Tải bản đầy đủ

GH nhiem khuan

13.6 Thử giới hạn nhiễm khuẩn
Thử giới hạn nhiễm khuẩn nhằm đánh giá số lợng vi khuẩn hiếu khí, nấm, mốc có
khả năng sống lại đợc và phát hiện các vi khuẩn chỉ điểm y tế có trong thuốc.
Thí nghiệm đợc tiến hành trong điều kiện vô khuẩn. Trong khi làm thí nghiệm,
chú ý không đa chất khử khuẩn vào mẫu thử.
Thử nghiệm đợc áp dụng cho tất cả các dợc phẩm gồm cả nguyên liệu và thành
phẩm của các thuốc không tiệt khuẩn trong quá trình sản xuất.
Thử nghiệm sơ bộ
Tìm chất ức chế có trong thuốc:
Thử nghiệm giới hạn nhiễm khuẩn sẽ không có giá trị nếu chất ức chế có trong
thuốc cản trở đến khả năng phát hiện các vi khuẩn. Vì vậy cần làm thí nghiệm
kiểm tra trớc bằng cách lấy dung dịch chế phẩm đã đợc pha ở nồng độ thích hợp
vào môi trờng chọn lọc cho Escherichia coli, Salmonella, Staphylococcus,
Pseudomonas aeruginosa, rồi cấy vào đó 1ml canh khuẩn 24 h tuổi đã pha loãng
với dung dịch đệm phosphat pH 7,2 ít nhất tới 10 -3 các vi khuẩn tơng ứng. Nếu vi
khuẩn không mọc, thí nghiệm cần thay đổi bằng cách:
1. Giữ nguyên lợng chất mang thử nhng tăng thể tích môi trờng.
2. Cho vào môi trờng một lợng vừa đủ chất khử hoạt tính thích hợp.
3. Phối hợp cách làm (1) và (2) để vi khuẩn mang cấy có thể mọc đợc.
Tuỳ theo thành phần và nồng độ của mẫu thử, có thể thêm vào môi trờng để
trung hoà chất ức chế các loại sau: lecithin đậu tơng 0,5 %, polysorbat 20: 4 %.

Làm lại thí nghiệm với điều kiện chất ức chế trong lợng mẫu mang kiểm tra đã
đợc trung hoà.
Môi trờng
Môi trờng nuôi cấy có thể pha theo cách dới đây hoặc có thể dùng môi trờng khô
do các hãng sản xuất môi trờng vi sinh vật cung cấp. Các môi trờng tự pha chế
phải hấp tiệt khuẩn bằng nồi hấp ở nhiệt độ 115 oC trong 30 phút trừ khi có
những chỉ dẫn riêng đối với loại môi trờng đặc biệt.
Thạch dùng cho pha chế môi trờng có độ ẩm dới 15%. Nớc và các chất dùng trong
các công thức phải tinh khiết.
Môi trờng lỏng casein lecithin đậu tơng polysorbat
Casein pancreatic
Lecithin đậu tơng
Polysorbat 20
Nớc

20,0
5,0
40,0
960

g
g
ml
ml

Hoà tan casein pancreatic và lecithin đậu tơng vào 960 ml nớc, đun cách thuỷ ở
48 - 50oC khoảng 30 phút cho tan hoàn toàn. Thêm 40 ml polysorbat 20, trộn
đều, phân chia vào các dụng cụ thích hợp.
Môi trờng thạch casein đậu tơng
Casein pancreatic
Natri clorid
Thạch

15,0 g
5,0 g
15,0 g


Bột đậu tơng thủy phân bởi
papain
Nớc
pH sau khi tiệt khuẩn: 7,3 +
0,2

5,0 g
1000 ml

Môi trờng lỏng casein đậu tơng
Casein pancreatic
17,0 g
Dikali hydrophosphat
2,5 g
Bột đậu tơng thuỷ phân bởi
3,0 g
papain
2,5 g
Glucose
5,0 g
Natri clorid
1000 ml
Nớc
Hoà tan các chất rắn vào nớc đun nóng nhẹ để tan hoàn toàn. Để nguội dung
dịch ở nhiệt độ phòng, phân chia vào các bình thích hợp đã tiệt khuẩn. pH sau
khi tiệt khuẩn:7,3 + 0,2.
Môi trờng thạch muối - manitol
Casein pancreatic
5,0 g
Thạch
15,0 g
Pepton
5,0 g
Cao thịt
1,0 g
Natri clorid
75,0 g
D - Manitol
10,0 g
Đỏ phenol
0,025 g
Nớc
1000 ml
Trộn, đun nóng, khuấy đều, đun sôi khoảng 1 phút để tan hoàn toàn, pH sau
khi tiệt khuẩn : 7,4 + 0,2.

Môi trờng thạch Baird - Parker
Casein pancreatic
10,0 g
Cao thịt
5,0 g
Cao men bia
1,0 g
Lithi clorid
5,0 g
Thạch
20,0 g
Glycin
12,0 g
Natri pyruvat
10,0 g
Nớc
950 ml
Đun nóng, khuấy đều sau đun sôi khoảng 1 phút, tiệt khuẩn, để nguội tới 45 50oC, thêm 10 ml dung dịch kali telurit 1% vô khuẩn và 50 ml nhũ dịch lòng đỏ
trứng. Trộn kỹ, nhẹ nhàng rót vào các hộp.
Chế tạo nhũ dịch lòng đỏ trứng bằng cách: Sát khuẩn toàn bộ bề mặt quả trứng,
đập vỡ vô khuẩn quả trứng, lấy lòng đỏ trứng vào ống trụ chia vạch vô khuẩn.
Thêm nớc muối vô khuẩn để có tỷ lệ lòng đỏ trứng so với nớc muối là 3/7. Bỏ vào
một cốc khuấy vô khuẩn, trộn với tốc độ lớn trong 5 phút.
pH sau khi tiệt khuẩn 6,8 + 0,2.


