Tải bản đầy đủ

KHẢO sát TÍNH đa HÌNH của GEN LRP5 tại SNP rs3736228 ở PHỤ nữ LOÃNG XƯƠNG SAU mãn KINH

BỆNH VIỆN BẠCH MAI
KHOA CƠ XƯƠNG KHỚP

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ

KHẢO SÁT TÍNH ĐA HÌNH CỦA
GEN LRP5 TẠI SNP rs3736228
Ở PHỤ NỮ LOÃNG XƯƠNG SAU MÃN KINH

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: TRẦN THỊ TÔ CHÂU

HÀ NÔI, 2018


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
BMI

Body Mass Index (chỉ số khối cơ thể)

CSTL


Cột sống thắt lưng

CXĐ

Cổ xương đùi

DNA

Deoxyribonucleic acid

ĐTNC

Đối tượng nghiên cứu

DXA

Dual energy X-ray Absorptiometry

LRP5

Low-density lipoprotein Receptor-related Protein 5

LX

Loãng xương

MĐX

Mật độ xương

PCR

Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp)

RFLP-PCR Restriction Fragment Length Polymorphism
(Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn)
SNP

Single Nucleotid Polymorphism (Đa hình đơn Nucleotid)

TGMK

Thời gian mãn kinh


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ..................................................................................................1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................3
1.1. Tổng quan về bệnh loãng xương...............................................................3
1.1.1. Định nghĩa loãng xương..................................................................3
1.1.2. Đặc điểm dịch tễ của loãng xương..................................................3
1.1.3. Phân loại loãng xương.....................................................................4
1.1.4. Chẩn đoán loãng xương..................................................................5
1.1.6. Mối liên quan giữa gen và loãng xương..........................................5
1.2. Tổng quan về mãn kinh............................................................................7
1.2.1. Định nghĩa mãn kinh.......................................................................7
1.2.2. Nguyên nhân của mãn kinh.............................................................7
1.2.3. Phân loại mãn kinh..........................................................................7
1.2.4. Ảnh hưởng của mãn kinh đến loãng xương....................................7
1.3. Tổng quan về gen LRP5.........................................................................8
1.3.1. Một số thuật ngữ được sử dụng trong di truyền học.......................8
1.3.2. Cấu trúc gen LRP5..........................................................................9
1.4. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về sự liên quan của gen LRP5 đến MĐX. .11
1.4.1. Các nghiên cứu ngoài nước về sự liên quan của gen LRP5 đến MĐX.....11
1.4.2. Các nghiên cứu trong nước về sự liên quan của gen LRP5 đến MĐX......12
1.5. Một số kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong phát hiện đột biến gen12
1.5.1. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)................................12
1.5.2. Kỹ thuật RFLP-PCR.....................................................................13
1.5.3. Kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp................................................14
Chương 1: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..............15
2.1. Đối tượng và địa điểm nghiên cứu..........................................................15
2.1.1. Địa điểm nghiên cứu.....................................................................15


2.1.2. Đối tượng nghiên cứu....................................................................15
2.2. Phương pháp nghiên cứu........................................................................16
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu.......................................................................16
2.2.2. Cỡ mẫu..........................................................................................16
2.2.3. Qui trình tuyển chọn đối tượng nghiên cứu và lấy máu................16
2.3. Sơ đồ qui trình nghiên cứu......................................................................18
2.4. Kỹ thuật phân tích mẫu nghiên cứu.........................................................19
2.4.1. Tách DNA bằng qui trình Estonia, kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ
DNA bằng phương pháp đo mật độ quang bằng máy NanoDrop 2000C.....19
2.4.2. Xác định kiểu gen bằng phương pháp RFLP-PCR.......................20
2.5. Phân tích kết quả....................................................................................22
2.6. Xử lý thống kê........................................................................................22
2.7. Vấn đề đạo đức đề tài.............................................................................22
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU........................................................23
3.1. Đặc điểm của đối tượng nghiên cứu........................................................23
3.1.1. Đặc điểm chung.............................................................................23
3.1.2. Đặc điểm MĐX đo bằng phương pháp DXA của ĐTNC..............24
3.2. Kết quả xác định kiểu gen.......................................................................25
3.3. Mối liên quan giữa kiểu gen LRP5 tại rs3736228 với mật độ xương........26
Chương 4: BÀN LUẬN.................................................................................28
4.1. Đặc điểm của đối tượng nghiên cứu........................................................28
4.1.1. Đặc điểm chung.............................................................................28
4.1.2. Đặc điểm về MĐX đo bằng phương pháp DXA của ĐTNC.........28
4.2. Xác định tính đa hình gen LRP5 tại SNP rs3736228 ở phụ nữ loãng xương
sau mãn kinh.................................................................................................32
4.3. Mối liên quan giữa gen LRP5 tại SNP rs3736228 với mật độ xương........34
KIẾN NGHỊ...................................................................................................37
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Tiêu chuẩn chẩn đoán loãng xương theo WHO................................5
Bảng 2.1. Mật độ xương đỉnh trung bình (g/cm 2) trong quần thể của phụ nữ
Việt Nam đo bằng máy Hologic....................................................17
Bảng 3.1. MĐX (g/cm2) và nhóm tuổi............................................................24
Bảng 3.2. Mối liên quan giữa MĐX (g/cm²) với thời gian MK......................25
Bảng 3.3. Tỷ lệ kiểu gen và alen của các đối tượng nghiên cứu.....................25
Bảng 3.4. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu theo kiểu gen...............................26
Bảng 3.5. Đặc điểm MĐX (g/cm²) đối tượng nghiên cứu theo kiểu gen........26
Bảng 3.6. Phân bố kiểu gen CT của LRP5 tại rs3736228 theo mức độ
loãng xương..................................................................................27
Bảng 3.7. Mối liên quan giữa kiểu gen LRP5 tại SNP rs3736228 với mức độ
loãng xương...................................................................................27
Bảng 4.1. Tỷ lệ kiểu gen tại rs 3736228 của gen LRP5 trong một số nghiên
cứu trên thế giới............................................................................34


DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1. Phân bố ĐTNC theo tuổi.............................................................23
Biểu đồ 3.2. Tỷ lệ loãng xương.......................................................................24
Biểu đồ 4.1. Tần số alen C và T của SNP rs3736228 ở một số chủng tộc............32


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Sơ đồ LRP5 và miền chức năng của nó............................................9
Hình 1.2: Sơ đồ protein LRP5 và vị trí các exon............................................10


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Loãng xương và gãy xương là một trong những bệnh phổ biến nhất
hiện nay trên thế giới đặc biệt là những nước đã và đang phát triển. Với xu thế
tuổi thọ ngày càng được cải thiện, kéo theo tỷ lệ người cao tuổi ngày càng gia
tăng, làm cho bệnh loãng xương càng trở thành một vấn đề đáng quan tâm đối
với sức khỏe cộng đồng trên toàn thế giới. Nhiều nghiên cứu trong vòng 30
năm qua cho thấy có khoảng 20% người mắc chứng loãng xương ở những
phụ nữ từ 60 tuổi trở lên [1].
Phụ nữ mãn kinh là đối tượng có nguy cơ cao bị loãng xương do sự suy
giảm nồng độ estrogen – một hormon do buồng trứng tiết ra và có vai trò
quan trọng trong quá trình chu chuyển xương. Chính vì vậy, nguy cơ gãy
xương do loãng xương ở phụ nữ sau mãn kinh là 10% cao tương đương với tỉ
lệ mắc bệnh ung thư vú [2]. Tại Việt Nam, qua nghiên cứu của Hồ Phạm
Thục Lan đã cho thấy tỉ lệ loãng xương CXĐ ở phụ nữ mãn kinh thành phố
Hồ Chí Minh là 28,6% [3]. Theo Nguyễn Thị Thanh Hương tỉ lệ loãng xương
CXĐ và CSTL ở miền Bắc lần lượt là 23,1% và 49,5% [4].
Hiện nay, đo mật độ xương bằng phương pháp DXA (Dual energy Xray Absorptiometry -hấp thụ tia X năng lượng kép) được xem là tiêu chuẩn
vàng trong chẩn đoán loãng xương [5]. Nghiên cứu trên các cặp sinh đôi và
phả hệ đã cho thấy 50-85% sự biến đổi MĐX là do gen qui định [6]. Gen
LRP5 tác động tới các tế bào tạo xương bằng cách can thiệp vào con đường
tín hiệu Wnt, qua đó ảnh hưởng đến khối lượng xương đỉnh đạt được và quá
trình mất xương, đặc biệt ở giai đoạn mãn kinh ở phụ nữ [7]. Gen LRP5 có
liên quan mạnh mẽ với MĐX cột sống, SNP xếp hạng cao nhất thuộc về locus
rs3736228 (A1330V). Koller và Van Meurs đã tìm thấy mối tương quan của
SNP rs3736228 trên gen LRP5 với mật độ xương CXĐ và CSTL trên phụ nữ
da trắng [8], [9]. Nghiên cứu của Guang-Yue Xu và cộng sự tại Trung Quốc
(2014) cho thấy gen LRP5 có liên quan đến tăng nguy cơ gãy xương và loãng


2

xương trong cộng đồng người châu Á và da trắng [10]. Tuy nhiên, nghiên cứu
tại Thái Lan và thành phố Hồ Chí Minh lại cho thấy alen nguy cơ T của SNP
rs3736228 không liên quan tới MĐX và nguy cơ loãng xương[11], [12]. Hiện
nay chưa có nghiên cứu nào được tiến hành trên phụ nữ mãn kinh miền Bắc
Việt Nam về mối liên quan giữa MĐX với SNP rs3736228 của gen LRP5.
Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Khảo
sát tính đa hình gen LRP5 tại SNP rs3736228 ở phụ nữ loãng xương sau
mãn kinh” với 2 mục tiêu:
1.

Xác định tính đa hình gen LRP5 tại SNP rs3736228 ở phụ nữ loãng

2.

xương sau mãn kinh.
Xác định sự liên quan giữa đa hình gen LRP5 tại SNP rs3736228 với
mật độ xương trên phụ nữ mãn kinh.


