Tải bản đầy đủ

Chiết xuất, phân lập một số hợp chất trong lá trà hoa vàng cúc phương (camellia cucphuongensis ninh rosmann)

an

dP
ha
rm

ac
y,

KHOA Y DƯỢC

VN
U

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

ine

TRẦN THỊ THƠM

ed

ic

CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT

M

TRONG LÁ TRÀ HOA VÀNG CÚC PHƯƠNG

ho
ol

of

(Camellia cucphuongensis Ninh & Rosmann)

NGÀNH DƯỢC HỌC

Co

py

rig

ht

@

Sc

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

HÀ NỘI - 2019


VN
U

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

dP
ha
rm

TRẦN THỊ THƠM

ac
y,

KHOA Y DƯỢC

CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT

an

TRONG LÁ TRÀ HOA VÀNG CÚC PHƯƠNG

ed
ic

ine

(Camellia cucphuongensis Ninh & Rosmann)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

ho
ol

of

M

NGÀNH DƯỢC HỌC

KHÓA

:

TS. VŨ ĐỨC LỢI
PGS. TS. ĐỖ THỊ HÀ

Co

py

rig

ht

@

Sc

NGƯỜI HƯỚNG DẪN :

QHY. 2014

HÀ NỘI 2019


LỜI CẢM ƠN

VN
U

Trong thời gian thực hiện khóa luận này, em đã nhận được rất nhiều sự
quan tâm giúp đỡ từ các thầy cô Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội,

ac
y,

các anh chị của Khoa Hóa Thực vật – Viện Dược liệu, cùng bạn bè và người
thân.

dP
ha
rm

Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn TS. Vũ Đức Lợi – Chủ nhiệm
Bộ môn Dược liệu – Dược học cổ truyền, Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia
Hà Nội, PGS. TS. Đỗ Thị Hà, Khoa Hóa Thực Vật - Viện Dược liệu đã tận
tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi để em thực hiện và hoàn thành khóa

an

luận này.

ine

Em xin chân thành cảm ơn tới ThS. Phạm Thị Thúy và các anh chị
chuyên viên của Phòng Hóa Thực vật II - Viện Dược liệu đã trực tiếp hướng

ed
ic

dẫn và tận tình chỉ dạy em trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận.

M

Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giảng viên trong Khoa Y
Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội, người thân trong gia đình, bạn bè đã truyền

of

dạy kiến thức, kỹ năng, đã tạo điều kiện, quan tâm, giúp đỡ, động viên em

ho
ol

trong 5 năm học tại trường.

Cuối cùng, em xin kính chúc các thầy cô luôn mạnh khỏe, hạnh phúc

Sc

và thành công trong cuộc sống, luôn giữ vững được nhiệt huyết trên con

@

đường truyền đạt tri thức của mình!

Co

py

rig

ht

Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 30 tháng 05 năm 2019
Sinh viên
Trần Thị Thơm


VN
U

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG

ac
y,

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................. 1

dP
ha
rm

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ............................................................................................ 2
1.1. Về thực vật ............................................................................................................ 2
1.1.1. Vị trí phân loại của chi Camellia L. và loài Camellia cucphuongensis ......... 2
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Camellia L. ....................................... 2

an

1.1.3. Đặc điểm thực vật và phân bố của loài Camellia cucphuongensis ................ 3

ine

1.2. Thành phần hóa học .............................................................................................. 8
1.2.1. Thành phần hóa học của chi Camellia ........................................................... 8

ed
ic

1.2.1.1. Nhóm polyphenol ...................................................................................... 8
1.2.1.2. Nhóm saponin ........................................................................................... 9

M

1.2.1.3. Nhóm polysaccarit .................................................................................... 9
1.2.1.4. Nhóm sterol và tinh dầu ............................................................................ 9

of

1.2.1.5. Nhóm acid amin và vitamin .................................................................... 10

ho
ol

1.2.2. Thành phần hóa học của các loài Trà hoa vàng ........................................... 10
1.2.2.1. Nhóm polyphenol .................................................................................... 10
1.2.2.2. Nhóm saponin ......................................................................................... 12

Sc

1.2.2.3. Nhóm tinh dầu ......................................................................................... 12

@

1.2.2.4. Nhóm acid amin ...................................................................................... 13
1.3. Tác dụng sinh học ............................................................................................... 14

ht

1.3.1. Tác dụng chống oxi hóa ............................................................................... 14

rig

1.3.2. Tác dụng chống ung thư ................................................................................ 14

py

1.3.3. Tác dụng kháng khuẩn ................................................................................. 15

Co

1.3.4. Tác dụng giảm cân và làm đẹp ..................................................................... 15
1.3.5. Tác dụng theo y học cổ truyền ..................................................................... 16

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 17


2.1. Nguyên liệu và thiết bị ........................................................................................ 17

VN
U

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................... 17
2.1.2. Nguyên vật liệu nghiên cứu........................................................................... 17
2.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 18

ac
y,

2.2.1. Phương pháp định tính các nhóm chất ......................................................... 18
2.2.2. Phương pháp chiết xuất và phân lập ............................................................ 18

dP
ha
rm

2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất ............................................... 19
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..................................... 20
3.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ thường gặp bằng phản ứng hóa học ............... 20
3.1.1. Định tính các nhóm chất trong dịch chiết ether dầu hỏa .............................. 20
3.1.2. Định tính các nhóm chất trong dịch chiết cồn.............................................. 20

an

3.1.3. Định tính các nhóm chất trong dịch chiết nước ........................................... 23

ine

3.1.4. Định tính các nhóm chất khác khác ............................................................. 24
3.2. Chiết xuất và phân lập các chất .......................................................................... 27

ed
ic

3.2.1. Chiết xuất cao toàn phần và cao phân đoạn .................................................. 27
3.2.2. Chiết xuất và phân lập hợp chất CC1 ............................................................ 29

