Tải bản đầy đủ

Nghiên cứu phân lập và định lượng thành phần tanshinon IIA từ cây đan sâm (salvia miltiorrhiza bunge) phục vụ công tác kiểm tra chất lượng dược liệu đan sâm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƢỢC

ĐÀO THỊ HỒNG BÍCH

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH LƢỢNG

THÀNH PHẦN TANSHINON IIA TỪ CÂY ĐAN
SÂM (Salvia miltiorrhiza Bunge) PHỤC VỤ CÔNG
TÁC KIỂM TRA CHẤT LƢỢNG DƢỢC LIỆU
ĐAN SÂM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH DƢỢC HỌC

Khóa

: QH.2012.Y

Người hướng dẫn: TS. NGUYỄN HỮU TÙNG


Hà Nội - 2017


LỜI CẢM ƠN
Trước hết, cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Hữu Tùng – giảng
viên bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc - Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia
Hà Nội, thầy đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho
em trong quá trình thực hiện khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm Khoa cùng toàn thể các thầy cô
giáo Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội nói chung và các thầy cô, cán bộ
thuộc Bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc nói riêng đã dạy dỗ, chỉ bảo và tạo
mọi điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian 5 năm học tập tại Khoa và thực hiện
khóa luận tốt nghiệp.
Và em muốn cảm ơn sự tài trợ của Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ
Quốc gia (NAFOSTED) trong đề tài mã số 106-YS.05-2015.05 để em có thể tham
gia và thực hiện nghiên cứu này.
Và cuối cùng là lời cảm ơn của em gửi tới gia đình và tập thể lớp Dược K57QH.2012.Y, đặc biệt là các bạn trong nhóm nghiên cứu gồm Ngần, Huệ, Hào đã
luôn động viên, cộng tác và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 23 tháng 05 năm 2017
Sinh viên
Bích
Đào Thị Hồng Bích


1.

BuOH

2.

CC

3.

DAD

4.

EtOAc

5.

HPLC

6.

Hex

7.

IUPAC

8.

LDL

9.

MS

10.

Mp

11.

NMR

12.

PL

13.

Rf

14.

RSD

15.

SKC

16.

TLC

17.

UV-VIS

18.

UV

19.

Φ



20.



21.

13

C-NMR


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN........................................................................................................ 2
1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐAN SÂM.............................................................................................. 2
1.1.1. Đặc điểm thực vật............................................................................................................ 2
1.1.2. Phân bố, sinh thái............................................................................................................. 2
1.1.3. Thành phần hóa học........................................................................................................ 3
1.1.4. Tác dụng sinh học............................................................................................................ 5
1.1.5. Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền........................................................ 6
1.2.TỔNG QUAN VỀ TANSHINON IIA................................................................................ 7
1.2.1. Cấu trúc hóa học............................................................................................................... 7
1.2.2. Đặc điểm tanshinon IIA................................................................................................. 7
1.3. TỔNG QUAN VỀ PHƢƠNG PHÁP HÓA LÝ TRONG NGHIÊN CỨU.....8
1.3.1. Phương pháp sắc kí cột.................................................................................................. 8
1.3.2. Phương pháp sắc kí lớp mỏng (TLC)....................................................................... 8
1.3.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)............................................. 10
1.3.4. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)......................................... 13
1.3.5. Phương pháp phân tích khối phổ (MS)................................................................. 14
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................16
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU.......................................... 16
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu.............................................................................................. 16
2.1.2. Dung môi, hóa chất....................................................................................................... 16
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu......................................................... 17
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................................................................. 17
2.2.1. Phương pháp chiết xuất và tinh chế tanshinon IIA từ đan sâm.................... 17
2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc của tanshinon IIA........................................... 17
2.2.3. Phương pháp đánh giá độ tinh khiết và phân tích tạp chất............................ 17
2.2.4. Phương pháp phân tích định lượng bằng HPLC................................................ 17
2.2.5. Phương pháp phân tích định tính, định lượng mẫu dược liệu đan sâm. . .19
2.2.6. Phương pháp xử lý số liệu......................................................................................... 19
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...................................................................... 20
3.1. CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ TANSHINON IIA TỪ ĐAN SÂM................20
3.1.1. Phương pháp xử lý và chiết mẫu............................................................................. 20
3.1.2. Phương pháp phân lập và tinh chế.......................................................................... 20


