Tải bản đầy đủ

TỐI ƯU HÓA PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH FLORFENICOL TRONG CÁ RÔ PHI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NẰNG CAO

TỐI ƯU HÓA PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH
FLORFENICOL TRONG CÁ RÔ PHI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU
NẰNG CAO
Bùi Thị Dịu1 và Lê Huy Tuấn1*
1

Khoa Nông Lâm Ngư Nghiệp, Đại học Hồng Đức, Thanh Hóa
lehuytuan@hdu.edu.vn,

Ngày nhận bài báo: 16/10/2017 - Ngày nhận bài phản biện: 03/11/2017
Ngày bài báo được chấp nhận đăng: 26/11/2017
TÓM TẮT
Nghiên cứu được thực hiện nhằm nâng cao hiệu quả xử lý mẫu và phân tích dư lượng kháng
sinh Florfenicol trong cá Rô phi bằng phương pháp sắc ký lỏng (HPLC, UV-Vis). Phương pháp được
phát triển dựa trên việc lựa chọn dung môi chiết; hoàn thiện quy trình xử lý mẫu và xác định đường
chuẩn của Florfenicol trong mẫu máu, gan, thân, thịt cá Rô phi; lựa chọn tỷ lệ thành phần pha động
và các điều kiện sắc ký khác. Kết quả cho thấy sử dụng dung môi chiết là Ethylacetate; chiết rung
siêu âm; pha động là Acetonitrile/nước ở tỷ lệ 75/25 (V/V);... có thể cho độ thu hồi 87,92-99,91%,
độ chụm 1,69-5,83%, giới hạn phát hiện 0,0042-0,0076 µg/g, thời gian lưu tương đối ngắn và trạng
thái sắc ký đồ khá lý tưởng.
Từ khoá: Florfenicol, kháng sinh, cá Rô phi, sắc ký lỏng hiệu năng cao


ABSTRACT
Optimization of methods for analysis of florfenicol antibiotic residues in
Tilapia by using high-performance liquid chromatography method
The study was carried out to improve the efficiency of sample handling and Florfenicol residue
analysis in Mozambique tilapia by using liquid chromatography method (HPLC–Vis). The method was
developed by selecting the solvent extraction, completing sample handling process and determining
Florfenicol Calibration curve in Mozambique tilapia’s blood, live, body and flesh; selecting component
ratio at mobile phase and other chromatographic conditions. The results were evaluated by the
recovery, limit of detection, trueness, robustness and Chromatogram state.
Keywords: Florfenicol, antibiotics, Tilapia, HPLC

1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm qua, cùng với sự phát triển không ngừng về diện tích và sản
lượng, nghề nuôi trồng thủy sản cũng đang đứng trước những thách thức không nhỏ
từ vấn đề dịch bệnh. Đây cũng chính là một trong những nguyên nhân dẫn đến việc
thuốc kháng sinh ngày càng được sử dụng nhiều trong nuôi trồng thủy sản.
Trước đây, thuốc kháng sinh Chloramphenicol được người nuôi sử dụng nhiều trong
việc điều trị các bệnh do vi khuẩn gây ra trên cơ thể động vật thủy sản, nhưng loại kháng
sinh này đã bị cấm sử dụng vì dư lượng của nó có thể gây ra hiện tượng thoái hóa tủy
xương ở người. Dẫn xuất Florinated của kháng sinh này đã được thay thế bằng Florfenicol
(FF) và nhanh chóng được sử dụng rộng rãi trong chăn nuôi và thủy sản. Mặc dù có tính
an toàn cao hơn nhưng Florfenicol vẫn nằm trong danh mục thuốc kháng sinh hạn chế sử
dụng (Bộ Nông nghiệp & PTNT, 2009), mức giới hạn tối đa của Florfenicol trong sản phẩm
thuỷ sản xuất vào thị trường EU là 1.000 ppb và Canada là 800 ppb.
Để phân tích lượng tồn dư của Florfenicol trong cơ thể động vật có các phương
pháp được đề xuất, như: Sắc ký lỏng (Phạm Kim Đăng và ctv, 2014; Hayes, 2005;
Kowalski và ctv, 2005; Guo và ctv, 2008; Sorensen và Elbaek, 2004; Sun và ctv,
2009a; Xie và ctv, 2010); Sắc ký khí (Pfenning và ctv, 2000; Zhang và ctv, 2006),
ELISA (Sun và ctv, 2009b)... Trong đó, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương
pháp hiện nay đang được sử dụng khá rộng rãi cả trong nước và quốc tế. Phương
pháp này có thể cho khoảng tuyến tính khá rộng, hiệu suất phân ly, độ chọn lọc, độ
ổn định tương đối cao.
Hiện nay, có khá nhiều nghiên cứu sử dụng HPLC để phân tích dư lượng
Florfenicol được công bố, tuy nhiên có rất ít các báo cáo về phương pháp phân tích
loại kháng sinh này trong cơ thể cá Rô phi, đặc biệt là phương pháp xử lý mẫu và
phân tích đối với từng cơ quan nội tạng cụ thể. Do đó, nghiên cứu này được thực hiện
nhằm xây dựng và tối ưu hóa hiệu quả xử lý mẫu và phân tích dư lượng kháng sinh
Florfenicol trong các mẫu gan, thận, máu và cơ thịt của cá Rô phi bằng phương pháp
sắc ký lỏng (HPLC, UV-Vis). Kết quả nghiên cứu sẽ góp phần bổ sung vào hệ thống
các phương pháp phân tích Florfenicol trên động vật nói chung và trên cá Rô phi nói
riêng.
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1

