Tải bản đầy đủ

KẾT QUẢ NGHIÊN cứu độc TÍNH và tác DỤNG GIẢM ĐAU, CHỐNG VIÊM TRÊN THỰC NGHIỆM của cây SÓNG rắn THU HOẠCH tại THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
BỘ MÔN DƯỢC LÝ

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG GIẢM ĐAU,
CHỐNG VIÊM TRÊN THỰC NGHIỆM CỦA
CÂY SÓNG RẮN THU HOẠCH
TẠI THÁI NGUYÊN

Hà Nội, 9 - 2016


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................1
Chương 1: TỔNG QUAN.................................................................................3
1.1. Tổng quan về dược liệu Sóng rắn -Chi Albizia......................................3
1.1.1. Vị trí phân loại chi Albizia.............................................................3
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố........................................................3
1.1.3. Một số nghiên cứu về dược liệu sóng rắn......................................4
1.2. Tổng quan về các mô hình nghiên cứu tác dụng giảm đau invivo..........8
1.2.1. Mô hình nghiên cứu tác dụng giảm đau ngoại biên.......................8

1.2.2. Mô hình nghiên cứu tác dụng giảm đau trung ương....................10
1.3. Các nghiên cứu chống viêm in vivo.....................................................12
1.3.1. Mô hình gây tăng tính thấm thành mạch......................................13
1.3.2. Mô hình gây phù tai chuột bằng oxazolon...................................13
1.3.3. Mô hình gây phù tai chuột bằng dầu croton ................................14
1.3.4. Mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenin...........................14
1.3.5. Mô hình gây viêm khớp...............................................................15
1.3.6. Mô hình gây viêm khớp bằng carrageenan..................................15
1.3.7. Mô hình gây viêm khớp bằng formaldehyd.................................15
1.3.8. Mô hình gây viêm khớp bằng collagen........................................15
1.3.9. Mô hình gây viêm khớp bằng chất kích thích miễn dịch.............16
1.3.10. Mô hình gây u hạt......................................................................16
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................17
2.1. Đối tượng nghiên cứu...........................................................................17
2.1.1. Thuốc và các hoá chất nghiên cứu...............................................17
2.1.2. Động vật thực nghiệm..................................................................18
2.2. Phương pháp nghiên cứu......................................................................18
2.2.1. Nghiên cứu độc tính bán trường diễn trên thỏ theo đường bôi....18
2.2.2. Phương pháp đánh giá tác dụng giảm đau và chống viêm..........22
2.3. Xử lý số liệu.........................................................................................25


Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU............................................................26
3.1 Kết quả nghiên cứu độc tính bán trường diễn......................................26
3.1.1 Tình trạng chung...........................................................................32
3.1.2. Sự thay đổi thể trọng thỏ:.............................................................32
3.1.2. Đánh giá chức năng tạo máu........................................................33
3.1.3. Đánh giá mức độ hủy hoại tế bào gan:.........................................40
3.1.4. Đánh giá chức năng gan...............................................................42
3.1.5. Đánh giá chức năng thận..............................................................45
3.1.6. Thay đổi về mô bệnh học.............................................................46
3.2. Kết quả nghiên cứu tác dụng giảm đau và chống viêm........................59
3.2.1. Nghiên cứu tác dụng giảm đau của Sóng rắn bằng phương pháp
mâm nóng....................................................................................59
3.2.2. Nghiên cứu tác dụng giảm đau của Sóng rắn bằng phương pháp rê
kim...............................................................................................60
3.2.3. Đánh giá tác dụng chống viêm.....................................................61
Chương 4: BÀN LUẬN..................................................................................66
4.1. Bàn luận về độc tính bán trường diễn của dịch chiết Sóng rắn............66
4.1.1. Ảnh hưởng của dịch chiết Sóng rắn tươi và khô lên tình trạng
chung và cân nặng của thỏ:.........................................................66
4.1.2. Ảnh hưởng của dịch chiết Sóng rắn tươi và khô lên các chỉ số
huyết học của thỏ:.......................................................................66
4.1.3. Ảnh hưởng của dịch chiết Sóng rắn lên chức năng gan thỏ:........67
4.1.4. Ảnh hưởng của dịch chiết Sóng rắn lên chức năng thận thỏ:......68
4.1.5. Ảnh hưởng của dịch chiết Sóng rắn lên mô bệnh học thỏ:..........69
4.2. Bàn luận về tác dụng giảm đau, chống viêm........................................69
4.2.1. Về tác dụng giảm đau...................................................................69
4.2.2. Về tác dụng chống viêm...............................................................70
KẾT LUẬN.....................................................................................................72
KIẾN NGHỊ.....................................................................................................74
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1.
Bảng 3.2.
Bảng 3.3.
Bảng 3.4.
Bảng 3.5.
Bảng 3.6.
Bảng 3.7.
Bảng 3.8.
Bảng 3.9.
Bảng 3.10.
Bảng 3.11.
Bảng 3.12.
Bảng 3.13.
Bảng 3.14.
Bảng 3.15.
Bảng 3.16.
Bảng 3.17.
Bảng 3.18.
Bảng 3.19.

