Tải bản đầy đủ

Đánh giá quy trình chiết và làm sạch tinh dầu từ hạt gấc bằng phương pháp phổ UV và sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
----------------------

KIỀU THỊ LAN

ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH CHIẾT VÀ LÀM SẠCH TINH
DẦU TỪ HẠT GẤC BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHỔ UV VÀ
SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành : Hóa học phân tích

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
----------------------

Hà Nội – 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
----------------------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Tên đề tài:
ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH CHIẾT VÀ LÀM SẠCH TINH
DẦU TỪ HẠT GẤC BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHỔ UV VÀ
SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC

Sinh viên thực hiện: Kiều Thị Lan
Ngành học: Hóa học phân tích
Cán bộ hướng dẫn: ThS. Vũ Thị Kim Thoa

Hà Nội – 2018


Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô Vũ Thị Kim Thoa, người đã tận
tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho em trong suốt quá trình
học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận của mình.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong khoa Hóa Học của
trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 đã nhiệt tình giúp đỡ về mọi cơ sở vật chất và
chỉ bảo em trong quá trình tiến hành thí nghiệm.
Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn những đóng góp ý kiến của các bạn
sinh viên lớp K40C – Sư phạm Hóa học trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 đã giúp
đỡ em rất nhiều trong quá trình hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình và sự
động viên, khích lệ của bạn bè, người thân đặc biệt là gia đình đã tạo niềm tin giúp
em phấn đấu học tập và hoàn thành khóa luận này.
Trong quá trình làm khóa luận tốt nghiệp này mặc dù đã cố gắng hết sức
nhưng chắc chắc không thể tránh khỏi thiếu sót.Vì vậy em kính mong nhận được ý
kiến đóng góp, chỉ bảo của quý thầy cô.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 5 năm 2018
Sinh viên

Kiều Thị Lan

Kiều Thị Lan

K40C – Sư phạm Hóa học


Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan khóa luận này là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới
sự hướng dẫn khoa học của ThS. Vũ Thị Kim Thoa.Các kết quả và số liệu trong
khóa luận là trung thực và chưa được công bố trong bất cứ công trình nào khác.
Hà Nội, tháng 5 năm 2018
Sinh viên

Kiều Thị Lan

Kiều Thị Lan

K40C – Sư phạm Hóa học


Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp
MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
MỞ ĐẦU.....................................................................................................................1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN .......................................................................................3
1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY GẤC ....................................................................................... 3
1.1.1.Đặc điểm thực vật học .............................................................................................. 3
1.1.1.1. Khái quát ................................................................................................................ 3
1.1.1.2. Mô tả thực vật ........................................................................................................ 3
1.1.1.3. Phân bố, sinh thái ................................................................................................. 4
1.1.2. Thành phần hóa học của quả gấc.......................................................................... 5
1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT DẦU THỰC VẬT ............................. 5
1.2.1. Chọn dung môi chiết. ............................................................................................ 5
1.2.2. Quá trình chiết ......................................................................................................... 8
1.2.3. Phương pháp chiết................................................................................................... 8
1.3. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT PHA RẮN ........................................ 10
1.3.1. Định nghĩa về chiết pha rắn. ................................................................................ 10
1.3.2. Các cơ chế chiết pha rắn. ..................................................................................... 10
1.4.

TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC ...................................................11

1.4.1. Khái niệm. ......................................................................................................12
1.4.2. Nguyên tắc của các quá trình sắc kí ................................................................... 12
1.4.3. Phân loại sắc kí hấp phụ ...................................................................................... 13
1.4.4. Các đại lượng đặc trưng của sắc kí đồ. .............................................................. 14
1.4.5. Hệ thống HPLC ..................................................................................................... 17
1.4.5.1. Bình đựng dung môi ............................................................................................ 18
1.4.5.2. Bộ phận khử khí ................................................................................................... 18
1.4.5.3. Bơm cao áp. ......................................................................................................... 18
1.4.5.4. Bộ phận tiêm mẫu. .............................................................................................. 18
1.4.5.5. Cột sắc kí khí. ...................................................................................................... 18

Kiều Thị Lan

K40C – Sư phạm Hóa học


1.4.5.6. Đầu dò. ................................................................................................................. 19
1.4.5.7. Bộ phận ghi tín hiệu. ........................................................................................... 20
1.4.5.8. Thiết bị in dữ liệu. ............................................................................................... 20
1.4.6. Các bước tiến hành sắc kí. .............................................................................20
1.4.6.1. Chuẩn bị dụng cụ, máy móc. ............................................................................. 20
1.4.6.2. Chuẩn bị dung môi pha động. ........................................................................... 20
1.4.6.3. Chuẩn bị mẫu đo HPLC. .................................................................................... 21
1.4.6.4. Cách vận hành thiết bị. ....................................................................................... 21
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ .......................................................22
2.1. Đánh giá qui trình chiết từ hạt gấc .......................................................................... 22
2.1.1. Phổ hấp thụ các chất chứa gốc với 3 nối liên hợp ............................................ 22
2.1.2. Sự phụ thuộc của mật độ quang A của dầu hạt gấc với nồng độ của dầu gấc
(mg/ml)................................................................................................................................ 22
2.1.3. Sự phụ thuộc của mật độ quang vào các dung môi ........................................... 23
2.1.4. Chiết tinh dầu hạt gấc bằng các dung môi hữu cơ............................................ 24
2.2.

ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH LÀM SẠCH TINH DẦU GẤC ...............................30

2.2.1. Nghiên cứu quá trình làm sạch bằng phương pháp chiết pha rắn ..................31
2.2.1.1. Nghiên cứu quá trình hấp phụ của dầu trên cột chiết silicagel .................... 31
2.2.1.2. Nghiên cứu quá trình giải hấp phụ của dầu .................................................... 33
2.3. ĐÁNH GIÁ THÀNH PHẦN TRIGLIXERIT TRONG DẦU HẠT GẤC ................ 40
2.3.1. Định tính các triglixerit trong dầu hạt gấc ........................................................ 40
2.3.2. Định lượng các triglixerit trong dầu hạt gấc ..................................................... 44
KẾT LUẬN ...............................................................................................................48
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................49


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Kí hiệu

Tên Tiếng Anh

Tiếng Việt

SPE

Solid – Phase Extraction

Chiết pha rắn

Wavelength

Bước sóng

Ultraviolet-Visible

Phổ tử ngoại khả kiến

High Performance Liquid

Phương pháp sắc kí lỏng hiệu

Chromatography

năng cao

UV-VIS

HPLC

Reverse Phase
RP-HPLC

High Performance Liquid
Chromatography
Normal Phase

NP-HPLC

High Performance Liquid
Chromatography

Phương pháp sắc kí lỏng hiệu
năng cao pha đảo

Phương pháp sắc kí lỏng hiệu
năng cao pha thường


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Các thành phần trong màng tươi của quả Gấc chín....................................5
Bảng 1.2. Dung môi khác nhau dùng trong chiết xuất các nhóm hoạt chất từ dược
liệu (Houghton và Raman, 1998).................................................................7
Bảng 2.1. Sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ dầu hạt gấc (tại = 270nm)
.....22
Bảng 2.2. Kết quả xác định khối lượng dầu hạt gấc qua mỗi lần chiết bằng dung môi
n-hexan với thể tích dung môi mỗi lần chiết là 10ml. ...............................25
Bảng 2.3. Kết quả xác định khối lượng dầu hạt gấc qua mối lần chiết bằng dung môi
n-hexan với thể tích dung môi mỗi lần chiết là 20ml. ...............................25
Bảng 2.4. Kết quả xác định tổng % chiết qua mỗi lần chiết bằng dung môi aceton 28
Bảng 2.5. Kết quả xác định 1 số đại lượng trong quá trình chiết dầu hạt gấc ..........30
Bảng 2.6. Kết quả khảo sát quá trình hấp thụ dầu hạt gấc trên cột DIAPAK C. ......32
Bảng 2.7. Phần trăm giải hấp chất phân tích bằng các hệ dung môi khác nhau .......34
Bảng 2.8. Kết quả rửa giải dầu bằng phương pháp chiết pha rắn .............................34
Bảng 2.9. Các thông số trong sắc kí đồ khi phân tích dầu hạt gấc bằng RP-HPLC .41
Bảng 2.10. Kết quả xác định thành phần của các triglixerit chính trong dầu hạt gấc
......46
Bảng 2.11. Kết quả xác định hàm lượng dầu và thành phần của các axit béo có trong
dầu hạt gấc. ................................................................................................47


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 1.1.a.b: Gấc nếp ..................................................................................................3
Hình 1.2. Hoa và quả gấc ............................................................................................4
Hình 1.3. Màng gấc ............................................................................................... ......4
Hình 1.4. Hạt gấc ............................................................................................... .........4
Hình 1.5. Sơ đồ thể hiện sự ảnh hưởng của các lực rửa giải ....................................13
Hình 1.6. Quá trình rửa giải và tách peak của chất A và chất B ...............................13
Hình 1.7. Sắc kí đồ của chất A và chất B..................................................................14
Hình 1.8. Ảnh hưởng của độ chọn lọc đến hiệu quả tách peak của hai chất A và B 15
Hình 1.9. Cách tính hệ số khôngđối xứng của peak .................................................16
Hình 2.1. Sơ đồ bước chuyển năng lượng của dao động electron (A) và phổ hấp thụ
phân tử của hợp chất chứa ba nối đôi liên hợp (B)..................................22
Hình 2.2. Sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ dầu hạt gấc (trong dm nhexan) ......................................................................................................23
Hình 2.3. Phổ hấp thụ phân tử eclectron của dầu hạt gấc trong các dung môi khác
nhau. 1-trong dung môi n-hexan, 2- trong dung môi CH2Cl2. ................24
Hình 2.4. Hiệu quả chiết dầu hạt gấc bằng dung môi hexan (thể tích dung môi của
mỗilần chiết 10 ml)
..................................................................................26
Hình 2.5. Hiệu quả chiết dầu hạt gấc bằng dung môi hexan (thể tích dung môi của
mỗi lần chiết 20 ml).................................................................................26
Hình 2.6. Hiệu quả chiết dầu hạt gấc bằng dung môi diclometan ............................27
Hình 2.7. Dung dịch dầu gấc trong dung môi diclometan trong 6 lần chiết (thể tích
mỗi lần 10ml)...........................................................................................28
Hình 2.9. Mô hình phân tử triglixerit và phospholipid có tròng dầu hạt thực vật ....31
Hình 2.10. Quá trình hấp thu dầu trên cột chiết pha rắn DIAPAK C. ......................32
Hình 2.11. Quá trình rửa giải cột chiết bằng các hệ dung môi khác nhau ................33
Hình 2.12. Quá trính chiết là làm sạch dầu hạt gấc ..................................................35


Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Hình 2.13. Sắc kí đồ của các phân đoạn dầu gấc thu được trong quá trình rửa giải
bằng hệ n-hexan và diclometan (1:1, v/v). A- dầu hạt gấc trước khi được
làm sạch, 1-8: các phân đoạn dầu thu được sau 1-8 ml rửa giải. ............36
Hình 2.14. Sắc kí đồ của các phân đoạn dầu gấc thu được trong quá trình rửa giải
bằng diclometan. A- dầu hạt gấc trước khi được làm sạch, 1-4: các phân
đoạn dầu thu được sau 1-4 ml rửa giải. ...................................................36
Hình 2.15.Sắc kí đồ của các phân đoạn dầu gấc thu được trong quá trình rửa giải
bằng aceton A- dầu hạt gấc trước khi được làm sạch, 1-4: các phân đoạn
dầu thu được sau 1-4 ml rửa giải .............................................................37
Hình 2.16. Quá trình giữ của αE2S trong trạng thái hấp phụ trên silicagel ..............38
Hình 2.17. Quá trình giữ của αE2S trong trạng thái hấp phụ trên silicagel theo thời
gian. .........................................................................................................39
Hình 2.18. Sắc ký đồ của dầu hạt gấc (A) trên nền dầu chuẩn momordica charantia
(B) ............................................................................................................41
Hình 2.19. Ba dạng cấu hình của các acid liên hợp octadecatrienoic có trong thiên
nhiên và dạng phổ hấp thụ phân tử của chúng ........................................43
Hình 2.20. Phổ hấp thụ electron trong dung môi 40% isopropanol và 60%
acetonitrin được đo trong cuvet của đầu dò diot quang (DAD). .............44
Hình 2.21. Các mẫu gấc được thu hái từ các tỉnh khác nhau....................................45
Hình 2.22. Kết quả tách triglixerit có trong dầu hạt gấc...........................................46


Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp
MỞ ĐẦU

Ngày nay cùng với sự phát triển khoa học, nhiều loại bệnh đã được phát hiện
và bước đầu nghiên cứu về phương pháp điều trị.Để đáp ứng nhu cầu chăm sóc sức
khoẻ người bệnh, các nhà khoa học đã nghiên cứu và chế tạo nhiều loại thuốc đặc
trị. Tuy nhiên, sau một thời gian sử dụng thì một số loại thuốc gây ra các tác dụng
phụ làm ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người bệnh chính vì vậy các nhà khoa học
quay trở lại với thiên nhiên, nghiên cứu thành phần hóa học, dược tính của các chất
có trong các loài thực vật với mong muốn sẽ tìm ra được phương thuốc mới an toàn
hơn cho sức khỏe con người. Việt Nam là đất nước nhiệt đới gió mùa với khí hậu
nóng ẩm, cây cối phát triển thuận lợi, rất phong phú và đa dạng.Vì vậy, việc nghiên
cứu, phân tích, giải mã các thành phần hóa học của thảo dược ngày càng phát triển.
Gấc là một cây thực phẩm đặc biệt ở Việt Nam, có danh pháp khoa học là
momordica cochinchinensis, thuộc chi mướp đắng.Ở Việt Nam có khoảng 3 loài
thường gọi là gấc nếp, gấc tẻ và gấc lai.Trái gấc được sử dụng trong ẩm thực, chăm
sóc sắc đẹp và y học.Gấc là loại thực phẩm đã được sử dụng lâu đời ở nước ta,
nhưng việc nghiên cứu cây này thì mới chỉ được nghiên cứu trong những năm gần
đây. Năm 1988-1989, TS. Phan Quốc Kinh và các cộng sự đã nghiên cứu các chế
phẩm từ quả gấc để làm các chất bổ sung chất dinh dưỡng. Từ năm 1941, bộ môn
dược liệu Đại học Dược Hà Nội đã bước đầu xác định màng đỏ bao quanh hạt gấc
có tác dụng giống như vitamin A và có tác dụng tăng trọng cho động vật và con
người. Ngoài -caroten thì phần màng đỏ của gấc còn chứa lycopene một chất
chống lão hóa mạnh nhất hiện nay.Ngành dược Việt Nam đã sản xuất một số chế
phẩm có chứa dầu màng gấc làm thuốc bổ, điều trị suy dinh dưỡng cho trẻ em và
một số bệnh về mắt.
Một số nghiên cứu gần đây cho thấy trong dầu hạt gấc có chứa một lượng
lớn các hợp chất có hoạt tính sinh học. Trong đó phải kể đến đầu tiên là hàm lượng
triglixerit với gốc axit béo không no chứa 3 nối đôi liên hợp α - eleostearic, một loại
axit béo với khả năng chống oxi hóa cao đã và đang được sử dụng để chế xuất thuốc