3.2. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC TANSHINON IIA.............................................................. 22
3.2.1. Tính chất vật lý............................................................................................................... 22
3.2.2. Các phương pháp phổ: phổ khối MS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân.........22
3.2.3. Xác định cấu trúc........................................................................................................... 24
3.3. ĐÁNH GIÁ ĐỘ TINH KHIẾT VÀ PHÂN TÍCH TẠP CHẤT…..………...24

3.3.1. Sắc ký lớp mỏng............................................................................................................ 24
3.3.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC........................................................................... 25
3.4. XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH LƢỢNG HPLC.......25
3.4.1. Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký....................................................................... 25
3.4.2. Tính thích hợp của hệ thống...................................................................................... 26
3.4.3. Độ tuyến tính................................................................................................................... 27
3.4.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)............................ 27
3.4.5. Độ chính xác................................................................................................................... 28
3.4.6. Độ đặc hiệu...................................................................................................................... 29
3.5. PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH ĐỊNH LƢỢNG DƢỢC LIỆU ĐAN SÂM……29
3.6. BÀN LUẬN................................................................................................................................ 30
3.6.1. Về phân lập và xác định cấu trúc của tanshinon IIA....................................... 30
3.6.2. Về phân tích bằng HPLC............................................................................................ 30
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................................................... 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC BẢNG
Bảng
Bảng 3.1

K

Bảng 3.2

K

Bảng 3.3

C

Bảng 3.4

K

Bảng 3.5

K

Bảng 3.6

G

t

Bảng 3.7

K

Bảng 3.8

K

Bảng 3.9

K

t


DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình vẽ

Tên hình v

Hình 1.1

Cây đan sâ

Hình 1.2

Cấu trúc m

Hình 1.3

Cấu trúc m

Hình 1.4

Cấu trúc m

Hình 1.5

Cấu trúc hó

Hình 1.6

Sắc ký đồ v

Hình 2.1

Một số hìn

Hình 2.2

Sơ đồ chiết

Hình 3.1

Phổ

Hình 3.2

Cấu trúc ta

Hình 3.3

Sắc ký lớp

Hình 3.4

Sắc ký đồ c

Hình 3.5

Đồ thị biểu

Hình 3.6

Sắc ký đồ c

13

CNM


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ðan sâm có tên khoa học là Salvia miltiorrhiza Bunge thuộc họ Bạc hà
(Lamiaceae) là một cây thuốc quý được dùng nhiều trong Đông y trong các bài
thuốc bổ máu và điều trị bệnh tim mạch [21-23]. Gần đây tác dụng chống ung thư
của đan sâm, đặc biệt là của thành phần tanshinon được phát hiện và thu hút sự quan
tâm nghiên cứu trên thế giới [21-23].

nước ta, nghiên cứu về đan sâm đang được quan tâm để phát triển ứng
dụng loại dược liệu quý này trong y học hiện đại. Nghiên cứu của Viện Dược liệu
đã cho thấy cây đan sâm trồng ở Sapa có hàm lượng tanshinon IIA cao bên cạnh
một số thành phần tanshinon khác [15,21]. Gần đây, tác giả Nguyễn Thanh Hải và
cộng sự đã công bố phân lập thêm một số thành phần tanshinon [23] và hai hợp chất
triterpen là acid ursoli và acid 2β-hydroxypomolic [23]. Các kết quả nghiên cứu ban
đầu về tác dụng sinh học và dược lý cho thấy dịch chiết đan sâm có tác dụng chống
đông máu, kết tập tiểu cầu [22]; hợp chất tanshinon IIA có tác dụng ức chế sự phát
triển của nhiều dòng tế bào ung thư phổi PC9 [21].
Theo các tài liệu công bố, tanshinon IIA là thành phần hoạt chất chính và
được sử dụng làm chất đánh dấu để đánh giá chất lượng dược liệu đan sâm như qui
định trong Dược điển Trung Quốc. Ở nước ta, tanshinon IIA đã được phân lập [21]
nhưng chưa có nghiên cứu xa hơn để định hướng xây dựng chất chuẩn đối chiếu cho
hợp chất này để phục vụ công tác đánh giá dược liệu đan sâm và các sản phẩm chứa
đan sâm đang ngày càng có nhiều trên thị trường. Theo hướng nghiên cứu này,


chúng tôi thực hiện đề tài Nghiên cứu phân lập và định lƣợng thành phần
tanshinon IIA từ cây đan sâm phục vụ công tác kiểm tra chất lƣợng dƣợc liệu


đan sâm với mục tiêu như sau:
1.

