Tải bản đầy đủ

Nghiên cứu kết quả điều trị lơ xê mi cấp dòng tủy theo một số bất thường nhiễm sắc thể và gen tại bệnh viện bạch mai năm 2017 2020

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Lơ xê mi cấp là bệnh khá thường gặp, điều trị còn nhiều khó khăn. Cơ
chế sinh bệnh là do rối loạn tăng sinh và biệt hóa tế bào trong quá trình sinh
máu mà nguyên nhân là do các bất thường vật chất di truyền ở mức độ nhiễm
sắc thể và gen trong tế bào gốc tạo máu. Lơ xê mi cấp (LXMC) dòng tủy
chiếm tỉ lệ cao nhất trong lơ xê xê mi cấp. Gần đây, nhờ những hiểu biết về cơ
chế bệnh sinh của bệnh, việc chẩn đoán và điều trị bệnh đã có nhiều tiến bộ.
Tuy nhiên, trong quá trình điều trị còn gặp một nhóm bệnh nhân không đáp
ứng với điều trị, tái phát nhanh, thời gian sống thêm toàn bộ ngắn. Nhiều
nghiên cứu thấy ở những bệnh nhân này có nhiều tổn thương nhiễm sắc thể
hoặc tổn thương gen.
Ứng dụng các kỹ thuật di truyền đã đóng góp nhiều cho công tác chẩn
đoán, điều trị và theo dõi điều trị bệnh. Nhờ các tiến bộ của các kỹ thuật di
truyền, việc xác định nhóm nguy cơ di truyền đã có nhiều thay đổi: bên cạnh
dựa vào phân tích bộ nhiễm sắc thể, còn xác định thêm các bất thường gen để
phân nhóm nguy cơ bệnh lơ xê mi cấp dòng tủy. Dựa vào nhóm phân loại
nguy cơ di truyền, bác sỹ lâm sàng sẽ có các phương án điều trị thích hợp với
người bệnh, nhằm nâng cao chất lượng điều trị cho người bệnh.
Tại Việt nam, đã có một số nghiên cứu về tỉ lệ bất thường nhiễm sắc thể

ở bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng tủy. Tuy nhiên, chưa có nhiều các nghiên cứu
sâu về kết quả điều trị bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng tủy dựa trên bất thường
nhiễm sắc thể và gen.


2

Vì những lí do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:” Nghiên cứu
kết quả điều trị lơ xê mi cấp dòng tủy theo một số bất thường nhiễm sắc thể
và gen tại bệnh viện Bạch mai năm 2017-2020”.
Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài này với 2 mục tiêu sau:
1.

Mô tả một số đặc điểm bất thường di truyền nhiễm sắc thể và gen ở bệnh
nhân lơ xê mi cấp dòng tủy điều trị tại Trung tâm Huyết học-truyền máu,
Bệnh viện Bạch Mai từ năm 2017-2020.

2.

Nghiên cứu kết quả điều trị lơ xê mi cấp dòng tủy theo một số bất
thường di truyền nhiễm sắc thể và gen tại Trung tâm Huyết họctruyền máu, Bệnh viện Bạch mai từ năm 2017-2020.


3

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Một số vấn đề chính trong lơ xê mi cấp dòng tủy
1.1.1. Định nghĩa
Lơ xê mi cấp là một nhóm bệnh đặc trưng bởi sự tăng sinh và tích lũy
trong tủy xương và ở máu ngoại vi của những tế bào tạo máu chưa trưởng
thành, ác tính (blast). Những tế bào này sẽ dần thay thế và ức chế quá trình
trưởng thành và phát triển của các dòng tế bào bình thường trong tủy xương.
Các tế bào non ác tính sẽ lan tràn ra máu ngoại vi, thâm nhiễm các tổ chức
trong cơ thể gây ra các biểu hiện lâm sàng như gan, lách, hạch to.
1.1.2. Dịch tễ
Tỉ lệ mắc bệnh AML khác nhau giữa các nước, ở Mỹ tỉ lệ này là 34/100.000 dân [1]. Ở Nhật tỉ lệ mắc bệnh 4,2/100.000.Tỉ lệ này tăng dần theo
tuổi và tương đối ổn định từ những năm 1960. Tại Mỹ, có khoảng 18.860 ca
mắc mới mỗi năm. Không có sự khác nhau về tỉ lệ mắc bệnh giữa người da
đen và người da trắng ở Mỹ [2].
1.1.3. Bệnh nguyên và cơ chế bệnh sinh của lơ xê mi cấp:[3]
1.1.3.1. Bệnh nguyên[3]
Cho đến nay chưa xác định được nguyên nhân gây lơ xê mi cấp. Các nhà
nghiên cứu ghi nhận một số yếu tố có thể liên quan đến bệnh lý này:
- Hóa chất: các chất nhóm Alkyl, nhóm benzen (những hóa chất có cấu
trúc hóa học nhân vòng).
- Tia xạ hay tia ion hóa: có thể gây tổn thương vật liệu di truyền hoặc
gây suy giảm miễn dịch. Ví dụ: tỉ lệ lơ xê mi cấp cao hơn sau các vụ nổ hạt
nhân hoặc ở nhóm người được điều trị bằng tia xạ.


4

- Virus: HTLV1, HTLV2 có thể gây lơ xê mi tế bào T ở người
- Yếu tố di truyền: có một số bệnh di truyền làm tăng nguy cơ mắc lơ xê mi
cấp: Hội chứng Down, các bệnh thiếu hụt miễn dịch bẩm sinh, thiếu máu Fanconi…
-

Lơ xê mi cấp thứ phát sau hội chứng rối loạn sinh tủy, hội chứng tăng sinh tủy
- Yếu tố môi trường: môi trường bị nhiễm độc do hóa chất, thuốc trừ sâu,
tia xạ…gây nên tình trạng nhiễm độc nguồn nước, thức ăn.
1.1.3.2. Cơ chế gây lơ xê mi từ các bất thường nhiễm sắc thể

-

Do các chuyển đoạn NST:
Chuyển đoạn NST là bất thường phổ biến nhất trong lơ xê mi cấp
Cơ chế bệnh sinh của LXM cấp được cho là do có sự hoạt hóa các gen
kiểm soát sự sinh sản và biệt hóa tế bào thông qua đột biến gen và NST. Hậu
quả là tăng sinh tế bào blast, bất thường chức năng chết theo chương trình
(apoptosis) và suy tủy thứ phát. Ví dụ, đột biến tạo ra gen tổ hợp bcr-abl và
sản phẩm của gen này là protein p190 được coi là một trong những cơ chế gây
bệnh LXM lympho cấp (trong khi đột biến tương tự với sản phẩm là protein
p210 là nguyên nhân gây LXM kinh dòng bạch cầu hạt).