Đại học Hồng Đức
* Tác giả để liên hệ: Ths Lê Huy Tuấn, Giảng viên bộ môn Khoa học Vật nuôi, Khoa Nông Lâm Ngư Nghiệp, Đại
học Hồng Đức. Địa chỉ: 565 Quang Trung, Đông Vệ, Tp. Thanh Hóa. Điện thoại: 0902.172.789. E-mail:
lehuytuan@hdu.edu.vn


2.1. Nguyên vật liệu
Kháng sinh chuẩn Florfenicol do hãng Sigma cung cấp. Nước cất hai lần được làm
sạch và loại ion qua hệ thống Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA). Toàn bộ các dung
dịch chuẩn bị cho chạy sắc ký đều được lọc qua màng lọc nilon 0,45µm trước khi đưa
vào cột.
Hệ thống sắc ký lỏng cao năng HPLC, UV-Vis Shimadzu và cột sắc ký: SHIMAZDU:
Shim-pack VP-ODS 150L4.6.
Chất chuẩn Florfenicol được pha trong methanol ở nồng độ 1µg/ml và bảo quản
trong tủ lạnh ở 0 - 40C. Dung dịch nghiên cứu pha loãng từ dung dịch gốc (1µg/ml)
bằng nước cất.
Cá Rô phi đen (oreochromis mossambicus) được chọn làm thí nghiệm, có khối
lượng 200±30g. Cá được nuôi tạm dưỡng 10 ngày trong bể composite (25℃, ph
7,5±0,5 do 6±0,5mg/l). Các mẫu máu, gan, thận và thịt của cá được lấy để phân
tích. Máu (lấy từ tĩnh mạch) được cho vào ống li tâm 5ml có chứa 100µl chất chống
đông, ly tâm 10000r/min, lấy phần huyết tương phía trên, bảo quản ở -20℃. Mẫu
gan, thận và thịt được bảo quản trong túi nilon ở nhiệt độ -20℃.
Mẫu huyết tương chờ giải đông tự nhiên. Thêm 1g Na 2SO4 khan và 2mL Ethyl
acetate, rung vortex 30s, đặt vào bể rung siêu âm 10 phút (tần số siêu âm 40 kHz,
công suất 500W), li tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút, hút lấy phần dung dịch phía
trên. Chiết lặp lại lần nữa với 3ml ethyl acetate. Gộp dung dịch từ hai lần chiết và
thổi cạn bằng khí N2 ở 40℃. Sau đó thêm 1ml dung dịch pha động, 1ml n-Hecxen,
rung vortex 1 phút, li tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút, hút lấy tầng dung dịch phía
trên. Tiếp tục tẩy mỡ một lần nữa với 1ml n-Hecxen. Bơm dung dịch thu được vào
bình đựng mẫu sắc ký thông qua đầu lọc 0,22µm.
Mẫu phẩm gan, thận, thịt chờ giải đông tự nhiên. Lấy 0,3g thận (1g gan, 3g thịt)
vào ống li tâm. Nghiền mịn bằng máy đồng hóa mẫu. Sau đó thêm Na2SO4 khan,
