới áp suất cao. Pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn
dƣới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ trên một chất mang rắn, hay một chất

@

mang đã đƣợc liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ.

ht

Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc

Co

py

rig

phân loại theo kích cỡ. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của
chúng giữa 2 pha tức là liên quan đến ái lực tƣơng đối của chất này với pha tĩnh và
pha động. Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào yếu tố đó.
Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ đƣợc phát hiện bằng detector. Nếu ghi quá
trình tách sắc ký của hỗn hợp nhiều thành phần, ta sẽ có một sắc đồ gồm nhiều pic.
8


ma
cy
,V
NU

Quá trình sắc ký tốt thì hỗn hợp gồm nhiều thành phần sẽ có bấy nhiêu pic riêng
biệt đƣợc tách ra trên sắc ký đồ

b. Ứng dụng của phƣơng pháp HPLC
- Định tính: dựa vào thời gian lƣu, hình dạng pic của mẫu thử và mẫu chuẩn,
hoặc chồng phổ của pic thử và pic chuẩn để định tính chất thử

dP
ha
r

- Xác định tạp chất: dùng để kiểm tra tạp chất trong mẫu thử, trên sắc ký đồ
không có pic tại thời gian lƣu của tạp chất khi chạy sắc ký trong cùng điều kiện
- Định lƣợng: dựa trên nguyên tắc nồng độ của một chất tỷ lệ với chiều cao
hoặc diên tích pic của nó [4; 14; 18].
1.3.
Tổng quan về các phƣơng pháp xác định cấu trúc
1.3.1. Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR)
a. Nguyên tắc

ne

an

Nếu hạt nhân nguyên tử có từ tính đƣợc đặt trong từ trƣờng, khi thay đổi từ
trƣờng sẽ dẫn đến hấp thụ năng lƣợng của sóng vô tuyến và xuất hiện phổ cộng
hƣởng từ hạt nhân.
Những hạt nhân nguyên tử có khối lƣợng là số lẻ và những hạt nhân nguyên

ed

ici

tử có khối lƣợng là số chẵn nhƣng số thứ tự nguyên tử là số lẻ thì có momen từ và
cho tín hiệu NMR. Các hạt nhân nguyên tử có khối lƣợng và số thứ tự nguyên tử là
những số chẵn thì không có momen từ và không cho tín hiệu NMR. Vị trí của tín

fM

hiệu cộng hƣởng từ proton trong phổ NMR phụ thuộc vào mật độ điện tử ở vùng lân

lo

cận quanh proton đó.
b. Các đại lƣợng đặc trƣng

Sc
h

oo

- Độ chuyển dịch hoá học: sự khác nhau về vị trí hấp thụ giữa proton của
mẫu phân tích và của chất chuẩn đƣợc gọi là độ chuyển dịch hoá học (δ).
)

(

)

(3)

@

Trong đó:

(

ht

δ: độ chuyển dịch hoá học
νmau: tần số của mẫu phân tích
νmay: tần số làm việc của máy
- Hằng số tƣơng tác spin

Co

py

rig

νTMS: tần số của mẫu chuẩn tetramethylsilane

9


ma
cy
,V
NU

Khoảng cách giữa các vạch của tín hiệu bội đƣợc biểu hiện bằng Hz, đặc

trƣng cho sự tƣơng tác gọi là hằng số tƣơng tác spin (J). Trị số J phụ thuộc vào
tƣơng quan không gian và mật độ điện tử ở vùng lân cận của 2 proton tƣơng tác.
- Diện tích dƣới tín hiệu
Diện tích dƣới tín hiệu tỷ lệ với số lƣợng proton cho tín hiệu đó. Đƣờng

dP
ha
r

cong tích phân diện tích dƣới tín hiệu cho biết số lƣợng tƣơng đối của proton cho tín
hiệu.
c. Ứng dụng của phổ NMR
Bằng cách xác định độ chuyển dịch hoá học δ, hằng số tƣơng tác J và diện
tích dƣới tín hiệu ngƣời ta có thể biện giải phổ và kết hợp với các thông tin của các
loại phổ khác nhƣ IR, MS từ đó xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất hữu cơ
[3; 4; 17].

