Tải bản đầy đủ

Nghiên cứu về đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây nhân trần tía adenosma bracteosum bonati scrophulariaceae tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN NGỌC QUỲNH

NGHIÊN CỨU VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT,
THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG
SINH HỌC CỦA CÂY NHÂN TRẦN TÍA
ADENOSMA BRACTEOSUM BONATI SCROPHULARIACEAE

Ngành: DƯỢC LIỆU - DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN
Mã số: 62.73.10.01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

Thành Phố Hồ Chí Minh – Năm 2018


Công trình được hoàn thành tại:
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS Trần Hùng
Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:
Luận án sẽ được bảo vệ tại Hội đồng đánh gía luận án cấp trường họp tại:
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
vào hồi …..giờ……….ngày…….tháng……..năm ….

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
- Thư viện Khoa học Tổng hợp Thành phố Hồ Chí Minh
- Thư viện Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh


1

GIỚI THIỆU LUẬN ÁN
1. Đặt vấn đề
Ở Việt Nam hiện nay có nhiều loài dược liệu thuộc chi Adenosma
được sử dụng trong việc phòng và điều trị viêm gan như Nhân trần
(Adenosma caeruleum R. Br.), Bồ bồ (Adenosma indianum (Lour.)
Merr.), Nhân trần tía (Adenosma bracteosum Bonati). Cả ba loài dược
liệu trên đều được đưa vào các chuyên luận Dược điển Việt Nam và các
tài liệu chính thống về cây thuốc Việt Nam. Trong đó dược liệu Bồ bồ,
được nghiên cứu khá nhiều về thành phần cũng như tác dụng sinh học
của tinh dầu có trong dược liệu này và được sử dụng khá phổ biến ở
miền Bắc. Tuy nhiên ở miền Nam, Nhân trần tía hay còn được gọi là
Nhân trần Tây Ninh được sử dụng khá phổ biến. Trên lâm sàng cũng cho
thấy có tác dụng trong điều trị viêm gan, bệnh viện Nhiệt Đới đã từng
dùng dược liệu này chữa cho hơn 4.000 trường hợp viêm gan do virus và
đạt kết quả tốt, bệnh viện Y học Dân tộc Tây Ninh đã dùng để chữa hơn
100 trường hợp xơ gan cổ trướng cho kết quả khỏi bệnh là 24% và tiến
triển khá tốt là 46,6%. Thêm vào đó nhóm nghiên cứu Đại Học Y Dược
TPHCM đã nghiên cứu sàng lọc 56 dược liệu, trong đó dược liệu Nhân
trần tía cho tác dụng chống oxy hoá cao, trên cả 4 mô hình thử nghiệm.
Bên cạnh các nghiên cứu được đánh giá cao về tác dụng trị liệu, thì việc
nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như các phương pháp theo dõi,
đánh giá thành phần, hàm lượng các hợp chất chính, để có thể đánh giá,
đảm bảo hợp chất lượng, tiêu chuẩn hóa dược liệu, sử dụng trong chăm
sóc sức khỏe một cách an toàn, hiệu quả và khoa học vẫn có rất ít nghiên
cứu.
Để nâng cao giá trị cũng như hiểu biết về dược liệu Nhân trần tía, đề
tài:“Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác
dụng sinh học về cây Nhân trần tía (Adenosma bracteosum BotaniScrophulariacea)” được thực hiện với các mục tiêu:
1. Nghiên cứu về đặc điểm thực vật của cây Nhân trần tía
2. Nghiên cứu về hóa học của cây Nhân trần tía


2
-

Khảo sát thành phần hóa thực vật dược liệu Nhân trần tía.
Phân lập hợp chất hoá học có trong tinh dầu và trong dược liệu
Nhân trần tía
- Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được
3. Xây dựng quy trình định lượng
- Xây dựng quy trình định lượng hai flavonoid có trong dược liệu
- Xây dựng quy trình định lượng carvacrol có trong tinh dầu Nhân
trần tía.
4. Khảo sát tác dụng sinh học
- Khảo sát tác dụng chống oxy hóa in vitro của cao chiết và một số
hợp chất phân lập được từ Nhân trần tía bằng mô hình DPPH
- Khảo sát tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu Nhân trần tía
2. Tính cấp thiết của đề tài
Nước ta có có nguồn tài nguyên thực vật phong phú. với trên 12000
loài là nguồn dược liệu quý dùng trong các bệnh. Nhân trần tía là một
trong những dược liệu được dùng để điều trị bệnh viêm gan, tuy nhiên
các nghiên cứu về thực vật thành phần hoá học của Nhân trần hầu như rất
ít các nghiên cứu ở trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Do những lý do
trên, đề tài được thực hiện trên loài Adenosma bracteosum nhằm làm
sáng tỏ thêm về thực vật, thành phần hoá học, kiểm soát hàm lượng
flavonoid có trong dược liệu, cũng như carvacrol có trong tinh dầu Nhân
trần tía, cũng như tác dụng dược lý của dược liệu này.
3. Những đóng góp mới của luận án
3.1. Khảo sát về hình thái và vi học của Nhân trần tía:
Có so sánh sự khác nhau về hình thái và giải phẫu học từng bộ phận
dùng (rễ, thân, lá) của Nhân trần ở những giai đoạn khác nhau. Bên cạnh
đó thực hiện soi bột bộ phận trên mặt đất, tìm thấy được 18 cấu tử.
3.2. Chiết xuất và phân lập các hợp chất có trong dược liệu Nhân trần
tía
Phân lập các nhóm hợp chất từ các cao chiết thu được 18 hợp chất


3
và được định danh bằng các phương pháp phổ hoc, trong đó có một hợp
chất mới: AB12.
3.3. Xây dựng và đánh giá quy trình định lương AB9 và AB18 có trong
Nhân trần tía bằng HPLC-PDA
Đề tài xây dựng và đánh giá quy trình định lượng đồng thời hai
flavonoid có trong Nhân trần tía bằng HPLC-PDA
3.4. Xây dựng và đánh giá quy trình định lượng carvacrol có trong tinh
dầu Nhân trần tía bàng GC-FID
Đề tài xây dựng và đánh giá quy trình định lượng carvacrol có trong
tinh dầu Nhân trần tía bằng GC-FID.
3.5. Thử tác dụng chống oxy của Nhân trần tía
3.5.1. Thử tác dụng chống oxy hoá trên cao chiết và hợp chất phân lập
được.
Các hợp chất phân lập từ Nhân trần tía (AB2, AB6; AB16, AB17,
AB18) được thử tác dụng chống oxy hoá trên UV-Vis. Trong đó các các
hợp chất được thử nghiệm ở các nồng độ khác nhau (0,01 – 1,5 mg/mL).
Ở tất cả các mẫu ở các nồng độ khác nhau đều có khả năng chống oxy
hoá. Tuy nhiên đa số các các mẫu cho tác dụng chống oxy hoá cao nhất ở
nồng độ 1,5 mg/mL.
3.5.2. Thử tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu Nhân trần tía
Tinh dầu Nhân trần tía được thử tác dụng kháng khuẩn với 6 chủng
vi khuẩn, trong đó có 5 vi khuẩn Gram dương (Pseudomonas
aeruginosam,
Staphylococcus
aureus,
Moraxella
catarrhalis,
Streptococcus pyogennes, Streptococcus pneumoniae) và một vi khuẩn
Gram âm (Haemophilus influenzae).Kết quả nhận thấy các tinh dầu có
khả năng kháng 5 loại vi khuẩn thử nghiệm, trong đó loài Streptococcus
pneumoniae có đường kính kháng khuẩn 62 mm. Tinh dầu không có khả
năng kháng loài Pseudomonas aeruginosam.
Khi thử MIC thì tinh dầu rất nhạy (có MIC thấp nhất 0,025 %) với
loài Streptococcus pneumoniae, một loại cầu khuẩn sinh mủ.