Ảnh hưởng của dịch chiết Sóng rắn đến thể trọng thỏ..............32
Ảnh hưởng của dịch chiết Sóng rắn đến số lượng hồng cầu
trong máu thỏ............................................................................33
Ảnh hưởng của dịch chiết Sóng rắn đến hàm lượng huyết sắc tố
trong máu thỏ............................................................................34
Ảnh hưởng của dịch chiết Sóng rắn đến hematocrit trong
máu thỏ.....................................................................................35
Ảnh hưởng của dịch chiết Sóng rắn đến thể tích trung bình hồng
cầu trong máu thỏ......................................................................36
Ảnh hưởng của dịch chiết Sóng rắn đến số lượng bạch cầu trong
máu thỏ......................................................................................37
Ảnh hưởng của dịch chiết Sóng rắn đến công thức bạch cầu
trong máu thỏ............................................................................38
Ảnh hưởng của dịch chiết Sóng rắn đến số lượng tiểu cầu trong
máu thỏ......................................................................................39
Ảnh hưởng của dịch chiết Sóng rắn đến hoạt độ AST (GOT)
trong máu thỏ............................................................................40
Ảnh hưởng của dịch chiết Sóng rắn đến hoạt độ ALT (GPT)
trong máu thỏ............................................................................41
Ảnh hưởng của dịch chiết Sóng rắn đến nồng độ bilirubin toàn
phần trong máu thỏ....................................................................42
Ảnh hưởng của dịch chiết Sóng rắn đến nồng độ albumin trong
máu thỏ......................................................................................43
Ảnh hưởng của dịch chiết Sóng rắn đến nồng độ cholesterol
toàn phần trong máu thỏ............................................................44
Ảnh hưởng của dịch chiết Sóng rắn đến nồng độ creatinin trong
máu thỏ......................................................................................45
Ảnh hưởng của Sóng rắn lên thời gian phản ứng với nhiệt độ
của chuột nhắt trắng..................................................................59
Tác dụng giảm đau của Sóng rắn trên chuột nhắt trắng bằng
máy rê kim.................................................................................60
Cân nặng trung bình của các lô chuột.......................................61
Tác dụng chống viêm cấp của Sóng rắn thể hiện qua độ phù
chân chuột trên mô hình gây phù chân chuột cống...................62
Tác dụng chống viêm cấp của Sóng rắn thể hiện qua độ dày
chân chuột trên mô hình gây phù chân chuột cống...................64


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1:
Hình 1.2:
Hình 1.3:
Hình 1.4:
Hình 1.5:
Hình 1.6.

Cây sóng rắn (Albizia myriophylla Benth)......................................5
Sóng rắn dài (Albizia procera)........................................................6
Sóng rắn dây (Acacia pennata).......................................................6
Sóng rắn sừng nhỏ (Albizia corniculata)........................................7
Sóng rắn tại Thái Nguyên...............................................................7
Một số máy đo ngưỡng đau khác dùng trong mô hình RandallSiletto..............................................................................................9
Hình 1.7. Phương pháp xác định ngưỡng đau bằng bức xạ nhiệt.................11
Hình 1.8. Máy đo viêm Plethysmometer No 7250 của Ugo - Basile (Italy).14