Phân lập và xác định hợp chất tanshinon IIA từ đan sâm

2. Phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC của tanshinon IIA trong
đan sâm và khảo sát tiêu chí làm chất chuẩn đối chiếu.

1


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về đan sâm
Cây đan sâm có tên khoa học là Salvia miltiorrhiza Bunge, thuộc chi Salvia,
họ Bạc hà (Lamiaceae).

Hình 1.1 Cây đan sâm
1.1.1. Đặc điểm thực vật
Cây đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) còn gọi là huyết sâm, xích sâm,
huyết căn là cây cỏ sống lâu năm, cao 30-80 cm, toàn thân mang lông ngắn màu
vàng trắng nhạt. Rễ nhỏ dài hình trụ, đường kính 0,5-1,5 cm, màu đỏ nâu. Thân
vuông trên có các gân dọc. Lá kép, mọc đối: 3-5 lá chét, đặc biệt có thể có 7. Lá
chét mọc giữa thường lớn hơn cả. Lá kép có cuống dài, cuống lá chét ngắn có dìa.
Lá chét dài 2-7,5 cm, rộng 0,8-5 cm. Mép lá chét có răng cưa tù. Mặt trên lá chét
màu xanh, có các lông mềm màu trắng, mặt dưới màu xanh tro, cũng có lông nhưng
dài hơn. Gân nổi ở mặt dưới, chia phiến lá thành nhiều múi nhỏ. Cụm hoa mọc
thành chùm ở đầu cành hay kẽ lá, chùm hoa dài 10-20 cm. Hoa mọc vòng, mỗi vòng
3-10 hoa, thường là 5 hoa. Hoa có tràng màu xanh tím nhạt, 2 môi, môi trên trông
nghiêng hình lưỡi liềm, môi dưới xẻ 3 thùy, thùy giữa có răng cưa tròn. Hai nhị ở
môi dưới, bầu có vòi dài lòi ra ở môi trên. Quả nhỏ, dài 3 mm, rộng 1,5 mm [1,14].
1.1.2. Phân bố, sinh thái
S.
miltiorrhiza được phân bố rộng rãi ở miền Bắc Trung Quốc. Nó cũng có
mặt tại Nhật Bản [31]. Cây đan sâm Việt Nam có nguồn gốc Trung Quốc [1] thích
hợp với đất cát ẩm, được trồng bằng rễ vào mùa xuân [6]. Cây trồng ở trại thuốc Sa
Pa (Viện Dược liệu) tỏ ra thích nghi với điều kiện khí hậu nhiệt đới vùng núi cao.
Cây sinh trưởng phát triển tương đối tốt, ra hoa quả hàng năm, hạt giống thu được
đã gieo đi gieo lại nhiều năm. Một số cây đưa xuống trại thuốc Tam Đảo (Viện
Dược liệu) sinh trưởng kém hơn [1]. Cây trồng tốt nhất vào tháng 2-3 để đến tháng
2


11-12 thu hoạch [1]. Mùa hoa từ tháng 5-8 (Tam Đảo), mùa quả tháng 6-9 [14]. Thu
hoạch rễ từ cuối mùa thu đến đầu mùa xuân [6].
1.1.3. Thành phần hóa học
Cho đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học
của đan sâm. Thành phần hóa học chính là acid phenolic, diterpenoid, flavonoid và
một số thành phần khác. Bộ phận trên mặt đất của có chứa flavonoid, triterpenoid và
monoterpenoid đặc biệt là trong hoa và lá. Trong khi đó, diterpenoid và acid
phenolic lại được tìm thấy chủ yếu ở rễ [28].
a. Diterpenoid
Nhóm diterpenoid bao gồm rất nhiều chất có cấu trúc khác nhau được phân
thành 4 phân nhóm là abietane diterpenoid, clerodane diterpenoid, pimarane
diterpenoid và labdane diterpenoid. Chủ yếu là abietane diterpenoid ở trong rễ,
clerodane diterpenoid và labdane diterpenoid thì ít hơn [31].
Thành phần chính trong nhóm abietane diterpenoid là các tanshinon như
tanshinon I, II và III, sau đó đến isotanshinon I và II, isocryptotanshinon và
cryptotanshinon [31] (hình 1.2).