4

4. Bố cục luận án
Luận án gồm 140 trang: Mở đầu 2 trang, tổng quan tài liệu 26
trang, nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu 16 trang, kết quả
nghiên cứu 82 trang, bàn luận 11 trang, kết luận và đề nghị 3 trang. Luận
án có 55 bảng, 68 hình, 6 sơ đồ, 114 tài liệu tham khảo gồm 21 tài liệu
tiếng Việt và 92 tài liệu tiếng nước ngoài, 1 trang web, 149 phụ lục thể
hiện các kết quả thực nghiệm.
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU VỀ NHÂN TRẦN TÍA
1.1. THỰC VẬT HỌC
1.1.1. Nhân trần tía (Adenosma bracteosum)
Tên Việt Nam: Nhân trần Tây Ninh, Nhân trần (nhiều) lá bắc,
nhân trần cái (miền Nam).
Tên khoa học: Adenosma bracteosum Bonati, họ Hoa mõm chó
(Scrophulariaceae).
Đặc điểm hình thái: cây thảo nhất niên, mọc đứng, không lông,
rất thơm, cao 20-70 cm; thân hình trụ ở gốc, phần thân ở trên và cành
vuông, có 4 cạnh ở góc. Thân và cành màu tím đỏ hoặc màu xanh. Lá
không cuống, mỏng, thường cuốn lại và dễ rụng, phiến thon, dài 2-2,5
cm, rộng 0,6-0,9 cm, mép lá có răng cưa, mặt dưới có ít lông, có tuyến.
Cụm hoa có dạng gié đứng, dài 1,5-5 cm, có nhiều lá bắc ở gốc tạo thành
tổng bao lá bắc. Các lá bắc phía trên lợp lên nhau, dạng màng trong suốt
hình tim có chóp nhọn, mép nguyên, có ít lông, có tuyến ở mặt ngoài. Lá
đài 5, không bằng nhau, đài hoa dạng màng. Tràng hoa có màu trắng
hoặc màu xanh tím, có ống cao 6 mm, môi dưới có 3 thuỳ bằng nhau, có
lông ở mặt trên, cánh hoa thường rụng, chỉ còn lại hai lá bắc và đài. Quả
nang cao 3 mm, không lông, chứa nhiều hạt nhỏ li ti màu nâu hay đen.
Dược liệu có mùi thơm nồng, vị cay mát và hơi đắng.
Phân bố: trong số 3 loài thuộc chi Adenosma R. Br. được sử dụng
làm thuốc ở Việt Nam, loài Nhân trần tía có phạm vi phân bố hạn chế và
chỉ phát hiện thấy ở một vài tỉnh phía Nam, như Tây Ninh, Bình Dương,


5
khu vực Vũng Tàu, các đảo như: Phú Quốc và Côn Đảo. Có tài liệu còn
ghi nhận ở cả Kon Tum, Đắc Lắc. Cây cũng phân bố khá phổ biến ở Lào
và Campuchia.
Bộ phận dùng: thân, cành mang lá và hoa phơi hay sấy khô. Thu
hái lúc cây đang ra hoa, phơi hay sấy ở 40-50 °C đến khô. Dược liệu có
mùi thơm nồng, vị cay mát và hơi đắng.
1.2. THÀNH PHẦN HOÁ HỌC
1.2.1. Nhân trần tía (Adenosma brateosum)
1.2.1.1. Tinh dầu
Từ năm 2015 các nghiên cứu phân tích thành phần tinh dầu khá
trùng khớp nhau về kết quả, trong đó thành phần chính carvacrol (2737,2%), carvarol methyl ether (23,2% - 28%), α-bisabolen (15,9%30,4%) và γ-terpinen (9,2%). Trong đó loài Nhân trần tía thu hái ở vùng
miền khác nhau, có thành phần và hàm lượng khác nhau
1.2.1.2. Thành phần khác
Nguyễn Minh Đức và cộng sự đã chiết xuất và phân lập được 3
hợp chất từ Nhân trần tía là bracteosid A, bracteosid B và bracteosid C.
1.3. TÁC DỤNG SINH HỌC
1.3.1. Tác dụng sinh học của Nhân trần tía
1.3.1.1. Tác dụng kháng khuẩn
Carvacrol trong tinh dầu Nhân trần tía đã được chứng minh có tác dụng
kháng khuẩn khá mạnh.
1.3.1.2. Tác dụng trên gan
Một số bệnh viên y học cổ truyên đã sử dụng Nhân trần tía để
điều trị viêm gan cho bệnh nhân và đạt kết quả tốt.
1.3.1.3. Tác dụng chống oxy hóa
Năm 2010, Nhóm nghiên cứu Nguyễn Ngọc Hồng, Trần Hùng
thực hiện sàng lọc hoạt tính chống oxy hoá của 56 loài dược liệu.
Adenosma bracteosum là một trong những dược liệu có hoạt tính mạnh
nhất so với 56 loài dược liệu nghiên cứu.


6
1.3.1.4. Tác dụng chống viêm
Nhân trần tía ở Tây Ninh, chứa hàm lượng carvacrol rất cao
(27%). Carvacrol là một trong những hợp chất có tác dụng như hợp chất
ức chế COX-II, rất giống hợp chất chống viêm nonsteroid (NSAIDs) như
thuốc ibuprofen.
1.3.1.5. Độc tính
Toàn cây chặt nhỏ phơi khô, chiết cồn 40%, rồi cô cách thủy đến
dịch đậm đặc. Chuột nhắt trắng không chết ở liều 300 g/kg quy ra dược
liệu khô.
1.4. TÁC DỤNG THEO Y HOC CỔ TRUYỀN
1.4.1. Nhân trần tía
Nhân trần tía có vị đắng, mùi thơm do chứa tinh dầu, song hàm
lượng thấp hơn Nhân trần, toàn cây Nhân trần tía bỏ rễ chữa viêm gan,
vàng da, ăn uống kém tiêu, sốt, cảm cúm, ngộ độc, 4000 trường hợp
viêm gan siêu vi được điều trị bằng bài thuốc có vị Nhân trần tía ở bệnh
viện Chợ Quán Tp. Hồ Chí Minh (1977-1984), cho kết quả tốt.
Bệnh viện Y học dân tộc Tây Ninh đã sử dụng bài thuốc Nhân trần để
điều trị 100 trường hợp xơ gan cổ trướng, trong đó khỏi bệnh 24%, đáp
ứng khá tốt 46,6%.
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU
2.1.1. Nhân trần tía
Nguyên liệu cây Nhân trần tía được thu hái và xác định loài
Adenosma bracteosum Bonati, Scrophulariaceae dựa trên đặc điểm hình
thái và so sánh với tài liệu chuyên ngành. Nguyên liệu Nhân trần tía sau
khi thu hái được phơi khô trong mát, loại tạp cơ học lẫn vào, được xay
thành bột với cỡ hạt ≤ 2 mm, bột dược liệu được bảo quản trong thùng
nhựa chống ẩm, để nơi khô, mát, được kiểm tra đạt yêu cầu về độ ẩm
theo DĐVN V trước khi sử dụng.
2.1.2. Vi khuẩn thử nghiệm
1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853


7
2.
3.
4.
5.
6.
2.2.

