Tải bản đầy đủ

Nghiên cứu định lượng atractylenolide III trong thân rễ bạch truật (atractylodes macrophala koidz) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao bắt cặp detector dad

VN
U

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

dP
ha
rm

ac
y,

KHOA Y DƯỢC

ine

an

TRẦN NGỌC TUÂN

M


ed
ic

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ATRACTYLENOLIDE III TRONG
THÂN RỄ BẠCH TRUẬT (Atractylodes macrophala Koidz) BẰNG SẮC
KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO BẮT CẶP DETECTOR DAD

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho
ol

of

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI – 2019


KHOA Y DƯỢC

ac
y,

Người thực hiện : TRẦN NGỌC TUÂN

VN
U

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

dP
ha
rm

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ATRACTYLENOLIDE III TRONG
THÂN RỄ BẠCH TRUẬT (Atractylodes macrophala Koidz) BẰNG SẮC
KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO BẮT CẶP DETECTOR DAD

Khóa: QH2014.Y
Người hướng dẫn:

ed
ic

TS. Hoàng Lê Sơn

ine

an

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho
ol

of

M

PGS.TS. Nguyễn Thanh Hải

HÀ NỘI – 2019


LỜI CẢM ƠN

ac
y,

VN
U

Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới Tiến sĩ Hoàng
Lê Sơn – Khoa Bào chế Chế biến và PGS.Tiến sĩ Nguyễn Thanh Hải – Chủ nhiệm
bộ môn Bào chế khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện Dược Liệu là những
người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện
khóa luận này.

dP
ha
rm

Tôi xin cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Bào chế - khoa Y Dược, Đại học Quốc gia
Hà Nội và khoa Bào chế Chế biến – Viện Dược Liệu, đã tạo điều kiện để tôi có thể
thực hiện khóa luận này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm, các Phòng ban khoa Y Dược, Đại học
Quốc gia Hà Nội cùng toàn thể các thầy cô giáo trong khoa đã cho tôi những kiến
thức quý báu trong suốt những năm học tập, sinh hoạt và rèn luyện tại khoa.

ine

an

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh,
động viên tôi trong lúc khó khắn cũng như trong quá trình thực hiện khóa luận này.

tháng

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho
ol

of

M

ed
ic

Hà Nội, ngày

Trần Ngọc Tuân

năm 2019


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Giới hạn phát hiện (Limit Of Detection)

LOQ

Giới hạn định lượng (Limit Of Quantitation)

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu
Chromatography)

DAD

Máy đo quang (Diode Array Detector)

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối

ACN

Acetonitrile

USP

Dược điển Hoa Kì

ICH

Hội nghị quốc tế về hài hoà hoá các thủ tục đăng ký dược phẩm sử
dụng cho con người

an
ine
ed
ic
M
of
ho
ol
Sc
@
ht
rig
py
Co

(High

Performance

dP
ha
rm

cao

Liquid

ac
y,

năng

VN
U

LOD


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Số trang

1

Hóa chất thuốc thử dùng trong nghiên cứu.

2

Trang thiết bị, máy móc sủ dụng trong nghiên cứu.

16

3

Kết quả sắc ký đồ khảo sát hệ dung môi pha động với các
chương trình chạy đẳng dòng bằng HPLC-DAD, bước sóng
phát hiện là 220nm.

4

Kết quả diện tích pic của các lần chiết mẫu Bạch truật với
Ethanol 96% khi phân tích bằng HPLC-DAD.

17

5

Các thông số đánh giá HPLC đối với Atractylenolide III.

18

6

Kết quả độ tuyến tính của phương pháp HPLC định lượng
Atractylenolide III với dãy nồng độ chuẩn.

20
21

7

Kết quả đánh giá tính thích hợp hệ thống của phương pháp
định lượng Atractylenolide III với mẫu chuẩn nồng độ
26µg/ml.

8

Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp định lượng
Atractylenolide III với mẫu Bạch truật chiết với Ethanol 96%.

22

9

Kết quả đánh giá độ thu hồi của phương pháp định lượng
trong mẫu thử thêm chuẩn Atractylenolide III.

22

10

Kết quả xác định hàm lượng Atractylenolide III trong mẫu
Bạch truật Việt Nam và Trung Quốc.

23

9

M

ed
ic

ine

an

dP
ha
rm

ac
y,

9

of

ho
ol

Sc
@
ht
rig
py
Co

VN
U

Tên bảng

Bảng


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Tên hình

Số trang

VN
U

Hình

Công thức cấu tạo một số chất chính trong cây bạch truật.

4

2

Công thức cấu tạo của Atractylenolide III.

7

3

Sắc ký đồ phân tích ở bước sóng 220nm - 254nm và bước
sóng hấp thụ cực đại của Atractylenolide III.

15

4

Sắc ký đồ HPLCđánh giá độ đặc hiệu của phương pháp
định lượng Atractylenolide III với mẫu thử, mẫu thử
thêm chuẩn và mẫu chuẩn.

28

5

Sắc ký đồ HPLC của Atractylenolide III với nồng độ lần
lượt là 0,065µg/ml và 0,65µg/ml.

19

6

Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và
diện tích pic của dung dịch chất chuẩn Atractylenolide
III.

20

7

Sắc ký đồ phân tích Atractylenolide III trong mẫu Bạch
truật bằng HPLC-DAD.