M«i trêng th¹ch Vogel – Johnson
Casein pancreatic
10,0 g
Cao men bia
5,0 g
Manitol
10,0 g
Natri pyruvat
10,0 g
Th¹ch
16,0 g
Glycin
10,0 g
Lithi clorid
5,0 g
Dikali hydrophosphat
5,0 g
§á phenol
25,0 mg
Níc
1000 ml
§un s«i ®Ó hoµ tan c¸c chÊt r¾n trong kho¶ng 1 phót. TiÖt khuÈn, ®Ó nguéi
®Õn 45 - 500C. Thªm 20 ml dung dÞch kali telurit 1% v« khuÈn.
pH sau khi tiÖt khuÈn 7,2 + 0,2.
M«i trêng th¹ch cetrimid
Gelatin pancreatic
20,0 g
Cetrimid (Cetyl trimethylamoni
0,3 g
bromid)
1,4 g
Magnesi clorid
13,6 g
Th¹ch
10,0 ml
Glycerin
1000
Níc
ml
Hoµ tan tÊt c¶ c¸c chÊt r¾n vµo trong níc, thªm glycerin. §un nãng, khuÊy ®Òu,
®un s«i 1 phót cho tan hoµn toµn.
pH sau khi tiÖt khuÈn : 7,2 + 0,2
M«i trêng th¹ch Pseudomonas ®Ó ph¸t hiÖn Fluorescin
Casein pancreatic
10,0 g
Peton
10,0 g
Dikali hydrophosphat khan
1,5 g
Magnesi sulfat (MgSO4.7H2O)
1,5 g
Th¹ch
15,0 g
Glycerin
10,0 ml
Níc
1000 ml
Hoµ tan tÊt c¶ c¸c chÊt r¾n vµo níc tríc khi thªm glycerin. §un nãng, khuÊy ®Òu,
®un s«i 1 phót cho tan hoµn toµn.
pH sau khi tiÖt khuÈn: 7,2 + 0,2.
M«i trêng th¹ch Pseudomonas ®Ó ph¸t hiÖn Pyocyanin
Gelatin pancreatic
20,0 g
Kali sunfat khan
10,0 g
Th¹ch
15,0 g
Magnesi clorid khan
1,4 g
Glycerin
10,0 ml
Níc
1000
ml
Hoµ tan c¸c chÊt r¾n trong níc tríc khi thªm glycerin. §un nãng, khuÊy ®Òu, ®un
s«i kho¶ng 1 phót ®Ó tan hoµn toµn.


pH sau khi tiệt khuẩn: 7,2 + 0,2.
Môi trờng lỏng lactose
Cao thịt
Lactose
Gelatin pancreatic
Nớc

3,0 g
5,0 g
5,0 g
1000
ml
Làm lạnh rất nhanh môi trờng sau khi tiệt khuẩn.
pH sau khi tiệt khuẩn : 6,9 + 0,2
Môi trờng lỏng selenit - cystin
Casein pancreatic
Natri selenit acid
Dinatri phosphat
Lactose
L- Cystin
Nớc

5,0 g
4,0 g
10,0 g
4,0 g
10,0
mg
1000
ml
Đun nóng để tan hoàn toàn. Đun tiếp 15 phút nữa. Không cần tiệt khuẩn tiếp
theo.
pH sau khi tiệt khuẩn : 7,0 +0,2
Môi trờng lỏng tetrathionat
Casein pancreatic
Calci carbonat
Muối mật
Pepton
Natri thiosulfat
Nớc

2,5 g
10,0 g
1,0 g
2,5 g
30,0 g
1000
ml
Đun nóng để hoà tan các chất rắn. Khi sử dụng thêm vào môi trờng dung dịch
gồm: 5,0 g kali iodid và 6,0 g iod trong 20 ml nớc. Sau đó thêm 10ml dung dịch
xanh brilliant 1% và trộn đều. Không đun nóng môi trờng sau khi thêm dung
dịch xanh brilliant.
Môi trờng thạch xanh brilliant
Pepton
Đờng trắng
Cao men bia
Casein pancreatic
Lactose
Natri clorid
Thạch
Đỏ phenol
Xanh brilliant
Nớc

5,0 g
10,0 g
3,0 g
5,0 g
10,0 g
5,0 g
20,0 g
80,0
mg
12,5
mg
1000


ml
Đun sôi để hoà tan tất cả các chất rắn trong 1 phút. Chỉ tiệt khuẩn tr ớc khi dùng.
Rót vào các hộp Petri và để nguội.
pH sau khi tiệt khuẩn: 6,9 +0,2
Môi trờng thạch xylose - lysin - desoxycholat
Xylose
3,5 g
Đỏ phenol
0,08 g
L-Lysin
5,0 g
Thạch
13,5 g
Lactose
7,5 g
Natri desoxycholat
2,5 g
Đờng trắng
7,5 g
Natri thiosulfat
6,8 g
Natri clorid
5,0 g
Săt (III) amoni citrat
0,8 g
Cao men bia
3,0 g
Nớc
1000
ml
Đun nóng, lắc tròn để trộn đều chất rắn với nớc. Chú ý không để nóng quá.
Chuyển ngay vào bình cách thuỷ và giữ ở nhiệt độ 50 oC. Rót vào các đĩa ngay
trớc khi môi trờng nguội hoàn toàn.
pH sau khi tiệt khuẩn: 7,4 + 0,2
Môi trờng thạch bismuth sulfit
Cao thịt
5,0 g
Sắt (II) sulfat
0,3 g
Casein pancreatic
5,0 g
Bismuth sulfit
8,0 g
Pepton
5,0 g
Thạch
20,0 g
Glucose
5,0 g
Xanh brilliant
25,0
Dinatri hydrophosphat
mg
Nớc
4,0 g
1000
ml
Đun nóng, lắc tròn để hoà đều các chất rắn với nớc, không để nóng quá.
Chuyển ngay vào bình cách thuỷ và giữ ở nhiệt độ 50 0C. Rót vào các đĩa để
nguội.
pH sau khi tiệt khuẩn: 7,6 + 0,2
Môi trờng thạch - sắt - ba đờng
Casein pancreatic
Sắt (II) amoni sulfat
Pepton
Natri clorid
Lactose
Natri thiosulfat
Đờng trắng
Thạch