ne

an

1.3.2. Phƣơng pháp phân tích khối phổ (MS)
a. Nguyên tắc
Dùng chùm điện tử có năng lƣợng trung bình (50-100 eV) để bắn phá phân
tử hữu cơ ở môi trƣờng chân không cao (10-3- 10-6mmHg). Trong quá trình đó chất

ed

ici

hữu cơ bị ion hoá và bị phá vỡ thành các mảnh. Các ion đƣợc tạo thành trong buồng
ion hoá, đƣợc gia tốc và tách riêng nhờ bộ phận phân tích khối trƣớc khi đến
detector. Tín hiệu tƣơng ứng với các ion sẽ đƣợc thể hiện bằng một số vạch (pic) có

fM

cƣờng độ khác nhau tập hợp lại thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối.
b. Ứng dụng

lo

- Xác định các đồng vị: Các nguyên tử đồng vị của cùng một nguyên tố có

Sc
h

oo

cùng số điện tích hạt nhân chỉ khác nhau về số neuron trong nhân đó nên khối lƣợng
nguyên tử khác nhau. Có thể dùng MS để xác định thành phần các đồng vị của các
nguyên tố trong mẫu.
- Định tính:
+ Phân tích khối phổ có thể cho rất chính xác khối lƣợng các ion phân tử

ht

@

M+, (M+1)+, (M+2)+, đây là các đặc trƣng quan trọng của hợp chất hoá học. Bên
cạnh đó xem xét thêm các pic đồng vị, tỷ số cƣờng độ của chúng cùng với khối
lƣợng của các mảnh ion có thể xác định công thức nguyên của chất phân tích.

Co

py

rig

+ Có thể so sánh phổ nghiên cứu với thƣ viện phổ có trong máy hoặc phổ
nghiên cứu với phổ chất đối chiếu để khẳng định thành phần định tính của mẫu.

- Xác định công thức cấu tạo: để xác định công thức cấu tạo của chất nghiên
cứu cần dùng kỹ thuật ion hoá thích hợp phân tách chất nghiên cứu thành nhiều

10


ma
cy
,V
NU

mảnh ion để làm rõ cấu tạo ghép nối của chúng. Việc biện giải phổ nên kết hợp với

phổ NMR và phổ IR.
- Định lƣợng: phân tích định lƣợng khối phổ tƣơng tự nhƣ các kỹ thuật khác
dùng cách thiết lập đƣờng chuẩn hoặc thêm đƣờng chuẩn cùng với độ cƣờng độ
vạch phổ để xác định nồng độ [3; 4; 17].
Chƣơng 2 - Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu
Đối tƣợng nghiên cứu

dP
ha
r

2.1.

Mẫu nghiên cứu là thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) đƣợc
thu hái ở Sa a, Lào Cai vào tháng 15-07-2016 và đƣợc giám định tên khoa học bởi
TS. Phạm Thanh Huyền, Khoa Tài nguyên dƣợc liệu, Viện Dƣợc liệu. Mẫu dƣợc
liệu (DL-150716) đƣợc lƣu tại Phòng Tiêu bản của Khoa Tài nguyên Dƣợc liệu-

lo

fM

ed

ici

ne

an

Viện Dƣợc liệu.

oo

Hình 2. Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.)
thu hái tại Sa Pa, Lào Cai 15/07/2016

@

Sc
h

2.2. Phƣơng tiện nghiên cứu
2.2.1. Dung môi, hoá chất
Dung môi dùng trong chiết xuất phân lập nhƣ ethanol (EtOH), methanol
(MeOH), dicloromethan (CH2Cl2), chloroform (CHCl3), ethyl acetat (EtOAc), nbutanol (BuOH) đều đạt tiêu chuẩn công nghiệp và đƣợc cất lại trƣớc khi dùng.

rig

ht

Pha tĩnh dùng trong sắc ký cột là silica gel (0,040 – 0,063 mm, Nacalai Tesque
Inc., Nhật Bản), silica gel pha đảo ODS-A (50 µm, YMC Co. Ltd., Nhật Bản).
Bản mỏng tráng sẵn trên đế nhôm loại pha thƣờng Kiesel 60 F254 và pha đảo

Co

py

TLC silica gel 60 RP-18 F254 S (Merk, Damstadt, Đức).