24

8

Phổ hấp thụ UV của thành phần khác trong mẫu Bạch
truật Việt Nam.

24

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho
ol

of

M

ed
ic

ine

an

dP
ha
rm

ac
y,

1


MỤC LỤC

VN
U

MỞ ĐẦU ...............................................................................................................................1
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN................................................................................................2

ac
y,

1.1. Giới thiệu chung về cây bạch truật .................................................................................2
1.1.1. Tên khoa học ............................................................................................................2

dP
ha
rm

1.1.2. Mô tả thực vật, bộ phận dùng ..................................................................................2
1.1.3. Phân bố, thu hái và chế biến ....................................................................................2
1.1.4. Thành phần hóa học .................................................................................................3
1.1.5. Tác dụng dược lý .....................................................................................................5

an

1.2. Tổng quan về vị thuốc Bạch thuật ..................................................................................7

ine

1.3. Vài nét về hoạt chất Atractylenolide III ..........................................................................8
1.4. Các nghiên cứu định lượng Atractylenolide III trong cây bạch truật .............................8

ed
ic

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 9
2.1. Đối tượng nghiên cứu................................................................................................... 9

M

2.2. Trang thiết bị, dung môi, hóa chất ............................................................................... 9

of

2.3. Phương pháp nghiên cứu.............................................................................................. 10
2.3.1. Khảo sát điều kiện sắc ký ..................................................................................... 10

ho
ol

2.3.2. Phương pháp xử lý mẫu ........................................................................................ 10
2.3.3. Thẩm định quy trình phân tích.............................................................................. 10

Sc

2.3.4. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả ................................................................ 13
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ ................................................................................................... 15

@

3.1. Xây dựng phương pháp định lượng Atractylenolide III .............................................. 15

ht

3.1.1. Xác định bước sóng phát hiện của chất chuẩn Atractylenolide III....................... 15

rig

3.1.2. Xây dựng điều kiện sắc ký trên mẫu Bạch truật bằng HPLC-DAD ..................... 15

Co

py

3.1.3. Xác định điều kiện tối ưu hóa xử lý mẫu.............................................................. 17
3.1.4. Điều kiện chạy sắc ký HPLC ................................................................................ 17

3.2. Thẩm định phương pháp phân tích .............................................................................. 18


3.2.1. Tính đặc hiệu của phương pháp ............................................................................ 18

VN
U

3.2.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ........................................................... 19
3.2.3. Độ tuyến tính ........................................................................................................ 19
3.2.4. Độ thích hợp của hệ thống .................................................................................... 21

ac
y,

3.2.5. Độ lặp lại ............................................................................................................... 21
3.2.6. Độ đúng................................................................................................................. 22

dP
ha
rm

3.3. Ứng dụng phương pháp xác định hàm lượng dược chất trong củ Bạch truật .............. 23
CHƯƠNG 4 - BÀN LUẬN ................................................................................................ 25
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .............................................................................................. 26

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho
ol

of

M

ed
ic

ine

an

TÀI LIỆU THAM KHẢO


MỞ ĐẦU

VN
U

Bạch truật là vị thuốc từ loài Atractylodes macrocephala Koidz (Họ
Compossitae), có vị trí quan trọng trong các bài cổ phương hoặc đơn độc tại Đông
Á trong hơn một ngàn năm nay để điều trị một số chứng bệnh như đau dạ dày, bụng

ac
y,

trướng đầy, ung thư, chứng loãng xương và béo phì. Khoảng hơn bảy mươi hợp
chất được xác định cấu trúc hóa học trong đó đa phần thuộc về nhóm

dP
ha
rm

sesquiterpenoid, phenolic acid và polyacetylene nhưng mối liên hệ với tác dụng trên
lâm sàng là chưa rõ ràng. Cả chất tinh khiết lẫn cao dịch chiết đều thể hiện tác dụng
dược lý mạnh như cải thiện hệ tiêu hóa thông qua thế bào IEC-6, kháng một số
dòng tế bào ung thư gồm HepG2, LOVO, CEM, và MKN-45, kích thích miễn dịch,
kháng viêm, chống oxy hóa, và cải thiện khả nhớ của chuột. Với những lợi ích trên

an

lâm sàng và hiệu quả điều trị đã được chứng minh, cây Bạch truật bắt đầu di thực về

ine

Việt Nam từ những năm 1970 và giờ được trồng phổ biên tại Lào Cai, Sơn La, Hà
Giang, Hà Nội và Lâm Đồng. Hiện tại, các nghiên cứu công bố về hàm lượng dược

ed
ic

chất có trong Bạch truật di thực vẫn còn hạn chế. Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài
“Nghiên cứu định lượng Atractylenolide III trong thân rễ bạch truật

M

(Atractylodes macrophala Koidz) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao bắt cặp

-

of

detector DAD” với hai mục tiêu dưới đây:
Xây dựng phương pháp định lượng Atractylenolide III trong thân rễ cây

-

ho
ol

Bạch truật bằng phương pháp HPLC-DAD.
Ứng dụng phương pháp để định lượng hàm lượng Atractylenolide III trong

Sc

mẫu Bạch truật Việt Nam và Trung Quốc.