10,0 g
0,2 g
20,0 g
5,0 g
10,0 g
0,3 g
10,0 g
13,0 g


D-Glucose monohydrat
Đỏ phenol
Nớc

1,0 g
0,025
g
1000
ml
Hoà nóng các chất rắn với nớc, đun sôi một phút cho tan hoàn toàn. Chuyển vào
các dụng cụ thích hợp để tiệt khuẩn.
pH sau khi tiệt khuẩn: 7,3 + 0,2
Môi trờng Mac - Conkey
Casein pancreatic
Natri clorid
Gelatin pancreatic
Thạch
Pepton
Lactose
Muối mật
Đỏ trung tính
Tím tinh thể
Nớc

1,5 g
5,0 g
17,0
g
13,5
g
1,5 g
10,0 g
1,5 g
30,0
mg
1,0 mg
1000
ml
Hoà nóng các chất rắn với nớc, đun sôi một phút cho tan hoàn toàn.
pH sau khi tiệt khuẩn : 7,1 + 0,2
Môi trờng thạch Levine - eosin - xanh methylen
Gelatin pancreatic
10,0 g
Dikali hydrophosphat
2,0 g
Thạch
15,0 g
Lactose
10,0 g
Eosin
0,4 g
Xanh methylen
0,065 g
Nớc
1000 ml
Hoà tan nóng các thành phần gelatin pancreatic, dikali hydrophosphat và thạch
trong nớc, để lạnh. Các thành phần còn lại chỉ thêm vào khi sử dụng bằng cách
đun chảy môi trờng rồi thêm vào theo tỷ lệ: Cứ 100 ml môi trờng thêm 5 ml dung
dịch lactose (1:5), 2 ml dung dịch eosin và 2 ml dung dịch xanh methylen
(1:300). Môi trờng sau khi hoà trộn phải trong.
pH sau khi tiệt khuẩn: 7,1 + 0,2
Môi trờng thạch Sabouraud
Glucosa
Casein pancreatic
Pepton
Thạch
Nớc
Hoà tan, đun sôi cho tan hoàn toàn.

40,0 g
5,0 g
5,0 g
1
5,0 g
1000 ml


pH sau khi tiệt khuẩn : 5,6 + 0,2
Môi trờng thạch - khoai tây - glucose
Nấu 300 g khoai tây đã bóc vỏ và thái nhỏ trong 500 ml nớc cất, lọc qua vải, thêm
nớc cất để đợc 1000 ml, rồi thêm vào các thành phần sau: thạch 15 g; glucose 20
g. Hoà tan nóng. Tiệt khuẩn. Khi dùng đun nóng chảy, để nguội đến 45 oC. Điều
chỉnh môi trờng bằng dung dịch acid tartric (1:10) đến pH 3,5 + 0,1. Rót vào
các đĩa.
Chú ý:
Không dùng môi trờng đun nóng trở lại lần thứ 2
Để ức chế vi khuẩn thờng gặp mọc trên môi trờng phát hiện nấm, mốc và men
(môi trờng Sabouraud hoặc môi trờng thạch - khoai tây- glucose) thêm vào một
lít môi trờng 0,1g tetracyclin hoặc 50 mg cloramphenicol, làm đều ngay trớc khi
dùng.
Dung dch m Natri clorid pepton pH 7,0
Kali dihydro phosphat 3,56 g
Natri hydro phosphat 7,23 g
Natri clorid
4,30 g
Pepton
1,00 g
Nc ct
1000 ml
Cú th thờm cht hot ng b mt hoc cht kh tỏc dng khỏng khun vo dung dch ny nh
Polysorbat 80 0,1 n 1,0%.
Hp tit trựng 1210C trong 15 phỳt.
Môi trờng nớc thịt
Cao thịt
5,0 g
Nớc
1000 ml
Môi trờng thạch thờng
Pepton
Natri clorid
Thạch
Nớc
pH sau khi tiệt khuẩn

10,0 g
5,0 g
15 - 20 g
1000 ml
7,4 +
0,2

Môi trờng pepton - natri clorid
Pepton
10,0 g
Natri clorid
5,0 g
Nớc
1000 ml
pH sau khi tiệt khuẩn
7,0 +
0,2
Môi trờng tăng sinh cho Clostridia
Cao thịt
10,0 g
Pepton
10,0 g
Cao men bia
3,0 g
Tinh bột dẽ tan
1,0 g
Glucose monohydrat
5,0 g
Cystein hydroclorid
0,5 g