M

3.2.3. Chiết xuất và phân lập hợp chất CC5 ............................................................ 30
3.2.4. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được .............................................. 31

of

3.2.4.1. Hợp chất CC1 ........................................................................................ 31

ho
ol

3.2.4.2. Hợp chất CC5 ........................................................................................ 32
3.3. Bàn luận .............................................................................................................. 33

Sc

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO

Co

py

rig

ht

@

PHỤ LỤC


1

1

2

13

Phổ proton

H-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13

C-NMR

AAPH

4

CC

6

CDCl3

7

d

8

DEPT

9

ESI-MS

10

FASN

11

GABA

12

IC50

13

IUPAC

14

LDL

Lipoprotein trọng lượng phân tử thấp

15

ho
ol

2,2'-Azobis (2-amidinopropan)

3

MeOD

Methanol D4

MIC

Nồng độ ức chế tối thiểu

MS

Phổ khối lượng phân tử

m/z

Khối lượng/ điện tích

NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

s

singlet

21

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

22

tonc

Nhiệt độ nóng chảy

23

v/v

Thể tích/ thể tích

ht

@

18

rig

20

py

dP
ha
rm
Sắc ký cột

chloroform
doublet

Sc

17

19

dihydrochlorid

an

Distortionless Enhancement by Polarization
Transfer

M

ed
ic

ine

Phổ khối ion hóa phun mù điện tử

of

16

Co

Tên đầy đủ

Ký hiệu, chữ viết tắt

ac
y,

STT

VN
U

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Fatty acid synthase

Gamma-Aminobutyric Acid
Nồng độ ức chế 50%

International Union of Pure and Applied
Chemistry


VN
U

DANH MỤC CÁC BẢNG
STT

Tên bảng

1

Bảng 1.1 Danh mục một số loài Trà hoa vàng ở Việt Nam
dược liệu

Bảng 3.2 Bảng so sánh dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR của CC1
và kaempferol

Bảng 3.3 Bảng so sánh dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR của CC5
và vanillin

4-7

25 - 27

31

32 - 33

an

4

ac
y,

3

Bảng 3.1 Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất có trong

dP
ha
rm

2

Trang

ine

DANH MỤC CÁC HÌNH
Tên hình

ed
ic

STT

Trang

Hình 1.1. Một số polyphenol chính

11

2

Hình 1.2. Một số tinh dầu chính

12

3

Hình 1.3. Một số acid amin chính

13

4

Hình 2.1. Hình ảnh lá và hoa Trà hoa vàng Cúc Phương

5

Hình 2.2. Hình ảnh mẫu dược liệu

of

ho
ol

Hình 3.2. Sơ đồ phân lập hợp chất CC1 từ phân đoạn ethyl
acetat của lá Trà hoa vàng

17
17
19
28
29

rig

ht

8

Sc

7

Hình 2.3. Sơ đồ phương pháp chiết xuất và phân lập các
chất
Hình 3.1. Sơ đồ chiết cao cồn 96% và các cao phân đoạn lá
Trà hoa vàng

@

6

M

1

Hình 3.3. Sơ đồ phân lập hợp chất CC5 từ phân đoạn
dichloromethan của lá Trà hoa vàng

30

10

Hình 3.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất CC1

32

11

Hình 3.5 Cấu trúc hóa học của hợp chất CC5

33

Co

py

9


VN
U

ĐẶT VẤN ĐỀ
Những năm gần đây, vấn đề chống oxi hóa, chống lão hóa và chống ung thư
đang là đề tài nóng được rất nhiều người quan tâm. Một trong những xu hướng đi
đầu đó là các sản phẩm bảo vệ sức khỏe có nguồn gốc từ thiên nhiên, các loại thảo

ac
y,

dược có lợi cho sức khỏe, tiểu biểu là các loại trà thuộc chi Camellia L.

Từ xa xưa, trà đã là một thức uống phổ biến và được yêu thích nhờ các tác

dP
ha
rm

dụng có lợi cho sức khỏe. Trong các loài trà thì Trà hoa vàng là một loại trà đặc biệt
quý, được mệnh danh là nữ hoàng của các loài trà. Các nghiên cứu từ y học cổ
truyền phương Đông đến các bằng chứng khoa học hiện đại đều chỉ ra các tác dụng
nổi bật của Trà hoa vàng như chống oxi hóa, chống ung thư, chống nhiễm khuẩn, hạ

an

mỡ máu, giảm cân và làm đẹp,…[44], [27], [41], [8].

Hiện nay, Việt Nam đã trở thành một trong những trung tâm phân bố với hơn

ine

40 loài Trà hoa vàng được công bố. Loài Camellia cucphuongensis Ninh &

ed
ic

Rosmann được giới lần đầu tiên trong một bài viết của Jean-Claude Rosmann vào
năm 1995 trên tờ Jardins de France, Pháp, sau đó là đăng trên tạp chí International

M

Camellia Journal [29]. Đây là một loài đặc hữu của Việt Nam, được phát hiện tại
Vườn Quốc gia Cúc Phương, Ninh Bình. Tuy nhiên, các nghiên cứu trong nước hầu

of

như chỉ tập trung vào phát hiện và mô tả đặc điểm hình thái của các loài mới, trong

ho
ol

khi các thành phần hóa học làm nên công dụng giá trị của Trà hoa vàng thì vẫn chưa
được tìm hiểu sâu sắc và toàn diện. Về loài Camellia cucphuongensis Ninh &
Rosmann, nhóm nghiên cứu của TS. Nguyễn Đức Tùng, Đại học Dược Hà Nội và

Sc

Viện Dược liệu là nghiên cứu lần đầu tiên, đã mô tả chi tiết đặc điểm thực vật, đặc

@

điểm sinh thái và phân lập được một số thành phần hóa học của loài này.
Chính vì vậy, đề tài “ Chiết xuất, phân lập một số hợp chất trong lá trà

ht

hoa vàng Cúc Phương (Camellia cucphuongensis) ” - là một phần của nghiên cứu

rig

trên, đã được thực hiện với các mục tiêu:

Co

py

1. Định tính một số nhóm chất hữu cơ trong lá Trà hoa vàng Cúc Phương.
2. Chiết tách, phân lập 1- 2 hợp chất từ lá Trà hoa vàng Cúc Phương.
3. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được.