19

R=R

1=H,

20

5(10),6(7)

R=R

1=H,

21
R=
R1= OH,
25

15(16)
5(10),6(7)

R=R

1=H,

19-21.Tanshinon I, II, III

24. Isocryptotanshinon

22-23. Isotanshinon I, II

25. Cryptotanshinon

Hình 1.2. Cấu trúc một số abietane diterpenoid
b.

Các dẫn xuất của acid phenolic

Các acid phenolic là thành phần chính trong nhóm chất tan được trong nước
của đan sâm. Thành phần chính của nhóm này là acid rosmarinic và các acid
salvianolic từ A - K [35].


3


Hình 1.3. Cấu trúc một số acid phenolic
c. Flavonoid
Thành phần có mặt nhiều nhất chính là flavon, flavonol và các dẫn xuất của
chúng [35].
- Flavon và aglycon flavon: thành phần chính là apigenin (5,7,4’-trihydroxyflavon)
và luteolin (5,7,3’,4’- tetrahydroxyflavon) và các dẫn xuất 6- hydroxylat của chúng.
- Flavon và flavonol glycosid: các flavon O-glycosid xuất hiện phổ biến trong các
loài thuộc chi Salvia L. và nhiều nhất trong số đó là các flavon 7-glycosid như
apigenin 7-glucosid (cosmosiin), luteolin 7-glucosid (cinarosid) và các
7-glucuronid tương ứng của chúng.
- Các flavonoid khác như: các anthocyanin là thành phần có mặt rất nhiều trong
các hoa đỏ hay đỏ tía ở các loài thuộc chi Salvia L.

4


d.

Một số thành phần khác

Triterpenoid phổ biến nhất và được tìm thấy trong đan sâm là acid ursolic và
acid oleanolic (hình 1.4). Ngoài ra còn tìm thấy 1 số triterpenoid khác như
anagadiol, taraxerol acetate, germanicol (hình 4), navidiol,…[ 31].
Ngoài ra còn có Tanin và một số thành phần khác [35].

1 R=H, R1=R2=Me, R3=H
2 R=R1=H, R2=R3=Me
1.
Acid ursolic 2. Acid oleanolic 3. Anagadiol 4. Taraxerol
5.Germanicol Hình 1.4. Cấu trúc một số triterpenoid có trong chi
Salvia L.
1.1.4. Tác dụng sinh học
Hiện nay đã có rất nhiều nghiên cứu về tác dụng dược lý của loài Salvia
miltiorrhiza Bunge. Các tác dụng đã được chứng minh bao gồm:
Làm giãn mạch vành, chống huyết khối, chống thiếu máu cục bộ. Các tác
dụng này do các thành phần tanshinon IIA, acid rosmarinic, danshensuan B, acid
salvinolic B, militron và salvinon. Ngoài ra, đan sâm còn được chứng minh có tác
dụng chống đau thắt ngực [1-2,14,21,25,29].
Tác dụng làm hạ đường huyết do có chứa thành phần là acid polyphenolic
[25].

Rễ đan sâm có tác dụng hạ lipid máu, ức chế sinh tổng hợp cholesterol ở tế
bào [2,10].
Tác dụng an thần do thành phần miltiron nên được sử dụng điều trị chứng
mất ngủ [7,10].
Dịch chiết đan sâm có tác dụng chống vi khuẩn, kể cả vi khuẩn
Staphylococus kháng thuốc. Các thành phần như dihydrotanshinon I,
hydroxytanshinon II-A, cryptotanshinon, methyl tanshinat và tanshinon II-B được
chứng minh có tác dụng chống vi khuẩn Staphylococus aureus [10,12,21,36].