11


ma
cy
,V
NU

Phát hiện bằng đèn tử ngoại ở bƣớc sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc
thử là dung dịch H2SO4 10 % trong ethanol hơ nóng để phát hiện vết chất.
Dung môi chạy sắc ký HPLC (methanol, acetonitrile, acid acetic) của Merk,
Đức, nƣớc cất dùng cho phân tích.
2.2.2. Thiết bị, dụng cụ

dP
ha
r

- Máy Jasco DIP-360 digital polarimeter (Jasco, Nhật Bản): đo năng suất
quay cực
- Máy Stuart SMP3 (Sanyo, Nhật Bản): đo điểm nóng chảy
- Máy AGILENT 1260 Series LC-MS/MS ion Trap (Agilent Technologies,
Hoa Kỳ): đo phổ khối ion hoá phun mù điện tử (ESI-MS)
- Máy JEOL ECX 400 (Jeol, Nhật Bản): đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân
một và hai chiều, sử dụng dung môi CDCl3/CD3OD, chất nội chuẩn là

ne

an

tetramethylsilan (TMS)
- Hệ thống sắc ký HPLC Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Mỹ)
với detector DAD và bộ phận bơm mẫu tự động
Phƣơng pháp nghiên cứu
Phƣơng pháp xử lý và chiết mẫu
- Phƣơng pháp chiết mẫu: chiết hồi lƣu đơn giản với dung môi ethanol 70
%/nƣớc

ed

ici

2.3.
2.3.1.

fM

- Phƣơng pháp chiết phân đoạn: chiết lỏng lỏng
Quy trình: Thân rễ sâm vũ diệp đƣợc chiết hồi lƣu 3 lần với ethanol 70 % ở

lo

70ºC. Tiến hành lọc loại bỏ bã dƣợc liệu, gộp dịch lọc, sử dụng máy cô quay chân

Sc
h

oo

không dƣới áp suất giảm tại 50ºC thu đƣợc cao khô. Cao khô này đem phân tán
trong nƣớc rồi lắc lần lƣợt với các dung môi có độ phân cực khác nhau (ete, ethyl
acetat và butanol), thu đƣợc các phân đoạn tƣơng ứng.
2.3.2.
Phƣơng pháp phân lập và tinh chế các hợp chất hoá học
Sử dụng các kỹ thuật sắc ký bao gồm:

ht

@

- Sắc ký cột: cột nhồi silica gel pha thƣờng và pha đảo
- Sắc ký lớp mỏng: để theo dõi quá trình phân lập, kiểm tra độ tinh khiết
của chất phân lập
Phƣơng pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất
Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập đƣợc dựa trên các phƣơng pháp phổ
bao gồm: phổ khối lƣợng (ESI-MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) kết hợp so

Co

py

rig

2.3.3.

sánh dữ liệu phổ thu đƣợc với các dữ liệu phổ đã đƣợc công bố trong các tài liệu
tham khảo.

12


Phƣơng pháp phân tích định tính các hợp chất bằng sắc ký lỏng hiệu năng

ma
cy
,V
NU

2.3.4.
cao

Việc phân tích định tính, dấu vân tay của một thành phần trong một mẫu hỗn
hợp nhiều thành phần nhƣ cao chiết dƣợc liệu, phân đoạn dịch chiết, …dựa trên
thông số thời gian lƣu của một chất sẽ cố định, đặc trƣng cho thành phần đó trong
điều kiện sắc ký xác định.