1


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

VN
U

1.1. Về thực vật
1.1.1. Vị trí phân loại của chi Camellia L. và loài Camellia cucphuongensis

Vị trí của chi Camellia L. trong hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan

ac
y,

(2009) [39] như sau:
Giới: Thực vật (Plantae)

dP
ha
rm

Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida)

Phân lớp: Sổ (Dilleniidae)
Bộ: Trà (Theales)

Họ: Trà ( Theaceae)

an

Chi: Trà (Camellia)

ine

Loài Camellia cucphuongensis:

Tên khoa học: Camellia cucphuongensis Ninh & Rosmann.

ed
ic

Tên Việt Nam: Trà hoa vàng Cúc Phương.
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Camellia L.

M

Cây bụi hoặc cây nhỏ thường xanh, cành nhẵn hay có lông. Lá thường có
cuống; đơn, mọc cách, không có lá kèm, kích thước lá thay đổi, dài từ vài cm đến

of

45 cm; chất lá thường dạng da, dày mỏng khác nhau, ít khi chất màng mỏng; chóp

ho
ol

lá nhọn, có đầu nhọn hoặc kéo dài thành đuôi; gốc lá hình nêm hẹp, nêm rộng, tròn
hay hình tim; mép lá có răng cưa nhọn hay tù. Hoa đều, lưỡng tính, kích thước lớn
hoặc nhỏ, mọc đơn độc hoặc tập trung 2-5 hoa ở nách lá hoặc đỉnh cành. Hoa màu

Sc

đỏ, trắng hay màu vàng. Cuống hoa ngắn hoặc gần như không. Lá bắc 2-10, mọc

@

xoắn trên cuống hoa, tồn tại hoặc sớm rụng. Lá đài thường 5 phiến, tồn tại hoặc sớm
rụng. Cánh hoa 4-19, hợp một phần ở gốc cùng với vòng nhị ngoài. Nhị nhiều,

ht

những nhị ngoài thường dính nhau thành cái chén hay ống ở phía gốc; vòng nhị

rig

phía trong rời nhau; chỉ nhị dài. Bầu trên, 1-5 ô; vòi nhụy 1-5, dạng sợi, rời hoặc

py

dính nhau ở mức độ khác nhau, bầu và vòi nhụy nhẵn hay phủ lông mịn. Quả nang
hình cầu, hình cầu dẹt hoặc hình trứng, khi khô chẻ ô từ trên xuống thành 3, 4 hay 5

Co

mảnh; có trụ quả hay không; vỏ quả dày hay mỏng, hoá gỗ. Hạt thường 1 đến nhiều

2


hạt trong mỗi ô, hình cầu, nửa cầu hay hình nêm; vỏ hạt màu nâu, nâu hạt giẻ nhạt

VN
U

hoặc nâu hồng, phủ lông hay nhẵn [3].

Có khoảng 280 loài, phân bố chủ yếu ở Nhiệt đới và Á nhiệt đới như Ấn Độ,
Trung Quốc, Vệt Nam, Thổ Nhĩ Kì, Brazil, Australia,...Ở Việt Nam đã bắt gặp 58

ac
y,

loài Camellia [3], trong đó có hơn 40 loài có hoa màu vàng, tập trung ở khu vực
phía Bắc (Thái Nguyên, Vĩnh Phúc, Quảng Ninh,…) và phía Nam ở một số tỉnh

dP
ha
rm

như Lâm Đồng, Đồng Nai,…( xem bảng 1.1)

1.1.3. Đặc điểm thực vật và phân bố của loài Camellia cucphuongensis
Cây gỗ nhỏ, cao 3 - 6 m. Cành già màu nâu đậm, sần sùi. Lá có cuống
ngắn, dài 2,5 mm, có lông. Lá thuôn dài hoặc hình elip, dài 6-12 cm, rộng 2,7 – 4,5
cm, mỏng, gốc lá tròn nhẵn. Hoa màu vàng, mọc ở đầu cành, đường kính khi nở 4,5

an

– 5 cm; cuống hoa nhẵn, dài 5 – 7 mm; lá bắc 5 – 6 lá, hình trứng, dài 2 – 5 mm; lá

ine

đài 8 – 9 lá, dài 0,4 – 1 cm, có lông. Có 13 – 15 cánh hoa, hình trứng, dài 1,8 – 2,3
cm, rộng 1,5 cm, đầu tròn, mặt dưới có lông. Nhị hoa dài 0,8 – 2,4 cm, chỉ nhị rời,

ed
ic

có lông. Noãn có 5 ô, có 5 vòi nhụy, rời, dài khoảng 1,3 cm. Quả hình cầu, dài 3,9
cm, đường kính 3,8 cm, màu đen gỗ khi khô, quả có 5 ô với 6 – 8 hạt trong mỗi ô,

M

hạt hình nêm dài 1,2 – 1,4 cm [29].

Mùa hoa kéo dài từ tháng 10 năm trước đến tháng 2 năm sau [2].

of

Loài này ưa ẩm mọc trong các thung lũng của rừng nhiệt đới ở độ cao 300-

ho
ol

400 m (khu vực gần hồ Mạc thuộc Vườn Quốc gia Cúc Phương) [2]. Đây là loài đặc
hữu, được phát hiện tại Vườn quốc gia Cúc Phương, Ninh Bình bởi Jean-Claude

Sc

Rosmann và Tiến sĩ Trần Ninh của Khoa Thực vật học, Đại học Quốc gia Hà Nội

Co

py

rig

ht

@

[29].