5


Chống nấm, tốt cho trường hợp nấm ngoài da, mụn trứng cá, rụng tóc,
ngứa và mày đay [10].
Hoạt tính chống viêm do có thành phần tanshinon IIA có tác động trên hệ
miễn dịch [11].
Hoạt tính chống oxy hóa gây bởi dihydrotanshinon I [2], acid salvinolic A,
B, acid rosmarinic [1], và các chất thuộc nhóm polysaccarid [12].
-

Mang lại lợi ích cho bệnh nhân suy thận mạn tính [2].

-

Tanshinon IIA còn có tác dụng chống ung thư [10-11].

Đan sâm có tác dụng làm mềm và thu nhỏ thể tích của gan và lá lách khi
sưng to do bệnh gan và huyết hấp trùng, có tác dụng an thần, gây ngủ và tác dụng
làm giảm các huyết quản nhỏ [7].
Ngoài ra, tanshinon trong đan sâm còn có tác dụng lên hormon sinh dục:
làm tăng nhẹ estrogen và androgen trên chuột [21].
1.1.5. Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền
Tính vị: vị đắng, tính hàn [3].
Quy kinh: quy vào 2 kinh tâm, can [3].
Tác dụng và công dụng:
Hoạt huyết, trục huyết ứ: dùng để trị vô kinh, hành kinh không đều, đau
bụng kinh, bế kinh, sau khi đẻ huyết ứ đọng gây đau bụng; các trường hợp do chấn
thương mà cơ gân sưng tấy đau đớn [3].
Dưỡng tâm an thần: dùng trong các bệnh tâm hồi hộp, mất ngủ, suy nhược
thần kinh; dùng trong bệnh co thắt động mạch vành tim, phối hợp với đương quy,
táo nhân [1,3]. Ngoài ra còn dùng để chữa bệnh nhồi máu cơ tim, đau thắt ngực, tâm
hư phiền nhiệt [2].
Bổ huyết: có thể dùng đối với các bệnh thiếu máu, đặc biệt đối với các
bệnh mặt nhợt nhạt, xanh xao của phụ nữ chưa có chồng. Khi dùng với tính chất bổ
huyết thì dùng đan sâm dạng không qua chế biến [3,7].
Bổ can tỳ: dùng trong các trường hợp gan và lá lách bị sưng to, trị bệnh
huyết hấp trùng đều có hiệu quả [3,7].
-

Giải độc: dùng trong các trường hợp sang lở, mụn nhọt [3].

6


Đây còn được xem là thuốc dùng tốt cho trường hợp đau dạ dày hay
viêm
vú [1,2].
Đan sâm còn được dùng để điều trị các bệnh viêm gan, xơ gan, suy thận
mạn tính, tiểu đường và các biến chứng của tiểu đường [2].
Liều dùng: 8-20g [3].
Chú ý: không dùng chung với Lê lô [6].
1.2. Tổng quan về tanshinon IIA
Trong chuyên luận Dược điển của nhiều nước bao gồm Trung Quốc, Anh và
Việt Nam, tanshinon IIA là một trong những chất chính được dùng để định tính, có
thể định lượng dược liệu đan sâm và cao đan sâm [7][24][34].
1.2.1. Cấu trúc hóa học

Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của tanshinon
IIA - Tên IUPAC:
1,6,6-trimethyl-8,9-dihydro-7H-naphthol[1,2-g][1]benzofuran-10,11-dion.
-

Công thức phân tử: C19H18O3

-

Khối lượng phân tử: 294,3444g/mol

1.2.2. Đặc điểm tanshinon IIA
-

o

Là bột màu đỏ, rất ít tan trong nước (0,0042 mg/l ở 25 C), tan tốt trong các

dung môi hữu cơ nhất là các dung môi kém phân cực trong methanol (5 mg/ml),
o

ethanol (5mg/ml) ở 25 C, EtOAc và dimethyl sulfoxit (25mg/ml) [27].
-

Tanshinon IIA thuộc nhóm diterpenoid có khung terpenoid, ngoài ra trong

phân tử còn có nhóm lacton và xeton. Tính chất hóa học của tanshinon IIA có đầy
7


đủ tính chất của terpenoid, ngoài ra trong phân tử còn có nhóm lacton và xeton.
Tính chất hóa học của tanshinon IIA có đầy đủ tính chất của terpeniod.
-