Kiều Thị Lan

1

K40C – Sư phạm Hóa học


Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

chống ung thư, chống giảm béo (CLA). Ngoài ra trong hạt gấc còn có một số các
hợp chất giá trị khác như saponin, ankaloit,…Tuy nhiên hiện nay ứng dụng của gấc
ở nước ta mới chỉ dùng lại ở việc sử dụng cơm gấc và màng đỏ bao quanh hạt gấc là
chủ yếu.Việc nghiên cứu để chiết xuất các hợp chất có giá trị trong hạt gấc hầu như
chưa được đề cập và chưa đưa vào sản xuất.Chính vì vậy, việc nghiên cứu để chiết
và làm sạch tinh dầu từ hạt gấc là nhu cầu cấp bách để tiến tới có thể tạo ra những
sản phẩm thương mại có giá trị từ hạt gấc.
Chính vì vậy, em chọn đề tài: “Đánh giá quy trình chiết và làm sạch tinh dầu
từ hạt gấc bằng phương pháp phổ UV và sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC” với mục

tiêu nghiên cứu như sau:
- Tìm ra quy trình chiết thành phần glixerit từ hạt gấc.
- Tìm ra quy trình tinh chế và làm sạch dầu gấc chiết được.
- Sử dụng phương pháp trắc quang UV-VIS và phương pháp sắc kí lỏng hiệu
năng cao để đánh giá hiệu quả chiết và làm sạch tinh dầu gấc đồng thời phân tích
thành phần glixerit của nó.

Kiều Thị Lan

2

K40C – Sư phạm Hóa học


Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY GẤC
1.1.1. Đặc điểm thực vật học
1.1.1.1. Khái quát
Tên khoa học: Momordica Cochinchinensis
Giới: Plantae
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Magnoliosida
Bộ: Cucubitales
Họ: Bầu bí Cucurbitaceae
Chi: Momordica
Loài: M. cochinchinensis
Tên nước ngoài: Muricic (Pháp), Cochinchina Momordica (Anh).
Tên Việt Nam: gấc (Kinh), mộc miết tử, má kưâru (Thái), mác khẩu (Tày).
Ở Việt Nam có khoảng 3 loài thường gọi là gấc nếp, gấc tẻ và gấc lai.

Hình 1.1.a.b: Gấc nếp

1.1.1.2. Mô tả thực vật
Cây gấc thuộc họ bầu bí, là cây dây leo, đa niên, đơn tính khác gốc, có
cây mang hoa đực, cây mang hoa cái. Đây là cây sống nhiều năm, mỗi năm lụi một
lần nhưng lại đâm chồi từ gốc cũ lên vào mùa xuân năm sau.
Lá mọc so le, có 3-5 thuỳ màu lục sẫm, gốc hình tim, lúc đầu có lông ở mặt
trên, sau nhẵn; gân hình chân vịt; cuống lá dài 2-3 cm.

Kiều Thị Lan

3

K40C – Sư phạm Hóa học


Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Hoa nở vào tháng 4 đến tháng 5, hoa đực và hoa cái riêng trên cùng một
cây; hoa đực mọc ở kẽ lá; tràng 5 cánh, màu trắng hoặc ngà vàng, hình trứng
thuôn, có lông dày ở mặt trong; hoa cái có lá bắc nhỏ, bầu xù xì.
Quả to hinh bầu dục dài từ 15 - 20cm, đuôi nhọn có nhiều gai mềm đỏ
đẹp. Quả non màu xanh, quả chín màu đỏ tươi. Bổ đôi theo chiều ngang thấy
có 6 hàng hạt xếp đều nhau, mỗi hàng có từ 6 đến 10 hạt. Quanh hạt có nhiều
màng màu đỏ tươi. Người ta còn dựa vào độ sai của quả (nhiều hay ít), kích
thước của quả (to hay nhỏ), gai quả (dày hay thưa), màu sắc của ruột quả (đỏ
hay vàng gạch), dầu (ít hay nhiều), số lượng hạt (nhiều hay ít) để phân loại:
gấc tẻ, gấc nếp hay gấc lai.
Hạt gấc có màng đỏ bao quanh lớp vỏ cứng đen, quanh mép có răng
cưa tù và rộng, hạt dày 25 - 35mm, rộng 19 - 31mm trông gần giống con ba
ba nhỏ bằng gỗ trong hạt có nhân chứa dầu.

Hình 1.2: Hoa và quả gấc

Hình 1.3: Màng gấc

Hình 1.4: Hạt gấc
1.1.1.3. Phân bố, sinh thái
Chi Momordica L. có khoảng 45 loài trên thế giới, đa số là cây trồng, tập
trung chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Phi và châu Mỹ. Châu Á có 5-7 loài, trong đó
Việt Nam có 4 loài (M. Karaudren Aymonin, 1975 và Nguyễn Hữu Hiếu, 1994).
Gấc được trồng nhiều ở Ấn Độ, Trung Quốc, Philippin, Lào và Việt Nam.