Ethyl acetate và thực hiện các bước tương tự xử lý mẫu máu (không sử dụng thao tác
rung siêu âm cho các loại mẫu phẩm này để tránh hiện tượng tạo váng huyền phù).
2.2. Xây dựng đường chuẩn
a. Xây dựng đường chuẩn của chất chuẩn: Lần lượt lấy Florfenicol tiêu chuẩn ở
các nồng độ 10; 5; 2; 1; 0,5; 0,2; 0,1; 0,05 µg/mL để trực tiếp phân tích bằng HPLC.
Mỗi nồng độ lặp lại 3 lần. Dựa vào nồng độ và diện tích peak trung bình tương ứng để
xác định phương trình tuyến tính và hệ số xác định (R2).
b. Xây dựng đường chuẩn trên mẫu phẩm: Lấy mẫu trắng của 1ml máu (0,3g
thận, 1g gan hoặc 3g thịt) lần lượt cho 0.5ml dung dịch Florfenicol ở các nồng độ 10;
5; 2; 1; 0,5; 0,2; 0,1; 0,05 µg/mL. Áp dụng các bước xử lý mẫu như mô tả ở mục 2.5.
Lúc này được chuỗi nồng độ lần lượt là 5; 2; 1; 0,5; 0,2; 0,1; 0,05; 0,025 µg/mL. Tiến
hành phân tích HPLC. Mỗi nồng độ lặp lại 3 lần. Dựa vào nồng độ và diện tích peak
trung bình tương ứng để xác định phương trình tuyến tính và hệ số xác định (R 2).
2.3. Xác định độ thu hồi và độ chuẩn
a. Xác định độ thu hồi: lấy 0.5ml dung dịch Florfenicol chuẩn ở các nồng độ 0,5; 2;
10 µg/mL cho vào các mẫu trắng để tiến hành chiết tách và phân tích theo các bước
trên. Mỗi nồng độ lặp lại 3 lần. Dựa vào nồng độ ban đầu, đường chuẩn tương ứng và
nồng độ sau khi phân tích, xác định độ thu hồi dựa vào công thức sau:
Độ thu hồi (H%) =

100%

b. Xác định chính xác: độ chính xác của phương pháp được xác định thông qua độ
chụm. Lấy 0,5 ml dung dịch Florfenicol chuẩn ở các nồng độ 0,5; 2; 10 µg/mL cho vào
các mẫu trắng để tiến hành chiết tách và phân tích theo các bước trên. Tiến hành thí
nghiệm trong 3 ngày liên tiếp. Mỗi ngày làm thí nghiệm lặp lại 5 lần.
2.4. Xác định giới hạn phát hiện (LOD)
Phân tích mẫu thêm chuẩn với nồng độ thấp nhất (0,05µg/ml đối với mẫu máu và
0,05 µg/g đối với gan, thận, thịt), lặp lại 10 lần, tính độ lệch chuẩn SD. Giới hạn phát hiện
của phương pháp được tính theo công thức: LOD = 3SD
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Lựa chọn dung môi chiết