3


Bảng 1.1. Danh mục một số loài Trà hoa vàng ở Việt Nam
STT

Tên loài

Tên thường gọi

Phân bố

1

Camellia aurea Hung T. Chang

Trà hoa vàng kim

Lạng Sơn

2

Camellia bugiamapensis Orel, Curry,

a
m

Vườn quốc gia Bù Gia Mập, Bình

Trà bù gia mập

Luu & Q.D

r
a
h
P
d

cy

U
N
,V

Phước

n
a
e

TLTK
[31]
[31]

3

Camellia capitata Orel

Trà đầu

Vườn Quốc gia Cát Tiên, Lâm Đồng

[14]

4

Camellia cattienensis Orel

Trà Cát Tiên

Vườn Quốc gia Cát Tiên, Lâm Đồng

[34]

n
i
ic

Quảng Ninh; Quế Phong, Nghệ An;

5

Camellia chrysantha (Hu) Tuyama

4

6

ol

M
f
o

Tam Đảo, Vĩnh Phúc; Ninh Bình; Đà

Lạt; Tuyên Quang; Ba Vì,Hà Nội; Vĩnh

[3]

Cửu, Đồng Nai.

Camellia cucphuongensis Ninh &

Trà hoa vàng Cúc

Vườn Quốc gia Cúc Phương, Ninh

Rosmann

Phương

Bình

Trà vàng lá dày

Tam Đảo, Vĩnh Phúc

[3]

Trà mi Đà Lạt

Đà Lạt, Lâm Đồng

[30]

o
h
Sc

Camellia crassiphylla Ninh &

7

8

ed

Trà hoa vàng

@
t
h
Hakoda

Camellia dalatensis V.D.Luong,

g
i
r
y

Ninh & Hakoda

p
o
C

[29]

9

Camellia dilinhensis Tran & Luong

Trà mi Di Linh

Di Linh, Lâm Đồng

[31]

10

Camellia dongnaiensis Orel

Trà hoa vàng Đồng

Đồng Nai

[31]


Hồi Xuân, Thanh Hóa; Nghệ An;

U
N
,V

Quảng Trị; Lâm Đồng; Tây Ninh; Biên

[31]

Nai

11

Camellia dormoyana (Pierre) Sealy

y
c
a

Trà vàng đo-môi

m
r
a

Hòa, Đồng Nai, Phú Quốc, Kiên Giang.
12

Camellia euphlebia Merr.ex Sealy

h
P
d

Sơn Động, Bắc Giang; Ba Chẽ, Quảng

Trà gân

5

Camellia flava (Pitard) Sealy

Trà hoa vàng nhạt

14

Camellia fleuryi (A.Chev) Sealy

Chè sốp

15

Camellia gilberti (A.Chev) Sealy

16

Camellia hakodae Ninh.T

17

Camellia hirsuta Hakoda. Ninh

18

Camellia hamyenensis M.Sealy

19

ed

rig

Bình; Hòa Bình; Nghệ An

[31]

[31]

Diên Khánh, Khánh Hòa; Vĩnh Phúc

[31]

Trà vàng Ginbec

Tam Đảo, Vĩnh Phúc

[3]

Trà vàng Hakoda

Tam Đảo, Vĩnh Phúc

[3]

Tam Đảo, Vĩnh Phúc

[3]

Hàm Yên, Tuyên Quang

[31]

Vũ Quang, Hà Tĩnh

[26]

Hữu Lũng, Lạng Sơn

[31]

M
f
o

Trà vàng nhiều
lông

Trà hoa vàng Hàm
Yên

Camellia hatinhensis Luong, Tran &

y
p
Co
20

@
t
h

o
h
Sc

Vườn Quốc gia Cúc Phương, Ninh

n
i
ic

13

ol

n
a
e

Ninh; Lạng Sơn

L. T. Nguyen

Camellia huulungensis Rosmann &

Trà hoa vàng Hữu

Ninh

Lũng


21
22

Camellia inusitata Orel, Curry &

Camellia kirinoi Ninh

Trà hoa vàng Kiri

Camellia limonia C.F.Liang &

Trà hoa vàng da

S.L.Mo

cam

h
P
d

[31]

Lạng Sơn

[33]

Thái Nguyên

[31]

Tuyên Quang, Bắc Cạn

[31]

Lạng Sơn

[31]

Lâm Đồng

[15]

Trà âu-con-nơ

Lâm Đồng

[36]

Camellia petelotii (Merr) Sealy

Trà vàng petelo

Tam Đảo, Vĩnh Phúc

[3]

Camellia phanii Hakoda & Ninh

Trà vàng phan

Tam Đảo, Vĩnh Phúc

[3]

Camellia quephongensis Hakoda et

Trà hoa vàng Quế

Ninh

Phong

Quế Phong, Nghệ An

[31]

Camellia luteopallida Luong,

Camellia luongii Tran et Le

6

Camellia megasepala Hung T.Chang

28

Camellia murauchii Ninh & Hakoda

29

Camellia ninhii Luong & Le

Sc

ho

Camellia oconoriana Orel, Curry &

@
t
h
Luu

31

p
o
C

g
i
r
y

fM

ed

Trà hoa vàng Ba

o
l
o

& Trin Ninh

n
a
e

n
i
ic

Trà hoa vàng trắng

T.Q.T.Nguyen, Luu

26

33

m
r
a

Lạng Sơn

[35]

Lạng Sơn

25

32

Đồng

[31]

[31]

24

30

y
c
a

Vườn quốc gia Biduop-Núi Bà, Lâm

Trà mi cánh dẹt

Luu

23

27

Lạng Sơn

Camellia indochinensis Merr

U
N
,V

Bể

Trà hoa vàng Murô


34

35

36

37

Trà hoa vàng Yên

Camellia rosmannii Ninh
Camellia sonthaiensis Luu, Luong,
Q.D.Nhuyen & T.Q.T.Nguyet

Ninh

Đảo

40

41
42

n
i
ic

Kirino

ed

Hải đường hoa

Camellia tienii Ninh.T

M
f
o
vàng

Camellia thuongiana Luong, Anna

l
o
o

Le & Lau

h
c
S

Trà mi Thưởng

Camellia tonkinensis (Pit.) Cohen-

Trà hoa vàng Bắc

Stuart

bộ

t@

Camellia vuquangensis Luong, Tran

y
p
Co

h
g
ri

& L. T. Nguyen

Camellia vidalii Rosmann

[31]