Kiều Thị Lan

4

K40C – Sư phạm Hóa học


Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Ở Việt Nam, gấc được trồng từ lâu đời trong nhân dân.Cây trồng có giống
quả chín màu đỏ và giống quả màu vàng. Giống quả vàng hiện thấy trồng ở một số
vùng núi thuộc tỉnh Lai Châu và Sơn La. Giống quả đỏ có 2 loại: quả to và quả
nhỏ, đều được trồng nhiều ở vùng trung du và đồng bằng Bắc Bộ.
1.1.2. Thành phần hóa học của quả gấc.
Bảng 1.1. Các thành phần trong màng tươi của quả Gấc chín.
Số thứ tự

Thành phần

Giá trị (%)

1

Nước

77

2

Protein

2,1

3

Lipide

7,9

4

Glucide

10,5

5



1,8

6

Muối khoáng

0,7

7

β-caroten

0,046

8

Lycopene

0,038

1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT DẦU THỰC VẬT
Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tùy thuộc vào thành phần hóa
học có trong mẫu (chất phân cực, chất không phân cực, chất có độ phân cực trung
bình,…) mà ta có thể chọn các dung môi hay hệ dung môi chiết khác nhau.
1.2.1. Chọn dung môi chiết.
Thông thường các chất chuyển hóa thứ cấp trong cây có độ phân cực
khác nhau nên đôi khi để tạo ra độ phân cực thích hợp người có thể sử dụng
một loại dung môi hoặc có thể phối hợp nhiều dung môi theo một tỉ lệ nhất
định để tạo ra hệ thống dung môi mới. Dung môi dùng cho quá trình chiết cần
phải được lựa chọn kỹ càng, cẩn thận.
Điều kiện của dung môi là phải dễ thấm vào dược liệu, hòa tan được
những chất chuyển hóa thứ cấp đang nghiên cứu, phải dễ dàng bay hơi khi cần

Kiều Thị Lan

5

K40C – Sư phạm Hóa học


Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

cô đặc dung dịch chiết và trơ về mặt hóa học (không phản ứng với những chất
nghiên cứu, không độc, không dễ bốc cháy). Những dung môi này cần phải
được làm sạch trước khi sử dụng, nếu chúng có lẫn những chất khác thì ảnh
hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết.
Methanol (CH 3 OH) và Chlorofom (CCl 3) thường chứa chất diotyl phtalat
[di-(2-etylhexyl)-phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat].Chất này sẽ làm sai lệch
kết quả phân tích trong quá trình nghiên cứu hóa thực vật, ngoài ra nó có thể
làm bẩn dung dịch chiết của mẫu vật.
Methanol (CH 3 OH) và Ethanol 80% (C 2H5OH) là những dung môi phân
cực hơn các hidrocacbon thế đó, các dung môi thuốc nhóm rượu sẽ thấm tốt
hơn vào màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được
lượng lớn các thành phần trong tế bào. Dung môi cồn trong nước có những đặc
tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ. Người ta cũng thường ít sử dụng nước để thu
được dung dịch chiết thô từ cây mà thay vào đó là dùng dung dịch nước của
methanol.
Ví dụ về lựa chọn dung môi trong chiết xuất được thể hiện ở bảng sau:

Kiều Thị Lan

6

K40C – Sư phạm Hóa học


Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Độ phân cực

Dung môi
Chlorofom

Thấp

Khóa luận tốt nghiệp
Phân nhóm hóa học chiết
Terpenoid, Flavonoid, Alcanoid,
Aglycogen

Cyclohexan

Sáp, chất béo

Hexan

Sáp, chất béo

Dicloromethan

Terpenoid, Flavonoid, Alcanoid,
Aglycogen

Diethylether

Alcanoid, Aglycogen

Ethylacetat

Alcanoid, Aglycogen, Glycosid

Aceton

Flavonoid, Alcanoid, Aglycogen
Tannin, Polyphenol, Terpenoid,

Ethanol

Flavonoid, Serol, Alcanoid,
Polyacethylen

Trung bình

Saponin, Tanin, Phenol, Flavon,
Đường, Aminoacid,
Methanol

Anthrocyanidin, Terpenoid,
Xanthoxyllin, Totarol, Lactone,
Polyphenol
Đường, Aminoacid, Saponin, Tanin,

Nước
Cao

Lectin, Terpenoid, Anthrocyanin,
Tinh bột, Polypeptid

Bảng 1.2: Dung môi khác nhau dùng trong chiết xuất các nhóm hoạt chất từ
dược liệu (Houghton và Raman, 1998)
Người nghiên cứu cần có sự hiểu biết về thành phần hóa học cũng như đặc
tính của các chất có trong mẫu vật được từ đó có thể lựa chọn các dung môi thích
hợp cho quá trình chiết, tránh được sự phân hủy bởi dung môi và quá trình tạo thành
chất không mong muốn.
Sau khi chiết, dung môi được cất quay ở nhiệt độ không quá 30C - 40C với
một vài hóa chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn.