Staphylococcus aureus ATCC 29213
Streptococcus pneumoniae ATCC 29212
Streptococcus pyogennes ATCC 12344
Moraxella catarrhalis ATCC 25238
Haemophilus influenzae ATCC 33533
CHẤT ĐỐI CHIẾU

Acid ascorbic (Vitamin C) dùng trong thử nghiệm chống oxy hóa.
(Viện Kiểm Nghiệm TPHCM) số lô: QT016070614 đạt độ tinh khiết
99,17%.
Chất đối chiếu đã được nhóm nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc và
xác định độ tinh khiết: isoscutellarein 8-O-β-glucuropyranosid (AB9)
đạt độ tinh khiết 97,51%/HPLC-PDA; isoscutellarein 8-O-βglucopyranosid (AB18) đạt độ tinh khiết 99,17%/HPLC-PDA; carvarol đạt
độ tinh khiết 97,30%/GC-FID.
2.3. TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
Hệ máy HPLC Waters 600S/626, đầu dò PDA 996, cột Merck RP18 (4,6×150 mm; 5 µm);
Máy quang phổ UV-Vis U2800 Hitachi và Gene Quant 1300/);
Máy HPLC Hitachi L – 2000 với đầu dò PDA L – 2455, cột
Merck RP-18 (4,6×150 mm; 5 µm); Hệ thống máy GC Agilent 7890B
ghép với detector FID, Cột HB-5 (30 m × 0,25 mm, 0,25 µm film
thickness); Khối phổ được đo bằng máy Micromass Quattro microTM
API, ở chế độ ESI+ hay ESI-; NMR: Bruker Avance 500 MHz.
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Dược liệu sau khi được thu hái sẽ được khảo sát về đặc điểm thực
vật để xác định mẫu nghiên cứu và góp phần xây dựng tiêu chuẩn kiểm
nghiệm Nhân trần tía (Khảo sát hình thái, giải phẫu học, soi bột dược
liệu). Mẫu, sau đó được khảo sát về thành phần hoá học, chiết xuất và
phân lập các hợp chất hoá học bằng các kỹ thuật sắc ký. Các hợp chất
phân lập được, được xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ học
thông dụng như: UV, IR, MS, NMR. Trong dược liệu có hai thành phần
chính là phần bay hơi và không bay hơi. Những hợp chất có hàm lượng


8
cao trong cây sẽ được xây dựng quy trình định lượng (flavonoid sẽ được
xây dựng quy trình định lượng bằng HPLC-PDA, carvacrol được xây
dựng quy trình định lượng bằng GC-FID theo hướng dẫn ICH. Tiến hành
khảo sát tác dụng sinh học trên mô hình in vitro một số hợp chất chiếm
hàm lượng cao trong cây (6 flavonoid flavonoid được khảo sát tác dụng
chống oxy hoá, tinh dầu được khảo sát tác dụng kháng khuẩn trên 6 vi
khuẩn thử nghiệm: Nội dung nghiên cứu được trình bày ở Sơ đồ

Khảo sát thực vật

• Chiết xuất, phân lập, tinh chế.

• Quy trình định lượng Flavonoid

• Xác định cấu trúc hóa học.

• Quy trình định lượng tinh dầu.

Khảo sát hóa học

Kiểm nghiệm

Khảo sát tác dụng sinh học
• Flavonoid: tác dụng chống oxy-hóa.
• Tinh dầu: tác dụng kháng khuẩn.

Sơ đồ trình tự các nội dung nghiên cứu
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. NGHIÊN CỨU THỰC VẬT HỌC
3.1.1. Hình thái thực vật
Cây Nhân trần tía (Adenosma bracteosum Bonati, họ
Scrophulariaceae) là loài thân thảo, cao khoảng 30 – 40 cm. Cành toả ra
ngang hay thẳng đứng. Thân có tiết diện tròn hơi nhô 4 góc, thân non
màu xanh có bốn cánh toả ra, thân già đỏ tía, lông tơ thưa, nhiều ở phần
mắt lá, ở gốc thân có màu nâu tía. Cành mọc thẳng đứng hoặc tỏa ngang.
Rễ ngắn, dài 1-4 cm, rễ chùm.
Dược liệu có mùi thơm nồng, vị cay mát và hơi đắng.


9
A.Toàn cây B. Lá đơn mọc đối C. Lá tím và xanh D. Lá chứa túi tiết E. Cụm hoa F. Cụm hoa dạng
gié G. Bao phấn hai buồng H. Hoa I. Bầu noãn, vòi nhuỵ, đầu nhuỵ K. hạt L. bầu noãn thượng có
hai lá noãn dính nhau, đính noãn trung trụ

Hình 3.1. Toàn cây Nhân trần tía và hoa
3.1.2. Vi phẫu thực vật
3.1.2.1. Rễ cây
Mặt cắt ngang rễ thân lá của A. bracteosum cũng giống những
cây hai lá mầm khác, tuy nhiên phần thân non có 4 cạnh và bị tiêu biến đi
khi về già.
Rễ non, lớp ngoài cùng mang nhiều lông hút. Ở rễ già, lớp ngoài
cùng là lớp bần gồm nhiều hàng tế bào hình chữ nhật và bị bong tróc
từng phần.

Hình 3.2. Vi phẫu rễ
cây A. bracteosum

3.1.3.

Hình 3.3. Vi phẫu thân
cây A. bracteosum

Hình 3.4. Vi phẫu
lá cây A.
bracteosum

Soi bột

Bột có màu nâu hơi tím hơi, mùi thơm đặc trưng. Trong bột thân
đã tìm thấy mảnh mô mềm, mám tế bào mô cứng, sợi mô cứng, mạch
mạng, mạch chấm đồng tiền, mạch xoắn, lông tiết chân đơn bào, đầu đa
bào, hạt tinh bột, hạt, phấn, bao phấn, mảnh cánh hoa.

A. Bao phấn mang hạt phấn B. Quả C.Mảnh
cánh hoa D. Hạt phấn có rãnh dọc E. Biểu bì
mang lổ khí F. Lổ khí G. Lông tiết đầu đa bào H.
Lông che chở đa bào

I.Mạch mạng K.Mô cứng L.Mạch chấm
đồng tiền M.Mảnh bần N.Mạch vạch
P.Mảnh mô mềm Q. Bó sợi U.Mạch soắn
V.Hạt tinh bột

Hình 3.5. Các cấu tử của bột A. bracteosum


10
3.2.