@

Lựa chọn chất nghiên cứu là Atractylenolide III giữa các hoạt chất chính thể hiện
tác dụng bảo vệ đường tiêu hóa, chống loãng xương, cải thiện trí nhớ, và kháng

ht

viêm trên các mô hình dược lý được giải thích như sau. Hàm lượng Atractylenolide

rig

III thấp hơn so với atractylenolide I và II có thể gây khó khăn quá trình định lượng

py

nhưng điều này phản ảnh một thực tế tác dụng của cao dịch chiết Bạch truật lại tốt
hơn đơn chất riêng biệt. Kiểm soát chất nhỏ hơn sẽ có lợi ích hơn trong trường hợp

Co

này.

1


CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN

VN
U

1.1. Giới thiệu chung về cây bạch truật
1.1.1. Tên khoa học.

ac
y,

Bạch truật có tên khoa học là Atractylodes macrocephala Koidz thuộc họ Cúc
(Compossitae) [1].

dP
ha
rm

1.1.2. Mô tả thực vật, bộ phận dùng

Đặc điểm: Cây thảo, sống lâu năm, có thân rễ to, mọc dưới đất. Thân thẳng, cao
0.3-0.8m, đơn độc hoặc phân nhánh ở bộ phận trên, phần dưới thân hóa gỗ. Lá mọc
cách, dài. Lá ở phần dưới của thân có cuống dài, phần trên có cuống ngắn, gốc lá
rộng, bọc lấy thân. Phiến lá xẻ sâu thành 3 thùy, thùy giữa rất lớn, hình trứng tròn,

an

hai đầu nhọn, hai thùy bên nhỏ hơn, hình trứng mũi mác, phần gốc không đối xứng.

ine

Các lá ở gần ngọn thân có phiến nguyên, hình thuôn hoặc hình trứng mũi mác, mép
có răng cưa. Đầu lớn, phần dưới có một lá bắc hình lá xẻ sâu, hình lông chim. Bao

ed
ic

hình chuông, có lá bắc mỏng xếp thành 7 hàng. Lá bắc dưới nhỏ hình trứng tam
giác, to dần ở phía trên. Hoa nhiều, tràng hình ống, phần dưới màu trắng, phần trên

M

màu đỏ tím, xẻ làm 5 thùy hình mũi mác, xoắn ra ngoài. Năm nhị hàn liền nhau (có

of

nhị bị thoái hóa), chỉ nhị hình sợi dẹp. Bầu thon mặt ngoài có lông nhung, màu nâu
nhạt, đoạn trên có lông hình lông chim. Vòi hình chỉ màu tím nhạt đầu nhị xẻ thành

ho
ol

2 thùy nông hình đầu, mặt ngoài có lông ngắn. Quả bế, thuôn, dẹp, màu xám [2].

ngà [2,10].

Sc

Bộ phận dùng làm thuốc: Dùng thân rễ cứng chắc, có dầu thơm nhẹ, ruột màu trắng

@

1.1.3. Phân bố, thu hái và chế biến
Phân bố: Bạch truật trồng chủ yếu ở Trung Quốc. Đến những năm 1970, Bạch truật

ht

đã bắt đầu di thực và hiện nay được trồng tại Lào Cai, Sơn La, Hà Giang, Hà Nội và

rig

Lâm Đồng [2,10].

py

Thu hái và sơ chế: Cây trồng bạch truật thu hái từ cuối tháng 10 đến đầu tháng 11

Co

(thường từ 8-22/11). Lúc thu hoạch, chọn ngày nắng ráo, đất khô, nhổ từng cây nhẹ
nhàng. Sau khi nhổ, lấy dao cất bỏ thân cây đem củ về chế biến [1,10].

2


Chế biến: Bạch truật đã loại bỏ tạp chất, rửa sạch, ủ mềm, thái lát dày, làm khô. Sau

-

VN
U

khi sơ chế có thể tiến hành chế biến 2 loại Bạch truật sau:

Thổ Bạch truật: Lấy bạch truật phiến, dùng bột mịn phục long cán sao đến
khi mặt ngoài có màu đất, rây bỏ đất, cứ 100 kg bạch truật phiến dùng 20 kg

-

ac
y,

bột mịn phục long cán [1].

Bạch truật sao: Lấy cám mật chích, cho vào trong nồi nóng, khi khói bốc lên

dP
ha
rm

thì cho bạch truật phiến vào sao cho đến khi có màu vàng sém, có mùi thơm
cháy, lấy ra rây bỏ cám mật chích, cứ 100 kg bạch truật phiến dùng 40 kg
cám mật chích. Có thể sử dụng cám gạo thay cám mật chích [1].
1.1.4. Thành phần hóa học

an

Thành phần hóa học trong cây bạch truật đã được xác định cấu trúc gồm 67 hoạt
chất chính thuộc chia vào các nhóm sau: Sesquiterpenoids, triterpenoids,

ine

polyacetylenes, coumarins, phenylpropanoids, flavonoids, và flavonoid glycosides.