Kiều Thị Lan

7

K40C – Sư phạm Hóa học


Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

1.2.2. Quá trình chiết
Quá trình chiết xuất diễn ra lần lượt như sau:
Dung môi thâm nhập vào bên trong dược liệu.
Dung môi hòa tan các chất bên trong dược liệu.
Khuếch tán các chất tan trong dung môi (khuếch tán phân tử và khuếch tán
đối lưu) bao gồm:
Khuếch tán các chất tan từ trong dược liệu qua màng tế bào ra mặt
ngoài dược liệu (khuếch tán qua lỗ xốp và khuếch tán phân tử).
Khuếch tán các chất từ mặt ngoài dược liệu ra lớp dung môi xa hơn
(khuếch tán phân tử).
Khuếch tán các chất theo dòng chuyển động của dung môi (khuếch
tán đối lưu).
1.2.3. Phương pháp chiết
Phương pháp chiết xuất là yếu tố quan trọng góp phần vào sự thành công của
quá trình nghiên cứu thuốc có nguồn gốc tự nhiên, bao gồm các phương pháp
truyền thống và phương pháp hiện đại.
Phương pháp truyền thống sử dụng dung môi kết hợp với gia nhiệt và khuấy
trộn. Các phương pháp chiết xuất hay sử dụng như:
a) Phương pháp chiết lạnh.
Phương pháp ngâm.
Phương pháp ngấm kiệt.
b) Phương pháp chiết nóng
Phương pháp sắc.
Phương pháp hãm.
Phương pháp hầm.
Phương pháp lôi cuốn hơi nước.
Phương pháp chiết Soxhlet.
Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất
trong quá trình chiết thực vật bởi lẽ phương pháp này không đòi hỏi nhiều thời gian,

Kiều Thị Lan

8

K40C – Sư phạm Hóa học


Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

công sức và rất dễ thực hiện. Thiết bị sử dụng là một chiếc bình thủy tinh với một
khóa ở dưới đáy để điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung
môi, có thể sử dụng dung môi nóng hoặc lạnh nhưng sẽ thu được hiểu quả cao hơn
nếu dùng dung môi nóng.
Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng nhiều như phương
pháp chiết liên tục bởi lẽ mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24h
rồi chất chiết được lấy ra. Quá trình chiết một mẫu được thực hiện qua 3 lần dung
môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những chất giá trị nữa. Sự kết thúc quá
trình chiết được xác định bằng một vài cách khác nhau.
Ví dụ: Khi chiết các chất béo thì nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và
sự xuất hiện của các cặn chiết tiếp theo sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết.
Các flavonoid là những hợp chất màu.Vì vậy, khi dịch chiết chảy ra mà
không có màu đồng nghĩa với việc trong cặn chiết không còn flavonoid và quá trình
chiết sẽ kết thúc.
Các lacton của Sesquitecpen và các glicotid trợ tim, phản ứng kedde có thể
dùng để biểu thị sự xuất hiện của chúng khi cho phản ứng với aniline axetat sẽ cho
biết sự xuất hiện của các hydrocacbon và từ đó có thể biết được khi nào quá trình
chiết sẽ kết thúc.Hay khi chiết các ankaloit, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của các
hợp chất này bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân:
Dragedroff và các tác nhân Maye.
Như vậy, tùy thuộc vào mục đích của người nghiên cứu là cần lấy chất gì từ
đó lựa chọn dung môi và các phương pháp chiết thích hợp nhằm đạt hiệu quả cao
nhất.
Mặt khác, ta có thể dựa vào các mối quan hệ của dung môi và chất tan của
các lớp chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết.
Ngoài ra, hiện nay có nhiều kĩ thuật chiết hiện đại mới được áp dụng với
nhiều ưu việt trong chiết xuất các hợp chất tự nhiên như:
Chiết xuất với sự hỗ trợ của sóng siêu âm (Chiết siêu âm – UAE).
Chiết xuất với sự hỗ trợ của vi sóng (Chiết vi sóng – MAE).
Chiết xuất lỏng siêu tới hạn (Chiết siêu tới hạn – SPE).
Chiết xuất bằng dung môi dưới áp lực cao (Chiết dung môi nhanh – ASE).