Tanshinon IIA không bền vững ở nhiệt độ cao, ánh sáng, độ ẩm và tiếp xúc

với oxy. Dưới tác động của các tác nhân trên, nó có xu hướng bị phân hủy. Đó có
thể là lí do chính trong việc giảm hàm lượng tanshinon IIA trong toàn bộ quá trình
chiết, cô đặc, xát hạt, sấy khô [27,34].
Vì có nhân thơm nên có thể sử dụng detector UV-VIS để định tính,
định
lượng tanshinon IIA. Tanshinon hấp thu mạnh UV ở bước sóng từ 254-280 nm [27]
- Các kết quả nghiên cứu in vivo cho thấy tanshinon IIA có tác dụng giảm đáng kể
kích thước vùng nhồi máu. Cơ chế có thể do khả năng dọn gốc tự do ở
màng ty thể tim. Tanshinon IIA ức chế quá trình oxi hóa LDL và hoạt động của
Angiotensin II, từ đó làm giảm phì đại tế bào cơ tim.
1.3. Tổng quan về một số phƣơng pháp hóa lý sử dụng trong nghiên cứu đề tài
1.3.1. Phƣơng pháp sắc kí cột
Sắc ký là một phương pháp vật lý để tách các thành phần trong một hỗn hợp
bằng cách phân chia chúng thành 2 pha: pha động và pha tĩnh.
Sắc ký hấp phụ được thực hiện trên một ống thủy tinh thẳng đứng gọi là
―cột‖ với chất hấp phụ đóng vai trò pha tĩnh, dung môi rửa cột đóng vai trò pha
động chảy qua chất hấp phụ. Đối với các chất riêng biệt trong hỗn hợp tùy theo khả
năng hấp phụ khả năng hòa tan của nó đối với dung môi rửa cột để lấy ra lần trước
hoặc sau. Chất hấp phụ trong sắc ký cột thường dùng là oxid nhôm, silicagel,
CaCO3, than hoạt tính, polyamide,… Các chất này phải được tiêu chuẩn hóa. Dung
môi dùng có thể là 1 hoặc 2,3 loại dung môi có tỉ lệ thích hợp. Với các chất hấp phụ
cổ điển, dung môi sử dụng có độ phân cực tăng dần.
1.3.2. Phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng (TLC)
- Nguyên tắc
Dựa vào hệ số phân tách khác nhau của chất cần phân tích giữa 2 pha: pha
động và pha tĩnh. Chất cần phân tích được hấp phụ (hoặc phân bố, trao đổi ion) trên
pha tĩnh, pha động chạy qua pha tĩnh đồng thời kéo theo chất cần phân tích. Dựa
vào hệ số phân bố khác nhau của mỗi chất đối với pha động và pha tĩnh ta có thể

8


tách riêng từng thành phần trong hỗn hợp phân tích. Các thành phần sau khi được
phân tách riêng biệt khỏi hỗn hợp được lưu giữ trên pha tĩnh.
Sau đó có thể nhận biết chất cần phân tích bằng ánh sáng thường (nếu các
chất phân tích có màu) hoặc soi huỳnh quang ở các bước sóng 254 nm, 366 nm hoặc
phun thuốc thử hiện màu, hoặc quét lên bề mặt bản mỏng thiết bị densitometer, một
thiết bị đo cường độ phản xạ ánh sáng tử ngoại hoặc khả kiến của chất cần phân
tích… Tuỳ thuộc bản chất của chất cần phân tích ta có thể sử dụng một trong các
phương pháp trên để phát hiện vết chất trong hỗn hợp cần phân tích.
-

Các đại lượng đặc trưng

+

Hệ số lưu giữ Rf

Đại lượng đặc trưng cho mức độ dịch chuyển của các chất phân tích là hệ số
lưu giữ Rf. Trị số của nó được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất
phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động:

Trong đó:
dR là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm)
dM là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha
động (đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm)
Rf có giá trị dao động giữa 0 và 1
+ Hệ số lưu giữ tương đối Rr

Trong đó:
dR,x

: là đường đ

dR,c

: là đường đ

(Giá trị Rr càng gần 1 thì chất phân tích và chất chuẩn càng đồng nhất)