-

Do các mất đoạn NST:
Mất đoạn NST dẫn đến mất hoặc bất hoạt các gen ức chế u, dẫn đến mất
kiểm soát sự phát triển tế bào u gây bệnh lơ xê mi.
Mô hình đột biến kép (double hit model) được cho là mô tả đầy đủ nhất
các khâu trong cơ chế bệnh sinh của LXM cấp. Theo mô hình này, cần không
chỉ một mà phải một số bất thường nhiễm sắc thể (NST) và đột biến gen nối
tiếp nhau, tác động vào quá trình kiểm soát tăng sinh tế bào tạo máu, ngăn
chặn sự biệt hóa của tế bào và ức chế quá trình trình chết bình thường theo
chương trình của tế bào (apoptosis) mới là điều kiện cần và đủ để bệnh nhân
biểu hiện bệnh lý LXM cấp. Các nghiên cứu mới đây còn cho thấy có sự tham
gia của các đột biến gen liên quan đến các phân tử gắn và tương tác tế bào
trong vi môi trường tạo máu của tủy xương cũng như các đột biến liên quan
đến di truyền ngoại gen.


5

1.1.4. Phân loại lơ xê mi cấp dòng tủy
Có hai hệ thống phân loại thường dùng trong lơ xê cấp dòng tủy. Trước
đây thường dùng hệ thống phân loại French-American-British (FAB). Tuy
nhiên, gần đây hệ thống phân loại theo WHO được áp dụng rộng rãi.
1.1.4.1. Phân loại LXM tủy cấp theo FAB 1986
Theo bảng phân loại FAB, LXM cấp tủy được chia ra thành 8 thể (M0-M7)
Bảng 1.1. Phân loại LXM tủy cấp theo FAB kết hợp dấu ấn miễn dịch
Thể
bệnh

Đặc điểm hình thái, hoá học tế bào

Dấu ấn miễn dịch

Tế bào non chưa biệt hóa ≥ 90% các tế bào cóCD34+
M0 nhân không thuộc dòng hồng cầu, không
có thể Auer, <3% MPO+
Tế bào non chưa trưởng thành dòng tủy
HLA-DR, CD13, CD33,
M1 90% các tế bào có nhân không thuộc dòngCD15, CD11±
hồng cầu, hiếm gặp thể Auer, > 3% MPO+
Tế bào non đầu dòng tủy < 90% các tế bào
HLA-DR, CD13, CD33,
M2 có nhân không thuộc dòng hồng cầu, nhiều thểCD15, CD11±
Auer
M3

Lơ xê mi tiền tủy bào cấp
Dưới nhóm: M3v

CD33, CD13, CD15,
CD11

M4

Lơ xê mi tủy-mono cấp
Dưới nhóm: M4eo

HLA-DR, CD34±, CD33,
CD15±, CD14, CD64, CD11

Lơ xê mi mono cấp

HLA-DR, CD34±, CD33,
CD15±, CD14, CD64, CD11

≥ 50% là các tiền thân hồng cầu

Glycophorin A

M5

M6 Blast dòng tủy ≥ 30% các tế bào có nhân

M7

không thuộc dòng hồng cầu
≥ 30% là các tế bào tiền thân dòng mẫu

HLA-DR, CD61, CD42,

tiểu cầu

CD34±, CD33±

1.1.4.2. Phân loại LXM tủy cấp theo WHO
Năm 2001 WHO đưa ra các bảng phân loại mới cho LXM tủy cấp, hội


6

chứng rối loạn sinh tủy, hội chứng tăng sinh tủy mạn ác tính và bệnh lý ác
tính dòng lympho. Các bảng phân loại này tiếp tục được cập nhật và sửa
đổi năm 2008 và 2016. Theo bảng phân loại của WHO, LXM tủy cấp được
phân loại dựa trên các tiêu chí: đặc điểm tế bào di truyền và gen, miễn
dịch và đặc điểm hình thái cũng như tiền sử điều trị.
WHO đưa ra tiêu chuẩn chẩn đoán LXM cấp với tỷ lệ blast 20% tế bào
có nhân trong tủy hoặc máu, đồng thời bổ sung các dưới nhóm LXM cấp như
nhóm có bất thường vật chất di truyền đặc hiệu hay LXM thứ phát.
Phân loại LXM tủy cấp và các bệnh lý tân tạo liên quan của WHO
2016 cụ thể như sau (Bảng 1.2)
Bảng 1.2. Phân loại LXM cấp dòng tủy theo WHO 2016 [4]
a. LXM tuỷ cấp có kèm theo bất thường vật chất di truyền tái diễn:
- LXM tuỷ cấp với t(8;21)(q22;q22); gen RUNX1-RUNX1T1;
- LXM tuỷ cấp với inv(16)(p13.1;q22) hoặc t(16;16)(p13.1;q22); gen
CBFβ/MYH11;
- LXM cấp thể tiền tủy bào với gen PML/RARα;
- LXM tuỷ cấp với t(9;11)(p22;q23); gen MLLT3/KMT2A;
- LXM tuỷ cấp với t(6;9)(p23;q34); gen DEK/NUP214;
- LXM tuỷ cấp với inv(3)(q21;q26.2) hoặc t(3;3)(q21.3;q26.2); gen
GATA2, MECOM;
- LXM tuỷ cấp (dòng mẫu tiểu cầu) với t(1;22)(p13;q13); gen
RBM15-MKL1;
- Thể để xuất bổ sung LXM cấp dòng tủy với BCR-ABL1;
- LXM tuỷ cấp có biến đổi gen NPM1;
- LXM tuỷ cấp có biến đổi gen CEBPA;