3

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về bệnh loãng xương
1.1.1. Định nghĩa loãng xương
Định nghĩa của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) năm 1994: loãng xương
là một bệnh lý của xương, được đặc trưng bởi sự giảm khối lượng xương kèm
theo hư tổn cấu trúc của xương, dẫn đến tăng tính dễ gãy của xương, tức là có
nguy cơ gãy xương. Do vậy, cần đo mật độ xương để đánh giá nguy cơ gaỹ
xương [13]. Định nghĩa này đã được WHO sửa đổi năm 2001, loãng xương
được đặc trưng bởi sự thay đổi sức mạnh của xương. Sức mạnh này được đặc
trưng bởi mật độ xương và chất lượng xương. Chất lượng xương được đánh
giá bởi các thông số: cấu trúc của xương, chu chuyển xương, độ khoáng hóa,
tổn thương tích lũy, tính chất của các chất cơ bản của xương. Trong các thông
số này, chu chuyển xương đóng một vai trò quan trọng.
1.1.2. Đặc điểm dịch tễ của loãng xương
Ở Việt Nam, một nghiên cứu dịch tễ học cho thấy khoảng 20% phụ nữ
trên 60 tuổi có triệu chứng loãng xương [4]. Theo quỹ loãng xương quốc gia
Mỹ-NOF (National Osteoporosis Foundation), trong khoảng 10 triệu người
Mỹ bị loãng xương, phụ nữ chiếm 80% [14]. Nhìn chung tỉ lệ loãng xương
nguyên phát giữa nữ và nam là 4:1. Ở Đức năm 2003, 7.8 triệu người bị loãng
xương trong đó có 6.5 triệu là phụ nữ và 4.3% trong số đó có ít nhất một gãy
xương trên lâm sàng. Phụ nữ mãn kinh là người có nguy cơ cao nhất bị loãng
xương do sự giảm nhanh chóng khối lượng xương có liên quan tới thời kỳ
mãn kinh. Một trong ba phụ nữ mãn kinh và một trong năm đàn ông trên 50
tuổi sẽ có nguy cơ gãy xương do loãng xương [15]. Các nghiên cứu trên phụ
nữ có thiếu hụt estrogen như phụ nữ sau mãn kinh, phụ nữ bị cắt buồng trứng
trước 45 tuổi cho thấy có tỉ lệ loãng xương tăng cao. Nghiên cứu của tác giả


4

Nguyễn Thị Thanh Hương năm 2012 phát hiện ra rằng có sự khác biệt giữa
cư dân thành thị và nông thôn, cư dân ở thành thị có mật độ xương thấp hơn ở
nông thôn và loãng xương nhiều hơn ở nông thôn [17]. Tuy nhiên, các yếu tố
như tuổi, cân nặng, lối sống, hormon cũng chỉ giải thích được 15-50% sự thay
đổi của mật độ xương [17] còn lại gen quyết định 50-85% sự thay đổi mật độ
xương [6].
1.1.3. Phân loại loãng xương
Loãng xương được chia làm hai loại: loãng xương nguyên phát và loãng
xương thứ phát [19],[20].
- Loãng xương nguyên phát là loại loãng xương không tìm thấy căn
nguyên nào khác ngoài tuổi tác và hoặc tình trạng mãn kinh ở phụ nữ.
+ Loãng xương nguyên phát typ1 hay loãng xương sau mãn kinh: nguyên
nhân do thiếu hụt estrogen, giảm tiết hormon cận giáp trạng, tăng thải canxi qua
nước tiểu, suy giảm hoạt động 25-OH-Vitamin D1 hydroxylase. Loại loãng
xương này thường gặp ở phụ nữ khoảng từ 50-60 tuổi, đã mãn kinh. Tổn
thương chủ yếu là mất chất khoáng ở xương xốp, biểu hiện bằng sự lún các
đốt sống hoặc gãy đầu dưới xương quay.
+ Loãng xương nguyên phát typ 2 hay loãng xương tuổi già: tình trạng
loãng xương liên quan tới tuổi tác và với sự mất cân bằng tạo xương. Loại này
xuất hiện ở cả nam và nữ, thường trên 70 tuổi. Mất chất khoáng toàn thể cả
xương xốp và xương đặc, biểu hiện chủ yếu là gãy cổ xương đùi. Loại loãng
xương này liên quan tới giảm hấp thu canxi, giảm chức năng tạo cốt bào dẫn
tới cường cận giáp thứ phát.
- Loãng xương thứ phát là loại loãng xương tìm thấy nguyên nhân do
một số bệnh hoặc một số thuốc gây nên. Thường gặp triệu chứng loãng xương
trong các bệnh suy sinh dục, cường vỏ thượng thận,dùng nội tiết tố vỏ thượng