Florfenicol có thể dễ hàng hòa tan trong các dung môi hữu cơ như: Acetonitrile,
Acetone, Ethylacetate... Vì vậy các dung môi này cũng thường được sử dụng trong
các phương pháp chiết tách các chất thuộc nhóm Phenicol (Feng và ctv, 2006; Peng,
2010; Zhu và ctv, 2006). Kết quả khảo sát hiệu quả chiết Florfenicol của Acetonitrile,
Ethylacetate, Acetone trong mẫu gan cá lần lượt cho hệ số thu hồi là: 86,13; 95,54;
91,72%. Acetonitrile cho hệ số thu hồi tương đối thấp, khi phân tích HPLC thấy xuất
hiện khá nhiều peak tạp, Florfenicol thường không có sự tách biệt hoàn toàn với các
tạp chất.
Trong khi đó, dung môi chiết là Ethylacetate và Acetone lại cho hệ số thu hồi khá
cao, đường nền của sắc ký đồ HPLC khá ổn định. Tuy nhiên, do Ethylacetate cho hiệu
quả chiết cao hơn, dễ dàng được thổi khô bằng khí N 2 và tính an toàn cao hơn nên thí
nghiệm này đã sử dụng Ethylacetate làm dung môi chiết cho quá trình xử lý mẫu.
3.2. Lựa chọn pha động và tỷ lệ các thành phần
Khảo sát hai loại dung môi thường được sử dụng làm pha động trong kỹ thuật sắc
ký lỏng là Methanol và Acetonitrile, kết quả cho thấy: dụng pha động là Acetonitrile
cho độ nhạy cao hơn, lượng dùng cần ít hơn Methanol.
Trong cùng điều kiện sắc ký, ảnh hưởng của tỷ lệ thành phần pha động
Acetonitrile/Nước (V/V) đến thời gian lưu được thể biện trong Bảng 1. Kết quả cho
thấy khi dùng pha động Acetonitrile/nước ở tỷ lệ 75/25 (V/V), thời gian lưu tương đối
ngắn, Acetonitrile tách khỏi các tạp chất, đường nền khá ổn định. Nếu hạ thấp tỷ lệ
Acetonitrile trong pha động sẽ làm kéo dài thời gian lưu. Nếu tiếp tục tăng tỷ lệ
Acetonitrile thì thời gian lưu cũng có sự thay đổi nhưng không rỏ ràng. Vì vậy, thí
nghiệm này đã lấy tỷ lệ pha động là Acetonitrile/Nước = 75/25 (V/V).
Bảng 1. Ảnh hưởng của tỷ lệ thành phần
50/5
0
16,8
8

Acetonitrile/nướcV/V
Thời gian lưumin

60/4
0
16,03

pha động đến thời gian lưu

65/3
5
13,1
5

70/3
0
11,7
3

75/2
5
10,8
5

80/2
0
10,7
3

85/1
5
10,9
2

3.3. Điều kiện sắc ký
- Cột sắc ký: VP-ODS C18250 mm4,6 mm, 5 µm
- Bước sóng tử ngoại: Tiến hành khảo sát quang phổ trong dải 200-300 nm,
Florfenicol cho mức hấp thụ cao nhất tại bước sóng 225 nm.
- Pha động: Acetonitrile/ nước = 25/75
- Lưu tốc dòng: 1,0 ml/phút
- Nhiệt độ cột: 35℃
- Lượng nhập mẫu: 20 µL
- Thời gian vận hành: 12 phút
3.4. Trạng
thái sắc ký đồ
mV

mV
150 Detector A:224nm

a, b, c, d, e, f (hình 1) lần lượt là sắc ký đồ của chất chuẩn, mẫu trắng của máu,
mẫu máu, gan, thận, và thịt thêm chuẩn.
275 Detector A:224nm
250
225

125

200

100

175
150

75

ab

125
100

50

75
50

25

25
0
0.0

0
1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

10.0

11.0

min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

10.0

11.0

min


mV
Detector A:224nm

mV
Detector A:224nm

350

300

300
250

250
200

200

dc

150

150

100

100

50

50

0

350

0

0.0
1.0
mV
Detector A:224nm

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

10.0

11.0

min

300

0.0
1.0
mV
300 Detector A:224nm

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

10.0

11.0

min

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

10.0

11.0

min

250

250

200

200
150

150

ef

100

100

50

50

0

0
0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

10.0

11.0

min

0.0

1.0

Hình 1. Sắc ký đồ của Florfenicol
a. Florfenicol chuẩn 2µg/mL; b. Mẫu trắng của máu; c. Máu thêm chuẩn 2µg/mL; d. Gan thêm
chuẩn 2µg/g.; e. Thận thêm chuẩn 2µg/g và f. Thịt thêm chuẩn 2µg/g