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho
ol

of

M

hơn trong cây bạch truật [7].

ed
ic

Ngoài ra, hai nhóm steroid và benzoquinones gồm có 4 hoạt chất chiếm tỉ lệ thấp

3


VN
U
ac
y,
dP
ha
rm
an
ine
ed
ic
M
of
ho
ol
Sc
@
ht
rig
py
Co

Hình 1: Công thức hóa học một số chất chính trong cây Bạch truật.
4


1.1.5. Tác dụng dược lý

VN
U

Cải thiện chức đường tiêu hóa: Trong thử nghiệm lâm sàng trên chuột sử dụng cao
bạch truật với hàm lượng 0,035 g/kg và 0,105 g/kg cho kết quả cải thiện trọng
lượng của chuột, và thúc đẩy khả năng tiêu hóa của vi khuẩn đường ruột [2,7].

ac
y,

Hoạt động chống khối u: Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng trên người mắc ung thư,
những người sử dụng cao ethanol bạch truật (1 – 4 mg/ml) trong 24 giờ cho thấy

dP
ha
rm

giảm đáng kể các tế bào ưng thư [2,7].

Tác dụng điều hòa miễn dịch: Các nghiên cứu trước đây đã phát hiện ra rằng khi sử
dụng bạch truật cho tác dụng điều hòa miễn dịch. Bột bạch truật dùng đường uống
với liều rất cao (1g/kg) sử dụng cho heo con trong 30 ngày cho kết quả tăng sinh tế

an

bào lympho ngoại biên, chỉ số tăng trọng, nồng độ immunoglobulin G (IgG) trong
huyết thanh, nồng độ IL-1 và IL-2, và biểu hiện mRNA PR-39. Những chỉ số này

ine

cho thấy rằng bạch truật có thể cải thiện sự trao đổi chất và chức năng miễn dịch

ed
ic

của heo con [2,7].

Tác dụng chống viêm: Thử nghiệm trên những con chuột bị viêm đại tràng cấp tính

M

do dextran sulfate gây ra, nghiên cứu sử dụng cao chiết bạch truật (100mg/kg) đã
làm giảm biểu hiện của những yếu tố viêm như COX-2, iNOS, IL-1β, TNF-α, NF-

of

B. Ngoài ra, những nghiên cứu sử dụng polyacetylenes (25 – 300 mg/kg) trên chuột

ho
ol

có hiện tượng viêm gây ra bởi acetic acid hoặc dimethyl benzene thì trong 3 − 5
ngày đã được tìm thấy để ức chế đáng kể phản ứng viêm [26,7].

Sc

Điều trị bệnh Alzheimer và bảo vệ hệ thần kinh: Trong một mô hình thử nghiệm có
sử dụng cao chiết xuất bạch truật với ethanol (0,5 – 2 mg/kg) được xây dựng để

@

tăng cường trí nhớ, giảm tần suất sai lệch và giảm cholinesterase (AChE). Tác dụng

ht

của cao chiết bạch truật với ethanol có thể cải thiện tình trạng suy giảm trên chuột

rig

già. Ngoài ra, phương pháp điều trị 3 ngày với atractylenolide III (30 µg/ml) được
xây dựng để cải thiện hoạt động của tế bào và ức chế apoptosis. Những tác dụng

py

này cho thấy rằng atractylenolide III có hoạt tính bảo vệ thần kinh quan trọng [4,7].

Co

Tác dụng chống lão hóa và chống oxy hóa: Cao bạch truật được chứng minh là có
hoạt động chống lão hóa và chống oxy hóa trên mô hình chuột. Trên những con
5


chuột sử dụng D-galactose, cao chiết bạch truật ngâm với nước được sử dụng làm

VN
U

tăng hoạt động NO synthase (NOs), tăng sản xuất NO, và giảm hàm lượng lipid
peroxide (LPO) trong mô não. Các điều trị bằng polysacarides (100−200 mg/kg)
cho chuột đã sử dụng D-galactose trong 6 tuần thấy rằng nồng độ MDA và

ac
y,

lipofuscin (Lipo) cũng như hoạt động của monoamtin oxydase (MAO) giảm. Hơn
nữa, điều trị này làm tăng glutathione peroxidase (GSH-Px), CAT, SOD và toàn bộ

dP
ha
rm

năng lượng hoạt động chống oxy hóa (T-AOC). Những tác dụng này cho thấy rằng
polysacarides làm tăng hoạt động chống oxy hóa ở chuột già bằng cách ức chế tạo
ra peroxit lipid và tăng hoạt tính enzyme chống oxy hóa [7].

Điều hòa nội tiết và tác dụng giảm co: Nghiên cứu sử dụng cao methanol bạch truật

an

với liều rất cao 0,5−0,8 g/kg cho chuột gây rối loạn nội tiết bởi testosterone
propionate trong 8 tuần cho thấy cải thiện chu kỳ động dục, mức độ hormone kích

ine

thích nang trứng (FSH) và giảm sự cân bằng của toàn bộ testosterone (TT), chỉ số
androgen tự do (FAI), androstenedione phụ thuộc vào liều dùng. Cao chiết này cũng

ed
ic

tăng kiểm soát biểu hiện của aquaporin-9 (AQP-9) và giảm kiểm soát biểu hiện của
thụ thể FSH (FSHR), vì vậy, cao chiết xuất bạch truật với metanol có thể điều chỉnh

M

tuyến sinh dục sản xuất hoóc môn và làm giảm chứng tăng huyết áp [7].

of

Điều trị béo phì và tăng cường chuyển hóa năng lượng: Những nghiên cứu sử dụng

ho
ol

cao bạch truật (100-300 mg/kg) cho chuột béo phì do chế độ ăn nhiều chất béo
trong 16 tuần dẫn đến giảm trọng lượng cơ thể, nồng độ lipid gan và nồng độ
cholesterol toàn phần trong huyết thanh. Phương pháp sử dụng cao chiết bạch truật