9


1.3.3. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
a. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
- Nguyên tắc
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp sắc ký tách các chất ra khỏi
hỗn hợp phân tích trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là một
chất rắn dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ trên một chất mang rắn, hay
một chất mang đã được liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng
dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc phân loại theo kích cỡ.
- Một số thông số đặc trưng của quá trình sắc ký



Hình 1.6. Sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trưng
Thời gian lưu :

tR: (Thời gian lưu): là thời gian tính từ khi chất phân tích được tiêm vào hệ
thống sắc ký đến khi được phát hiện ở nồng độ cực đại của nó.
t0 (Thời gian chết): là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ
thống
sắc ký
-





tR (Thời gian lưu thực): tR = tR – t0

(Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính của sắc ký đồ với một chất
nhất định khi tiến hành sắc ký trong một điều kiện nhất định).
-

W : là chiều rộng đáy pic.

-

W1/2 : là chiều rộng pic đo ở 1/2 chiều cao pic.



Hệ số dung lượng k’:

10




Trong thực nghiệm hệ số dung lượng k được tính theo công thức:

k'  t R  tR  t0  tR 1
'

t0

t0

t0

Hệ số dung lượng cho biết khả năng phân bố của chất đó vào hai pha, tức là
tỷ lệ giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động tại thời


điểm cân bằng. Nếu k nhỏ thì tR cũng nhỏ, chất bị rửa giải gần với thời điểm bơm


mẫu do đó làm giảm khả năng tách, nếu k lớn quá thì sẽ dẫn đến doãng pic, độ


nhạy thấp và thời gian lưu kéo dài. Trong thực tế k nằm trong khoảng 2-5 là tốt
nhất.



Hệ số chọn lọc :

α


khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng. Để tách riêng hai chất

thường chọn  nằm trong khoảng 1,05 đến 2.



Hiệu lực cột:

Hiệu lực cột được đánh giá thông qua 2 thông số: số đĩa lý thuyết (N) và
chiều cao đĩa lý thuyết (H). Cột sắc ký được coi như có N tầng lý thuyết, ở mỗi tầng
sự phân bố chất tan vào hai pha đạt đến một trạng thái cân bằng. Mỗi tầng được giả
định như một pha tĩnh có chiều cao H.

N  16


 tR 2
W

Hoặc
N  5,54
Nếu gọi L là chiều cao cột sắc ký thì chiều cao của đĩa lý thuyết H được tính
bằng công thức:



Hệ số bất đối AF (tailing factor):

Hệ số bất đối AF cho biết mức độ cân đối của pic trên sắc ký đồ.

AF  W1/20
2a


11


Trong đó:
W1/20 : là chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic.
a
: là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép
đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic.
Trong phép định lượng thì yêu cầu 0,9  AF  2
Giá trị của AF càng gần 1 thì pic càng cân đối



Độ phân giải (resolution):

Độ phân giải đặc trưng cho mức độ tách 2 chất ra khỏi nhau trên một điều
kiện sắc ký. Độ phân giải của 2 pic kề nhau được tính theo công thức:

RS 
-

Độ phân giải cơ bản đạt được khi RS = 1,5 khi đó 2 pic tách khỏi nhau rõ

ràng, chỉ xen phủ nhau 0,3 %
Rs = 1,0: Hai pic chưa tách hẳn còn xen phủ nhau 4 %
RS = 0,75: Hai pic chưa tách nhau
b.



Ứng dụng của phương pháp HPLC:
Định tính:

Dựa vào thời gian lưu, hình dáng pic của mẫu thử và mẫu chuẩn, hoặc chồng
phổ của pic thử và pic chuẩn để định tính chất thử.



Xác định tạp chất:

Dùng để kiểm tra tạp chất trong mẫu, trên sắc ký đồ không có pic tại thời
gian lưu của tạp chất (dùng chất đối chiếu) khi chạy sắc ký trong cùng điều kiện.