Chƣơng 3- Kết quả thực nghiệm và bàn luận

dP
ha
r

3.1. Chiết xuất và tinh chế các hợp chất saponin từ thân rễ SVD
3.1.1. Chiết xuất và phân lập
Mẫu thân rễ sâm vũ diệp (500 g) (hàm ẩm là 7,81%) sau khi rửa sạch, phơi

an

khô, thái nhỏ đƣợc ngâm chiết bằng dung môi ethanol 70% 3 lần (mỗi lần 1500 ml)
sử dụng thiết bị chiết hồi lƣu trong 3 giờ. Các dịch chiết ethanol thu đƣợc đƣợc lọc

ici

ne

qua giấy lọc, gom lại và cất loại dung môi dƣới áp suất giảm cho 95,9 g cao chiết
tổng ethanol. Hoà tan cao chiết trong nƣớc cất (500 ml) và chiết phân bố lần lƣợt
bằng ether, ethyl aceate và n-BuOH (mỗi dung môi 3 lần, mỗi lần 500 ml). Các dịch
chiết phân đoạn đƣợc cất loại dung môi dƣới áp suất giảm để thu đƣợc phân đoạn

ed

tƣơng ứng Ê-te (5,82 g), EtOAc (2,70 g) và n- BuOH (21,7 g).

Co

py

rig

ht

@

Sc
h

oo

lo

fM

Hình 3. Sơ đồ chiết phân đoạn lỏng-lỏng

13


ma
cy
,V
NU
dP
ha
r
an
ne
ici
ed
fM
lo

oo

Tiếp theo phân đoạn BuOH đƣợc tiến hành phân lập sắc ký sử dụng cột nhồi
silica gel (Φ 85 mm x 80 mm) với hệ dung môi rửa giải là gradient của CH2Cl2-

Sc
h

MeOH (5:1 → 0:1, v/v, mỗi phân đoạn 600 ml) thu đƣợc 4 phân đoạn ký hiệu là
B1-B4.

@

Phân đoạn B2 (4,3 g) đƣợc tiếp tục phân lập sắc ký cột pha thuận silica gel
(Φ 45 mm x 350 mm) với hệ dung môi rửa giải là CHCl3-MeOH-H2O (3:1:0,1),
v/v/v, 1500 ml) thu đƣợc 4 phân đoạn nhỏ (B2.1-B2.4) và tiếp tục từ phân đoạn
B2.2 (920 mg) sử dụng sắc ký cột pha đảo C18 (Φ 50 mm x 350 mm) với hệ pha

rig

ht

động MeOH-H2O (1:1), v/v, 1400 ml) thu đƣợc hợp chất số 2 (bột màu trắng, 100
mg). Cuối cùng từ phân đoạn B4 (5,1 g) bằng sắc ký cột pha đảo C18 (Φ 50 nm x

Co

py

350 mm) với hệ pha động MeOH-H2O (1:1, v/v, 1600 ml) thu đƣợc hợp chất số 1
(bột màu trắng ngà, 180 mg). Tóm tắt quá trình phân lập nhƣ hình 5

14


ma
cy
,V
NU

Phân đoạn BuOH
(21,7 g)

Sắc ký cột Silica gel (Φ85 mm × 80 mm)
CH2Cl2-MeOH (5:1 0:1, v/v, 600 mL/PĐ)

B2
4,3 g

B3
3,7 g

B4
5,1 g

dP
ha
r

B1
840 mg

SKC pha đảo C18
(Φ50 mm × 350 mm)
MeOH-H2O
(1:1, v/v, 1600 mL)

an

1. SKC Silica gel (Φ45 mm ×
350 mm) CHCl3-MeOH-H2O
(3:1:0,1, v/v/v, 1500 mL)
2. SKC pha đảo C18 (Φ50 mm ×
350 mm) MeOH-H2O
(1:1, v/v, 1400 mL)

Chất số 1
Bột màu trắng, 180 mg

ne

Chất số 2
Bột màu trắng, 100 mg

ici

Hình 4. Sơ đồ phân lập sắc ký 2 hợp chất tinh khiết từ phân đoạn BuOH

ed

3.1.2. Kiểm tra độ tinh khiết hai chất phân lập đƣợc bằng SKLM

fM

Chất số 1 và số 2 sau khi phân lập đƣợc kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM
Silicagel RP-18 F254S trên cùng một bản mỏng, triển khai với hệ dung môi

rig

ht

@

Sc
h

oo

lo

methanol: nƣớc=2:1; thu đƣợc sắc ký đồ bản mỏng nhƣ hình 6

Hình 5. Sắc ký đồ của chất số 1 và số 2 phân lập được sau khi phun thuốc
thử H2SO4 10% /EtOH