7

- Thể đề xuất bổ sung LXM cấp dòng tủy với đột biến RUNX1;
b. LXM tuỷ cấp có liên quan với hội chứng rối loạn sinh tủy;
c. LXM tuỷ cấp có liên quan đến điều trị;
d. LXM tuỷ cấp không xếp loại được theo các cách khác:
- LXM tuỷ cấp có sự biệt hóa tối thiểu;
- LXM tuỷ cấp không có sự trưởng thành;
- LXM tuỷ cấp có sự trưởng thành;
- LXM cấp tủy-mono;
- LXM cấp mono/nguyên bào mono;
- LXM cấp dòng hồng cầu;
- LXM cấp dòng mẫu tiểu cầu;
- LXM cấp dòng bạch cầu hạt ưa base;
- Tăng tế bào tủy cấp kèm theo xơ tủy;
e. Sarcoma tủy;
f. Tăng sinh dòng tủy có liên quan đến hội chứng Down:
- Sinh tủy bất thường thoáng qua (transient abnormal myelopoiesis – TAM);
- LXM cấp dòng tủy liên quan đến hội chứng Down.
g. Tân sản tế bào tua non dạng tương bào;
h. LXM cấp hỗn hợp dòng:
- LXM cấp tế bào không biệt hóa;
- LXM cấp kiểu hình hỗn hợp (mixed phenotype acute leukemia –
MPAL) với t(9;22)(q34.1;q11.2); gen BCR-ABL1;
- MPAL dòng tế bào B/tủy, không phân loại được theo cách khác;
- MPAL dòng tế bào T/tủy, không phân loại được theo cách khác.
1.1.5. Chẩn đoán xác định lơ xê mi cấp dòng tủy:
Chẩn đoán xác định LXM cấp vào biểu hiện lâm sàng và xét


8

nghiêm, cụ thể là:


Lâm sàng: tùy bệnh nhân và thể bệnh mà có thể gặp một triệu chứng hay đầy
đủ các biểu hiện lâm sàng:

-

Hội chứng thiếu máu: da xanh, mệt mỏi, hoa mắt chóng mặt, nhịp tim
nhanh xảy ra nhanh, nặng dần. Mức độ thiếu máu thường không cân xứng
với tình trạng xuất huyết do cơ chế chủ yếu gây thiếu máu ở đây là giảm tổng
hợp hồng cầu trong tủy xương.

-

Hội chứng xuất huyết: xuất huyết tự nhiên, hay gặp ở da và niêm mạc (chấm, nốt,
đám, mảng xuất huyết, chảy máu mũi, chảy máu chân răng …) có thể ở các tạng
(xuất huyết đường tiêu hoá, tiết niệu, sinh dục, não - màng não ...)
Mức độ xuất huyết khác nhau tùy từng bệnh nhân, từ rất nhẹ đến rất
nặng, đe dọa tính mạng người bệnh (như xuất huyết não – màng não).

-

Hội chứng nhiễm trùng: sốt, viêm loét miệng họng, viêm phổi, nhiễm trùng
da…

-

Hội chứng thâm nhiễm: gan lách hạch to, phì đại lợi, thâm nhiễm da, đau
xương



Cận lâm sàng: xét nghiệm tuỷ đồ (hoặc máu ngoại vi) là xét nghiệm quyết
định chẩn đoán: tế bào blast ≥20% tế bào có nhân trong tủy xương hoặc máu
ngoại vi.



Chẩn đoán thể bệnh LXM cấp dựa vào phân loại FAB và phân loại của
WHO.


9

1.1.6. Điều trị lơ xê mi cấp dòng tủy
1.1.6.1. Mục đích điều trị
-

Tiêu diệt tế bào ác tính để đạt được lui bệnh hoàn toàn

-

Tránh tái phát
1.1.6.2. Nguyên tắc điều

-

Phác đồ đa hoá trị liệu.

-

Điều trị làm nhiều đợt: tấn công, củng cố, duy trì

-

Kết hợp điều trị đặc hiệu với điều trị hỗ trợ

-

Trong điều kiện có thể: phối hợp hoá trị liệu với điều trị nhắm đích và ghép tế
bào gốc tạo máu.

-

Điều trị tùy theo nhóm nguy cơ.
1.1.6.3. Điều trị LXM cấp dòng tủy (AML) hiện nay (trừ thể tiền tủy bào)

-

Phác đồ hóa trị liệu tiêu chuẩn bao gồm trong LXM cấp người lớn: điều trị
tấn công (điều trị cảm ứng) bằng phác đồ “3+7”, củng cố bằng cytarabine
liều cao (HIDAC) 3 đợt. Cụ thể như sau:
a. Phác đồ "3+7":
2

- Daunorubicin 60 mg/m /ngày, truyền tĩnh mạch ngày 1-3;
2

- Cytarabine 100-200 mg/m /ngày, truyền tĩnh mạch ngày 1-7.
Thuốc nhắm đích gemtuzumab ozogamicin ( kháng thể đơn dòng chống
CD33 kết hợp kháng sinh chống ung thư calicheamicin phối hợp với phác đồ
“3+7” cũng là một phương án điều trị tấn công được khuyến cáo.
2

b. Phác đồ cytarabine liều cao: cytarabine 3000 mg/m /12 giờ x 2
lần/ngày, truyền tĩnh mạch ngày 1, 3, 5.
-

LXM cấp dòng tủy tiên lượng tốt (có đột biến t(8;21) hoặc inv(16) đáp ứng
tốt với hóa trị liệu được điều trị củng cố theo phác đồ HIDAC (4 đợt). Chỉ
nên cân nhắc ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài nếu tái phát.

-

LXM cấp dòng tủy có tiên lượng xấu: đáp ứng kém với hóa trị liệu nên tiến


10

hành ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài sau lui bệnh hoàn toàn lần 1. Các gen
đột biến mới như FLT3, NPM1, CEBPA, BAALC, ERG đang được nghiên cứu
để cân nhắc sử dụng hóa trị liệu hay ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài sớm.