Natri clorid
5,0 g
Natri acetat
3,0 g
Thạch
0,5 g
Nớc cất
1000 ml
Hoà tan thạch bằng cách đun nóng tới sôi, khuấy đều liên tục. Hấp tiệt khuẩn
121oC trong 15 phút. Nếu cần điều chỉnh pH sao cho sau khi tiệt khuẩn khoảng
6,8.
Môi trờng thạch Columbia
Casein pancreatic
10,0 g
Thịt
5,0 g
Dịch tim pancreatic
3,0 g
Cao men bia
5,0 g
Tinh bột ngô
1,0 g
Natri clorid
5,0 g
Thạch bột
15,0 g
Nớc cất
1000 ml
Hoà tan thạch bằng cách đun nóng tới sôi, khuấy đều liên tục. Nếu cần điều
chỉnh pH sao cho sau khi tiệt khuẩn khoảng 7,3 + 0,2. Hấp tiệt khuẩn 121oC
trong 15 phút. Làm lạnh tới 45oC đến 50oC. Khi cần có thể thêm 20 mg
gentamycin base và rót vào các hộp Petri.
Môi trờng sulfit - lactose
Casein pancreatic
5,0 g
Cao men bia
2,5 g
Cystein hydroclorid
0,3 g
Natri clorid
2,5 g
Lactose
10,0 g
Nớc cất
1000 ml
Hoà tan tất cả các thành phần trong nớc và điều chỉnh để có pH 7,1 + 0,1. Đóng
vào các ống nghiệm 16 x 160 mm mỗi ống 8 ml và một ống nhỏ Durham. Hấp
tiệt khuẩn 121oC trong 15 phút. Bảo quản ở 4oC.

Môi trờng lỏng Enterobacteria - Mossel
Genlatin pancreatic
D-Glucose monohydrat
Mật bò khô
Kali dihydrophosphat
Dinatri hydrophosphat
Xanh brilliant
Nớc cất

10,0 g
5,0 g
20,0 g
2,0 g
8,0 g
15 mg
1000 ml

Điều chỉnh pH sao cho sau khi đun là 7,0 - 7,4. Đun sôi trong 30 phút và làm lạnh
ngay.

Môi trờng muối mật violet - red
Cao men bia
Gelatin pancreatic
Muối mật
Lactose
Natri clorid
D-Glucose monohydrat

3,0 g
7,0 g
1,5 g
10,0 g
5,0 g
10,0 g


Đỏ trung tính
Tím tinh thể
Thạch
Nớc cất

30 mg
2 mg
15.0 g
1000 ml

Điều chỉnh pH sao cho sau khi đun là 7,2 - 7,6. Môi trờng đợc đun sôi để tiệt
trùng nhng không đợc hấp tiệt trùng.
Chuẩn bị thí nghiệm
Lấy mẫu:
Đối với các thử nghiệm dới đây, mỗi thử nghiệm lấy 10ml hoặc 10g chế phẩm.
Cách thử nghiệm:
Một mẫu chế phẩm cần xác định giới hạn vi khuẩn phải thực hiện đầy đủ các
thử nghiệm sau:
Đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại đợc, tính ra số lợng vi khuẩn, nấm mốc
có trong 1g hoặc 1ml chế phẩm.
Thử nghiệm tìm những vi khuẩn gây bệnh sau:
Staphylococcus aureus
Pseudomonas aeruginosa
Salmonella
Escherichia coli
Chuẩn bị mẫu
Chế phẩm mang thử nghiệm trong quá trình hoà tan hoặc nhũ hoá phải đảm
bảo không làm thay đổi chủng loại vi khuẩn, nấm mốc có trong thuốc. Để có một
dung dịch hoặc nhũ dịch thích hợp cho thử nghiệm, tiến hành nh sau:
Đối với chế phẩm rắn, hoà tan trực tiếp hoặc nghiền mịn chế phẩm trong bình
với dung môi hoặc chất nhũ hoá thích hợp.
Đối với chế phẩm ở dạng lỏng nh dung dịch thực, nhũ dịch trong nớc, chất rắn
hòa tan dễ dàng và hoàn toàn trong nớc..., dùng dung dịch đệm phosphat pH 7,2
hoặc dung dịch natri clorid 0,9% để hoà loãng.
Những chế phẩm lỏng không thể hoà lẫn trong nớc nh dầu, kem hoặc sáp: Chế
tạo nhũ dịch bằng cách thêm một lợng vừa đủ tác nhân nhũ hoá vô khuẩn thích
hợp nh các loại polysorbat. Dùng phơng pháp khuấy trộn cơ học hoặc đồng thời
làm ấm bằng nhiệt nhng không đợc vợt quá 45oC để có nhũ dịch chế phẩm
đồng nhất.
Các chế phẩm ở dạng khí dung - lỏng: Làm lạnh bình để các khí hoá lỏng rồi mở
nắp để lấy một lợng thích hợp mang thử.
Tiến hành
Đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí:
Đối với chế phẩm hoà tan tốt hoặc tạo thành dung dịch hơi đục, dùng phơng
pháp đĩa thạch. Còn các chế phẩm khác dùng phơng pháp hoà loãng trong ống
nghiệm.
Hoà tan hoặc làm nhũ hoá 10 g hoặc 10 ml chế phẩm vừa đủ trong 100 ml
dung dịch đệm phosphat pH 7,2 hoặc trong 100 ml dung môi thích hợp với từng
loại chế phẩm, để đợc dung dịch chế phẩm có độ pha loãng ở tỷ lệ 1/10. Đối với
những chế phẩm dạng nhầy không thể lấy chính xác bằng pipet ở tỷ lệ 1/10, có