Co

py

Nhận xét: Sau khi phun thuốc thử, SKĐ của cả 2 hợp chất đều thấy xuất
hiện duy nhất vết màu hồng khá đậm, sau đó chuyển sang màu tím đặc trƣng cho

15


hợp chất phân lập đƣợc là những chất tinh khiết.
3.2. Xác định cấu trúc của 2 saponin phân lập đƣợc
3.2.1. Hợp chất số 1
Chất số 1 (Stipuleanoside R2): chất bột màu trắng

ma
cy
,V
NU

các dẫn xuất triterpen có hệ số Rf lần lƣợt là 0,30 và 0,34. Vì vậy sơ bộ kết luận hai

Góc quay cực: [α]D25=+7,5 (c=0,2; MeOH);
Phổ ESI-MS: m/z 1087 [M-H]- tƣơng ứng với khối lƣợng phân tử là M=
Phổ 1H-NMR (MeOD; 500 MHz) và
xem bảng 2

13

dP
ha
r

1088

C-NMR (MeOD; 125 MHz), DEPT:

Bảng 2. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR, DEPT của hợp chất số 1
δC

δCa,b

DEPT

1

39,8

39,8

CH2

2

26,9

27,0

3

90,7

90,8

4

40,1

40,7

5

57,0

57,0

CH

6

19,3

19,3

CH2

7

33,9

34,0

CH2

8

40,7

40,2

C

9

49,1

49,2

CH

10

37,8

37,9

C

11

24,5

24,5

CH2

123,8

123,8

C

144,7

144,8

C

42,9

42,9

C

15

28,8

28,9

CH2

16

23,9

24,0

CH2

17

48,0

48,0

C

18

42,5

42,6

CH

19

47,2

47,3

CH2

20

31,5

31,5

C

an

*

Vị trí C

13

oo

lo

fM

ed

ici

CH2
CH
C

5,27 (br s)

Co

py

rig

ht

@

14

Sc
h

12

ne

Aglycon

δHa,c (độ bội, J=Hz)

16


34,9

34,9

CH2

22

33,1

33,2

CH2

23

28,5

28,5

CH3

24

17,0

17,0

CH3

25

16,0

16,0

CH3

26

17,7

17,7

CH3

27

26,3

26,3

CH3

28

178,0

178,1

COOR

29

33,4

33,5

CH3

1,05(s)

30

24,0

24,0

CH3

0,96(s)

1’

106,3

106,4

CH

4,01 (d, J = 1,0 Hz)

2’

76,4

76,4

CH

3’

81,9

82,0

4’

79,3

79,4

5’

78,1

78,1

6’

176,5

176,4

1’’

104,5

104,4

CH

2’’

75,5

75,6

3’’

78,3

78,3

CH

4’’

71,0

5’’

78,3

6’’

62,4

dP
ha
r

ne
ici

ed

fM
62,4

CH2

108,3

108,3

CH

82,1

82,1

CH

3’’’

75,3

75,3

CH

4’’’

87,1

87,1

CH

5’’’

62,4

62,4

CH2

1’’’’

95,7

95,7

CH

2’’’’

73,9

73,9

CH

3’’’’

77,9

77,9

CH

Sc
h

oo

lo

CH

@

1,17(s)

COOH

78,3

ht

0,85(s)

CH

CH

2’’’

0,81(s)

CH

71,1

1’’’

0,93(s)

CH

CH

Đƣờng Ara

0,95(s)

an

Đƣờng GlcA

Đƣờng Glc I

ma
cy
,V
NU

21

4,92 (d, J = 8,0 Hz)

5,19 (br s)

Co

py

rig

Đƣờng Glc II
5,40 (d, J = 8,0 Hz)

17


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×

×