Sc

này dẫn đến sự tăng nồng độ insulin, và không dung nạp glucose. Những hiệu ứng

@

này cho thấy rằng bạch truật có thể ngăn ngừa béo phì. Hơn nữa, sử dụng cao bạch
truật (0,2 − 1,0 mg/ml) đến các tế bào C2C12 trong 24h tăng đáng kể giải phóng

ht

glucose, sự biểu hiện của PGC1α và palmitoyltransferase 1b chuyển hóa khoáng

rig

chất (CPT). Hơn nữa, cao bạch truật cũng làm giảm hàm lượng axit béo tự do

py

(FFA). Khi kết hợp với nhau, những tác động này cho thấy bạch truật có thể kích

Co

thích chức năng ty thể và chuyển hóa năng lượng trong các mô cơ [2,7].
Tác dụng chống loãng xương: Nghiên cứu thử nghiệm trên các đại thực bào chuyển
hóa từ tủy xương và chuột bị tác động bởi thụ thể của phối tử NF-κB (RANKL; một
6


cytokine thiết yếu thúc đẩy biệt hóa tế bào tiền hủy xương thành tế bào hủy xương),

VN
U

việc sử dụng cao chiết xuất bạch truật với ethanol cho thấy ức chế sự phân hóa tế
bào hủy xương [7].

Hoạt tính kháng khuẩn: Cao bạch truật cũng đã được chứng minh là có hoạt động

ac
y,

kháng khuẩn. Nghiên cứu sử cao chiết bạch truật (5-40 mg/ml) với tụ cầu vàng,
E.Coli, và trực khuẩn mủ xanh trong 24 giờ cho thấy để ức chế đáng kể sự phát

dP
ha
rm

triển của các vi khuẩn này [2,7].

Tác dụng lợi niệu: Trên chuột thử nghiệm với cao chiết nước của bạch truật (1 – 10
g/ml) trong 30 phút cho thấy cao chiết có tác dụng ức chế tiểu quản thận tái hấp thu
nước, tăng bài tiết Natri [4,7].

an

1.2. Tổng quan về vị thuốc Bạch thuật

ine

Tính vị quy kinh: Khổ, cam, ôn. Vào kinh Tỳ và Vị [1].

ed
ic

Công năng chủ trị:

Kiện tỳ, ích khí, táo thấp, lợi thủy, cố biểu, liễm hãn, an thai.

M

Chủ trị: Tiêu hóa kém, bụng trướng, tiêu chảy, phù thũng, tự hãn, động thai.

of

Cách dùng: Ngày dùng từ 6–12g, dạng thuốc sắc hoặc bột. Bạch truật sao cám, tẩm
mật ong tăng tác dụng kiện tỳ, sao cháy có tác dụng chỉ huyết [1].

ho
ol

Kiêng kỵ: Đau bụng do âm hư nhiệt trướng, đại tiện táo, háo khát không dùng [1].

py

rig

ht

@

Sc

1.3. Vài nét về hoạt chất Atractylenolide III

Hình 2: Công thức cấu tạo của Atractylenolide III.

Co

Atractylenolide III có công thức phân tử là C15H20O3.

7


Danh pháp IUPAC: (4 S,8 R,9 S)-9 -hydroxy-3,8 -dimethyl-5-methylidene

VN
U

4,4 ,6,7,8,9-hexahydrobenzo(1)benzofuran-2-one.
Tính chất:

Atractylenolide III là dạng bột màu trắng hoặc tinh thể màu trắng.

-

Atractylenolide III tan tốt trong nước, methanol, ethanol, và một số dung môi

ac
y,

-

hữu cơ khác.

Atractylenolide III cho phổ hấp thụ cực đại ở 220nm [27].

dP
ha
rm

-

Tác dụng dược lý: Atractylenolide III có tác dụng bảo vệ thần kinh, dạ dày, chống
ung thư và chống viêm. Hoạt chất Atractylenolide III cũng có tác dụng kiểm soát
miễn dịch bằng cách điều chỉnh chức năng của tế bào IL-6 trong tế bào mast.

an

1.4. Các nghiên cứu định lượng Atractylenolide III trong cây bạch truật

ine

Trong một nghiên cứu của nhóm tác giả Hao Cai và các đồng nghiệp vào năm 2012
đã định lượng hai hoạt chất trong Bạch truật là Atractynolid I và Atractynolid III

ed
ic

với bước sóng cực đại 220nm. Máy Agilent Zorbax Eclipse XDB Cột C-18 (250
mm × 4.6 mm, 5 μm). Tốc độ dòng 1 ml/phút , tiêm 10µl và nhiệt độ cột là 250C.