THỬ TINH KHIẾT NGUYÊN LIỆU A. BRACTEOSUM

Dược liệu được tiến hành thử tinh khiết với độ ẩm, độ tro và hợp
chất chiết được trong cồn 96%. Kết quả độ ẩm, độ tro và chất chiết được
thể hiện trên Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả thử tinh khiết của mẫu bột dược liệu Nhân trần tía
phần trên mặt đất (n=3)
Độ
ẩm
(%)

Tro toàn
phần (%)

Tro
không
tan / HCl
(%)

9,74

5,38

0,5

Hàm lượng chất
chiết được (%)
Dung môi nước
24,02

Hàm lượng
chất chiết được
(%)
Dung môi cồn
96%
12

3.3.
XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TINH DẦU TRONG THÂN
CÀNH VÀ HOA NHÂN TRẦN TÍA
Hoa và thân cành được tách ra và chiết xuất cất và có sự khác
nhau đáng kể về hàm lượng tinh dầu trong hoa và thân cành. Tinh dầu
thu được, được xác định tỷ trọng dựa theo DĐVN V.
Bảng 3.2. Tính chất và hàm lượng tinh dầu có trong Nhân trần tía
Bộ phận dùng
Thân cành và lá

Hoa

Hàm lượng
(%)
0,28
1,94

Màu sắc

Tỷ trọng

Màu vàng nhạt
Màu vàng nhạt

0,8984
0,8984

3.4.
CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP CÁC THÀNH PHẦN TRÊN
MẶT ĐẤT CỦA A. BRACTEOSUM
3.4.1. Chiết xuất
3.4.1.1. Chiết xuất tinh dầu
Phần dược liệu trên mặt đất (5 kg) được chiết xuất bằng phương
pháp cất kéo hơi nước thu được 14g tinh dầu.
3.4.1.2. Chiết xuất hợp chất không bay hơi
Phần trên mặt đất của cây Nhân trần tía (5 kg) được ngấm kiệt
với 85 L ethanol. Dung môi được bốc hơi dưới áp suất giảm thu được
cao lỏng. Cao chiết được tiến hành chiết phân bố với các laoij dung môi
có độ phân cực tăng dần, đòng thời kết hợp với thay đổi pH để thu được
các phân đoạn có thành phần hoá học đơn giản. Các cao chiết thu được,


11
được tiến hành sắc ký cột (12 cột pha thuận, 3 cột pha đảo, hai cột
Sephadex LH20 và một cột Diaion). Các chất phân lập được (18 hợp chất
được đặt tên lần lượt AB1 (20 mg), AB2 (10 mg), AB4 (15 mg), AB5 (5
mg), AB6 12 (mg) AB7 (3,7 mg), AB9 (20 mg), AB10 (4 mg), AB11 (5
mg), AB12 (4 mg), AB13 (10 mg), AB14 12 mg), AB15 (8 mg), AB16
(12 mg), AB17 (6 mg), AB18 (20 mg), AB19 (4 mg), AB22 (5 mg)).
Trong đó có 4 hợp chất có cấu trúc đơn giản (AB11, AB12, AB14,
AB15), một hợp chất monoterpen thuộc thành phần tinh dầu (AB1), 1
hợp chất là triterpen AB5 và hai hợp chất nhân sterol (AB4, , AB7), 10
flavonoid, 4 flavonoid (AB6, AB10, AB16, AB17) một flavonoid gắn hai
đường (AB22), 5 flavonoid có gắn một đường (4 gắn đường
glucuropyranosid: AB2, AB9, AB13, AB19; 1 gắn đường
glucopyranosid: AB18), được xác định cấu trúc bằng UV, IR, MS, NMR.
3.4.1.3. Xác định cấu trúc các chất phân lập
3.4.1.4. Hợp chất monoterpen AB1
AB1 là hợp chất lỏng có màu vàng nhạt, tỷ trọng 0,9772 g/cm3 ở
20 °C, điểm sôi 237,7 °C, không tan trong nước sôi, dung môi hòa tan:
ethanol, diethyl ether, carbon tetrachlorid, aceton. Được phân lập từ tinh
dầu Nhân trần tía
15,3
2,20

10

CH3
2 121,0

130,9
7,01

3
4

118,9
6,71
8

H3C
24,0
1,20

1

OH
153,8

6
5
148,6
7
33,9
2,80

113,1
6,64

9

CH3
24,0
1,20

Hình 3.6. Công thức và tương tác HMBC chính của hợp chất AB1
3.4.1.5. Hợp chất flavonoid
Hợp chất có khung flavon (AB6, AB10, AB16, AB17)


12
116,1
6,93
j=8,5

128,2
7,86
j=8,0
94,3
6,40

HO

8

7

164,7
99,5
6,11

10

6

3

4

102,3

157,4

61,9
3,92

162,1

4'
3'

2'

2

9

5

6'
1'

120,5
163,4

O

161,3

OH

5'

132,6
152,4

H3CO

128,2
7,86
j=8,0

6

10
4

106,2

5

148,5

60,5
3,82

OH

Hình 3.7. Công thức và các
tương tác chính trên HMBC của
AB10
110,2
7,59
j=9,0

56,6
3,93

H3CO

91,6
6,94

158,6

56,5
3,93

6

131,9

H3CO

O

8

7

121,4

1'

5'

3'

4

105,1

OH

56,0
3,90

103,3
182,2 6,93

O

9

1'

3'

R1

2'
6

5

H

3

4
10

R2

H

OH

9
10
4

106,4

148,5

3

6'

121,0

5'
OCH3

110,0
7,58

102,9
7,00

OH

4'

1'

164,0

2

161,5

3'

2'

55,7
3,89

182,5

O

Hình 3.10. Công thức và các
tương tác chính trên HMBC của
AB16

AB10: R1=H, R2=H, R3=OH, R4=H
AB6: R1=OCH3, R2= OCH3, R3= OCH3, R4=H
AB16: R1= OCH3, R2= OCH3, R3= OCH3, R4=
OCH3
AB17: R1=H, R2= OCH3, R3= OCH3, R4= OCH3

OH

4'

6'

2

O

145,2

8

5

H3CO

H

8

120,3
7,59
j=7,2

OH

5'

H

6,97
J=7,0

2'
128,5
7,96
J=7,0

115,9
6,98
j=8,5

7
6

O

R4
7

135,7

60,5
3,81

Hình 3.9. Công thức và các
tương tác chính trên HMBC của
AB6
R3

132,5
152,4

OCH3

3

1'

121,0

102,6
6,88

O

OCH3

H3CO

148,0

4'
3' 116,1

182,5

61,8
3,92

OH
61,4
4,02

115,7
6,95

3

OH

161,5

5'

Hình 3.8. Công thức và các
tương tác chính trên HMBC của
AB17

4'

2'

163,9

10

152,0

6'

2

9

5

120,4
7,59
j=9

150,8

2

9

135,8

H3CO

O

116,1
6,97
J=7,0

6'