5

thận kéo dài, cường cận giáp, cường giáp, rối loạn hấp thu, thiếu canxi, bất
động dài ngày, điều trị bằng heparin kéo dài.
1.1.4. Chẩn đoán loãng xương
Hiện nay đo mật độ khoáng xương bằng phương pháp hấp thụ tia X
năng lượng kép được coi là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán loãng xương [18],
[19]. Kết quả đo mật độ xương của đối tượng được đo được so sánh với MĐX
đỉnh (là MĐX lúc 20-30 tuổi). Kết quả của so sánh này là chỉ số T (T-score).
T=

iMDX – pMDX
pSD

Trong đó, iMĐX là mật độ xương của đối tượng i, pMĐX là mật độ
xương trung bình của quần thể trong độ tuổi 20-30 và SD là độ lệch chuẩn
của mật độ xương trung bình của quần thể trong độ tuổi 20-30.
Bảng 1.1. Tiêu chuẩn chẩn đoán loãng xương theo WHO[19]
Tiêu chuẩn chỉ số T

Chẩn đoán

Chỉ số T > -1

Bình thường

-1 ≤ Chỉ số T < -2,5

Giảm mật độ xương

Chỉ số T ≤ -2,5

Loãng xương

Chỉ số T ≤ -2,5 + tiền sử gãy xương gần đây

Loãng xương nghiêm trọng

1.1.6. Mối liên quan giữa gen và loãng xương
Di truyền và môi trường là các yếu tố ảnh hưởng đến BMD. Đây là
những yếu tố quan trọng quyết định sinh bệnh học của loãng xương [20]. Các
nghiên cứu về phả hệ gia đình và cặp sinh đôi cùng trứng đã chỉ ra rằng 5085% sự thay đổi của BMD là do gen qui định [6]. Gen không chỉ quyết định
đến BMD, loãng xương mà nó còn ảnh hưởng đến nguy cơ gãy xương do
loãng xương. Tỉ lệ di truyền của gãy xương do loãng xương nói chung là


6

khoảng 25%, của gãy xương cổ tay xấp xỉ 25-54%, của gãy xương hông là
48% [20]. Ở phụ nữ, nếu có người thân trong gia đình bị gãy xương sẽ là
những người có nguy cơ gãy xương tăng gấp 2 so với trung bình [21]. Con gái
của những phụ nữ mãn kinh có BMD thấp thì có MĐX đỉnh ở cả CSTL và
CXĐ thấp hơn so với con gái của những phụ nữ mãn kinh có BMD bình
thường [22]. Nghiên cứu của Kelly cho thấy có sự liên quan mạnh mẽ của yếu
tố di truyền trong việc giảm MĐX xương cột sống ở các cặp song sinh nữ
[23]. Hơn 60 gen có liên quan đến BMD xương cột sống, xương hông và rất
nhiều gen khác có liên quan đến loãng xương sau mãn kinh đã được xác định
[20]. Nghiên cứu của Estrada và cộng sự đã xác định được 56 locus liên quan
với BMD với mức ý nghĩa (p<5x10-8), 14 locus có liên quan đến nguy cơ gãy
xương trong đó có 6 locus liên quan cao nhất với p<510-8 bao gồm: 18p11.21
(C18orf19), 7q21.3 (SLC25A13), 11q13.2 (LRP5), 4q22.1(MEPE), 2p16.2
(SPTBN1) và 10q21.1(DKK1) [39], [24]. Các nghiên cứu về ảnh hưởng của
SNP rs3736228 (A1330V) của gen LRP5 trên quần thể người Châu Á đã cho
các kết quả trái ngược nhau . Một nghiên cứu trên 1012 phụ nữ Trung Quốc
với 21 SNP của các gen liên quan đến loãng xương ở phụ nữ Châu Âu cho
thấy 5 SNP của 4 gen bao gồm ZPTB40 (rs7524102, rs6696981), ESR1
(rs9479055), OPG (rs6469804), RANK (rs3018362) có liên quan đến MĐX
cột sống. Bảy SNP trong 5 gen ZBTB40 (rs7524102, rs6696981), OPG
(rs6993813,

rs6469804), RANK (rs3018362), SOST (rs1513607), LRP5

(rs3736228) có liên quan đến MĐX hông [25]. Tuy nhiên nghiên cứu của
Zhang, Anong và Hồ Phạm Thục Lan cho rằng không có sự liên quan giữa
SNP rs3736228 với BMD tại CXĐ hay CSTL trên phụ nữ mãn kinh Trung
Quốc, Thái Lan và miền Nam Việt Nam [11], [12], [26]. Nghiên cứu trên phụ
nữ Nhật Bản có tuổi trung bình 64.6 ± 10.8 (trong khoảng 25 – 89 tuổi) Ezura
nhận thấy các biến thể di truyền trong gen LRP5 là yếu tố quan trọng ảnh