Kiều Thị Lan

9

K40C – Sư phạm Hóa học


Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

1.3. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT PHA RẮN
1.3.1. Định nghĩa về chiết pha rắn.
Chiết pha rắn (SPE) (Solid – Phase Extraction) là quá trình phân bố chất tan
giữa hai pha lỏng – rắn có thể là các hạt silicagel xốp, các polime hữu cơ hoặc các
loại nhựa trao đổi ion hay than hoạt tính. Quá trình chiết có thể thực hiện ở điều
kiện tĩnh hay động. Các chất bị giữ lại trên pha rắn có thể được tách ra bằng cách
rửa giải với dung môi thích hợp. Thông thường thể tích cần thiết để rửa giải hoàn
toàn chất phân tích luôn nhỏ hơn rất nhiều so với thể tích của dung dịch mẫu ban
đầu, vì thế có hệ số làm giàu cao.
1.3.2. Các cơ chế chiết pha rắn.
Về cơ bản, cơ chế chiết SPE giống với cơ chế tách trong phương pháp sắc kí
lỏng hiệu nâng cao (HPLC) gồm 3 cơ chế chính: cơ chế hấp phụ pha thường, cơ chế
hấp phụ pha đảo và cơ chế trao đổi ion. Tuy nhiên, SPE khác với HPLC là trong
HPLC có sự tách chất phân tích ra khỏi nhau trong hệ dòng chảy liên tục của pha
động, còn SPE giữ chất phân tích lại trên pha rắn sau đó rửa giải chất phân tích ra
khỏi pha rắn với dung môi thích hợp. Các chất phân tích sẽ được tách khỏi dung
dịch ban đầu với nồng độ đậm đặc hơn và tinh khiết hơn.
Cơ chế hấp phụ pha thường (normal phase)
Là sự hấp thu các chất phân tích từ dung môi không phân cực lên bề mặt
phân cực của pha rắn. Cơ chế của quá trình tách dựa trên lực tương tác phân cực
như: các liên kết hydro, các tương tác phân cực π – π, tương tác lưỡng cực hay
tương tác lưỡng cực cảm ứng. Cơ chế này liên quan đến sự hấp thu các nhóm chức
của chất tan lên các vị trí phân cực của pha tĩnh để chống lại độ tan của các chất tan
trong pha động.
Trong SPE pha thường, thường sử dụng các loại pha tĩnh không liên kết như:
silica, alumina và magie silica, nhưng phổ biến nhất vẫn là silica.
Để rửa giải chất phân tích ra khỏi chất hấp thu, thường sử dụng dung môi
phân cực có khả năng phá vỡ các liên kết giữa chất phân tích với bề mặt chất hấp
thu.

Kiều Thị Lan

10

K40C – Sư phạm Hóa học


Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Cơ chế hấp thụ pha đảo (reversed – phase)
Ngược với cơ chế hấp thụ pha thường, pha tĩnh ở đây là các chất không phân
cực còn pha động là pha không phân cực. Cơ chế là tương tác không phân cực còn
gọi là tương tác Van Der Vaals, hiệu ứng phân tán hay sự phân tách.
Cơ chế trao đổi ion
Dựa vào sự trao đổi ion của chất tan (mang điện tích) trong các dung môi
phân cực hay không phân cực với chất hấp thu trao đổi ion. Cơ chế tương tác ion
này có nang lượng cao (80Kcal/mol). Vì vậy, các chất tan phân cực có thể hấp thu
hiệu quả từ dung môi phân cực cũng như tù dung môi không phân cực. Trong quá
trình hấp thu sẽ xuất hiện sự cạnh tranh để trao đổi ion. Quá trình này phụ thuộc vào
độ chọn lọc của ion hay số lượng ion cạnh tranh ở các vị trí này. Do vậy, chất chất
tích được làm giàu sẽ phải cạnh tranh với các ion khác trong dung dịch mẫu. Sự trao
đổi ion là quá trình thuận nghịch.
Các chất hấp thụ trao đổi thường có chứa các nhóm chức anion hoặc các
cation liên kết với silica.Các chất trao đổi cation mạnh có chứa nhóm chức axit
sulfonic và các chất trao đổi ion yếu thường là các nhóm axit cacboxylic. Đối với
các chất trao đổi anion mạnh là các nhóm chức chứa amin bậc 4, còn các chất trao
đổi anion yếu thường là bậc 1,2 và 3.
Pha tĩnh thường là silica liên kết với nhóm chức anion hay cation. Nếu là các
chất trao đổi cation mạnh thì dùng silica liên tiếp với nhóm sulfonic axit, còn là chất
trao đổi yếu thường là liên kết với nhóm – COOH.
Việc rửa giải các chất phân tích hấp thu trên pha tĩnh có thể tiến hành theo
nhiều cách: nếu là trao đổi cation có thể dùng H+ của axit mạnh hoặc dùng các
cation mạnh hơn, nếu là trao đổi anion thì dùng OH hoặc các anion khác.
1.4. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC
HPLC là chữ viết tắt của 4 chữ cái đầu bằng Tiếng Anh của phương pháp sắc
kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước kia gọi là
phương pháp sắc kí lỏng cao áp ( High Pressure Liquid Chromatography). Phương
pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp

Kiều Thị Lan

11

K40C – Sư phạm Hóa học


Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

sắc kí cột cổ điển.Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại
hóa cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích.Phương
pháp này được áp dụng rộng rãi trong các ngành kiểm nghiệm thuốc và nó hiện là
công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần cho phép định tính và định
lượng.
1.4.1. Khái niệm.
Sắc kí lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là
chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu
phân hoạc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn hay một chất mang đã được
biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Quá trình sắc kí lỏng dựa
trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ (Rây phân tử).
Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lí
do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay
hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt.
Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp
chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực
thực phẩm, dược phẩm, môi trường,…
1.4.2. Nguyên tắc của các quá trình sắc kí
Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc kí và
loại sắc kí. Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc kí hấp phụ. Nếu pha tĩnh là
chất trao đổi ion thì ta có sắc kí trao đổi ion. Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc
kí phân bố hay sắc kí chiết. Nếu pha tĩnh là gel thì ta có sắc kí gel hay sắc kí rây
phân tử. Cùng với pha tĩnh để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột, chúng ta cần có
một pha động. Như vậy nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân
tích A,B,C,… vào cột phân tích, kết quả là các chất A,B,C,… sẽ được tách ra khỏi
nhau khi đi qua cột. Quyết định hiệu quả của sự tách sắc kí ở đây là tổng hợp các
tương tác.