thể pha loãng tiếp để lấy đợc chính xác, nghĩa là có thể pha loãng đến tỷ lệ
1/50 hoặc 1/100 v.v...
Thực hiện thử nghiệm phát hiện chất ức chế trớc khi xác định tổng số vi khuẩn
hiếu khí. Chế phẩm đã pha loãng phải cho ngay vào môi trờng nuôi cấy mà
không đợc để quá 1 giờ.
Dung dịch đệm pH 7,2: Hoà 34g kali dihydrophosphat (KH 2PO4) vào khoảng 500
ml nớc cất trong bình định mức 1000 ml. Điều chỉnh pH tới 7,2 + 0,1 bằng cách
thêm dung dịch natri hydroxyd 2%. Thêm nớc cất tới vạch. Trộn đều, phân chia
vào các bình, tiệt khuẩn, bảo quản ở lạnh. Khi dùng, hoà loãng với nớc cất theo tỷ
lệ 1: 800 và tiệt khuẩn.
a) Phơng pháp đĩa thạch
Hoà loãng chế phẩm sao cho khi cấy 1 ml dịch chế phẩm vào môi tr ờng trong
một hộp Petri, số khuẩn lạc mọc khoảng 30 đến 300 khuẩn lạc. Lấy dung dịch có
độ pha loãng cuối cùng cho vào 2 hộp Petri, mỗi hộp 1ml. Thêm vào mỗi hộp 15 20 ml môi trờng thạch casein đậu tơng hoặc môi trờng thạch thờng đã đun chảy
và để nguội đến 45 oC. Đậy hộp, trộn đều bằng cách xoay qua, xoay lại. Sau đó
để yên cho thạch đông cứng ở nhiệt độ phòng. Lật ngợc hộp, mang ủ ở 35oC từ
24 - 48 h. Sau thời gian ủ, kiểm tra vi khuẩn mọc ở đĩa, đếm số l ợng khuẩn lạc.
Lấy giá trị của đĩa có số lợng khuẩn lạc lớn nhất mà số khuẩn lạc trong đĩa
không lớn hơn 300 và tính ra số lợng khuẩn lạc trong 1g hoặc 1ml chế phẩm.
Nếu thấy không có khuẩn lạc mọc ở đĩa có độ pha loãng 1/10 thì kết luận chế
phẩm có ít hơn 10 khuẩn lạc trong 1 g hoặc 1 ml.
b) Phơng pháp pha loãng trong ống nghiệm
Cho vào 14 ống nghiệm cỡ thông thờng, mỗi ống 9,0 ml môi trờng lỏng casein
đậu tơng. Lấy một dãy 12 ống chia thành 4 lô, mỗi lô 3 ống. Dùng một lô 3 ống
để kiểm tra.
Thêm vào lô 1 gồm 3 ống và một ống thứ 4 (ống A) 1 g (hoặc1 ml) chế phẩm và
trộn đều.
Thêm vào lô 2 gồm 3 ống và một ống thứ 4 (ống B) 1 ml dung dịch lấy từ ống A
và trộn đều.
Thêm vào lô 3 gồm 3 ống, mỗi ống 1 ml dung dịch lấy từ ống B và trộn đều.
Bỏ không sử dụng ống A và ống B.
Theo cách pha trên có lô 1, lô 2, lô 3, tơng ứng với lợng chế phẩm là: 100; 10; và 1
mg hoặc l trong mỗi ống. Đậy kín các ống mang ủ ở 32 - 35 oC trong 24 giờ, quan
sát vi khuẩn mọc ở các ống chứa chế phẩm, mang đối chiếu với bảng 1 để biết
số lợng vi khuẩn có trong 1 g hoặc 1ml chế phẩm.
Bảng 1: Tổng số vi khuẩn trong chế phẩm.
Số mg (hoặc l) chế phẩm cho mỗi ống
100
10
1
Số lợng vi khuẩn lớn nhất
có thể có trong 1 g hoặc
1 ml
3
3
3
>1100
3
3
2
1100
3
3
1
500
3
3
0
200
3
2
3
290
3
2
2
210
3
2
1
150
3
2
0
90


Số ống có vi khuẩn mọc

1
1
1
1
0
0
0
0

3
2
1
0
3
2
1
0

160
120
70
40
95
60
40
23

khuẩn mọcvicó ốngSố

3
3
3
3
3
3
3
3

c)Phng phỏp mng lc:
Dựng cỏc mng lc cú kớch thc l lc khụng ln hn 0,45 àm, cú kh nng gi li cỏc vi khun cn
kim tra. Chn loi mng lc lm bng nguyờn liu gi li vi khun nhng khụng nh hng n mu
th. Thớ d cú th dựng mng Cellulose nitrat lc cỏc dung dch nc, du v cn thp . Dựng
mng cellulose acetat lc dung dch cn cao . Dựng h thng lc cú thit k cho phộp chuyn
c mng lc vo mụi trng nuụi cy.
Chuyn mt lng thớch hp dung dch mu th ó pha theo mc Chun b mu, (Tt nht l ly mt
lng dung dch mu ó chun b tng ng vi 1g hoc 1ml mu cn th; nu lng vi khun cú
nhiu trong mu th, cú th ly lng dung dch mu ớt hn). Mi mu th cn 2 mng lc, dung dch
mu th ó chun b phi lc ngay qua mng. Ra mng lc 3 ln, mi ln khong 100ml dung dch
thớch hp nh dung dch m natri clorid pepton pH 7,0. Khi cn cú th thờm cht hot ng b mt
nh polysorbat 80 hoc cỏc cht kh hot tớnh ca cỏc cht khỏng khun vo dung dch dựng ra.
Cng cú th ra mng vi s ln ớt hn, nu thy loi ht thuc v tỏc nhõn nh hng n kt qu
th nghim khi mng. Chuyn mt mng lc lờn mụi trng thch dựng phỏt hin vi khun. 30
to 35C, theo dừi, m s vi khun mc trờn mng. Chuyn mng lc cũn li lờn mt mụi trng phỏt
hin nm. 20 to 25C, theo dừi trong khong 5 ngy, m s nm mc trờn mng. Nu chc chn
v thi gian mc ca nm cn phỏt hin thỡ cú th theo dừi, m trong khong thi gian ngn hn.
Chn m cỏc a cú s khun lc cao nht ớt hn 100 khun lc trờn mng. Tớnh s khun lc cú trong
1 gam hoc 1ml mu th.
Mu th l thuc dng ming p thm qua da: Chuyn vụ trựng 10 ming dỏn vo bỡnh ó cú sn 500
ml dung dch m natri clorid pepton pH 7,0, Lc u trong 30 phỳt. Lc qua 2 mng lc tỡm vi
khun v nm mi mng 50ml dung dch. Tip tc , theo dừi, m vi khun v nm mc nh trờn.
Thử nghiệm tìm các vi khuẩn
a) Tìm Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa
Cho chế phẩm vào 100 ml môi trờng lỏng casein đậu tơng, ủ ở 35 - 370C, kiểm
tra vi khuẩn mọc ở môi trờng. Nếu thấy mọc, dùng que cấy lấy môi trờng, cấy lên