11

-

Với LXM tủy cấp tái phát hoặc kháng thuốc, có thể sử dụng các phác đồ hóa
trị liệu liều cao như phác đồ FLAG, FLAG-IDA... hoặc các phương pháp
điều trị thử nghiệm. Phác đồ FLAG-IDA:
2

-

Fludarabin 25-30 mg/m truyền tĩnh mạch ngày 1-5

-

Cytarabine 2000 mg/m truyền tĩnh mạch ngày 1-5

-

G-CSF 300 mg/ngày tiêm dưới da từ ngày 6 đến khi phục hồi bạch cầu đoạn

2

9

trung tính trên 1,5 x 10 /L
-

2

Idarubicin 10 mg/m /ngày đường tĩnh mạch ngày 1-3.
1.1.6.4. Những tiến bộ gần đây trong điều trị lơ xê mi cấp dòng tủy
Trước đây, phương pháp điều trị lơ xê mi cấp dòng tủy chủ yếu dựa vào
anthrycline và cytarabine. Gần đây, nhờ những hiểu biết về cơ chế bệnh sinh của
bệnh, các thuốc nhắm đích ra đời đã cải thiện hơn chất lượng điều trị:
- Thuốc ức chế FLT3-ITD
Trong lơ xê mi cấp dòng tủy, đột biến gen này chiếm tới 30% [39]. Đây
là gen thuộc nhóm tiên lượng xấu trong phân loại nguy cơ của WHO: Nghiên
cứu tiền lâm sàng thấy rằng ức chế quá trình phosphoryl hóa và truyền tín
hiệu theo dòng của FLT3-ITD sẽ gây ra cái chết theo chương trình của tế bào
lơ xê mi [40]. Do đó, ức chế gen FLT3-ITD là một hướng tiếp cận mới trong
điều trị nhắm đích.
Thuốc ức chế FLT3 có ba thế hệ: thế hệ thứ nhất gồm: sorafenib,
sunitinib, midostaurin và lestaurtinib; thế hệ thứ 2 là chất ức chế có lựa chọn
như: quizartinib; và thuốc thế hệ thứ ba giải quyết được vấn đề kháng thuốc
gồm: crenolanib và gilteritinib. [41]
Sorafenib là một thuốc ức chế nhiều kinase với hoạt động chống FLT3.
Trên một thử nghiệm ngẫu nhiên, mù đôi, thấy thuốc có ảnh hưởng chống lơ


12

xê mi khi thêm sorafenib vào phác đồ hóa trị chuẩn với thời gian sống không
bệnh là 21 tháng so với nhóm chứng là 9 tháng.[42]
- Thuốc ức chế Aurora kinase:
Thuốc AURKs là serine/threonine kinase có liên quan chủ yếu với
điều hòa kiểm soát chu trình tế bào. Có 3 loại gồm: AURKA, AURKB,
AURKAC. Nó ức chế quá trình phân bào và ý nghĩa lâm sàng đã được
công bố bào năm 2003.[43]
Cho đến nay, kết quả điều trị còn khiêm tốn. Alisertib có đáp ứng
điều trị 6/35 người bệnh lơ xê mi cấp dòng tủy tái phát, 49 % người bệnh
đạt ổn định.[44]. Thuốc Barasertib có tác dụng ở bệnh nhân AML nặng,
tái phát hoặc dai dẳng.
- Thuốc điều hòa ngoại gen:
Decitabine và azacitidine là chất ức chế DNA methyltransferase điều trị
AML, rối loạn sinh tủy…. Thuốc có thể sử dụng đơn trị cho những bệnh nhân
không thể điều trị hóa chất cường độ mạnh. Tuy nhiên, thường phối hợp với
hóa chất hoặc các thuốc nhắm đích. Hiện đang có nhiều thử nghiệm lâm sàng
với kiểu phối hợp này để điều trị AML.
Vorinostat và panobinostat là chất ức chế histone deacetylase, có hiệu
quả chống lơ xê mi ở bệnh nhân AML nặng, tuy nhiên khi thử nghiệm đơn trị
hiệu quả còn hạn chế. [45]. Hiện đang có các thử nghiệm phối hợp nhóm này
với các hóa chất cổ điển, thuốc nhắm đích khác và sau đó là ghép tủy đồng loại.
- Liệu pháp miễn dịch


13

Gemtuzumab ozogamini là kháng thể đơn dòng chống CD33, là kháng
thể đầu tiên được thử nghiệm để điều trị AML [46], có nhiều thử nghiệm đã
chứng minh hiệu quả chống lơ xê mi ở người bệnh AML trưởng thành, đặc
biệt ở người già không thích hợp với điều trị hóa chất mạnh. Kháng thể này
phối hợp với phác đồ “3+7” cũng là một phác đồ điều trị tấn công được
khuyến cáo hiện nay. Mặc dù kết quả điều trị có nhiều hứa hẹn, hiệu quả vẫn
còn hạn chế do sự kết hợp thuốc không ổn định, tác dụng phụ của thuốc, đặc
biệt độc với gan.
Ngoài kháng thể đơn dòng chống CD33, còn nhiều kháng thể đơn dòng
nhắm đích điều trị AML đang được nghiên cứu như: kháng thể kháng CD98,
kháng thể KIR, kháng thể PD1, kháng thể CTLA4…
- Liệu pháp tế bào:
Liệu pháp tế bào, đặc biệt CAR-T cell đang phát triển rất nhanh trong
điều trị ung thư. Ehninger nghiên cứu trên 319 người bệnh AML thấy 87,8%
có biểu hiện CD33, 77,9% biểu hiện CD123. Do đó 97,2% người bệnh có thể
được điều trị kháng thể kháng CD33 hoặc kháng thể kháng CD123. [47] Do
đó, liệu pháp tế bào để điều trị AML đang tập trung vào hai marker này. Nhiều
nghiên cứu tiền lâm sàng cho thấy CAR-T33 có hiệu quả rõ ràng diệt tế bào
lơ xê mi in vitro [48]. Khi nghiên cứu trên chuột bị AML, thấy CAR-T123 có
tác dụng giảm hoạt động của tế bào blast. Cần có thêm nhiều nghiên cứu tiền
lâm sàng để chứng minh sự an toàn của CAR-T123 trước khi đưa vào nghiên
cứu lâm sàng.