[31]

Tam Đảo, Vĩnh Phúc

h
P
d

[3]

Thái Nguyên

[31]

Tam Đảo, Vĩnh Phúc

[31]

Đạ Huoai, Lâm Đồng

[14]

Ba Vì, Hà Nội

[31]

Vũ Quang, Hà Tĩnh

[26]

Lâm Đồng

[31]

n
a
e

Camellia thanxaensa Hakoda et

7

39

Sơn Thái, Khánh Hòa

Trà hoa vàng Tam

38

m
r
a

Trà Sơn Thái

Camellia tamdaoensis Hakoda &

y
c
a

Yên Tử, Quảng Ninh

Tử

U
N
,V


1.2. Thành phần hóa học

VN
U

Hiện nay trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu khá đầy đủ về thành phần hóa
học của các loài hay gặp thuộc chi Camellia L, đặc biệt là trà xanh. Tuy nhiên, các
nghiên cứu đã thực hiện về thành phần hóa học của các loài Trà hoa vàng cho thấy

ac
y,

có điểm khác biệt với trà xanh thông thường. Các nghiên cứu đã xác định thành
phần của Trà hoa vàng thuộc 13 nhóm chất khác nhau, trong đó các thành phần

dP
ha
rm

quan trọng nhất liên quan đến các nhóm chất polyphenol, flavonoid, tanin, saponin,
đường khử tự do, acid amin, sterol, acid hữu cơ, tinh dầu và các nguyên tố vi lượng
[10], [44].

1.2.1. Thành phần hóa học của chi Camellia L.
1.2.1.1. Nhóm polyphenol

an

Thành phần hóa học của chi Camellia rất đa dạng, các alcaloid purin và

ine

polyphenol là các hợp chất có hoạt tính sinh học chính trong trà, được báo cáo rộng
rãi là đóng vai trò quan trọng trong việc giảm nguy cơ mắc bệnh [46].

ed
ic

Các alcaloid purin chính trong trà bao gồm caffein (1), theobromin (2),
theophylin (3) và theacrin (4) [4], [5], [48], [49].

M

Các hợp chất phenolic là axit gallic và tám loại catechin tự nhiên bao gồm

of

(+) - catechin (C) (5), (-)-epicatechin (EC) (6), (-)-gallocatechin (GC) (7), (-)epigallocatechin (EGC) (8), (-)-catechin gallat (CG) (9), (-)-gallocatechin gallat

ho
ol

(GCG) (10), (-)-epicatechin gallat (ECG) (11) và (-)-epigallocatechin gallat
(EGCG) (12) [47].

Sc

Nghiên cứu năm 2016 của Wang Xin đã phân lập được 17 loại flavonol là ()-epicatechin-3-O-(Z)-coumarat (13), (-)-epicatechin-3-O-(E)-coumarat (14), (-)-

@

epicatechin-3-O-(E)-caffeat (15), (+)-catechin (5), ampelopsin (16), (-)-epicatechin

ht

(6) , (-)-epiafzelechin (17), (-)-epicatechin-3-O-gallat (11), (-)-epiafzelechin-3-O(18),

(+)-catechin-3-O-gallat

(9),

(+)-epiafzelechin-3-O-gallat

rig

gallat

(19),

epicatechin- 3-O-p-hydroxybenzoat (20), (-)-epigallo-catechin (8), (-)-gallocatechin

py

(7), (-)-epigallo-catechin-3-O-gallat (12), (+)-gallocatechin-3-O-gallat (10) và (-)-

Co

epicatechin-3-O- (3”-O-methyl)-gallat (21) [42].

8


1.2.1.2. Nhóm saponin

VN
U

Cho đến nay, chỉ có saponin triterpenoid pentacyclic được báo cáo phát hiện
từ chi Camellia, và hầu hết chúng là các saponin triterpenoid loại oleanane. Các
nghiên cứu đã phân lập được 188 hợp chất saponin từ rễ, thân, lá, hoa và hạt của các

ac
y,

loài thuộc chi Camellia. Trong đó có 87 saponin từ C. sinensis; 33 từ C. japonica;
24 từ C. sinensis var. assamica; 37 từ C. oleifera và 7 từ C. sasanqua [18].

dP
ha
rm

Một nghiên cứu năm 2018 trên các bộ phận của sáu loài gồm C. sinensis, C.
sinensis var. assamica, C. oleifera, C. japonica và C. sasanqua cho kết quả các
nhóm saponin chính là camelliasaponin (22); theasaponin (23); assamsaponin (24);
teaseedsaponin (25); oleiferasaponin (26); floratheasaponin (27); camelliosid (28);
chakasaponin (29); yuchasaponin (30); jegosaponin (31); sasanquasaponin (32);

an

sanchakasaponin (33); maetenosid (34); ternstoemiasid (35); oleiferosid (36);

ine

camelliaolean (37);… [12].
1.2.1.3. Nhóm polysaccarit

ed
ic

Polysaccarit trong trà (TPS) là một polysacarit có tính axit liên kết với
protein không chứa tinh bột, chứa 44,2% đường trung tính, 43,1% axit uronic và

M

3,5% protein . Thành phần carbohydrate của TPS bao gồm glucose (Glc), galactose
(Gal), arabinose (Ara), rhamnose (Rha), xyloza (Xyl), mannose (Man), ribose (Rib)

of

và axit glucuronic. TPS có thể được chia thành polysacarit trung tính (NTPS) và

ho
ol

polysacarit axit (ATPS). Đường và axit uronic có nhiều trong TPS. NTPS chứa
82,7% đường, 12,9 % axit uronic, trong khi ATPS chứa 85,5% đường, 39,8% axit

Sc

uronic. Thành phần đường trong NTPS chủ yếu là Gal (67,6%), trong khi Rha, Ara,
Gal thường nằm trong ATPS. Axit nucleic cũng được phát hiện trong ATPS. TPS từ

@

một số nguồn trà cũng mang các nguyên tố đất hiếm (REE) bao gồm La, Ce và Nd,

ht

trong đó La chiếm hơn 75% tổng số REE. Sắt, magiê, kẽm và selen cũng được phát

rig

hiện trong TPS [28].

py

1.2.1.4. Nhóm sterol và tinh dầu
Dầu từ hạt của các loài trà đã được biết đến từ lâu, với thành phần chính là

Co

sterol và acid béo. Theo một nghiên cứu của Wang Xin và cộng sự năm 2017 có thể
thấy rằng C. sinensis và các loài khác có thành phần sterol như sau: các loại dầu C.