đĩa thạch Vogel - Johnson (hoặc thạch Baird - Parker hoặc thạch manitol - muối)
và môi trờng thạch cetrimid. Đậy đĩa, lật ngợc hộp Petri, mang ủ. Sau khi ủ kiểm
tra nếu không thấy có những khuẩn lạc với đặc tính nh ghi trong bảng 2 và
bảng 3 (nêu ở phần sau) đối với từng môi trờng đã sử dụng thì chế phẩm không
có Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa. Nếu thấy có khuẩn lạc
nghi ngờ thì tiếp tục làm các phản ứng sinh hoá của Staphylococcus aureus
hoặc Pseudomonas aeruginosa nh sau:
*Phản ứng coagulase (đối với Staphylococcus aureus):
Dùng que cấy chuyển khuẩn lạc nghi ngờ đặc trng từ mặt thạch Vogel-Johnson
(hoặc thạch Baird - Parket, hoặc thạch manitol - muối) thêm vào từng ống
nghiệm, mỗi ống 0,5 ml huyết tơng thỏ hoặc ngựa. Đem ủ 37oC, kiểm tra các
ống sau 3 giờ ủ rồi tiếp tục ủ thêm 24h. Nếu thấy có đông huyết t ơng (ở bất kỳ
mức độ nào), chế phẩm có Staphylococcus aureus.
Bảng 2: Đặc điểm hình thái của Staphylococcus aureus trên các môi trờng lựa
chọn
Môi trờng
Đặc
điểm
hình
thái
khuẩn
lạc

Thạch
Thạch
Vogel manitol - muối
Johnson
Màu đen đợc Khuẩn
lạc màu
bao bọc bằng vàng cùng với một
một vùng vàng vùng vàng xung
quanh

Thạch
Baird - Parker
Khuẩn lạc màu đen
bóng, viền quanh bằng
một vùng sáng rõ 2 - 5
mm

*Phản ứng oxydase và sinh sắc tố ( đối với Pseudomonas aeruginosa):
Lấy những khuẩn lạc nghi ngờ đặc trng từ mặt môi trờng thạch cetrimid cấy ria
trên mặt môi trờng thạch Pseudomonas phát hiện Fluorescin và môi trờng
Pseudomonas phát hiện Pyocyanin trong hộp Petri. Nếu nhiều khuẩn lạc cần đợc
cấy truyền, có thể chia bề mặt hộp thành bốn phần, mỗi phần cấy một loại
khuẩn lạc lựa chọn. Đậy và lật ngợc hộp môi trờng đã cấy truyền và ủ ở 35 + 2oC
ít nhất 3 ngày kiểm tra đờng cấy dới ánh sáng đèn tử ngoại. Kiểm tra các đĩa
để xác định có khuẩn lạc đặc trng theo bảng 3 hay không. Xác nhận bất kỳ
khuẩn lạc nghi ngờ nào mọc trên một hoặc nhiều môi trờng. Phát hiện
Pseudomonas aeruginosa bằng phản ứng oxydase: Nhỏ ngay lên khuẩn lạc hoặc
chuyển khuẩn lạc lên một mẩu (hoặc một khoanh) giấy đã tẩm trớc N - dimethyl phenylen diamin dihydroclorid. Nếu thấy hiện màu đỏ hồng chuyển sang màu
tím, chế phẩm có Pseudomonas aeruginosa. Có thể xác định Pseudomonas
aeruginosa bằng các phép thử sinh hoá và nuôi cấy thích hợp khác.
Bảng 3. Đặc điểm hình thái của Pseudomonas aeruginosa trên các môi tr ờng
lựa chọn
Thạch
Thạch
Môi trờng
Thạch
Pseudomonas để
Pseudomonas để
cetrimid
phát hiện
phát hiện
Fluorescin
Pyocyanin
Đặc điểm hình Màu lục nhạt Không màu đến Màu vàng nhạt
thái khuẩn lạc
thông thờng
màu vàng nhạt


Huỳnh quang ở
ánh sáng tia cực
tím
Phản
ứng
oxydase
Nhuộm Gram

Màu lục

Màu hơi vàng

Màu xanh nớc biển

Dơng tính

Dơng tính

Dơng tính

Trực khuẩn
Trực khuẩn
Trực khuẩn
Gram âm
Gram âm
Gram âm
b) Tìm Salmonella và Escherichia coli
Cho chế phẩm vào khoảng 100 ml môi trờng lỏng lactose, ủ. Kiểm tra nếu có vi
khuẩn mọc, lắc nhẹ nhàng. Lấy 1ml cho vào một ống chứa sẵn 10 ml hỗn hợp
môi trờng lỏng selenit - cystin và môi trờng lỏng tetrathionat, trộn đều, ủ trong
18 - 24 h. Phần còn lại của môi trờng lactose sẽ dùng để tìm Escherichia coli.
Tìm Salmonella: Lấy một quai cấy từ canh thang selenit cystin và tetrathionat ria
lên mặt môi trờng thạch xanh brilliant, môi trờng thạch bismuth sulfit trong các
đĩa Petri. Đậy đĩa, lật ngợc, ủ. Kiểm tra, nếu không thấy có khuẩn lạc dạng nh
mô tả ở bảng 4, chế phẩm không chứa các nòi Salmonella.
Bảng 4. Đặc điểm hình thái của Salmonella trên môi trờng lựa chọn
Môi trờng
Thạch xanh brilliant