14

1.2. Các bất thường di truyền trong lơ xê mi cấp dòng tủy
1.2.1. Lịch sử của phân tích nhiễm sắc thể trong lơ xê mi cấp dòng tủy
Năm 1960, người ta phát hiện ra NST Philadelphia(Ph) trong bệnh lơ xê
mi kinh dòng hạt. Sau đó Rowley đã phát triển kỹ thuật nhuộm đặc hiệu cho
thấy đó là kết quả của chuyển đoạn cân đối t(9;22), sau đó tiếp tục phát hiện ra
chuyển đoạn t(8;21) trong lơ xê mi cấp dòng tủy. Những phát hiện này đã mở ra
con đường cho việc nghiên cứu các biến đổi di truyền trong bệnh máu ác tính
[9], [10]. Sau đó, nhờ những kiến thức về bất thường nhiễm sắc thể, đặc biệt
trong bệnh AML, giúp hiểu hơn về cơ chế gây bệnh, dựa vào đó phát triển các
phương pháp điều trị dựa trên tiên lượng theo các bất thường nhiễm sắc thể.
Phân loại đầu tiên của AML của nhóm FAB, đề xuất tiêu chuẩn xác định
bệnh AML dựa trên hình thái[11]. Những nghiên cứu về bất thường nhiễm sắc
thể trong AML công bố vào năm 1982 tại Chicago [12]. Thời gian sống của
bệnh nhân đã được công bố tại hội nghị, với phân tích đa biến cho thấy nhiễm
sắc thể là yếu tố tiên lượng độc lập với sự sống của người bệnh [13]. Bất
thường nhiễm sắc thể xác định được ở 50-60% người lớn mắc AML lúc chẩn
đoán [14], [15]. Tuổi và nhiễm sắc thể là yếu tố tiên lượng quan trọng nhất
trong AML[16], [17].
Hơn nữa, ở những bệnh nhân AML mới chẩn đoán có bộ nhiễm sắc thể
bất thường, việc phân tích nhiễm sắc thể cũng giúp dự đoán được có đáp ứng
hoàn toàn không hay không. Trong thực tế, nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng sau
điều trị tấn công nếu còn tồn tại các bất thường nhiễm sắc thể đã xác định lúc
chẩn đoán thì có tỉ lệ tái phát cao, kém đáp ứng, thời gian sống không bệnh
(DFS) và thời gian sống toàn bộ (OS) ngắn [18]. Do đó, nhóm làm việc quốc
tế về bệnh AML đã định nghĩa lui bệnh hoàn toàn về mặt di truyền là sau điều


15

trị tấn công lui bệnh hoàn toàn về hình thái và không thấy các bất thường NST
lúc chẩn đoán [19].
Sự hiện diện của một số chuyển đoạn NST đã dẫn đền nhiều phát hiện
liên quan đến bệnh sinh của AML. Ví dụ t(8;21)(q22;q22) dẫn đến hình thành
gen AML1/ETO, được xem là bất thường di truyền tiên lượng tốt. Gen này
còn dùng để đánh giá trước và sau ghép, theo dõi bệnh tồn lưu tối thiểu [20].
1.2.2. Phân loại nguy cơ di truyền
Mặc dù có một số khác biệt trong phân loại nguy cơ di truyền dựa trên kết
quả phân tích nhiễm sắc thể giữa các nhóm hợp tác Quốc tế, nhìn chung người
bệnh AML được phân thành ba nhóm: nguy cơ cao, trung bình và thấp [21], [22].
Bảng 1.3. Phân loại nguy cơ di truyền theo một số nhóm nghiên cứu
Nguy


MRC SWOG/

Thấp t(15;17) t(8;21)

SWOG/ ECOG
t(15;17) t(8;21)

inv(16)/t(16;16) [thiếu del(9q),

CALGB

GIMEMA/A
ML10

t(15;17)

t(15;17)

t(8;21)

t(8;21)

Bộ NST phức tạp ( ≥ 3 inv(16)/t(16;16)
bất thường)

inv(16)/
t(16;16)

inv(16)/t(16;16)/del(16q)
Trung Bình thường,
bình loại khác

Bình thường, +6, +8, -Y,

Bình thường,

del(12p)

loại khác

Không có bộ
NST phức tạp
cao

Bình thường, -Y

Không có bộ
NST phức tạp

abn(3q)

abn(3q),(9q),(11q),(21q)

inv(3)/t(3;3) -7,

-5/del(5q), -7

abn(17p)

t(6;9), t(6;11)

complex (≥ 5

-5/del(5q), -7/del(7q)

t(11;19),+8

bất thường)

t(6;9) t(9;22)

Bộ NST phức tạp

không bao gồm Bộ NST phức tạp (≥3 bất (≥ 3 bất thường)
Các biến đổi thường)
Các biến đổi NST
NST thuộc nhóm
thuộc nhóm nguy
nguy cơ thấp

khác


16

cơ thấp

Nhiều nghiên cứu đa trung tâm đã báo cáo người bệnh AML có t(8;21)
(q22;q22) hoặc inv(16)(p13q22)/t(16;16)(p13;q22) được điều trị bằng
cytarabine liều cao có tiên lượng tốt[23]. Ngược lại, AML có bất thường 3q,
del(5q), -5/-7 hay tổn thương nhiều nhiễm sắc thể có tiên lượng rất xấu, đáp
ứng rất kém với phác đồ hóa trị thông thường, phải ghép tủy đồng loại sớm
[23]. Người bệnh có bộ nhiễm sắc thể bình thường được xếp vào nhóm tiên
lượng trung bình. Tuy nhiên, trong nhóm này, có triệu chứng lâm sàng và đáp
ứng điều trị khác nhau. Mặc dù phân tích nhiễm sắc thể là một yếu tố tiên
lượng độc lập với tỉ lệ lui bệnh hoàn toàn, nguy cơ tái phát và thời gian sống
toàn bộ trong những phân tích đa biến, vẫn còn khoảng 10% trường hợp AML
có tổn thương nhiễm sắc thể không thể hiện rõ mối liên quan này [23].
1.2.3. Một số bất thường thuộc nhóm nguy cơ cao
1.2.3.1. Bộ nhiễm sắc thể phức tạp
Định nghĩa tổn thương nhiều nhiễm sắc thể (complex karyotype: CK)
cũng khác nhau và thay đổi giữa các nhóm nghiên cứu. CK là bệnh nhân có từ
ba bất thường NST trở lên, không tính các bất thường sau: t(8;21), inv(16),
t(15;17) và 11q23/MLL (gồm t(9;11) và t(11;19); thường mất đoạn 5q, 7q hay
17p, mất đoạn 18q21q22, 12p13 hay 16q22q24 hoặc thêm đoạn 11q23q25,
1p33p36, 8q22q24 hay 21q11q22 [24].
1.2.3.2. Bộ nhiễm sắc thể thiểu bội
Nhóm HOVON nghiên cứu 1975 người lớn bị bệnh AML đã xác định
thêm nhóm nguy cơ cao mới: monosomal karyotype, đó là những người mà
bộ NST mất một NST kèm theo mất ít nhất một NST khác hoặc bất thường