9


sinensis có hàm lượng tương đối cao của canophyllol (38), 24-methylenecycloartan-

VN
U

3-ol (39), spinasterol (40) và (-)sitosterol (41); dầu C. oleifera có hàm lượng tương
đối cao của (-)amyrin (42) và stigmast-7-en-3-ol (43); các loại dầu C.
chekiangoleosa



hàm

lượng

tương

đối

cao

của

betulin

(44),

24-

ac
y,

methylenecycloartan-3-ol (45), amyrin (46) và stigmast-7-en-3-ol (47). Trong khi
đó lupanol (48) và obtusifoliol (49) chỉ được phát hiện trong dầu C. magnocarpa từ

dP
ha
rm

Quảng Châu - Ngô Châu, Trung Quốc [43].
1.2.1.5. Nhóm acid amin và vitamin

Các loài thuộc chi Camellia cũng chứa nhiều vitamin, đặc biệt là vitamin C,
mang lại tác dụng giải nhiệt và chống oxi hóa của trà [38].

Trong khi đó, theanin (29) là axit amin đặc trưng và chính trong trà [25].

an

1.2.2. Thành phần hóa học của các loài Trà hoa vàng

ine

1.2.2.1. Nhóm polyphenol

Nhóm polyphenol được coi là nhóm chất quan trọng nhất trong Trà hoa

ed
ic

vàng do các tác dụng sinh học nổi bật của chúng.

Nghiên cứu năm 2013 của Jia-Ni Lin và cộng sự trên 6 loài Trà hoa vàng là

M

Camellia murauchii, Camellia impressinervis, Camellia euphlebia, Camellia

of

tunghinensis, Camellia nitidissima var. microcarpa và Camellia nitidissima đã phát
hiện 8 loại catechin là (-)-epigallocatechin gallat (EGCG) (12), (-)-epigallocatechin

ho
ol

(EGC) (8), (-)-epicatechin gallat (ECG) (11), (-)-epicatechin (EC) (6), (+)-catechin
(C) (5), (-)-gallocatechin (GC) (7), (-)-gallocatechin gallat (GCG) (10), (-)-catechin

Sc

gallat (CG) (9) [44].

Bên cạnh đó, các flavonol như quercetin (50), kaempferol (51), myricitin

@

(52) và các glycosid của chúng như myricetin-3-glucosid (53), kaempferol-3-

ht

glucosid (54), quercetin-3- hamnoglucosid (55),… cũng được tìm thấy, trong đó

rig

flavonol glycosid chiếm 2 đến 3% chất rắn chiết xuất tan trong nước của trà [13],

Co

py

[27], [41], [44].

10


OH

HO

O

OH
HO

OH

OH

OH

OH
OH

OH

OH

OH

HO

OH

O

OH

O
OH

OH O

ine

(-) – Epigallocatechin gallat

M
of

OH

OH

O

Sc

@
ht

Kaempferol-3-glucosid
(54)

HO

O
OH

O

OH

OH
O

OH

O

OH
OH O

OH O

OH
OH

OH

Myricetin-3-glucosid (53)
Hình 1.1. Một số polyphenol chính

Co

py

rig

OH

OH

OH

Myricitin (52)

OH

O

OH

HO

ho
ol

O

O

OH

OH

HO

O

OH

Kaempferol (51)

(12)

O

OH

ed
ic

OH

OH

OH

OH

OH

OH

O

OH

(11)

HO

an

O

O

(-) – Epicatechin galltat

dP
ha
rm

(-) – Epigallocatechin (8)

Catechin (5)

OH

O

O

OH

HO

O

OH

ac
y,

HO

OH

VN
U

OH

OH

11

Quercetin (50)


1.2.2.2. Nhóm saponin

VN
U

Các saponin (triterpenoid saponin) là nhóm chất được tìm thấy từ tất cả các
bộ phận của cây, trong đó bộ phận phân lập được nhiều nhất là hạt. Các saponin đại
diện như camelliasid A, B (19);…[12].

ac
y,

1.2.2.3. Nhóm tinh dầu

Từ loài C. nitidissima, các nhà khoa học Trung Quốc đã phân lập được 56

dP
ha
rm

chất tinh dầu từ lá và 34 chất từ hoa. Các tinh dầu chính là linalool (56), phytol (57),
cis-geranyl aceton (58), n-hexanal (59), methyl salicylat (60), eudesmol (61),…
[41].

CH3

an

CH3

H3 C

CH3
OH
CH3

O

ine

H
CH2

ed
ic

Eudesmol (61)

OH

ho
ol
Sc
@
ht

N

n-Hexanal (59)

HO

CH3

CH2
H3 C

CH3

Linalool (56)

Co

py

Hình 1.2. Một số tinh dầu chính

12

CH3

cis-Geranyl aceton (58)

O

Methyl salicylat (60)

rig

CH3

H3C

of

O

CH3

M

O

CH3

OH


1.2.2.4. Nhóm acid amin

VN
U

Cũng trong nghiên cứu của Jia-Ni Lin và cộng sự đã phát hiện các acid amin
trong 6 loài trà hoa vàng như GABA (62), theanin (63), Arg (64), Glu (65), Tyr
(66), Trp (67), Thr (68),…[27].

ac
y,

GABA (Gamma-Aminobutyric Acid) (62) là một dẫn truyền thần kinh quan
trọng với hoạt động chính trong hệ thống thần kinh trung ương của động vật có vú.

dP
ha
rm

Trong nghiên cứu này, C. euphlebia có hàm lượng GABA cao nhất trong số sáu loài
[27].