M

Hệ được sử dụng trong nghiên cứu này là ACN (A) và nước (B) với tỉ lệ 0-10 phút

of

30-60% A; 10-20 phút 60-65% A; 20-25 phút 65-100% A; 25-37 phút 100% A.
Nghiên cứu lựa chọn phương pháp xử lý mẫu với Ethanol 80%, chiết siêu âm trong

ho
ol

30 phút , sau đó lọc để thu được dịch chiết [7,13].
Theo dược điển Hong Kong định lượng được hoạt chất Atractylenolide III trong

Sc

mẫu Bạch truật bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng với điều kiện bước sóng hấp

@

thụ cực đại 220nm, cột silicagen liên kết ODS (5µm, 250 x 4,6mm), tốc độ dòng
1ml/phút và với hệ dung môi Methanol :Nước = 70 :30 trong 25 phút. Mẫu được xử

ht

lý bằng phương pháp siêu âm với 2g bột dược liệu trong 50 ml dung môi Ethanol

rig

70%, siêu âm, có thể tiến hành chiết nhiều lần với thời gian kéo dài phù hợp với

Co

py

mục đích nghiên cứu mẫu [23].

8


CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

VN
U

2.1. Đối tượng nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu: thân rễ khô của Bạch truật với tên khoa học Atractylodes
Liêu Ninh, Trung Quốc do Viện Dược Liệu cung cấp.
2.2. Trang thiết bị, dung môi, hóa chất

dP
ha
rm

Hóa chất – thuốc thử

ac
y,

macrophala Koidz (họ Compossitae). Mẫu có nguồn gốc từ Hà Nội, Việt Nam và

Hóa chất thuốc thử được cung cấp bởi nhà sản xuất có uy tín với độ tinh khiết phù
hợp với mục đích sử dụng.

an

Bảng 1: Hóa chất, thuốc thử dùng trong nghiên cứu.
Nguyên vật liệu

ine

Nguồn gốc

Trung Quốc

ed
ic

Atractylenolide III
Acetonitrile

Độ tinh khiết 98%

Merck-Đức

HPLC

Trung Quốc

PA

Trung Quốc

PA

ho
ol

Thiết bị, dụng cụ

of

Ethanol

M

Methanol

Tiêu chuẩn

Thiết bị máy móc được sử dụng đảm bảo chính xác và độ tin cậy theo thông tin như

Sc

nhà sản xuất.

Tên thiết bị, dụng cụ

ht

STT

@

Bảng 2: Trang thiết bị, máy móc sử dụng trong nghiên cứu.

Shimadzu LC – 20AD

Nhật Bản

2.

Shimadzu SPD – M20A

Nhật Bản

3.

Shimadzu SIL – 20A

Nhật Bản

rig

1.

py
Co

Xuất xứ

9


4.

Shimadzu CTO – 10AS

Nhật Bản

5.

Cột supelco

6.

Máy siêu âm MRC

VN
U
Mỹ

ac
y,

Việt Nam

2.3. Phương pháp nghiên cứu

dP
ha
rm

2.3.1. Khảo sát điều kiện sắc ký

Chúng tôi tiến hành sắc ký với cột Supleco C18(5µm, 250 x 4,6mm), tốc độ dòng
1ml/phút và thể tích tiêm mẫu 20µl để khảo sát bước sóng hấp thụ cực đại và hệ
dung môi pha động.

Khảo sát bước sóng: Tiến hành sắc ký với chất chuẩn Atractylenolide III

an

-

bằng phương HPLC-DAD để tìm ra bước sóng hấp thụ cực đại của chất.
Khảo sát hệ dung môi pha động: Phương pháp khảo sát với các hệ dung môi

ine

-

ed
ic

ACN:Nước và Methanol:Nước.
2.3.2. Phương pháp xử lý mẫu

Dung dịch gốc: Cân chính xác khoảng 1mg chất chuẩn Atractylennolide III

of

-

M

Chuẩn bị mẫu chuẩn:

trong 1ml Methanol trong bình định mức 1ml.
Tiến hành pha dãy chuẩn trong bình định mức 1ml với các nồng độ 104; 52;

ho
ol

-

32,5; 26; 19,5; 13; 6,5; 3,25; 1,675; 0,65 và 0,065µg/ml từ dung dịch mẹ.

Sc

Xử lý mẫu: Cân khoảng 0.2g bột dược liệu chiết với 5ml dung môi Nước, Methanol,

@

và Ethanol 30; 50; 70; 90; 96% bằng phương pháp siêu âm. Sau đó định mức với
bình định mức 5ml bằng dung môi. Lọc dung dịch qua màng 0,45µl trước khi tiến

rig

ht

hành phân tích định lượng.
2.3.3. Thẩm định quy trình phân tích

py

Theo tài liệu “Thẩm định quy trình phân tích: nội dung và phương pháp”

Co

(Validation of analytical procedures: text and methodology) của ICH (International
Conference on Harmonization) ban hành vào tháng 11 năm 2005, các yếu tố của

10


một quy trình phân tích định lượng cần thẩm định gồm: độ đúng, độ chính xác, tính

VN
U

đặc hiệu, tính tuyến tính giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng [5,6,22,25].
Tính đặc hiệu

Khái niệm: Là khả năng phát hiện được chất phân tích khi có mặt các tạp chất khác

ac
y,

như các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự, tạp chất.... Trong phép
phân tích định lượng, là khả năng xác định chính xác chất phân tích trong mẫu khi

dP
ha
rm

bị ảnh hưởng của tất cả các yếu tố khác, nhằm hướng đến kết quả chính xác.
Phương pháp xác định: Sử dụng phương pháp thêm chuẩn sau chuẩn bị mẫu, cách
này thường áp dụng đối với các phương pháp sắc ký. Sau khi chuẩn bị mẫu thử và
phân tích mẫu thử trên thiết bị sắc ký thu được các pic sắc ký, ta thêm chuẩn vào

an

mẫu đã chiết xuất và phân tích mẫu này. So sánh sắc ký đồ của hai mẫu để đánh giá

ine

tính đặc hiệu.