17

cấu trúc, không tính các bất thường sau: t(8;21)(q22;q22), t(9;11)(p21;q23),
t(15;17)(q22;q21) hay inv(16) [25].
Các nghiên cứu cho thấy tổn thương di truyền nguy cơ cao tăng theo
tuổi. Gần đây, Tổ chức y tế thế giới đã thấy rằng việc tăng số lượng người
bệnh AML có thể được phân loại dựa vào các tổn thương di truyền NST và
gen của họ [26]. Nhóm “ AML với các bất thường gen tái diễn gồm các thể
AML tiên phát: AML với t(8;21)(q22;q22) / AML1-ETO và AML với inv(16)
(p13.1q22)/ CBFB-MYH11 được chẩn đoán bệnh AML mà không cần tế bào
blast phải trên 20%. Có hai thể mới gồm AML với đột biến gen NPM1
(nucleophosmin) và AML với CEBPA (CCAAT enhancer binding protein alpha).
Hai loại đột biến gen này là tổn thương gen tiên phát (đột biến gen nhóm II) làm
giảm biệt hóa sự tạo máu [30]. Đột biến gen FLT3 (fms-related tyrosine kinase
3) được xếp vào nhóm đột biến gen I, gặp trong nhiều dưới nhóm của bệnh
AML, tuy nhiên trong phân loại của WHO không được xếp thành thể riêng, mặc
dù nó có ý nghĩa tiên lượng, bệnh nhân có đột biến gen này dễ tái phát.
Bảng 1.4. Ý nghĩa tiên lượng của bất thường di truyền tế bào và phân tử
trong lơ xê mi cấp dòng tủy (NCCN)
Nhóm nguy cơ

Di truyền tế bào

Di truyền phân tử

Thuận lợi

inv(16) hay t(16;16)

Bộ NST bình thường kèm đột biến
2 alen thuộc gen CEBPA

t(8;21)
t(15;17)

Đột biến gen NPM1 không kèm
FLT3 ITD

Trung bình

Bộ NST bình thường

Đột biến gen KIT trong lơ xê mi
+8 t(9;11) có các bất CBF: inv(16) hay t(16;16), t(8;21)
thường NST không
thuộc nhóm tốt và xấu

Xấu

Bộ NST phức tạp (≥ 3 Bộ NST bình thường và có đột
bất thường NST)
biến gen FLT3 ITD


18

Bộ NST đơn bội
-5/-5q or -7/-7q
Các biến đổi liên quan
11q23 (trừ t(9;11))
inv(3) hay t(3;3)
t(6;9)
t(9;22)

1.2.4. Các đột biến gen liên quan tiên lượng
Gần đây, việc xác định lại yếu tố tiên lượng của nhóm tiên lượng trung
bình trong lơ xê mi cấp dòng tuỷ được quan tâm nhiều. Nhóm tiên lượng tốt
được điều trị phác đồ hoá chất chuẩn trong khi nhóm tiên lượng xấu được
khuyến cao nên ghép tế bào gốc đồng loại sớm. Tuy nhiên, 40-50% bệnh nhân
lơ xê mi cấp dòng tuỷ được xếp vào nhóm tiên lượng trung bình và đa số bệnh
nhân này có bộ nhiễm sắc thể bình thường. Đột biến gen FLT3, NPM1 và
CEBPA được sử dụng để phân loại nhóm nguy cơ trung bình ở bệnh nhân có
bộ nhiễm sắc thể bình thường. Đột biến gen c-KIT làm thay đổi nhóm tiên
lượng bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng tuỷ có biến đổi gen CBF từ tốt thành
trung bình.
1.2.4.1. FLT3 (Fms-like Tyrosine Kinase 3)
FLT3 là một receptor tyrosine kinase liên quan tới quá trình sinh máu,
đột biến gen FLT3 là đột biến gen thường gặp trong lơ xê mi cấp dòng tuỷ. Có
2 đột biến phổ biến của gen FLT3: FLT3-ITD (internal tandem
duplication:ITD) và một đột biến điểm của tyrosine kinase domain (TKD). Cả
2 đột biến dẫn đến hoạt hoá liên tiếp, tuy nhiên chỉ FLT3-ITD được xác định
liên quan với tiên lượng xấu hơn. Khoảng 20% lơ xê mi cấp dòng tuỷ có đột
biến gen FLT3-ITD, nhưng gặp nhiều hơn trong lơ xê mi cấp tiền tuỷ bào và
lơ xê mi cấp dòng tuỷ có bộ nhiễm sắc thể bình thường [27], [28]. Lơ xê mi


19

cấp dòng tuỷ có bộ nhiễm sắc thể bình thường có đột biến gen FLT3-ITD có
tiên lượng xấu [27].
1.2.4.2. NPM1 (Nucleophosmin 1)
Gen NPM1 mã hoá một phosphoprotein vận chuyển giữa nhân và bào
tương, đóng vai trò hình thành ribosome, định hình và duy trì tính ổn định của
bộ gen, điều hoà và ổn định gen ức chế tế bào ung thư như p53 và p19Arf.
Đột biến phổ biến nhất là xen đoạn 4 bp. Đột biến gen NPM1 gặp ở khoảng
30% bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng tuỷ và khoảng 50-60% bệnh nhân lơ xê mi
cấp dòng tuỷ có bộ nhiễm sắc thể bình thường, đây là đột biến gen gặp nhiều
nhất trong lơ xê mi cấp dòng tuỷ [27]. NPM1 thường ít khi đi kèm với nhóm
các bất thường gen tái diễn, BCOR hoặc CEBPA nhưng thường đi kèm cùng
FLT3, DNMT3A và IDH [29]
Lơ xê mi cấp dòng tuỷ bộ nhiễm sắc thể bình thường, có đột biến gen
NPM1 đơn thuần có tiên lượng tốt tương tự nhóm lơ xê mi cấp có bất thường
gen yếu tố gắn lõi [30].
Một số nghiên cứu cho rằng đột biến gen NPM1 đi kèm với FLT3-ITD
có tiên lượng trung bình, khác với bệnh nhân chỉ có đơn thuần một trong hai
đột biến này; trong khi một số nghiên cứu cho rằng chỉ khi đột biến FLT3ITD có ít thì thêm đột biến NPM1 sẽ có tiên lượng trung bình.[31]