164,2

O

149,3

8

7

102,3
6,65

181,3

OH

OCH3

61,4
4,02

116,1
6,93
j=8,5

128,5
7,96
J=7,0

O

Hình 3.11. Cấu trúc hoá học của các hợp chất flavon
Hợp chất có khung flavon-O-β-glucuronid (AB2, AB9, AB13, AB19)
4,68
3,16

H3CO

69,1
3,36

60,5
3,66
3,59

HOOC
HO

OH

77,3
3,23

HO

75,9
3,30

74,1
3,44

OH

C

106,4
4,67
j=8,0

H

HO

129,1
8,14
j=8,5

O
125,3

157,2

76,1
3,79

121,1
102,3

149,4
103,4

99,0

181,8
OH

O

73,7
3,47

75,3
3,33
161,3 OH

C

106,3
4,80
J=7,5

129,1
8,14
j=8,5

115,9
6,94
j=9,0

H

O

128,9
8,06
J=9,0

O

OH
H

O 164,0

157,2

H

115,9
6,94
j=9,0

169,9

71,5
3,49

HO

O

125,1
149,2

HO

O

163,9
(Z)

102,4
6,80

103,3

157,1

OH

161,1

OH

116,0
6,90
J=9,0

121,1

157,3

98,9
6,26

116,0
6,90
J=9,0

128,9
8,06
J=9,0

181,7

O

Hình 3.12. Cấu trúc và tương tác

Hình 3.13. Cấu trúc và tương tác

HMBC chính của AB2

HMBC chính của AB9


13

HO

71,4HOOC
170,2
3,37
6''
4''

HO
75,4
3,37

3''

2''

93,7

1''

72,81
C
100,2
3,37 OH
5,16
j=8,0

H

O

151,1

8 6,98

7

2

121,2

105,8

4

OH

HO

7,92,
H j=9

5''

100,2
6,03

HO

O

106,6
4,65
j=7,5

2''

72,9
3,44

C

OH

1''

H

O

7

8

157,2
6
5

126,1
157,2

OH

3
4

102,0
6,68

O

R3
O

5'
6'
129,0
8,15
j=9,0

181,1

O

Hình 3.16. Cấu trúc hoá học hợp chất flavon-O-β-glucuronid
Hợp chất flavon-O-β- glucopyranosid (AB18)
HO

60,4
3,66; 3,59

HOH2C 6''

77,2
3,25

4''
3'' 5''

HO
75,9
3,30

74,0
3,43

O

2''
1''

C

106,4
4,68
8,0

129,1
8,15
J=8,8

O

OH

125,2

H
HO

8

156,9

98,8
6,27

149,3

7

9

6

10
5

157,1

OH

103,4

O

163,9
2
3

4

1'

115,8
6,94
8,5

OH

4'
5'
6'

121,1
102,3
6,81

161,2

3'
2'

129,1
8,15
J=8,8

115,8
6,94
8,5

181,8

O

Hình 3.17. Cấu trúc và tương tác HMBC chính của hợp chất AB18
Hợp chất flavonoid có cấu trúc di-glycosid (AB22)

Hình 3.18. Cấu trúc của hợp chất AB22

OH

4'

AB9: R1=β-glucuronic, R2=OH, R3=H
AB2: R1= β -glucuronic 6''methylester,
R2=OH, R3=H
AB13: R1=OH, R2= β -glucuronic,
R3=OH
AB19: R1=H, R2=OH, R3= β glucuronic

R2

69,0
3,35

160,9

3'

2'

163,2
1'
2
121,3

O

9

102,0

115,9
6,90
j=8,5

Hình 3.15. Cấu trúc và tương
tác HMBC chính của hợp chất
AB19

OH

R1

149,3

10

O

Hình 3.14. Cấu trúc và tương tác
HMBC chính của hợp chất AB13

OH

3''
76,5
3,24

H

182,3

146,8 5

129,0
8,15
j=9,0

171,9
72,5 HOOC
6'' 76,6
3,57
4''
6,60

H

6'128,4

102,4
3 6,08

10

6

HO

161,2
115,9
5' 6,94
j= 8,5

1'

164,0

OH

4'

9

130,48

HO

1

O

115,9
6,94

3' j= 8,5

2'

H

O

75,1 5''
3,93

H

128,4
7,92,
j=9

H

115,9
6,90
j=8,5


14
3.4.1.6. Hợp chất không phải flavonoid
24

29

23
19

28
1

22

18
20

29
17

11
13

21

26

30

25
25

2

14

3

1

Hình 3.19. Cấu trúc của hợp
chất AB4

22
OH

17

24

15

9
5

HO

5

19
13

26

28

9
8

11

27

3
HO

20

7

O

27

23

Hình 3.20. Cấu trúc và tương
tác chính trên HMBC của
hợp chất AB5

.

Hình 3.21. Cấu trúc của hợp chất AB7
Bảng 3.3. Dữ liệu phổ 1H –NMR và 13C-NMR của hợp chất AB5 và
AB7
Hợp chất AB12
Tan trong EA, dễ tan trong DMSO, MeOH; ít tan trong CHCl3;
không tan trong n-hexan, PE; Không phát quang dưới UV 365 nm, tắt
quang dưới UV 254 nm, cho màu tím đen khi phun thuốc thử FeCl3 5%,
không hiện màu khi phun thuốc thử VS; UV/methanol: l max(nm) = 279
nm; IR (KBr): υcm-1: : thể hiện các băng hấp thu (cm-1) trong vùng 14501650, đây là tín hiệu của vòng g -pyron; các băng hấp thu 3200 - 3550,
đây

tín
hiệu
của
OH
linh động; các băng từ 1500 - 1700, đây là tín hiệu của các liên kết C = C
vòng thơm; ESI-MS (-): m/z = 237 [M+H]. Phổ 1H-NMR của hợp chất
AB12 . cho thấy vùng trường thấp có tín hiệu của hai cặp proton thơm
ghép ortho với nhau [δH 7,04 (2H; d; 8,0 Hz); H-2' và H-6'] và [δH 6,68
(2H; d; 8,5 Hz); H-3' và H-5'], chứng tỏ trên vòng thơm của khung
flavonoid có cấu trúc đối xứng. Bên cạnh đó, trên phổ 1H-NMR còn cho


15
thấy một proton olefin [δH 6,15 (1H; s) H-3], hai proton -CH2- [δH 4,24
(2H; s) H-8], hai proton thuộc nhóm -CH2-OH [δH 4,26; d; 6,0; H-7].
Tuy nhiên trên vòng thơm còn có hai proton thuộc nhóm thế hydroxy gắn
trên vòng thơm [δH 9,27; s; H-5] và [δH 8,86; s; H-4]. Phổ 13C-NMR hợp
chất AB12, cho tín hiệu của 15 carbon trong đó có tín hiệu cộng hưởng ở
vùng trường thấp (δc 115,5-167,1 ppm). Ở vùng trường thấp còn có tín
hiệu carbonyl của nhóm keton [δC 167,1; C-4]. kết hợp dữ liệu 13C-NMR
và 1H-NMR, hợp chất AB12 có một vòng thơm và một nhân pyran. Quan
sát tuơng tác HMBC cho tín hiệu proton -CH2-OH [δH 4,26; d; 6,0; H-7]
có tương tác với C-6 [δC 141,5 ppm]. Tín hiệu proton của hydroxy 8,86
ppm tương tác C-5. Điều này chứng tỏ -CH2OH gắn vào vị trí C-6 và OH gắn vào vị trí C-5 trên công thức. Bên cạnh đó tín hiệu proton [δH
3,81 ppm] của -CH2- có tương tác với C-2 [δC 167,1 ppm] và C-1' [ δC
127,0 ppm]. Điều đó chứng tỏ -CH2-, nối giữa một vòng thơm và một
vòng pyran.
Bảng 3.4. Dữ liệu phổ 1H –NMR và 13C-NMR, HMBC (DMSO-d6;
125/500MHz) của hợp chất AB12
2
3
4
5
6