DANH MỤC ẢNH
Ảnh 3.1:
Ảnh 3.2:
Ảnh 3.3:
Ảnh 3.4:
Ảnh 3.5:
Ảnh 3.6:
Ảnh 3.7:
Ảnh 3.8:
Ảnh 3.9:
Ảnh 3.10:
Ảnh 3.11:
Ảnh 3.12:
Ảnh 3.13:
Ảnh 3.14:
Ảnh 3.15:
Ảnh 3.16:
Ảnh 3.17:
Ảnh 3.18:
Ảnh 3.19:

Hình ảnh da thỏ lô chứng sinh học................................................46
Hình ảnh da thỏ lô chứng sinh học................................................46
Hình ảnh da thỏ lô bôi Sóng Rắn tươi...........................................47
Hình ảnh da thỏ lô bôi Sóng Rắn tươi...........................................47
Hình ảnh da thỏ lô bôi Sóng Rắn khô...........................................48
Hình ảnh da thỏ lô bôi Sóng Rắn khô...........................................48
Hình thái vi thể gan thỏ lô chứng..................................................50
Hình thái vi thể gan thỏ lô chứng..................................................50
Hình thái vi thể gan thỏ lô trị 1 sau 4 tuần bôi thuốc thử..............51
Hình thái vi thể gan thỏ lô trị 1 sau 4 tuần bôi thuốc thử..............51
Hình thái vi thể gan thỏ lô trị 2 sau 4 tuần bôi thuốc thử..............52
Hình thái vi thể gan thỏ lô trị 2 sau 4 tuần bôi thuốc thử..............52
Hình thái vi thể thận thỏ lô chứng.................................................53
Hình thái vi thể thận thỏ lô chứng.................................................54
Hình thái vi thể thận thỏ lô trị 1 sau 4 tuần bôi thuốc thử.............54
Hình thái vi thể thận thỏ lô trị 2 sau 4 tuần bôi thuốc thử.............55
Hình thái vi thể thận thỏ lô trị 2 sau 4 tuần bôi thuốc thử.............55
Hình thái vi thể da thỏ lô chứng da có cấu trúc bình thường........56
Hình thái vi thể da thỏ lô chứng da có ít lympho bào trong trung bì
nông...............................................................................................57
Ảnh 3.20: Hình thái vi thể da thỏ lô trị 1 sau 4 tuần bôi thuốc thử................57
Ảnh 3.21: Hình thái vi thể da thỏ lô trị 2 sau 4 tuần bôi thuốc thử................58
Ảnh 3.22: Hình thái vi thể da thỏ lô trị 2 sau 4 tuần bôi thuốc thử................58


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nóng ẩm gió mùa nên có
nguồn tài nguyên thực vật vô cùng phong phú và đa dạng. Chính nguồn tài
nguyên này đã cung cấp cho con người nhiều sản phẩm thiên nhiên có giá trị
trong nhiều lĩnh vực khác nhau của cuộc sống, đặc biệt là dùng làm thuốc
chữa bệnh [1], [2]. Các loại thuốc thảo mộc được dùng như tác nhân điều trị
trực tiếp, làm chất dò sinh hoá để làm sáng tỏ nguyên lí dược học hoặc làm chất
chuẩn để phát triển các loại thuốc mới. Chính vì vậy việc nghiên cứu hoá học
cũng như hoạt tính sinh học của các loài cây thuốc có ý nghĩa quan trọng cho
việc sử dụng một cách hợp lý và có hiệu quản nhất nguồn tài nguyên thiên
nhiên này.
Thái Nguyên là tỉnh miền núi thuộc vùng trung du - miền núi Bắc bộ. Do
nằm sát chí tuyến Bắc trong vành đai Bắc bán cầu, nên khí hậu của tỉnh Thái
Nguyên mang đậm tính chất của khí hậu nhiệt đới gió mùa. Bởi thế, đây chính là
địa phương có tiềm năng cho nhiều cây thuốc sinh trưởng và phát triển.
Theo một nghiên cứu về nguồn tài nguyên cây thuốc năm 2010, huyện
Võ Nhai, tỉnh Thái Nguyên hiện có 136 loài thực vật có khả năng làm thuốc
chữa bệnh thuộc 122 chi, 63 họ của 3 ngành. Trong đó, cây thuốc quý hiếm
cần được bảo vệ là 2 loài, chiếm 1,48%. Một nghiên cứu khác năm 2011, tại
huyện Đồng Hỷ, tỉnh Thái Nguyên hiện có 187 loài thực vật bậc cao có mạch
và nấm lớn có công dụng làm thuốc, thuộc 156 chi, 81 họ. Trong đó có 12 loài
cây thuốc quý hiếm, bị đe dọa tuyệt chủng ở Việt Nam, thuộc 10 chi, 9 họ của
2 ngành thực vật bậc cao có mạch.
Chi Albizia có số loài tương đối lớn phân bố rộng khắp các vùng nhiệt
đới từ châu Phi, châu Á, châu Úc và Nam Mỹ. Ở Việt Nam có 17 loài với