3.5. Đường chuẩn
a. Đường chuẩn của chất chuẩn
Phân tích HPLC đối Florfenicol tiêu chuẩn ở các nồng độ 10; 5; 2; 1; 0,5; 0,2; 0,1;
0,05 µg/mL cho kết quả như hình 2. Phương trình tương quan tuyến tính của
Florfenicol là Y1= 45857X1-63,55; mức độ tương quan rất chặt (R2=1)

Hình 2. Đường chuẩn của Florfenicol tiêu chuẩn

b. Đường chuẩn Florfenicol của máu, gan, thận và thịt
Tiến hành xây dựng đường chuẩn của Florfenicol trong các loại mẫu phẩm như
mô tả ở phần 2.2b. Kết quả như hình 3, trong đó a, b, c, d lần lượt là đường chuẩn
của Florfenicol trong máu, gan, thận và thịt. Phương trình tuyến tính và hệ số xác
định lần lượt là:
Trong máu (Y2)Y2= 44758X2 + 3175,R² = 0,9996
Trong gan (Y3),Y3= 44287X3 + 3306,R² = 0,9992
Trong thận (Y4),Y4= 42876X4 + 2564,R² = 0,9997
Trong thịt (Y5),Y5= 43265X5 + 2599,R² = 0,9998
(Y là diện tích peak, X là nồng độ Florfenicol

)


Hình 3. Đường chuẩn của Florfenicol trong máu, gan, thận và thịt

3.6. Hệ số thu hồi và độ chụm
Kết quả xác định hệ số thu hồi và độ chính xác được thể hiện trong bảng 2. Hệ số
thu hồi khá cao (trên 94%); RSD% trung bình tương đối thấp (3,34 ̵ 4,24%).
Bảng 2.

Hệ số thu hồi và độ lệch chuẩn tương đối

Nồng độ thêm chuẩn (µg/g)
Nồng độ thực tế (µg/g)**
Hệ số thu hồi (%)**
Hệ số thu hồi trung bình (%)
RSD*(%)**
RSD trung bình (%)

Mẫu máu
thêm
chuẩn
0,5
2
10
0,466
1,903
9,868
93,28
95,13
98,68
95,70
5,83
2,67
4,22
4,24

Mẫu gan
thêm
chuẩn
0,5
2
10
0,450
1,940
9,747
89,90
96,98
97,47
94,79
5,47
1,69
2,86
3,34

Mẫu thận
thêm
chuẩn
0,5
2
10
0,440
1,934
9,991
87,92
96,70
99,91
94,84
5,45
3,64
2,65
3,91

Mẫu thịt
thêm
chuẩn
0,5
2
10
0,458
1,929
9,722
91,60
96,44
97,22
95,09
4,88
2,68
3,34
3,63

*RSD: Độ lệch tiêu chuẩn tương đối **: Các giá trị trong từng ô tương ứng với nồng độ thêm chuẩn 0,5; 2 và 10
mg/g

3.7. Giới hạn phát hiện của phương pháp (LOD)
Giới hạn phát hiện Florfenicol trong các mẫu máu, gan, thận và thịt lần lượt là
0,0066 µg/ml, 0,0072 µg/g, 0,0039 µg/g, 0,0051 µg/g (Bảng 3)
Bảng 3.
Mẫu

Giới hạn phát hiện của phương pháp
Nồng độ phân tích

Máu(µg/ml)

0,0435 0,0461 0,0476 0,0450

0,0430

0,0466

Gan (µg/g)

0,0471 0,0461 0,0435 0,0496

0,0445

0,0466

Thận (µg/g) 0,0486 0,0471 0,0491 0,0450

0,0471

0,0476

Thịt (µg/g)