δc
(ppm)
167,1
109,0
173,6
150,3
141,5

7

59,5

8

32,7

Stt

1'
127,0
2'
129,4
3'
115,3
4'
156,1
5'
115,3
6'
129,4
4-OH'
5-OH
OH-7-CH2OH-

Phổ
DEPT
=C=
=CH=C=
=C=
=C=
CH2CH2=C=
=CH=CH=
=C=
=CH=
=CH-

δH
ppm, mult., J (Hz)

HMBC

6,27 s

C-7; C-6; C-2; C-4

4,24 (d; 6,0)

C-3; C-2

3,80 s

C-2’; C-4’; C-2; C-1’; C-6; C5;

7,03 (t; 2,5; 8,5)
6,69 (t; 2,5; 8,5)

C-8; C-2’; C-4’; C-3’
C-2’; C-4’; C-3’; C-1’

6,69 (t; 2,5; 8,5)
7,03 (t; 2,5; 8,5)
9,27 s
8,86 s
5,61 s

C-2’; C-4’; C-3’; C-1’
C-8; C-2’; C-4’; C-3’
C-3'; C-4'
C-5; C-6
C-2; C-7


16
Hợp chất AB12 được đề nghị là (2-(4-hydroxybenzyl)-3
hydroxy-6-(hydroxymethyl)-4H-pyran-4on) lần đầu tiên được báo cáo
(kết quả tra www.scifinder.cas.gov, ngày 13/2/2017. Cấu trúc và các
tương quan trong HMBC của AB12

Hình 3.22 Cấu trúc và tương tác chính trên HMBC của hợp chất AB12
Hợp chất AB14
H

H
H
H

139,2
8,01

145,7

HO

O

168,0

6

2

5

3
4

173,9

O

109,8
6,33

59,4
4,28

OH

H
H

H

115,3
6,68
j=8,5

H

7

HO

5,61

129,4
7,04
j=8
59,2
4,24
j-6

O

H2 C

167,1

32,7
3,81

141,5
109,0
6,28

HO

156,1

150,3
173,6

8,86

O

OH

OH

26,3
2,58

O

7

115,3
6,68
j=8,5

127,0

129,4
7,04
j=8

H

6,94
j=8,0

131,2
7,91
j=8,5

5
6

115,5
6,94
3 j=8,0

4

167,2

2
1
161,2

131,2
7,91
j=8,5

OH

7
115,1
6,81
j=8,5

129,7

H 115,5

O

CH8 3

198,4

9,27

131,5
7,78
j=8,5

161,6
115,1
6,81
3 j=8,5

4
5
6

2
1
121,3

131,5
7,78
j=8,5

OH

OH

Hình 3.23.
Hình 3.24.
Hình 3.25.
Hình 3.26.
Công thức
Công thức của
Công thức
Công thức
của hợp chất
hợp chất AB12
của hợp chất
của hợp chất
AB11
AB14
AB15
3.5.
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI
HAI FLAVONOID TRONG A. BRACTEOSUM BẰNG HPLC-PDA
Hợp chất có khung isoscutellarein và gắn đường
glucuropyranosid và glucopyranosid thường xuyên xuất hiện trong
Nhân trần tía. Vì vậy, xây dựng quy trình định lượng đồng thời hai
flavonoid và sử dụng isoscutellarein 8-O-β-glucuropyranosid (AB9) và
isoscutellarein 8-O-β-glucopyranosid (AB18) chất đối chiếu là cần thiết
cho việc kiểm nghiệm nguyên liệu này.


17
3.5.1. Xây dựng quy trình định, xác định độ tinh khiết AB9 và
AB18 bằng HPLC-PDA
Isoscutellarein 8-O-β-glucuropyranosid và isoscutellarein 8-O-βglucopyranosid cũng được thực hiện kiểm tra độ tinh khiết bằng HPLCPDA với điều kiện sắc ký như sau: Hệ thống máy: Máy HPLC Hitachi L2000, đầu dò DAD L-2455.; Pha tĩnh: Cột LiChroCart RP C18 (250 mm
x 4 mm, 5µm); Nhiệt độ cột: 25 ̊C; Thể tích tiêm mẫu: 20 µL; Tốc độ
dòng: 1,4 mL/ phút; Bước sóng phát hiện: 270 nm; Pha động: ACN –
H3PO4, pH = 2,5 (30 : 70)
Kết quả: Tính tương thích hệ thống của isoscutellarein 8-O-βglucuropyranosid và isoscutellarein 8-O-β-glucopyranosid có RSD lần
lượt là 1,7% và 2%. Sắc ký đồ AB9 và AB18 đạt về tính tương tính hệ
thống, AB9 và AB18 tiếp tục được xác định độ tinh khiết pic. AB9
(97,51), AB18 (99,17). Với độ tinh khiết trên AB9 và AB18 có sử dụng
làm chất đánh dấu trong phân tích định lượng Nhân trần tía.
3.5.2. Khảo sát điều kiện sắc ký AB9 và AB18
3.5.2.1. Khảo sát điều kiện chiết xuất AB9 và AB18 từ A. bracteosum
dùng trong định lượng
Dược liệu được khảo sát quy trình chiết xuất như: dung môi, thời
gian, nhiệt độ, thể tích dung môi, số lần chiết xuất: Vậy điều kiện chiết
xuất được lựa chọn: Dược liệu được chiết xuất bằng sóng siêu âm, dung
môi chiết xuất là methanol, nhiệt độ 60 0C, thời gian 40 phút, thể tích
dung môi 100 mL, số lần chiết xuất 3 lần. Sau đó cao chiết tiếp tục được
xử lý mẫu dùng cho quá trình phân tích định lượng.
3.5.3. Đánh giá quy trình định lượng bằng HPLC-PDA
Quy trình định lượng đã thỏa mãn đầy đủ các yêu cầu của một quy trình
định lượng theo hướng dẫn của ICH và AOAC.


18
3.5.4. Áp dụng quy trình định lượng đồng thời isoscutellarein 8-Oβ-glucuropyranosid và isoscutellarein 8-O-β-glucopyranosid trong
nhân trần tía bằng HPLC-PDA
Thực hiện định lượng 9 mẫu nhân trần tía với điều kiện sắc ký đã
khảo sát. Trong đó hàm lượng isoscutellarein 8-O-β-glucopyranosid cao
nhất mẫu cây bắt đẩu ra hao và thu hái tại Binh Dương. Mẫu cây chưa ra
hoa, thu hái tại Tây Ninh có hàm lượng isoscutellarein 8-O-βglucopyranosid thấp nhất.