Kiều Thị Lan

12

K40C – Sư phạm Hóa học


Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Chất phân tích A+B+C
F1
Pha tĩnh

F3
F2

Pha động

Hình 1.5.Sơ đồ thể hiện sự ảnh hưởng của các lực rửa giải
Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi cột
nước trước tiên khi lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất (F1) và ngược lại. Đối với mỗi
chất, sự lưu giữ được quy định bởi 3 lực F1,F2,F3. Trong đó, F1 và F2 giữ vai trò
quyết định, còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn. Ở đây, F1 là lực giữ chất phân
tích trên cột, F2 là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột. Như vậy,
với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau.Kết quả là các chất khác nhau sẽ di
chuyển trong cột với tốc độ khác nhau khi ra khỏi cột như hình 1.16.

Hình 1.6. Quá trình rửa giải và tách peak của chất A và chất B
1.4.3. Phân loại sắc kí hấp phụ
Quá trình sắc kí dựa trên sự hấp phụ mạnh yếu khác nhau của pha tĩnh đối
với các chất tan và sự rửa giải của pha động để kéo chất tan ra khỏi cột. Sự tách một
hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học của chất hấp phụ. Trong loại này có hai
kiểu hấp phụ:
Sắc kí hấp phụ pha thường (Normal Phase: NP-HPLC): pha tĩnh phân
cực, pha động không phân cực.
Sắc kí hấp phụ pha đảo (Reverse Phase: RP-HPLC): pha tĩnh không
phân cực, pha động phân cực.

Kiều Thị Lan

13

K40C – Sư phạm Hóa học


Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Trong đó, sắc kí hấp phụ pha đảo được ứng dụng nhiều nhất vì có thể tách
các hỗn hợp các chất có tính chất gần tương tự nhau và thuộc loại không phân cực,
phân cực yếu hay trung bình như các vitamin, các thuốc hạ nhiệt, giảm đau,…
Hiện nay, chủ yếu chúng ta sử dụng loại sắc kí pha đảo (RP-HPLC).
1.4.4. Các đại lượng đặc trưng của sắc kí đồ.

t0: thời gian lưu chết.
trA: thời gian lưu chất A.

trB: thời gian lưu chất B.

t’rB: thời gian lưu thực chất A.

t’rB: thời gian lưu thực chất B.

Hình 1.7. Sắc kí đồ của chất A và chất B
a) Thời gian lưu thực.
Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi bơm mẫu vào cột cho đến
khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại.Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và
các chất khác nhau thì thời gian lưu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện sắc kí đã
chọn.Vì vậy, thời gian lưu là đại lượng để phát hiện định tính các chất.
Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố:
Bản chất sắc kí của pha tĩnh.
Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động.
Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan.
Trong một số trường hợp thời gian lưu còn phụ thuộc vào pH của pha động.
b) Hệ số dung lượng K’.
Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong
hai pha động với sức chứa cột tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và
lượng chất tan trong pha động ở trong thời điểm cân bằng.

Kiều Thị Lan

14

K40C – Sư phạm Hóa học


Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp
�� ′ =

���

��0




Nếu K’ nhỏ thì ��� cũng nhỏ và sự tách kém.Nếu K’ lớn thì peak
bị
doãng.Trên thực tế, K’ từ 1 – 5 là tối ưu.
c) Độ chọn lọc α.
Độ chọn lọc α cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc kí, khi hai chất A và B
có K’A và K’B khác nhau thì mới có khả năng tách, mức độ tách biểu thị ở độ chọn
lọc α.

α=

� ′�

với (B > K’A)

K’

�′�

với α càng khác 1 thì khả năng tách càng rõ ràng.

Hình 1.8. Ảnh hưởng của độ chọn lọc đến hiệu quả tách peak của hai chất A và B
d) Số đĩa lí thuyết.
Số đĩa lí thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện
sắc kí nhất định. Mỗi đĩa lí thuyết trong cột sắc kí giống như một lớp pha tĩnh có
chiều cao là H. Tất nhiên lớp này có tính chất động tức là một khu vực của hệ phân
tích mà trong đó một cân bằng nhiệt động học được thiết lập giữa nồng độ trung
bình của chất tan trong pha tĩnh và pha động.
Bề dày H phụ thuộc vào nhiều yếu tố:
Đường kính và độ hấp phụ của pha tĩnh.
Tốc độ và độ phân cực của pha động.
Hệ số khuếch tán của các chất trong cột.
Kiều Thị Lan

15

K40C – Sư phạm Hóa học


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×

×