2
khoảng 4 - 5 loài được dùng làm thuốc trong đó có cây sóng rắn. Cây sóng
rắn (tên gọi trong dân gian) mọc hoang nhiều tại Thái Nguyên ở rìa rừng, trên
đất trống, trên các bờ cát của các dòng sông, trên đất nghèo, từ vùng thấp đến
độ cao 900m. Sóng rắn được nhân dân dùng để chữa các bệnh viêm ngoài da
như mụn dộp, herpes, zona và một số bệnh khác [1], [2].
Cho đến nay vẫn chưa có một nghiên cứu nào nghiên cứu về cây thuốc
này. Để có cơ sở khoa học về an toàn và hiệu quả của dược liệu này, nâng cao
giá trị sử dụng và tìm hiểu đầy đủ hơn về cây thuốc. An toàn và hiệu quả là hai
yêu cầu bắt buộc khi nghiên cứu các dược liệu hoặc thuốc y học cổ truyền [43].
Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu độc tính và tác
dụng giảm đau, chống viêm trên thực nghiệm của cây sóng rắn thu hái tại
Thái Nguyên” với 2 mục tiêu sau:
1. Nghiên cứu kích ứng da và độc tính bán trường diễn của dịch chiết
cây Sóng rắn trên động vật thực nghiệm
2. Đánh giá được tác dụng giảm đau và chống viêm cấp của cây sóng
rắn trên động vật thực nghiệm.


3

Chương 1
TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về dược liệu Sóng rắn -Chi Albizia
Qua quan sát đặc điểm hình thái, cây sóng rắn được sơ bộ nhận định lấy
từ một hoặc một vài loài thuộc chi Albizia, họ đậu - Fabaceae.
1.1.1. Vị trí phân loại chi Albizia
Theo các tài liệu về phân loại thực vật [1],[2], chi Albizia có vị trí phân
loại như sau:
Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân lớp Hoa hồng (Rosidae)
Bộ Đậu (Fabales)
Họ Đậu (Fabaceae)
Chi Albizia
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố
Cây gỗ, cây nhỡ mọc đứng hay leo hoặc dây leo. Nhánh ít khi có gai
nhỏ cong, có gốc ở sẹo lá. Lá kèm hình dùi hay tai, thường rụng sớm. Lá hai
lần lông chim có trục sơ cấp và thứ cấp có tuyến.
Cụm hoa bông, đầu hay ngù, cuống cụm hoa ở nách các lá trên hay
xếp thènh chùy ở ngọn và ở nách. Hoa gồm 2 loại (ở trung tâm và ở rìa) trong
các cụm hoa đầu và ngù. Đài hợp, xếp van, có 5 răng. Nhị nhiều, chỉ nhị dính
thành ống ở gốc, bao phấn không có tuyến. Bầu không cuống hay có cuống,
có khi có tuyến mật. Quả có van mỏng hay dai, mở hay không. Hạt có cán,
dẹp hay lồi hai mặt, màu vàng, nâu hay đen, không có hạt.
Chi Albizia có số loài tương đối lớn phân bố rộng khắp các vùng nhiệt
đới từ châu Phi, châu Á, châu Úc và Nam Mỹ. Ở Việt Nam có 17 loài, thường
sử dụng nhiều là:


4
A. attopeuensis (pierre) I. Nielsen - Bản xe Lao, Dây cai, Cha ke.
A. chinensis (Osbeck) Merr - Sóng rắn Trung Quốc
A. corniculata - Sóng rắn sừng nhỏ, cây muồng gai
A. falcataria (L.) Fosb - Muồng giấy, Hợp hoan
A. julibrissin Durazz - Hợp hoan
A. kalkora (Roxb.) Prain - Hợp hoan núi
A. lebbeck (L.) Benth - Bồ kết tây, Lim xanh
A. lebbekoides (DC.) Benth - Bản xe trắng, câm trắng, muồng trúc
A. lucidior (Steud.) I. Nielsen - Bản xe, đĩa roi, ché
A. myriophylla Benth - Sóng rắn, cam thảo cây, bản xe nhiều lá
A. odoratissima (L.f.) Benth - Hợp hoan thơm
A. procera (Roxb.) Benth - Muồng xanh, sóng rắn dài, cọ thon
1.1.3. Một số nghiên cứu về dược liệu sóng rắn
1.1.3.1. Albizia myriophylla Benth
- Tên khác: Sóng rắn, cam thảo cây, bản xe nhiều lá
- Mô tả cây: Cây bụi mọc cao 2 - 4m, tự hay leo, thân có vỏ màu nâu,
cành non có lông màu hung. Lá kép có cuống chung dài 9cm, với 9 - 16 cặp lá
chét, mỗi lá chét có từ 20 - 40 cặp lá lá chét thứ cấp dài 5 - 8mm, rộng 1mm,
có lông ở dưới và ở dìa. Cụm hoa hình tán, mang hoa hình bán cầu dài 1mm,
vành 4mm, có lông vàng, 15 tiểu nhụy. Quả giáp dài 12cm, rộng 2cm chứa 4 9 hạt dài 6mm, màu nâu.
- Phân bố: Mọc phổ biến ở phía Nam có một số người đã dựa vào vị
ngọt của vỏ thân và vỏ rễ đã khai thác với mục đích dùng thay cam thảo.
- Bộ phận dùng: Vỏ thân, vỏ rễ, thu hái quanh năm dùng tươi hay phơi
sấy khô.
- Thành phần hóa học: Trong rễ sóng rắn có 0,035% ancaloid, màu
trắng ngà, vị rất đắng, 6% saponin thô màu vàng nâu nhạt, vị gắt cay hút ẩm ở
ngoài không khí. Ngoài ra còn có phản ứng flavonoid và steroid.


5
- Tính vị, công năng: Sóng rắn có vị ngọt, tính mát có tác dụng tả can
nhiệt, thoái tâm hỏa, lương huyết, giải độc.
- Nghiên cứu dược lý: Cho chuột nhắt (trọng lượng 20g) bôi dung dịch
nước thuốc với liều 18g/kg thể trọng đến 20g/kg thể trọng chuột chết sau 2 - 3
ngày. Tỷ lệ tử vong 10% (với liều 18g/kg) và 25% (với liều 20g/kg). Do đó
nhóm tác giả đã khuyến cáo cần nghiên cứu sâu hơn về độc tính và giá trị
chữa bệnh của Sóng rắn để tiếp tục sử dụng hay dừng.
- Ứng dụng điều trị trong dân gian:
+ Ở Việt nam hay một số nước khác dùng vỏ cây để chữa ho, viêm phế
quản và làm các bánh men để ủ rượu gạo. Lá giã nát đắp lên các vết thương
dùng cầm máu.
+ Dịch hãm cây Sóng rắn dùng phối hợp với rễ cây thuốc khác được
nhân dân Malaysia dùng làm thuốc hạ sốt. Lá dùng pha nước tắm và gội đầu.
Ở Thái Lan rễ sóng rắn được dùng làm giải khát và làm thuốc nhuận tràng,
quả làm thuốc chữa ho.