Theanin (63) là một axit amin tự do được tìm thấy độc quyền trong cây trà.
Nó là một thành phần chính chịu trách nhiệm cho vị ngọt và hương vị umami của
trà, đồng thời sở hữu một số tác dụng dược lý. Kết quả nghiên cứu cho thấy C.

an

nitidissima var. microcarpa có hàm lượng theanin cao nhất trong số sáu loài được

O

ine

nghiên cứu [27].

N
H

NH2

GABA (62)

O

OH
NH2
Theanin (63)

O

of

O

ho
ol

HO

OH

OH

NH2

Sc
@
ht
rig

Tyr (66)

O

OH

OH

O

H3C

NH2

OH
NH2

Trp (67)

Thr (68)

Hình 1.3. Một số acid amin chính

Co

N
H

NH2

HO

Glu (65)

py

O

N
H

OH

M

H2N

O

ed
ic

O

13


1.3. Tác dụng sinh học

VN
U

1.3.1. Tác dụng chống oxi hóa

Các nghiên cứu về hoạt tính chống oxi hóa của các loài thuộc chi Camellia,
đặc biệt là trà xanh đã được thực hiện từ lâu, cả trong nước và quốc tế. Từ kết quả

ac
y,

các nghiên cứu cho thấy tác dụng chống oxi hóa của trà là do hoạt tính của các hợp
chất nhóm polyphenol, đây cũng là nhóm chất đặc trưng của Trà hoa vàng.

dP
ha
rm

Nghiên cứu năm 2014 về tác dụng chống oxi hóa của loài Camellia
chrysantha (Hu) Tuyama đã tìm thấy các chất có tác dụng chống gốc tự do, theo thứ
tự tác dụng là glucopyranosid > catechin > epicatechin > kaempferol > vitexin >
isovitexin [44].

Một nghiên cứu năm 2017 so sánh khả năng chống gốc tự do của các

an

catechin với các chất chống oxi hóa khác (các flavonoid, vitamin C) cho thấy khả

ine

năng bắt các gốc tự do của catechin cao hơn các chất cùng so sánh. Trong đó (+)catechin và (-)-epicatechin là những hợp chất hiệu quả nhất trong việc bảo vệ chống

ed
ic

lại sự tan máu hồng cầu do AAPH (2,2'-Azobis (2-amidinopropan) dihydrochlorid),
trong khi (-)-epicatechin gallat, (-)-epigallocatechin gallat và (-)-epigallocatechin

M

chống tan máu do thuốc. (-)-Epigallocatechin gallat và (-)-epicatechin gallat có

of

hiệu quả nhất trong việc ức chế quá trình oxy hóa do AAPH gây ra bởi 2'7'dichlorodihydroflurescein có trong hồng cầu [16].

ho
ol

Trong nghiên cứu của Wang Bing và cộng sự năm 2018 đã cho thấy tác dụng
chống oxi hóa và bắt gốc tự do của thành phần tinh dầu và chiết xuất ethanol của

Sc

Camellia nitidissima. Bằng cách so sánh chỉ số IC50 của tinh dầu hoa và lá cây,
chiết xuất ethanol với vitamin C trong các test DPPH (2,2-diphenyl-1-

@

picrylhydrazyl) và ABTS (2,2’- azino-bis(3-ethylbenz -thiazoline-6-sulfonic acid),

ht

đã cho thấy tác dụng tương đương [41].
1.3.2. Tác dụng chống ung thư

rig

Nghiên cứu năm 2016 của Małgorzata Kujawska và các cộng sự về tác dụng

py

của chiết xuất Camellia sinensis chống lại tác nhân gây ung thư gan là N-

Co

nitrosodiethylamine (NDEA) ở chuột bằng cách sử dụng phương pháp mô học và

14


sinh hóa đã cho kết luận rằng điều trị bằng chiết xuất của lá trà cho tác dụng bảo

VN
U

vệ một phần gan chuột khỏi bệnh ung thư tế bào gan do NDEA gây ra [22].

Độc tính lên tế bào của trà hoa vàng đã được thử nghiệm in vitro lên tế bào
ung thư vú của người MDA-MB231. Sau 48 giờ điều trị với 100−800 g / mL chiết

ac
y,

xuất từ lá hoa trà vàng, Tỷ lệ ức chế khả năng sống của tế bào tại 800 μg / mL dao
động từ khoảng 80% ở C. tunghinensis đến khoảng 25% ở C. impressinervis và C.

dP
ha
rm

nitidissima var. microcarpa, theo thứ tự C. tunghinensis> C. murauchii>
C.euphlebia> C. nitidissima> C. nitidissima var. microcarpa> C. impressinervis
[27].

FASN được xác định là đóng một vai trò quan trọng trong quá trình tạo mỡ
và ung thư tiến triển. Để làm sáng tỏ tác dụng của lá hoa Trà hoa vàng với sinh tổng

an

hợp axit béo, một nghiên cứu đã được thực hiện . Kết quả nghiên cứu cho thấy điều

ine

trị với 400 g / mL lá hoa trà vàng C. nitidissima có tác dụng ức chế tốt đối với
FASN . Ức chế FASN làm suy giảm sự phát triển và tăng sinh tế bào khối u bằng

ed
ic

một số cơ chế như ngăn chặn cung cấp năng lượng, xáo trộn chức năng màng, ức
chế sao chép DNA… Ngoài ra chiết xuất Trà hoa vàng còn được chứng minh là có

M

khả năng khởi động quá trình chết theo chu trình của tế bào ung thư [27].
1.3.3. Tác dụng kháng khuẩn

of

Hai vi khuẩn gram dương (S. aureus và B. subtilis) và hai vi khuẩn gram âm

ho
ol

(E. coli và P. aeruginosa) được chọn để đánh giá các hoạt động diệt khuẩn trong in
vitro của tinh dầu và chiết xuất ethanol C. nitidissima trên đĩa thạch agar loãng. Các