20

Hình 1.1. Các dạng đột biến gen NPM1
(Nguồn: http://www.haematologica.org/content/95/4/529.figures-only)
1.2.4.3. CEBPA (CCAAT Enhancer Binding Protein)
CEBPA là một yếu tố phiên mã liên quan đến biệt hoá bạch cầu hạt trung
tính. Đột biến gen CEBPA gặp trong khoảng 10% bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng
tuỷ và phổ biến nhất ở bệnh nhân có bộ nhiễm sắc thể bình thường hoặc del(9q).
Đột biến gen CEBPA trên 2 alen trong lơ xê mi cấp dòng tuỷ gặp xấp xỉ
2/3 bệnh nhân, còn lại là đột biến một alen. Lơ xê mi cấp dòng tuỷ bộ nhiễm
sắc thể bình thường đột biến 2 alen gen CEBPA có tiên lượng tốt hơn đột biến
1 alen gen CEBPA [32] [33]. Một số nghiên cứu chứng minh đột biến 1 alen
gen CEBPA không có tiên lượng tốt hơn và theo dõi thấy đột biến 2 alen có
thời gian sống toàn bộ lâu hơn (9,6 năm) so với đột biến 1 alen (1,7 năm) [32]
Đột biến 2 alen gen CEBPA thường cả đầu C và N và dẫn đến mất biểu hiện
của gen CEBPA bình thường. Đột biến vô nghĩa ảnh hưởng đầu N của phân
tử, ngăn chặn biểu hiện của protein CEBPA suốt chiều dài [34]. Đột biến đầu
C làm giảm sự dimer hoá hoặc gắn DNA.
1.2.4.4. Gen c-KIT
KIT thuộc họ thụ thể bề mặt tế bào liên quan đến quá trình tăng sinh, biệt
hoá và sống sót của tế bào. Đột biến gen KIT ảnh hưởng chủ yếu trên exon 8
và 17, gặp ở khoảng 2-14% bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng tuỷ [35] Một nhóm
lơ xê mi cấp dù có gen yếu tố gắn lõi có thêm đột biến gen KIT được xem là
có tiên lượng xấu [36]. Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy chỉ trong lơ xê
mi cấp dòng tuỷ có t(8;21) [37] và một nghiên cứu khác đã không thành công
khi chứng minh gen c-Kit có ảnh hưởng tiên lượng đến tất cả bệnh nhân lơ xê
mi cấp dòng tuỷ [38].
1.2.5. Các kỹ thuật di truyền ứng dụng trong bệnh lơ xê mi cấp dòng tủy
1.2.5.1. Kỹ thuật di truyền tế bào


21

Phương pháp nhuộm bang và phân tích NST được ứng dụng trong bệnh
lơ xê mi từ những năm 1970. Nhuộm Giêm sa hoặc băng G các cụm NST kỳ
giữa và phân tích dựa trên các băng đặc trưng cho từng NST. Phương pháp
này đánh giá được tổng quát bộ NST, tuy nhiên cũng có mặt hạn chế: nhiều
thể bệnh lơ xê mi tế bào khó phân chia ở kỳ giữa nên không đủ cụm NST để
phân tích bất thường, phương pháp này cũng không phát hiện được các biến
mất đoạn nhỏ hơn 5-10MB, các chuyển đoạn ẩn [5] Phương pháp này cũng
mất nhiều thời gian. Gần đây, đã phát triển kỹ thuật di truyền với độ phân cao
đã khắc phục được nhược điểm của kỹ thuật di truyền tế bào truyền thống.
1.2.5.2. Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH)
FISH là kết hợp giữa di truyền tế bào và sinh học phân tử nhằm xác định
sự có mặt hay không của một đoạn trình tự ADN trên NST ở kỳ giữa hoặc
trong nhân tế bào ở giai đoạn gian kỳ. Nhiều biến thể của FISH đã được phát
triển và ứng dụng trong bệnh lý huyết học: M-FISH hay SKY, cIg FISH…[6].
Kỹ thuật FISH có thể xác định được các chuyển đoạn ẩn như t(12;21) trong lơ
xê mi cấp lympho và những mất đoạn ẩn như: del(4q12) trong lơ xê mi bạch
cầu ưa acid.
1.2.5.3. Kỹ thuật PCR: [7]
Kỹ thuật PCR giúp xác định các biến đổi di truyền ở mức độ ADN/ARN.
Các kỹ thuật PCR(RT-PCR, Realtime-PCR, ASO-PCR…) đã và đang là kỹ
thuật xét nghiệm có tính ứng dụng rộng rãi nhất đối với các bệnh lý huyết
học. Kỹ thuật PCR được sử dụng để phát hiện và sàng lọc ban đầu các bất
thường gen gây bệnh dựa trên các cặp mồi đặc hiệu. Kỹ thuật này cũng có giá
trị trong theo dõi đáp ứng điều trị và bệnh tồn lưu tối thiểu. Trong bệnh máu
thường sử dụng các kỹ thuật RT-PCR, multiplex PCR, Nested-RT PCR
thường được sử dụng để phát hiện tổ hợp gen lai (BCR-ABL, AML1-ETO,


22

CBFB-MYH11…) và các đột biến khác (NPM1, FLT3…) với độ nhạy và độ
đặc hiệu rất cao.
1.2.5.4. Kỹ thuật lai so sánh hệ gen (CGH)[8]
Kỹ thuật CGH cho phép xác định các thêm hay mất đoạn trong toàn bộ
hệ gen. Kỹ thuật này dựa trên sử dụng gắn màu huỳnh quang với các DNA
được tách từ mẫu bệnh (màu xanh), DNA chứng gắn màu đỏ. DNA bệnh nhân
và DNA bình thường được trộn lẫn và được lai trên tiêu bản có bộ NST bình
thường ở kỳ giữa. Ưu điểm của kỹ thuật là không cần có mẫu bệnh nhân phân
bào ở kỳ giữa, nhưng nhược điểm là hạn chế về độ phân giải, chỉ cho phép
xác định các vùng thêm hoặc mất đoạn lớn nhưng không xác định được các
chuyển đoạn cân đối hoặc đảo đoạn.