Yêu cầu: Trên sắc ký đồ, pic mẫu thử phải trùng với vị trí của pic chất chuẩn và sắc

ed
ic

ký đồ của chất nền không có pic nào.

M

Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Khái niệm: Giới hạn phát hiện (LOD) của một quy trình phân tích là lượng thấp

of

nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể phát hiện được và không cần phải

ho
ol

xác định chính xác hàm lượng.

Giới hạn định lượng (LOQ) của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của chất

Sc

phân tích có trong mẫu thử có thể định lượng với độ đúng và độ chính xác phù hợp.
Phương pháp xác định: Dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu S/N. LOD là nồng độ mà

@

tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị 2 – 3 và LOQ lại nồng độ mà tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị

ht

gần bằng 10.

rig

Độ tuyến tính

py

Khái niệm: Tính tuyến tính của quy trình phân tích là khả năng luận ra các kết quả
của phương pháp dựa vào đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ đáp ứng của đại

Co

lượng đo được như chiều cao hoặc diện tích pic (y) và nồng độ (x).

11


Tính tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax+b với hệ số tương

VN
U

quan tuyến tính R2.
Phương pháp xác định:
Khảo sát ở ít nhất 5 hoặc 6 mức nồng độ khác nhau.

-

Nồng độ cao nhất và thấp nhất phải nằm trong khoảng xác định của phương
pháp.
Các mẫu được pha loãng từ mẫu chuẩn ban đầu.

dP
ha
rm

-

ac
y,

-

Yêu cầu: Hệ số hồi quy tuyến tính: 0,995 ≤ R2 ≤ 1.
Độ thích hợp hệ thống

an

Khái niệm: Đánh giá độ thích hợp của hệ thống để đảm bảo hệ thống phù hợp để
phân tích. Đánh giá sự phù hợp của hệ thống là các phép thử để chứng minh rằng hệ

ine

thống hoạt động đúng theo mục đích sử dụng.

ed
ic

Phương pháp xác định: Tiêm trực tiếp dung dịch chuẩn nhiều lần lặp lại vào hệ
thống sắc ký và xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD). Số lần bơm tối thiểu 5 lần

M

phải cho RSD nhỏ hơn 2% Nếu RSD lớn hơn 2% cần sử dụng 6 điểm.

of

Yêu cầu: Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích pic và thời gian lưu ≤ 2%.
Độ lặp lại

ho
ol

Khái niệm: Độ lặp lại là sự ổn định trong phương pháp phân tích định lượng mẫu
trong quá trình thực hiện.

Sc

Phương pháp xác định: Trong phân tích hàng ngày, cần thực hiện song song tối

@

thiểu 2 lần nhằm tránh được các sai số ngẫu nhiên gặp phải. Đánh giá mức độ chênh
lệch giữa hai lần làm với giá trị trung bình, sự chênh lệch này phải thỏa mãn theo

ht

yêu cầu của từng phương pháp.

rig

Yêu cầu: Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) ≤ 2%.

Co

py

Độ đúng

12


Khái niệm: Độ đúng của phương pháp là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị

VN
U

trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là
đúng.

Phương pháp xác định: Thêm một lượng chất chuẩn xác định vào mẫu thử hoặc

ac
y,

mẫu trắng, phân tích các mẫu thêm chuẩn đó, làm lặp lại tối thiểu bốn lần bằng

Đối với mẫu thử:

-

Đối với mẫu trắng:

ine

an

-

dP
ha
rm

phương pháp khảo sát, tính độ thu hồi theo công thức sau đây:

ed
ic

Trong đó:
R%: Độ thu hồi %

M

: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn

of

: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử

ho
ol

: Nồng độ chất phân tích trong mẫu chuẩn
: Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn

Sc

Sau đó tính độ thu hồi chung là trung bình của độ thu hồi các lần làm lặp lại.

@

Yêu cầu: Độ thu hồi đạt 98 - 102% và RSD ≤ 2%.
2.3.4. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả

rig

ht

Các số liệu thực nghiệm được xử lý bằng phương pháp thống kê với chương trình

py

Excel thông qua diện tích và thời gian lưu trên peak để xác định giá trị trung bình và

Co

độ lệch chuẩn tương đối (RSD). Công thức áp dụng xử lý kết quả:

13


Trong đó:
là giá trị trung bình của các phép thử, được tính bằng công thức:

ac
y,

SD độ lệch chuẩn của độ đáp ứng. Trong đó SD được tính theo công thức:

dP
ha
rm

-

VN
U

-

an

Công thức sử dụng trên Excel: Sử dụng hàm =stdev/average.

Đánh giá kết quả thông qua các thông số: Hệ số kéo đuôi F, hệ số phân giải R, giá

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho
ol

of

M

ed
ic

ine

trị trung bình và độ lệch chuẩn tương đối RSD.