Sc

giá trị MIC cho thấy hiệu quả kháng khuẩn đáng kể khi so sánh với ampicillin và
tobramycin, trong đó phần tinh dầu hiệu quả hơn với S. aureus, B.subtilis và E. coli

@

(các giá trị MIC lần lượt là 0,625; 1,25 và 1,25 mg/mL), nhưng không chống lại P.

ht

aeruginosa (MIC 10,0 mg/mL). Chiết xuất ethanol của C. nitidissima thể hiện hiệu
quả tốt hơn với hai chủng vi khuẩn gram dương [41].

py

rig

1.3.4. Tác dụng giảm cân và làm đẹp
Nhóm catechin (EG, EC, ECG, EGCG,…) được biết đến là nhóm chất chính

Co

tạo nên tác dụng giảm cân và làm đẹp của trà. Một nghiên cứu về việc sử dụng
catechin liều cao chiết xuất từ trà xanh trên đối tượng phụ nữ béo bụng cho thấy sau

15


12 tuần điều trị mang lại hiệu quả giảm cân đáng kể, giảm chu vi vòng eo, giảm

VN
U

nồng độ cholesterol và LDL trong huyết tương. Bên cạnh đó không có tác dụng phụ
hoặc tác dụng bất lợi nào được ghi nhận. Trong đó, EGCG là catechin dồi dào nhất
và được coi là thành phần có hoạt tính sinh học cao nhất để giảm trọng lượng cơ

ac
y,

thể, bằng cách giảm sự biệt hóa và tăng sinh tế bào mỡ trong quá trình tạo mỡ [8].
1.3.5. Tác dụng theo y học cổ truyền

dP
ha
rm

Theo cuốn “Từ điển cây thuốc Việt Nam” của Võ Văn Chi, Trà hoa vàng
được sử dụng để chữa bệnh kiết lỵ, các bệnh chốc lở [1].

Ở Trung Quốc, ngoài việc pha trà, làm cây cảnh, Trà hoa vàng được sử
dụng rộng rãi như một loại thuốc Trung y để điều trị chứng bệnh khác nhau, chẳng

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho
ol

of

M

ed
ic

ine

an

hạn như kiết lỵ, đau họng, tăng huyết áp và phòng chống ung thư [9], [17], [45].

16


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

VN
U

2.1. Nguyên liệu và thiết bị

dP
ha
rm

ac
y,

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Hình 2.2. Hình ảnh mẫu dược liệu

ine

an

Hình 2.1. Hình ảnh lá và hoa Trà hoa
vàng Cúc Phương [2].

ed
ic

- Nơi thu hái: Vườn quốc gia Cúc Phương, huyện Nho Quan, tỉnh Ninh Bình, Việt
Nam.

- Thời điểm thu hái: 26/02/2018.

M

Mẫu thực vật được giám định bởi Thạc sĩ Nguyễn Anh Đức, đại diện Tổ

of

giám định mẫu, Bảo tàng Thực vật, Khoa Sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên, Đại
học Quốc gia Hà Nội. Kết quả cho thấy mẫu dược liệu có tên khoa học là Camellia

ho
ol

cucphuongensis Ninh & Rosmann, thuộc chi Camellia, họ Chè – Theaceae. Mẫu
cây được lưu tại Bảo tàng Thực vật, số hiệu mẫu HNU 024061(xem phụ lục 1).

Sc

2.1.2. Nguyên vật liệu nghiên cứu
2.1.2.1. Dụng cụ, thiết bị, máy móc

@

- Tủ sấy Memmert, Binder-FD115.

ht

- Các dụng cụ thí nghiệm thường quy: cốc có mỏ, bình nón, ống nghiệm, đũa thuỷ

rig

tinh, pipet, bình gạn, phễu lọc, giấy lọc…
- Máy cô cách thủy GFL.

py

- Cân kỹ thuât Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR.

Co

- Đèn soi từ ngoại hai bước sóng 254 nm và 365 nm.

17


- Pha tĩnh dùng trong sắc ký cột: silica gel pha thường cỡ hạt 0,063-0,200 mm

VN
U

(Merck), (0,040 - 0,063 mm, Merck); Sephadex LH-20 (Amersham Bioscience,
Uppsala, Thụy Sỹ). Bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck) (silica gel,
0,25 mm) và bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck, 0,25 mm)...

ac
y,

- Sắc ký cột: các loại cột sắc ký có kích cỡ khác nhau.

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được ghi trên máy Bruker Avance 500MHz tại

2.1.2.2. Hóa chất, dung môi

dP
ha
rm

Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

- Dùng trong nghiên cứu thành phần hóa học: TT Mayer, TT Dragendorff, TT
Bouchardat, TT diazo mới pha, FeCl3 5%, geletin 1%, chì acetat 5%, TT Legal,
dung dịch natri nitroprussiat, TT ninhydrin 3%, ethanol 96%, dicloromethan, ether,

an

acid formic, acid chlohidric, acid sulfuric,…

ine

- Dung môi hóa chất dùng để chiết xuất và phân lập: ethanol (EtOH) 96%, n-hexan
(Hx), ethyl acetat (EtOAc), methanol (MeOH), dichloromethan (DCM), aceton

ed
ic

(Ace)... đạt tiêu chuẩn tinh khiết.
2.2. Phương pháp nghiên cứu

M

2.2.1. Phương pháp định tính các nhóm chất
Định tính sơ bộ các nhóm chất có trong lá Trà hoa vàng Cúc Phương: tiến

ho
ol

chất theo tài liệu.

of

hành định tính các nhóm chất bằng các phản ứng hóa học đặc trưng cho từng nhóm
2.2.2. Phương pháp chiết xuất và phân lập

Sc

Phương pháp chiết xuất và phân lập các chất từ lá Trà hoa vàng Cúc

Co

py

rig

ht

@

Phương được thể hiện trong sơ đồ Hình 2.3 sau đây:

18


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×

×