7

hưởng đến MĐX ở phụ nữ và A1330V góp phần làm tăng nguy cơ loãng
xương ít nhất là ở phụ nữ Nhật Bản [27].
1.2. Tổng quan về mãn kinh
1.2.1. Định nghĩa mãn kinh
Ở người phụ nữ vào khoảng 40-50 tuổi, các noãn nang của buồng trứng
trở nên không đáp ứng với kích thích của hormon tuyến yên. Qúa trình này
xảy ra từ từ dẫn đến giảm chức năng buồng trứng. Biểu hiện của sự suy giảm
này là chu kỳ kinh nguyệt và chu kỳ phóng noãn trở nên không đều. Sau vài
tháng đến vài năm các chu kỳ buồng trứng, chu kỳ niêm mạc tử cung ngừng
hoạt động, người phụ nữ hết kinh, không phóng noãn, nồng độ các hormon
sinh dục nữ giảm đến mức thấp nhất. Hiện tượng này gọi là mãn kinh [28].
1.2.2. Nguyên nhân của mãn kinh
Mãn kinh là do sự kiệt quệ của buồng trứng ở vào khoảng tuổi quanh 45,
ở buồng trứng số nang noãn có khả năng đáp ứng với tác dụng kích thích của
FSH và LH còn rất ít vì vậy lượng estrogen giảm dần đến mức thấp nhất. Với
lượng estrogen này thì không đủ để tạo cơ chế điều hòa ngược dương tính
kích thích phóng noãn [28].
1.2.3. Phân loại mãn kinh
- Mãn kinh tự nhiên là tình trạng vô kinh liên tục 12 tháng sau lần có
kinh cuối cùng mà không có bất kỳ nguyên nhân bệnh lý nào.
- Mãn kinh nhân tạo là tình trạng dừng kinh nguyệt sau khi cắt bỏ buồng
trứng (có hoặc không có cắt bỏ tử cung) hoặc do điều trị hóa chất, phóng xạ
làm suy giảm chức năng buồng trứng.
1.2.4. Ảnh hưởng của mãn kinh đến loãng xương
Estrogen là thành phần quan trọng trong sự phát triển và tái mô hình
xương.


8

Ở người lớn, estrogen đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì khối
lượng xương [30]. Tác động của estrogen đến xương là qua thụ thể estrogen
(estrogen receptor, ER) [32]. Ảnh hưởng của estrogen đến chu trình tái tạo
xương là làm giảm số lượng và hoạt động của tế bào hủy xương. Sự thiếu
estrogen do việc kéo dài giai đoạn hủy xương do sự gia tăng tuổi thọ của các
hủy cốt bào và rút ngắn giai đoạn tạo xương bằng cách thúc đẩy quá trình
chết theo chương trình của tế bào tạo xương. Những thay đổi này dẫn đến các
tế bào tạo xương không còn đủ khả năng để lấp đầy các chỗ trống do tế bào
hủy xương tạo ra. Hơn nữa, kéo dài tuổi thọ tế bào hủy xương làm tăng sự
hủy xương và dẫn đến việc loại bỏ hoàn toàn cấu trúc mạng lưới bên trong
xương xốp. Đồng thời, sự thâm nhập sâu hơn của hủy cốt bào ở bề mặt nội
cốt dẫn đến sự hao hụt và làm mỏng vỏ xương [36]. Kết quả là dẫn đến sự mất
cân bằng của quá trình tái tạo xương. Thiếu hụt estrogen làm tăng hoạt hóa
thụ thể của yếu tố nhân kappa B ligand (RANKL), dẫn đến tăng số lượng và
tăng kích hoạt tế bào hủy xương, giảm quá trình chết theo chương trình của tế
bào này. RANKL là các phân tử quan trọng cuối cùng cần thiết cho sự phát
triển của tế bào hủy xương. Protein RANKL liên kết với thụ thể RANK của
nó trên tế bào hủy xương và bị bất hoạt bởi OPG (Oteoprotegerin) được tiết ra
bởi các tế bào tạo xương (osteoblast).
1.3. Tổng quan về gen LRP5
1.3.1. Một số thuật ngữ được sử dụng trong di truyền học
Locus: (số nhiều là loci) Một locus là vị trí của một trình tự DNA trên
nhiễm sắc thể
SNP: (Single Nucleotide Polymorphism) là các dạng đa hình của
nucleotide đơn. Đa hình đơn nucleotid, hoặc SNPs là những biến thể trình tự
DNA xảy ra khi một đơn nucleotide (A,T,C hoặc G) trong trình tự bộ gen bị
thay đổi.


9


10

1.3.2. Cấu trúc gen LRP5
Protein LRP5 thuộc về gia đình receptor LDL (các thụ thể kiểm soát
lipid) – các receptor bề mặt tế bào. LRP5 ở người kéo dài khoảng 136 kb trên
cánh dài của nhiễm sắc thể 11 ở vị trí 11q13.4. Gen bao gồm 23 exon với tổng
chiều dài là 5124 cặp bazo mã hóa 1516 aminoaxit với vùng ngoại bào lớn, vùng
xuyên màng duy nhất và một đuôi tế bào chất [37]. LRP5 được gắn vào màng tế
bào với hầu hết các cấu trúc của nó ở vùng ngoại bào (Hình 1.3). Phần ngoại
bào này chịu trách nhiệm cho phức hệ Wnt/Frizzled bám vào, trong khi đuôi
tế bào chất có liên quan đến bất hoạt phức hợp GSK-3B.