Mô tả khuẩn lạc
Khuẩn lạc không màu hoặc màu hồng nhạt tới trắng
đục, nhỏ, rõ nét (thờng bao quanh bằng một vùng
màu hồng tới đỏ)
Thạch xylose - lysin Khuẩn lạc màu đỏ, có thể chấm đen ở trung tâm
- desoxycholat
Thạch
bismuth Khuẩn lạc màu đen hoặc màu xanh
sulfit
Nếu thấy khuẩn lạc, đem nhuộm soi thấy gồm những trực khuẩn hình gậy,
Gram âm phù hợp với mô tả ở bảng 4, thực hiện tiếp bằng cách chuyển khuẩn lạc
nghi ngờ riêng biệt sang ống môi trờng thạch - sắt - ba đờng (nghiêng). Trớc tiên
cấy ria trên mặt thạch nghiêng, sau cấy sâu xuống phần đứng của thạch, ủ.
Kiểm tra không thấy môi trờng bị kiềm hoá (màu đỏ) phần nghiêng và acid
hoá (màu vàng) phần dựng đứng, có hoặc không có kèm theo màu đen ở phần
dựng đứng do sinh H2S. Chế phẩm không chứa các nòi Salmonella.
Tìm Escherichia coli:
Cấy ria một quai cấy từ môi trờng lactose đã có vi khuẩn mọc ở trên bề mặt môi
trờng thạch Mac - Conkey. Đậy nắp, lật ngợc hộp, ủ. Kiểm tra nếu không có khuẩn
lạc phù hợp với mô tả ở bảng 5 thì chế phẩm không có Escherichia coli. Nếu có
khuẩn lạc phù hợp với mô tả ở bảng 5 thì chuyển khuẩn lạc nghi ngờ lên mặt thạch
Levine - eosin - xanh methylen trong các đĩa Petri . Nếu có nhiều khuẩn lạc nghi
ngờ, chia đĩa thành 4 phần, mỗi phần cấy một loại khuẩn lạc đã lựa chọn. Đậy
đĩa, lật ngợc, ủ. Kiểm tra nếu không có những khuẩn lạc thể hiện cả hai đặc
tính ánh kim dới ánh sáng phản chiếu, và màu đen xuất hiện ở ánh sáng truyền
qua, mẫu chế phẩm không có Escherichia coli. Kết hợp các phản ứng thử nghiệm
sinh hoá và đặc điểm nuôi cấy để kết luận sự có mặt của Escherichia coli
trong chế phẩm.
Bảng 5: Đặc điểm hình thái của Escherichia coli trên thạch Mac - Conkey


Đặc điểm hình
khuẩn lạc
Nhuộm Gram

thái Khuẩn lạc màu đỏ gạch, có thể có
vùng mật kết tủa bao quanh
Trực khuẩn Gram âm

c) Phát hiện Enterobacteria và các vi khuẩn Gram âm khác
Làm đồng nhất chế phẩm đem kiểm tra bằng cách xử lý một lợng thích hợp nh đã mô
tả ở phần chế tạo mẫu thử nghiệm và ủ ở 35 - 37 oC một thời gian thích hợp (thờng từ
2 - 5 h) trong môi trờng canh thang lactose để phục hồi lại vi khuẩn mà không làm
tăng vi khuẩn. Lắc bình chứa và chuyển một lợng đã đồng nhất của chế phẩm tơng
đơng khoảng 1 g hoặc 1 ml chế phẩm vào 100 ml môi trờng lỏng Enterobacteria Mossel và ủ ở 35 - 37oC trong 18 - 24 h. Cấy lên đĩa thạch muối mật violet-red có chứa
lactose và glucose ủ ở 35 -37oC trong 18 - 48 h. Chế phẩm không có Enterobacteria
nếu không thấy mọc những khuẩn lạc vi khuẩn Gram âm trên đĩa.
Đánh giá số lợng: ủ một lợng thích hợp môi trờng lỏng Enterobacteria - Mossel với những
lợng chế phẩm đem kiểm tra đã đợc làm đồng nhất chứa 1,0 g; 0,1 g và 10 mg
hoặc 1,0 ml; 0,1 ml và 10 l. Nếu cần có thể pha loãng chế phẩm, ủ ở 35 -37 oC trong
24 - 48 h. Các khuẩn lạc đã phát triển tốt thờng đỏ hoặc đĩa đỏ, nhuộm vi khuẩn
bắt màu Gram âm, chứng tỏ kết quả dơng tính. Ghi lợng nhỏ nhất của chế phẩm mà
ở đó cho kết quả dơng tính và lợng lớn nhất của chế phẩm mà ở đó cho kết quả âm
tính. Xác định số lợng Bacteria theo bảng 6.
Bảng 6. Tính lợng Bacteria trong chế phẩm
Kết quả đối với mỗi lợng sản phẩm
1,0 g
0,1 g hoặc 0,01 g hoặc
hoặc
0,1 ml
0,01 ml
1 ml
+
+
+
+
+
+
-

Số Bacteria
có trong 1 gam sản phẩm
Lớn hơn 102
ít hơn 102 nhng lớn hơn 10
ít hơn 10 nhng lớn hơn 1
ít hơn 1