Định lượng:

Dựa trên nguyên tắc nồng độ của một chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích
pic của nó. Có 4 phương pháp định lượng được sử dụng:
-

Phương pháp chuẩn ngoại

-

Phương pháp chuẩn nội

-

Phương pháp thêm chuẩn

12


-

Phương pháp chuẩn hoá diện tích

1.3.4. Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR)
a. Nguyên tắc
Nếu hạt nhân nguyên tử có từ tính được đặt trong một từ trường, khi thay đổi
từ trường sẽ dẫn đến hấp thụ năng lượng của sóng vô tuyến và xuất hiện phổ cộng
hưởng từ hạt nhân.
Những hạt nhân nguyên tử có khối lượng là số lẻ và những hạt nhân nguyên
tử có khối lượng là số chẵn nhưng số thứ tự nguyên tử là số lẻ thì có momen từ và
cho tín hiệu NMR. Các hạt nhân nguyên tử có khối lượng và số thứ tự nguyên tử là
những số chẵn thì không có momen từ và không cho tín hiệu NMR.
Vị trí của tín hiệu cộng hưởng từ proton trong phổ NMR phụ thuộc vào mật
độ điện tử ở vùng lân cận quanh proton đó.
b. Các đại lượng đặc trưng



Độ chuyển dịch hoá học

Sự khác nhau về vị trí hấp thụ giữa proton của mẫu phân tích và của chất
chuẩn được gọi là độ chuyển dịch hoá học ()

δ



ppm

=

ν mau -ν TMS 

×106

ν

may

Trong đó:


: là độ dịch chuyển hoá học

mau
TMS
may



Hằng số tương tác spin

Khoảng cách giữa các vạch của tín hiệu bội được biểu hiện bằng Hz, đặc
trưng cho sự tương tác spin gọi là hằng số tương tác spin (J). Trị số J phụ thuộc vào
tương quan không gian và mật độ điện tử ở vùng lân cận của 2 proton tương tác.



Diện tích dưới tín hiệu

13


Diện tích dưới tín hiệu tỷ lệ với số lượng proton cho tín hiệu đó. Đường cong
tích phân diện tích dưới tín hiệu cho biết số lượng tương đối của proton cho tín hiệu.
c. Ứng dụng của phổ NMR
Bằng cách xác định độ dịch chuyển hoá học , hằng số tương tác J và diện
tích dưới tín hiệu người ta có thể biện giải phổ và kết hợp với các thông tin của các
loại phổ khác như IR, MS từ đó xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ [17,20].
1.3.5. Phƣơng pháp phân tích khối phổ (MS)
a. Nguyên tắc
Dùng chùm điện tử có năng lượng trung bình (50 – 100 eV) để bắn phá phân
-3

-6

tử hữu cơ ở môi trường chân không cao (10 - 10 mmHg). Trong quá trình đó,
chất hữu cơ bị ion hoá và bị phá vỡ thành mảnh. Các ion được tạo thành trong
buồng ion hoá, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phân tích khối trước khi đến
detector. Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch (pic) có
cường độ khác nhau tập hợp lại thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối.
b.

Ứng dụng của MS



Xác định các đồng vị

Các nguyên tử đồng vị của cùng một nguyên tố có cùng số điện tích hạt nhân
chỉ khác nhau về số neutron trong nhân đó nên khối lượng nguyên tử khác nhau. Có
thể dùng MS để xác định thành phần các đồng vị của các nguyên tố trong mẫu.



Định tính
+

Phân tích khối phổ có thể cho rất chính xác khối lượng các ion phân tử M ,
+

+

(M+1) , (M+2) , đây là các đặc trưng quan trọng của hợp chất hoá học. Bên cạnh
đó xem xét thêm các pic đồng vị, tỷ số cường độ của chúng cùng với khối lượng của
các mảnh ion có thể xác định công thức nguyên của chất phân tích. Xác định công
thức cấu tạo.
Để xác định công thức cấu tạo của chất nghiên cứu cần dùng kỹ thuật ion hoá
thích hợp phân tách chất nghiên cứu thành nhiều mảnh ion để làm rõ cấu tạo ghép
nối của chúng. Việc biện giải phổ nên phối hợp với phổ NMR và phổ IR.



Định lượng

14


Phân tích định lượng khối phổ tương tự như các kỹ thuật khác dùng cách
thiết lập đường chuẩn hoặc thêm đường chuẩn cùng với đo cường độ vạch phổ để
xác định nồng độ [20].

15


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×

×