Hình 1.1. Sơ đồ LRP5 và miền chức năng của nó [41].
LRP5 protein đóng vai trò quan trọng trong sự duy trì và phát triển của rất
nhiều mô. Trong giai đoạn phát triển sớm, nó giúp cho sự biệt hóa của tế bào võng
mạc. Thêm vào đó protein này còn giúp điều hòa mật độ khoáng xương, bao gồm
canxi và rất nhiều chất khoáng khác. LRP5 có liên quan đến khối lượng xương đỉnh
ở động vật có xương sống .Trong các mô xương, LRP5 được tìm thấy trong các
tế bào tạo xương và tế bào xương, nhưng không thấy trong hủy cốt bào
(Spenceretal.2006 ) [38].


11

Biến thể A1330V (rs3736228) nằm tại vị trí exon 18, vùng mã hóa thứ
2 của protein LRP5. Mặc dù chức năng của vùng này chưa rõ ràng nhưng
A1330V có liên quan đến sự giảm MĐX có thể do biến thể này làm thay đổi
con đường truyền tín hiệu bằng cách làm giảm ái lực với WNT ngoài tế bào
hoặc các protein ức chế [39]. SNP xếp hạng cao nhất thuộc về locus
rs3736228 (A1330V), SNP này có ảnh hưởng rộng nhất đến mật độ khoáng
xương, với mỗi alen T làm giảm MĐX xuống 0,13 SD. Alen nguy cơ T tại vị
trí rs3736228 (A1330V) có liên quan với giảm MĐX tại cổ xương đùi
(p=1,9×10-4), sự thay đổi MĐX giải thích bằng sự thay đổi alen tại rs3736228
(A1330V) là 0,6% cho xương cột sống và 0,2% cho cổ xương đùi [40].

Hình 1.2: Sơ đồ protein LRP5 và vị trí các exon.
Các biến thể đa hình được mô tả ở bên phải [39].


12

1.4. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về sự liên quan của gen LRP5
đến MĐX
1.4.1. Các nghiên cứu ngoài nước về sự liên quan của gen LRP5 đến MĐX
Kết quả của khám phá ra tầm quan trọng của LRP5 trong chuyển hóa
xương dẫn đến khám phá ra vai trò của LRP5 là gen ứng viên trong quá trình
điều hòa MĐX và/ hoặc nguy cơ gãy xương trong quần thể dân số. Hai SNP
được quan tâm nhiều nhất là V667M tại vị trí exon 9 và A1330V tại exon 18
[37]. Trên chủng tộc người da trắng đa hình gen LRP5 – V667M có liên quan
đáng kể với mật độ xương CSTL [41] và liên quan yếu với bệnh loãng xương
nguyên phát ở nam giới [42]. Tuy nhiên không có sự liên quan với MĐX
CXĐ và CSTL ở phụ nữ mãn kinh [8]. Có thể do tần suất alen của SNP này
thấp nên hiện tại chưa có nghiên cứu nào trên V667M được tiến hành trên các
chủng tộc khác.
Tại vị trí SNP rs3736228 (A1330V) có sự thay thế nucleotid C
(Cytosine) thành T (Thymine) dẫn đến trong quá trình tổng hợp acid amin
thay thế Alanin thành Valin. Đa hình A1330V có liên quan đáng kể với BMD
CSTL và xương đùi trên nhóm bệnh nhân loãng xương người Anh [43] và phụ
nữ mãn kinh da trắng [8]. Các nghiên cứu trên phụ nữ mãn kinh Hy Lạp [44]
và người Maya-Mestizo [45] đều tìm thấy sự liên quan của SNP này với MĐX
CXĐ và CSTL. Tuy nhiên các nghiên cứu về sự liên quan của SNP này với
MĐX và loãng xương trên phụ nữ Châu Á thì còn đang tranh cãi. Anong và Hồ
Phạm Thục Lan đều không tìm thấy mối liên quan giữa SNP này với MĐX ở
phụ nữ Thái Lan và miền Nam Việt Nam. Ezura nghiên cứu trên 308 phụ nữ
Nhật Bản thấy rằng các biến thể của gen LRP5 có vai trò quan trọng ảnh hưởng
đến MĐX và A1330V là biến thể góp phần gây ra loãng xương ít nhất là trên
phụ nữ Nhật [27]. Do đó, nghiên cứu làm rõ thêm mối quan hệ giữa SNP
rs3736228 với MĐX và loãng xương trên phụ nữ Châu Á là cần thiết.