Đếm tổng số nấm, mốc, và men
Dùng phơng pháp đĩa thạch tơng tự nh đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí, nhng
sử dụng môi trờng thạch Sabouraud hoặc môi trờng thạch - khoai tây- glucose, ủ
các đĩa ở nhiệt độ ở 20 - 25oC, theo dõi trong 5 ngày.
Tìm Clostridia
Thử nghiệm thứ nhất dùng cho những sản phẩm qui định không có Clostridia.
Thử nghiệm thứ hai là bán định lợng đối với Clostridium perfringens ỏp dng với
những sản phẩm có tiêu chuẩn về số lợng Clostridium perfringens.
Thử nghiệm tìm Clostridia
Chuẩn bị mẫu thử nh trong mục chuẩn bị thí nghiệm. Lấy hai mẫu để kiểm
tra khoảng 1 g (ml) mỗi mẫu, cho vào hai bình đã chứa sẵn 100 ml môi tr ờng
tăng sinh cho Clostridia. Một mẫu đem đun nóng tới 80oC trong 10 phút rồi làm
lạnh ngay. ủ cả hai mẫu ở điều kiện kỵ khí, ở 35 - 37 oC trong 48h. Sau khi ủ từ
mỗi bình cấy chuyển sang một ống môi trờng thạch Columbia đã thêm
gentamycin và tiếp tục ủ ở 35 - 37 oC trong 48h. Nếu không thấy có vi khuẩn
mọc, mẫu thử đạt yêu cầu.


Khi thấy vi khuẩn mọc, chọn một khuẩn lạc điển hình cấy chuyển sang môi trờng thạch Columbia không có gentamycin và ủ ở hai điều kiện kỵ khí và hiếu
khí. Khi chỉ thấy mọc ở điều kiện kỵ khí, trực khuẩn Gram dơng (có hoặc
không có nội bào tử); phản ứng catalase âm tính tức là có Clostridium spp. Nếu
cần so sánh sự phát triển của khuẩn lạc trên hai đĩa và dùng thử nghiệm catalase
để loại trừ những nòi Bacillus spp. kỵ khí và hiếu khí có phản ứng catalase dơng tính. Thử nghiệm này cũng đợc dùng để phân biệt những khuẩn lạc cùng
dạng trên thạch hoặc bằng cách chuyển vi khuẩn lên trên phiến kính và nhỏ dung
dịch nớc oxy già loãng, nếu thấy có sủi bọt nghĩa là phản ứng catalase dơng
tính.
Đếm Clostridium perfringens
Tạo mẫu thử nh mô tả ở mục chuẩn bị thí nghiệm. Pha loãng bằng dung dịch
đệm pepton-natri clorid có pH 7,0 đến các dung dịch chế phẩm có nồng độ 10 2
, 10-3 . Tiến hành xác định tổng số vi khuẩn giống nh xác định tổng số vi
khuẩn hiếu khí sống lại đợc mục Tiến hành. Mỗi lần chuyển 1ml đã làm đồng
đều sang một ống chứa sẵn 9 ml môi trờng sulfit - lactose và một ống nhỏ
Durham. Lắc nhẹ nhàng và đem ủ ở 46 + 0,5oC trong khoảng 24 đến 48 h.
Các ống có màu đen (sắt sulfid) và sinh hơi trong ống Durham (ít nhất 1/10 thể
tích) là có Clostridium perfringens. Tính lợng Clostridium perfringens theo bảng 1.
mục 13.6
Những nòi vi khuẩn dùng để kiểm tra:
Thử nghiệm thứ 1: Clostridium sporogenes ATCC 19404 và NCTC 532
Thử nghiệm thứ 2: Clostridium perfringens ATCC 13124 và NCTC 6125
Nếu cần, kết hợp với dùng Clostridium perfringens để kiểm tra điều kiện nhạy
cảm và điều kiện kỵ khí.
Lặp lại thí nghiệm
Khi nghi ngờ, cần đợc thử nghiệm lại nh hớng dẫn ở trên với một lợng chế phẩm
tăng gấp đôi.
Yêu cầu giới hạn nhiễm khuẩn
Nếu không có chỉ dẫn trong chuyên luận riêng thì giới hạn nhiễm khuẩn cho các
loại thuốc có quá trình sản xuất không tiệt khuẩn nh sau:
Bảng 7. Yêu cầu giới hạn nhiễm khuẩn
Mứ
c
1
2

3

Loại chế phẩm

Yêu cầu

Các chế phẩm dùng
cho bỏng và các vết
loét sâu
Các chế phẩm dùng tại
chỗ nh chữa xng tấy,
tổn thơng, và các
màng
nhầy
(mũi,
họng, tai, âm đạo ...)

Không có các vi khuẩn có thể sống lại trong
1 g (ml) mẫu thử
Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại đuợc
không quá 100 trong 1 g (ml)
Mẫu thử phải không có Enterobacteria,
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus
aureus, nấm và mốc trong 1 g (ml)

Các chế phẩm dùng tại Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại đợc
chỗ cho da nh kem bôi, không quá 500 trong 1 g (ml)
nớc thơm, dầu, dung Mẫu thử phải không có Enterobacteria,


dịch, bột...

Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus
aureus, nấm và mốc trong 1 g (ml)

4

Các chế phẩm dùng Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại đợc
uống; qua trực tràng; không quá 104 trong 1 g (ml)
thấm qua da.
Tống số Enterobacteria không quá 500 trong
1 g (ml)
Nấm và mốc không quá 100 trong1 g (ml)
Không đợc có Salmonella trong 10 g(ml)
Mẫu
không

Escherichia
coli,
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus
aureus. trong 1g(ml)

5

Các chế phẩm có chứa
các nguyên liệu có
nguồn gốc thực vật,
động vật không thể
xử lí theo qui trình
làm
giảm
lợng
vi
khuẩn.

Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại đợc
5.104 trong 1 g (ml)
Nấm và mốc không quá 500 trong 1 g (ml)
Tống số Enterobacteria không quá 500
trong1 g (ml)
Không đợc có Salmonella trong 10 g(ml)
Mẫu
không

Escherichia
coli,
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus
aureus trong 1g(ml)



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×

×