14


3.1. Xây dựng phương pháp định lượng Atractylenolide III

VN
U

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ

3.1.1. Xác định bước sóng phát hiện của chất chuẩn Atractylenolide III

ac
y,

Tiến hành khảo sát với mẫu chuẩn Atractylenolide III với nồng độ 6.5µg/ml điều
kiênh cột Supleco C18, tốc độ dòng 1ml/phút, chế độ chạy sắc ký gradient dung môi

an

dP
ha
rm

ACN từ 20 đến 80% trong 60 phút. Kết quả thu được như hình 3.

ine

A

B

ed
ic

Hình 3: Sắc ký đồ HPLC và bước sóng hấp thụ cực đại của Atractylenolide III
trong đó: A – sắc ký đồ chất chuẩn ở bước sóng 1- 254nm và 2- bước sóng 220nm;

M

B – Bước sóng hấp thụ cực đại.

of

Kết quả và nhận xét: Chúng ta thấy mẫu hấp thụ cực đại ở bước sóng 220nm. Dựa
vào sắc ký đò, chúng tôi thấy rằng chất chuẩn Atractylenolide III mà chúng tôi sử

ho
ol

dụng hoàn toàn đúng theo tiêu chuẩn nhà sản xuất với độ tinh khiết 98%.

Sc

3.1.2. Xây dựng điều kiện sắc ký trên mẫu Bạch truật bằng HPLC-DAD
Chuẩn bị 1 mẫu thử với phương pháp xử lý mẫu nêu ở trên bằng dung môi Ethanol

@

96%. Tiến hành sắc ký kháo sát pha động với điều kiện sắc ký khảo sát pha động
với cột pha đảo Supleco C18, tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu là 20µl,

Co

py

rig

ht

nhiệt độ phòng 250C và chế độ chạy đẳng dòng. Kết quả thu được như bảng 3:

15


Bảng 3: Kết quả sắc ký đồ khảo sát hệ dung môi pha động với các chương trình

Hệ dung môi

Sắc ký đồ
Dataf ile Name:Et-AMTQ.2.lcd
m AU
220nm ,4nm

MeOH

200

ac
y,

Hệ 1:
Thời gian

150

100

7

50

0
0.0

2.5

0

dP
ha
rm

0-15

VN
U

chạy đẳng dòng bằng HPLC-DAD, bước sóng phát hiện là 220nm.

5.0

7.5

10.0

12.5

m in

tR=13,044

Dataf ile Name:EtOH-AM-ACN-20-80.lcd

Hệ 2:

m AU
254nm ,4nm

5.0

CAN

an

Thời gian

2.5

20

ine

0.0
0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

m in

tR= 27,481

ed
ic

0-30

Datafi l e Name:n-hexan-AM-ACN gradi ent 45-50.lcd

Hệ 3:

100

mAU
220nm,4nm

of

45

ho
ol

0-30

CAN

M

75

Thời gian

Sc

Hệ 4:

@

Thời gian
0-30

CAN
43

50
25
0
0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

min

tR= 19,835
Dataf ile Name:Et-AM-43ACN.5.lcd
25

mAU
220nm,4nm

20

15

10

5

0

5.0

ht

0.0

10.0

15.0

rig

tR= 23,356

Co

py

tR (phút): Thời gian lưu của hoạt chất cần phân tích Atractylenolide III

16

20.0

25.0

min


Kết quả: Chúng tôi thấy hệ dung môi là ACN và Nước tỷ lệ 43:57 cho sắc ký đồ tốt

VN
U

nhất, phân tách rõ ràng, pic không có hiện tượng kéo đuôi, thời gian lưu đủ dài để
rửa giải và không làm pic chồng lên nhau.
3.1.3. Xác định điều kiện tối ưu hóa xử lý mẫu

ac
y,

Chúng tôi tiến hành xử lý mẫu bạch truật với dung môi Nước, Ethanol 30%, 50%,
70%, 96%, Methanol và n-hexane, bằng phương pháp siêu âm. Từ kết quả chạy sắc
mẫu bằng dung môi Ethanol 96% là tốt nhất.

dP
ha
rm

ký lỏng hiệu năng cao với các mẫu được xử lý ở trên, chúng tôi thấy rằng việc xử lý

Tiếp theo, chúng tôi tiến hành xử lý mẫu bạch truật với dung dịch Ethanol 96%
chiết bằng phương pháp siêu âm 3 lần trong 3 giờ. Kết quả thu được dưới bảng 4.

an

Bảng 4: Kết quả diện tích pic của các lần chiết mẫu bạch với Ethanol 96% khi phân

Lần 1

M

Lần 2

ed
ic

Lần chiết

ine

tích bằng HPLC-DAD.
S pic
216030
24229

Lần 3

ho
ol

of

0

Kết quả: Sau 2 lần chiết, hàm lượng dược chất trong dược liệu đã hết hoàn toàn.
Lần chiết thứ 2, diện tich pic bằng 1/10 diện tích pic chiết lần 1.

Sc

Nhận xét: Từ kết quả trên, chúng tôi lựa chọn phương pháp chiết sau âm mẫu Bạch

@

truật 1 lần trong 1 giờ.

ht

3.1.4. Điều kiện chạy sắc ký HPLC

rig

Dựa vào các nghiên cứu trên, chúng tôi đã xác định được điều kiện chạy sắc ký như

Co

py

sau:

-

Cột pha đảo Supleco C18 (5µm, 250 x 46mm).

-

Tốc độ dòng 1 ml/phút.

-

Nhiệt độ phòng 250C.

17


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×

×