Bảng 3.5 Hàm lượng các chất AB9 và AB18 trong A. bracteosum được
định lượng bằng HPLC-PDA
Nơi thu hái

M

u
1

Tây Ninh

2
3
4

Bình
Dương

5
6
7

An Giang
8
BV.YHCT.
CT

9

Thời
kỳ
sinh trưởng
Chưa ra hoa
Bắt đầu có
hoa
Hoa nở rộ
Chưa ra hoa
Bắt đầu có
hoa
Hoa nở rộ
Trước ra hoa
Bắt đầu
hoa
Mẫu khô

ra

S (mAU*phút)
AB9

AB18

262339

1830616

2168069

3425899

2553276

3242888

2092237

2654476

1359266

5744926

2727167

4255423

1222481

3924170

1234222

5387962

2267742

3505149

Hàm lượng
(mg/100g)
AB9
AB18
0,08
0,5
6
46
0,59
1,0
1
26
0,69
1,0
3
01
0,55
0,7
0
89
0,75
3,5
8
58
0,71
1,2
6
74
0,33
1,1
1
72
0,33
1,6
4
09
0,63
1,0
3
91

AB9: isoscutellarein 8-O-β-glucuropyranosid;
AB18: isoscutellarein 8-O-β-glucopyranosid

Hàm lượng AB9 và AB18 cao nhất ở mẫu cây bắt đầu ra hoa và Bình
Dương cho hàm lượng AB9 và AB18 cao nhất.


19
3.6.
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CARVACROL
CÓ TRONG TINH DẦU NHÂN TRẦN TÍA BẰNG GC-FID
3.6.1. Kiểm tra độ tinh khiết carvacrol bằng Sắc ký lớp mỏng và
GC-FID
Carvacrol còn được thực hiện kiểm tra độ tinh khiết bằng GCFID với điều kiện sắc ký như sau: nhiệt độ tiêm mẫu: 280oC, tỷ lệ chia
dòng 1 : 70; Cột phân tích: HP-5 (30 m x 320 µm x 0,25 µm); Detector
ion hóa ngọn lửa (FID); Nhiệt độ detector: 250 oC, tốc độ dòng khí H2:
30 mL/phút, dòng không khí: 300 mL/phút, dòng khí bổ trợ: 45 mL/phút;
Thể tích tiêm mẫu: 1 µL; Tốc độ dòng: 1,3 mL/phút; Thời gian phân tích
mấu: 30,5 phút
Kết quả: tham khảo sắc ký đồ và kết quả khảo sát tính tương
thích hệ thống các phép đo độ tinh khiết. Tính tương thích hệ thống của
các thông số thời gian lưu (tR), diện tích đỉnh (S), RSD<2%. Dựa vào
sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết pic, carvacrol là một pic lớn nhất. Từ đó,
áp dụng phương pháp quy về 100% diện tích pic để xác định độ tinh
khiết. Độ tinh khiết carvacrol được xác định là 97,3%
3.6.2. Đánh giá quy trình định lượng bằng GC-FID
Quy trình định lượng đã thỏa mãn đầy đủ các yêu cầu của một
quy trình định lượng theo hướng dẫn của ICH và AOAC.
3.6.3. Áp dụng quy trình định lượng carvacrol trong tinh dầu
Nhân trần tía bằng GC-FID
Thực hiện định lượng 6 mẫu nhân trần tía với điều kiện sắc ký đã
khảo sát
Bảng 3.6. Hàm lượng tinh dầu, carvacrol trong tinh dầu và trong A.
bracteosum được định lượng bằng GC-FID

Nơi thu hái

Mẫu

Thời
kỳ
sinh
trưởng

Hàm lượng
carvacrol
trong tinh dầu
toàn phần (%)

Hàm lượng
carvacrol
trong dược
liệu (%)

Hàm
lượng
tinh dầu
trong
dược liệu
(%)


20
10
Bệnh
việnYHCT
11
12

Bình
Dương

13
14

Tây Ninh
15

Hoa
(Mẫu
khô)
Thân
cành
(mẫu
khô)
Hoa
nở rộ
Thân
cành
Hoa
nở rộ
Thân
cành

20,241

0,478

2,36

61,258

0,086

0,14

27,346

1,042

3,81

30,167

0,054

0,18

23,001

1,994

8,67

57,357

0,206

0,36

Hàm lượng carvacrol trong tinh dầu toàn phần:
3.7. KHẢO SÁT MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA NHÂN
TRẦN TÍA
3.7.1. Khảo sát tác dụng chống oxy hoá
3.7.1.1. Khảo sát tác dụng chống oxy hóa trên bảng mỏng của cao
chiết Nhân trần và các hợp chất phân lập được.
Vì vậy cao chiết cloroform và ethyl acetat có tác dụng chống oxy
hóa mạnh hơn các cao còn lại, được dùng định hướng phân lập
flavonoid.
3.7.1.2. Khảo sát tác dụng chống oxy hóa trên UV của các hợp chất
phân lập được
Khảo sát tác dụng chống oxy hoá trên các hợp chất tinh khiết
phân lập được Kết quả:
Bảng 3.7. Tác dụng chống oxy hóa các hợp chất phân lập từ cao CHCl3
và EtOAc
Nồng
(mg/mL)

độ

AB6

AB17

AB18

AB2

AB1
6

%HTOH

18,1
4
AB16: 5,4' dihdroxy-6,7,3'trimethoxyflavon; AB17: 5,4' dihdroxy -6,7,8 trimethoxyflavon;
AB18: 5,7,4' trihydroxyflavon-8-O-β-D glucopyranosid; AB2: 5,7,4' trimethoxyflavon6''methylester-8-O-β-D glucopyranosid; AB16: 5,4' dihdroxy-6,7,8,3' tetramethoxyflavon
1,5

12,15

11,7

27,97

7,13

Các hợp chất trên đều có khả năng chống oxy hoá, tuy nhiên ở nồng độ
1,5 mg/mL, cho tác dụng chống oxy hoá cao hơn ở các nồng độ còn lại.