0,0476

0,0491

0,0440 0,0461 0,0471 0,0445

0,049
1
0,050
1
0,048
1
0,046
6

SD
0,002
2
0,002
4
0,001
3
0,001
7

LOD
0,006
6
0,007
2
0,003
9
0,005
1


4. KẾT LUẬN

Kết quả nghiên cứu ban đầu về kỹ thuật sắc ký lỏng cao năng để phát hiện tồn
dư florfenicol sản phẩm cá Rô phi đã cho thấy với các điều kiện tối ưu có thể đáp ứng
được các yêu cầu theo quyết định 2002/657/CE của ủy ban Châu Âu và Tiêu chuẩn Việt
Nam TCVN 8374:2010. Độ thu hồi đạt được tương đối cao (87,9299,91%), độ chụm
(1,69-5,83%), giới hạn phát hiện (0,0042-0,0076 µg/g). Phương pháp này có thể ứng
dụng để phân tích Florfenicol tồn dư trong cá Rô phi. Nghiên cứu có thể tiếp tục mở
rộng trên các nền mẫu của gia súc, gia cầm và một số loài thủy sản khác.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (2009), Thông tư số 15/2009/TT-BNN, Ban hành danh mục
thuốc, hoá chất, kháng sinh cấm sử dụng, hạn chế sử dụng.
2. Phạm Kim Đăng, Vũ Thị Ngân và Phạm Hồng Ngân (2014), Xác định đồng thời dư lượng kháng sinh
Chloramphenicol (CAP), Florphenicol (FF), Thiamphenicol (TAP) trong một số sản phẩm động vật bằng
phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS), Tạp chí Khoa học và Phát triển, 12(2): 165-176.
3. Feng Jingbin, Li Liudong and Jia Xiaoping (2006), Pharmarcokinetics of Florfenicol in Tilapina, South
China Fisheries Science, 2(5): 2529.
4. Hayes J.M. (2005), Determination of florfenicol in fish feed by liquid chromatography, JAOAC Internat,
88(6): 177583.
5. Kowalski P., Chmielewska A and Konieczna L (2005), Comparative evaluation between capillary
electrophoresis and high performance liquid chromatography for the analysis of florfenicol in plasma,
Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 39: 980989.
6. Guo Xia, Zhang Suxia and Jian Cheng (2008), Determination of Florfenicol and Florfenicol Amine Residues in
Shrimp Muscle High Performance Liquid Chromatography. Chinese Journal of Veterinary Drug, 42(7),1216.
7. Peng Zhangxiao (2010), The Pharmacokinetics and Toxicology of Ivermectin in Crucian. Shanghai Ocean
University.
8. Pfenning A. P., Rupp H. S and Roybal J. E (2000), Simultaneous determinati on of residues of
chloramphenicol, florfenicol , florfenicol amine, and thiamphenicol in shrimp tissue by gaschromat ography
with electron capturedetection, JAOAC Internat, 83(1): 2530.
9. Sorensen L.K., Elbaek T. H. (2004), Simultaneous determination of trimethoprim, sulfadiazine, florfenicol and
oxolinic acid in surface water by liquid chromatography tandem mass spectrometry, Chromatographia, 60: 285291.
10. Sun Faliang, Diao Youxiang and Sun Ning (2009a), Establishment and Application of Detecting the
Residues of Florfenicol in Chicken Muscle by Indirec comptivive Enzyme – Linked Immunosorbent Assay.
Chinese Scientia Agricultura Sinica. 2009, 42(5): 181519.
11. Sun Lei, Zhang Li and Wang Shu huai (2009b), Determination of Chloramphenicol, Thiamphenicol,
Florfenicol and Florfenicol Amine Residues in Animal Derived Food by PULC-MS/MS, Chinese Journal of
Veterinary Drug, 43(3) : 4045.
12. TCVN 8374:2010. Thủy sản và sản phẩm thủy sản – Xác định hàm lượng Florfenicol bằng phương pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
13. Xie Kaizhou, Yao Yilin and Xu Dong (2010), Simultaneous determination of reidues of florfenicol and
the matabotite florfenicol amine in hen egg by HPLC with fluorescence detection, Chinese Journal
Vaterinary Madicine, 30(4): 489492.
14. Zhang S., Li J. and Sun E (2006), Simultaneous determination of florfenicol and florfenieol amine in fish,
simhrp, and swinemuscle by gas chromatograph y with a microcell electron capturede tector, JAOAC
Internat, 89(5): 143541.
15. Zhu Limin, Yang Xianle and Lin Qicun (2006), The residues and pharmacokintics of florphenicol in Trionyx
sinnensis following intramascular injection and oral administration, Journal of fisheries of China, 30(4): 515519.



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×

×