23

1.2.5.5. Kỹ thuật giải trình tự gen
Công nghệ giải trình tự gen được hình thành từ hơn hai thập kỷ qua và
nhanh chóng trở thành công nghệ nổi bật nhất trong công nghệ sinh học. Kỹ
thuật ban đầu là Sanger, dựa trên nguyên lý ngừng phản ứng kéo dài chuỗi, sử
dụng các nucleotid đã được sửa đổi ddNTP, công nghệ giải trình tự đã sang
thế hệ hai với các ưu thế về công suất, độ chính xác cao và giá thành giảm[7].
Công nghệ giải trình tự gen thế hệ hai (NGS) đã cho phép nghiên cứu sâu về
cơ chế di truyền, sinh học phân tử của gen ung thư, đặc biệt là ung thư máu.
Các phương pháp phân tích trình tự gen:
-

Giải trình tự toàn bộ hệ gen

-

Giải trình tự hệ exome

-

Giải trình tự RNA thông tin

-

Giải trình tự gen đích để phát hiện các thay đổi trong vùng trình tự quan tâm,
so sánh với gen tham chiếu.
Với ưu thế về hiệu suất đọc trình tự và khối lượng dữ liệu thu được,
NGS còn có thể sử dụng để phân tích đồng thời nhóm các gen: AML/ALL, đa
u tủy xương hoặc theo dõi tổn thương tối thiểu của bệnh.
1.3. Tình hình nghiên cứu các bất thường di truyền và điều trị dựa trên
biến đổi di truyền bệnh lơ xê mi cấp dòng tủy
1.3.1. Tại Việt Nam
Hơn thập kỷ qua, nhờ các tiến bộ của các kỹ thuật di truyền, việc nghiên
cứu và điều trị lơ xê mi cấp tại Việt Nam đã có nhiều tiến bộ. Nghiên cứu của
Phạm Quang Vinh trên 203 bệnh nhân AML phát hiện 62,56 % bệnh nhân có
bất thường NST. Vũ Minh Phương, Phạm Quang Vinh thấy 16% bệnh nhân lơ
xê mi cấp dòng tủy có gen AML1-ETO, 11% có gen CBFB-MYH11[49]


24

Kiều Thị Vân Oanh, Vũ Minh Phương nghiên cứu thấy ở lơ xê mi cấp
dòng tủy có 16,7% mang đột biến gen NPM1 và 22,2 % mang đột biến gen
FLT3-ITD[50].
Nghiên cứu của Trần Công Hoàng, Dương Quốc Chính gặp 56,7% bất
thường NST trong lơ xê mi cấp dòng tủy[51]
Dựa vào phân tích di truyền cũng chia thành ba nhóm tiên lượng, từ đó dự
đoán được kết quả điều trị. Vũ Minh Phương, Phạm Quang Vinh so sánh kết quả
điều trị tấn công trên 104 bệnh nhân AML thấy tỉ lệ đạt lui bệnh hoàn toàn ở nhóm
thuận lợi là 81%, ở nhóm trung gian 59%, nhóm tiên lượng xấu 16% [52]
1.3.2. Trên thế giới
Khi phân tích di truyền tế bào của lơ xê mi cấp dòng tủy, Mrozek và
Baldus cũng thấy hầu hết bệnh nhân có ít nhất một bất thường di truyền. Các tác
giả thấy khoảng 60% bệnh nhân có bất thường NST[53]. Najfeld thấy có khoảng
81% bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng tủy có bất thường nhiễm sắc thể [54].
Nghiên cứu về kết quả điều trị ở bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng tủy, F
Stölzel, Mohr B thấy rằng nhóm bệnh nhân có bộ NST phức tạp có thời gian
sống toàn bộ ngắn hơn bệnh nhân có bộ NST bình thường[55]. Kayser nghiên
cứu bệnh nhân có bộ NST thiểu bội thấy rằng nhóm bệnh nhân này có tỉ lệ
đáp ứng hoàn toàn thấp, thời gian sống toàn bộ ngắn[56].


25

CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Người bệnh từ 16 tuổi - 60 tuổi được chẩn đoán xác định là lơ xê mi cấp

-

dòng tủy theo phân loại FAB 1986, điều trị nội trú tại khoa Huyết học – Bệnh
viện Bạch Mai trong thời gian từ tháng 01/2017 đến tháng 10/ 2020.
2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân
-

Bệnh nhân mới được chẩn đoán lơ xê mi cấp dòng tủy theo tiêu chuẩn FAB
1986[57].

-

Chưa được điều trị bằng hóa chất trước đó.

-

Bệnh nhân 16 -60 tuổi.

-

Bệnh nhân tự nguyện tham gia nghiên cứu. Bệnh nhân và gia đình đồng ý
điều trị hóa chất.

-

BN không có chống chỉ định điều trị hóa chất: bệnh tim mạch, các bệnh lý ác
tính khác, suy gan, suy thận...
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ.

-

Bệnh nhân lơ xê mi cấp sau một bệnh máu khác: rối loạn sinh tủy, hội chứng tăng
sinh tủy mạn,… hoặc thứ phát sau một bệnh ung thư khác.

-

Mắc các bệnh bẩm sinh có thể có những rối loạn di truyền: Down…

-

Lơ xê mi cấp thể tiền tủy bào (M3).

-

BN có bệnh lý nội, ngoại khoa có chống chỉ định điều trị hóa chất: bệnh tim
mạch, các bệnh lý ác tính khác, suy gan, suy thận...
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

-

Địa điểm: Trung tâm Huyết học và Truyền máu Bệnh viện Bạch Mai.

-

Thời gian: Từ tháng 01/ 2017 đến tháng 10/ 2020.


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×

×