21
3.7.2. Khảo sát tác dụng kháng khuẩn tinh dầu Nhân trần tía
3.7.2.1. Kết quả định tính khả năng kháng khuẩn
Khả năng kháng khuẩn được định tính bằng phương pháp
khuếch tán trong thạch, thu được kết quả được trình bày Bảng 3.8.
Bảng 3.8. Định tính khả năng kháng khuẩn (đường kính vòng kháng
khuẩn, mm)
Chủng
1
2
3
4
5
6
Tinh dầu
15
30
52
62
20
Chứng DMSO+Tween 0,05%
Ghi chú: “-“: là không có hoạt tính kháng khuẩn, đường kính vòng kháng khuẩn bao
gồm cả đường kính khoanh giấy là 6 mm.
1.Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 2. Staphylococcus aureus ATCC 29213 3.
Moraxella catarrhalis ATCC 4. Streptococcus pyogennes ATCC
5
Streptococcus pneumoniae ATCC 29212 6. Haemophilus influenzae ATCC 33533

Tinh dầu Nhân trần tía có khả năng kháng khuẩn trên cả 5 loài vi
khuẩn, trong đó Nhân trần tía không kháng loài vi khuẩn Pseudomonas
aeruginosa.
3.7.2.2. Kết quả xác định MIC
Bảng 3.9. MIC của tinh dầu Nhân trần tía thử nghiệm (%)
Chủng
MIC chất thử (%)

2
0,2

3
0,05

4
0,2

5
0,025

6
0,05

MIC các chủng thử nghiệm
2.Sta: Staphylococcus aureus ATCC 29213
3.Mora: Moraxella catarrhalis ATCC
4.Pyo: Streptococcus pyogennes ATCC
5.Pneu: Streptococcus pneumoniae ATCC 29212
6.Hemo: Haemophilus influenzae ATCC 33533

Kết quả cho thấy tinh dầu Nhân trần tía có khả năng kháng Pneu: Streptococcus
pneumoniae ở nông độ thấp nhất so với các loài vi khuẩn còn lại.

CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN
4.1. THỰC VẬT HỌC NHÂN TRẦN TÍA A. BRACTEOSUM
4.1.1. Về phân tích hình thái, sinh thái, giải phẫu và bột dược liệu
Trong mô tả DĐVN V mô tả cụm hoa dạng chùm, tuy nhiên
nhận định nhóm nghiên cứu thì các hoa Nhân trần tía không có cuống
hoa, và cấu trúc theo kiểu cụm hoa dạng gié.
4.1.2. Về mặt vi phẫu và bột dược liệu


22
Đặc điểm các cấu tử trong bột dược liệu trong nghiên cứu này
cũng đã được chụp hình và mô tả chi tiết bao gồm 18 cấu tử trong bột rễ,
thân, lá và hoa. Tài liệu về thực vật học đã công bố chỉ có 5 cấu tử đó là
lông che chở, mảnh mô mềm và mảnh mạch gỗ.
4.2. VỀ MẶT HÓA HỌC A. BRACTEOSUM
4.2.1. Chiết xuất và phân lập các chất trong A. bracteosum
Trong quá trình chiết xuất nhận tháy chiết phân bố theo thang pH
phù hợp và có thể. Phân lập các nhóm hợp chất từ các cao chiết thu được
18 hợp chất (chia là các phân nhóm nhỏ như: monoterpen; flavon, flavon
glucuropyranosid; flavon glucopyranosid; sterol; nhóm hợp chất có cấu
trúc đơn giản) và được định danh bằng các phương pháp phổ hoc, trong
đó có một hợp chất mới: AB12.
4.3.
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI
HAI FLAVONOID TRONG A. BRACTEOSUM BẰNG HPLC-PDA
Hai hợp chất isoscutellarein 8-O-β-glucuropyranosid và
isoscutellarein 8-O-β-glucopyranosid là được sử dụng là hợp chất đối
chiếu cho quy trình định lượng Nhân trần tía. Đây là hai hợp chất có
chung khung isoscutellarein và xuất hiện trong khá nhiều hợp chất được
phân lập từ Nhân trần tía. Nhìn chung, toàn cây Nhân trần tía có hàm
lượng AB18 cao hơn AB9 từ 1,5 đến 6 lần.Trong đó cây bắt đầu ra hoa
thu hái ở Bình Dương có hàm lượng isoscutellarein 8-O-βglucopyranosid cao gấp khoảng 5 lần isoscutellarein 8-O-βglucuropyranosid.
4.4. XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CARVACROL
TRONG A. BRACTEOSUM BẰNG GC-FID
Tuy nhiên, nếu so sánh về hàm lượng carvacrol trong tinh dầu, thì
hàm lượng carvacrol trong tinh dầu thân cành cao hơn hàm lượng
carvacrol trong tinh dầu hoa. Trong đó hàm lượng carvacrol trong tinh
dầu thân cành mẫu Bình Dương thấp nhất, mẫu thu bệnh viện YHCT là
cao nhất (61,258%), hàm lượng trên rất gần với hàm lượng carvacrol có
trong mẫu tinh dầu thân thu hái tại Tây Ninh. Rất có thể mẫu dược liệu


23
thu mua tại bệnh viện YHCT có nguồn gốc từ Tây Ninh (57,375%),
nhưng do điều kiện bảo quản mẫu không tốt, thành phần dễ bay hơi trong
tinh dầu giảm, carvacrol khó bay hơi hơi (nhiệt độ sôi 237,7 °C).
4.5. THỬ TÁC DỤNG CHỐNG OXY CỦA NHÂN TRẦN TÍA
Các cao chiết được thử tác dụng chống oxy bằng sắc ký lớp mỏng,
trong đó tất cả các chiết đều có tác dụng chống oxy hoá, nhưng cao chiết
ethyl acetat cho tác dụng chống oxy hoá rõ ràng nhất. Kết quả này khá
phù hợp với nhóm tác giả Nguyễn Ngọc Hồng, Trần Hùng (2010).
Thực hiện thử nghiệm hoạt tính chống oxy hoá các hợp chất phân lập
được từ Nhân trần tía (AB2, AB6; AB16, AB17, AB18). Tuy nhiên đa số
các các mẫu cho tác dụng chống oxy hoá cao nhất ở nồng độ 1,5 mg/mL.
4.6.
THỬ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU
NHÂN TRẦN TÍA
Kết quả nhận thấy các tinh dầu có khả năng kháng 5 loại vi khuẩn
thử nghiệm. Còn tinh dầu Bồ bồ cũng có tác dụng trên vi khuẩn
Staphylococcus aureus, Streptococcus haemolyticus.Khi thử MIC thì tinh
dầu rất nhạy với loài Streptococcus pneumoniae (có MIC (0,025%) thấp
nhất trong 5 loài vi khuẩn thử nghiệm, một loại cầu khuẩn sinh mủ. Từ
kết quả trên, có thể định hướng sử dụng trong phòng và chữa bệnh viêm
phổi và viêm màng não…
KẾT LUẬN
Sau quá trình thực hiện, luận án đã hoàn thành các nội dung
nghiên cứu và đạt được cả các mục tiêu đề ra ban đầu.
1. Nghiên cứu về đặc điểm thực vật của cây Nhân trần tía
Trong nghiên cứu này, hình thái thực vật của cây (rễ, thân, lá,
hoa) đã được mô tả chi tiết. Các đặc điểm vi phẫu, rễ, thân, được mô tả
một cách cụ thể ở từng giai đoạn phát triển. Bột dược liệu được mô tả chi
tiết 18 cấu tử. Điều này giúp cho việc kiểm nghiệm về thực vật học cho
dược liệu này một cách dễ dàng.
2. Nghiên cứu về hóa học của cây Nhân trần tía
Phân lập và xác định cấu trúc hợp chất phân lập được: Kết quả
của nghiên cứu hóa học đã phân lập từ A.brateosum 18 hợp chất, tất cả
lần đầu tiên được phân lập từ dược liệu này: Các hợp chất đã được tìm
thấy trong chi Adenosma: carvacrol, betulinic (mairin).Các hợp chất chưa


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×

×