13

1.4.2. Các nghiên cứu trong nước về sự liên quan của gen LRP5 đến MĐX
- Tháng 3/2015 Hồ Phạm Thục Lan và cộng sự thuộc nhóm nghiên cứu
Cơ Xương trường Đại Học Tôn Đức Thắng đã công bố trên tạp chí Bone ba
gen liên quan đến mật độ xương của người Việt Nam bao gồm: SP7, ZBTB40
và MBL2 và tác giả không tìm thấy mối liên quan giữa gen LRP5 với MĐX
hay loãng xương [12]. Đây là công trình nghiên cứu về di truyền loãng xương
đầu tiên ở Việt Nam.
- Cho tới nay chưa có nghiên cứu nào tại miền Bắc nước ta tiến hành
nghiên cứu về sự liên quan của gen LRP5 đến mật độ xương và gãy xương do
loãng xương.
1.5. Một số kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong phát hiện đột biến
gen
1.5.1. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
Nguyên tắc của phản ứng PCR dựa trên cơ sở tính chất biến tính, hồi tính
của DNA và nguyên lý tổng hợp DNA nhờ hoạt tính của các DNA
polymerase. Với nguyên liệu là bốn loại Nucleotid, enzym DNA polymerase
xúc tác sự tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch DNA khuôn. Phản ứng đòi
hỏi sự có mặt của những mồi xuôi và mồi ngược có trình tự bổ sung với hai
đầu của trình tự DNA khuôn.
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm
ba bước:
- Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation). Trong một dung dịch
phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA
được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của phân tử,
thường là 94oC - 95oC trong vòng 30-60 giây.


14

- Bước 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing). Nhiệt độ được hạ thấp cho
phép các mồi cặp với khuôn, dao động trong khoảng 40 oC-70oC tuỳ thuộc Tm
của các mồi sử dụng và kéo dài 30-60 giây.
- Bước 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension). Nhiệt độ được
tăng lên 72oC để DNA polymerase là các polymerase chịu nhiệt (Taq
polymerase, Tth polymerase, Pfu polymerase,…) hoạt động tổng hợp tốt nhất.
Thời gian phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo
dài từ 30 giây đến nhiều phút.
Sau mỗi chu kỳ các chuỗi đôi DNA mới tạo thành sẽ tiếp tục được dùng
để làm các DNA khuôn cho sự tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo.
Sản phẩm cuối của phản ứng PCR là đoạn DNA chuỗi đôi có chiều dài bằng
khoảng cách giữa hai đoạn gen mồi, và hai đầu tận cùng của sản phẩm được
xác định bởi đầu tận cùng 5’ của hai đoạn gen mồi.
Số lượng chu kỳ mỗi phản ứng PCR phụ thuộc vào số lượng khuôn DNA
ban đầu, thường không vượt quá 40 chu kỳ. Sau mỗi chu kỳ sẽ làm tăng gấp đôi
lượng mẫu của lần trước. Như vậy sau n chu kỳ, từ một DNA đích đã nhân bản
được thành 2n bản sao. Nhờ vậy đủ số lượng DNA để có thể tách ra khi điện di,
phát hiện được sau khi nhuộm và để tạo dòng hoặc giải trình tự. Trong quá trình
thực hiện phản ứng PCR, ở những chu kỳ sau lượng khuôn tăng nhưng lượng
mồi và dNTP (deoxyribonucleoside triphosphate) tự do giảm, enzym DNA
polymerase hoạt động yếu dần. Do đó, cần tính toán hàm lượng mồi, dNTP và
enzym để đảm bảo phản ứng PCR cho kết quả tốt nhất [46].
1.5.2. Kỹ thuật RFLP-PCR
Kỹ thuật RFLP-PCR là phương pháp nghiên cứu tính đa hình chiều dài
của các phân đoạn DNA dựa trên điểm cắt của các enzym giới hạn
(Restriction Enzym, RE). Quá trình thực hiện kĩ thuật RFLP-PCR gồm các
giai đoạn sau [47].


15

- Tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi thích hợp để khuyếch đại đoạn
DNA chứa SNP cần phân tích.
- Tiến hành phân cắt đoạn DNA này với một enzym giới hạn thích hợp.
- Điện di xác định sự khác nhau của các băng DNA và đưa ra kết luận.
Enzym giới hạn: Enzym giới hạn (hay enzym cắt). Đặc điểm chung của
các loại enzym giới hạn:
- Đều được chiết tách từ vi khuẩn và tên enzym mang tên của vi khuẩn.
- Cắt phân tử DNA xoắn kép ở những trình tự base đặc hiệu (hay còn gọi
là vị trí giới hạn, trình tự giới hạn) với từng loại enzym.
- Vị trí cắt thường có 4-8 Nucleotid, đặc trưng quan trọng nhất của trình
tự giới hạn là đoạn DNA gồm 4-8 cặp Nucleotid này có trình tự giống nhau
khi đọc theo chiều 3’-5’ và 5’-3’. Vì vậy, vị trí cắt của enzym giống nhau trên
cả 2 mạch.
Sau khi cùng bị cắt với cùng loại enzym giới hạn, các sợi đơn DNA có
các đầu kết dính với các nucleotid bổ sung cho nhau [46] .
Điện di DNA: Acid Nucleotid là các đại phân tử tích điện âm, trong điện
trường có điện thế và cường độ thích hợp, DNA di chuyển từ cực âm đến cực
dương của điện trường. Để kiểm tra và xác định tính chất của DNA, cần điện di
DNA trên gel. Phân tử DNA càng nhỏ di động càng nhanh. Có 2 loại gel được
sử dụng để điện di DNA đó là gel polyacrylamid và gel agarose. Tùy theo chiều
dài của sản phẩm mà lựa chọn nồng độ gel thích hợp, thường dao động trong
khoảng 0,8- 3%. Để quan sát hình ảnh DNA khi điện di, người ta nhuộm DNA
bằng Redsafe hoặc Ethidium bromide, dưới ánh sáng tử ngoại, DNA gắn với
Redsafe/ Ethidium bromide sẽ phát sáng. Khi cho chạy điện di DNA nghiên
cứu thường có DNA mẫu (marker) cùng chạy để so sánh, xác định kích thước
của đoạn DNA [47].
1.5.3. Kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp


16

DNA là cơ sở của gen. Phân tử DNA là một chuỗi xoắn kép của hai mạch
đơn được tạo thành từ 4 loại Nucleotid, khác nhau nhờ các base của chúng, đó
là: A (Adenine), C (Cytosine), G (Guanine), T (Thymine). Các Nucleotid này
liên kết với nhau theo một trật tự xác định. Giải trình tự của một gen tức là phát
hiện được thứ tự sắp xếp của 4 loại Nucleotid này trên phân tử DNA.


17

Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng và địa điểm nghiên cứu
2.1.1. Địa điểm nghiên cứu
- Các đối tượng nghiên cứu được thăm khám, đo MĐX và lấy máu tại
Bệnh viện Bạch Mai.
- Phân tích gen được thực hiện tại trường Đại học Y Hà Nội.
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu
2.1.3.1. Tiêu chuẩn lựa chọn
- Những phụ nữ mãn kinh tự nhiên có tuổi từ 40 trở lên có tiền sử khỏe
mạnh. Mãn kinh tự nhiên là tình trạng vô kinh liên tục 12 tháng sau lần có
kinh cuối cùng mà không có bất kỳ nguyên nhân bệnh lý nào.
- Tất cả các đối tượng nghiên cứu được đo MĐX tại 2 vị trí CXĐ và
CSTL bằng phương pháp đo hấp thụ tia X năng lượng kép và được phân tích
gen LRP5 tại SNP rs3736228.
2.1.3.2. Tiêu chuẩn loại trừ
+ Bệnh nhân không có đầy đủ các tiêu chuẩn trên.
+ Bệnh nhân bất động từ 01 tháng trở lên.
+ Bệnh nhân có tiền sử mắc các bệnh mãn tính như suy thận, bệnh gan,
ung thư, các bệnh nội tiết và các rối loạn chuyển hóa Vitamin D, chuyển hóa
xương, đái tháo đường, béo phì, hội chứng kém hấp thu, bệnh cường giáp
trạng, hội chứng Cushing.
+ Bệnh nhân có sử dụng các loại thuốc liên quan đến chuyển hóa canxi,
Vitamin D trong vòng 06 tháng vừa qua như: corticoid, heparin.
+ Bệnh nhân bị cắt bỏ tử cung buồng trứng, phẫu thuật cắt dạ dày, cắt
đoạn ruột (trừ ruột thừa), đang có thai hoặc cho con bú.
+ Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu.


18

2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
- Thiết kế nghiên cứu: nghiên cứu mô tả cắt ngang.
2.2.2. Cỡ mẫu
- Cỡ mẫu: N = Z²(1-α/2) x p(1-p)/d²
N là cỡ mẫu nhỏ nhất đạt được
Z là hệ số tin cậy, ở mức xác suất 95%, Z= 1,96
P là tỉ lệ alen T ở quần thể, theo nghiên cứu của Zhang (2005) là
17,2%[26].
d là độ chính xác mong muốn, d= 0,07
Từ công thức tính ra n= 122. Như vậy cỡ mẫu tối thiểu cho nghiên cứu
là 122 bệnh nhân. Thực tế chúng tôi thu nhận được 184 bệnh nhân.
2.2.3. Qui trình tuyển chọn đối tượng nghiên cứu và lấy máu
2.2.3.1. Qui trình tuyển chọn đối tượng nghiên cứu
- Các đối tượng đủ tiêu chuẩn trong mỗi nhóm được phỏng vấn theo bộ
câu hỏi sàng lọc, thăm khám lâm sàng theo một mẫu bệnh án nghiên cứu
thống nhất bao gồm chiều cao, cân nặng, BMI, các yếu tố nguy cơ loãng
xương, tiền sử và bệnh kèm theo (xin xem phụ lục).
2.2.3.2. Qui trình lấy máu
- Tất cả đối tượng thỏa mãn tiêu chuẩn được lấy 2ml máu tĩnh mạch chống
đông bằng EDTA và được tách chiết DNA tại trường Đại học Y Hà Nội và lưu
máu cho tới khi phân tích ở -80°C.
2.2.3.2. Qui trình đo mật độ xương theo phương pháp hấp phụ tia X năng
lượng kép (DXA- Dual Energy X-ray Absorption)
- Thiết bị sử dụng: máy đo MĐX của hãng Hologic-Mỹ, tại trung tâm Y
học hạt nhân và Ung Bướu - Bệnh viện Bạch Mai, là máy đo hấp thụ tia X
năng lượng kép thế hệ 3, chùm tia hình dẻ quạt góc rộng. Mức sai số là 1%.


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×

×