Hình 1.1: Cây sóng rắn (Albizia myriophylla Benth)
1.1.3.2. Albizia procera (Roxb.) Benth.
- Tên khác: Sóng rắn dài, Mu cua.
- Mô tả: Cây gỗ lớn có thể cao 25m. Lá nhẵn, kép lông chim hai lần, có
cuống chung to, dài 20cm, mang 1 tuyến cách gốc 5mm; lá chét 9-10 đôi, màu
nâu ở mặt trên, nhạt màu ở mặt dưới, hơi có lông, với lông nằm trên cả hai
mặt, thuôn hay xoan, dài 25-35mm, rộng 15-20mm, tròn ở đầu, thon hẹp


6
không đều ở gốc. Hoa dạng đầu gần hình cầu, xếp thành chuỳ dạng tháp đối
diện với lá ở ngọn, dài 15-20cm, có nhánh trải ra, dài 8cm ở gốc. Quả độc dài
15cm, rộng 2cm, thon hẹp và có mũi nhọn dài ở đầu, thon hẹp ở gốc, nhẵn,
bóng, màu nâu. Hạt 10 hay ít hơn, hình trái xoan rộng, dài 9mm, rộng 8mm,
rất dẹp, bóng, màu nâu nhạt.

Hình 1.2: Sóng rắn dài (Albizia procera)
1.1.3.3. Acacia pennata (L.) Willd
- Tên khác: Sóng rắn dây, Keo lông chim
- Mô tả: Dây leo, có khi là cây bụi phân nhánh nhiều, mọc trườn, có
nhiều gai, nhánh non có lông. Lá kép lông chim hai lần; cuống chung có
tuyến mang 16 cặp lá chét bậc nhất, mỗi lá chét này lại mang 17-35 cặp lá
chét bậc hai; dài 4-5mm, rộng 1-2mm; lá kèm 2-3mm. Chuỳ hoa ở ngọn hay ở
nách gồm nhiều đầu hoa trắng, to cỡ 13mm. Quả thuôn, mỏng dài tới 13cm,
rộng tới 3cm; hạt thuôn, không đều, dẹp, màu nâu hay đen.

Hình 1.3: Sóng rắn dây (Acacia pennata)


7
1.1.3.4. Albizia corniculata (Lour.) Druce
- Tên khác: Sóng rắn sừng nhỏ
- Mô tả: Cây gỗ nhỏ mọc đứng, cao 5mm, hay leo, dài tới 20m. Lá kép
với 3-4 cặp lá bậc nhất; các lá này lại mang 4-10 cặp lá chét bậc hai thuôn, dài
8-25mm, rộng 5-16mm, không lông. Chuỳ hoa hình tháp mang các hoa đầu
với 6-12 hoa không cuống; hoa nhỏ có cánh hoa 5mm, có lông; nhị cỡ 17.
Quả dẹp, dài 11-21cm, rộng 2,6-4,2cm; hạt 7-12.

Hình 1.4: Sóng rắn sừng nhỏ (Albizia corniculata)
1.1.3.5. Sóng rắn tại Thái Nguyên

Hình 1.5: Sóng rắn tại Thái Nguyên
Hiện chưa có công trình nghiên cứu nào về định tên khoa học, mô tả
hình thái thực vật, xác định thành phần hóa học và các nghiên cứu về dược lý
về cây sóng rắn tại Thái Nguyên.
Kinh nghiệm sử dụng thuốc trong nhân dân dùng lá rửa sạch, nhai hoặc
giã nát vắt nước bôi đắp điều trị viêm ngoài da như mụn dộp, herpes, zona.


8
1.2. Tổng quan về các mô hình nghiên cứu tác dụng giảm đau invivo
Đau là một triệu chứng của nhiều bệnh và cần điều trị với các thuốc
giảm đau. Vị trí của receptor đau ở da, mô là những đầu tự do của dây thần
kinh. Các kích thích lên receptor đau là các kích thích cơ học, nhiệt, hóa học
[4]. Hầu hết các receptor đau tiếp nhận mọi loại kích thích, tuy nhiên cũng có
receptor nhạy cảm hơn với một kích thích nhất định.Thuốc giảm đau ngoại biên
sẽ ngăn chặn sự hình thành các xung tại receptor đau. Thuốc giảm đau trung
ương sẽ ức chế sự dẫn truyền các xung tín hiệu đau trong hệ thống thần kinh
trung ương [4]. Sự phân loại thành các thuốc giảm đau ngoại biên và trung ương
là cơ sở xây dựng các mô hình dược lý nghiên cứu các thuốc giảm đau mới.
1.2.1. Mô hình nghiên cứu tác dụng giảm đau ngoại biên
Hầu hết các thuốc có tác dụng giảm đau ngoại biên thường thể hiện thêm
tác dụng chống viêm, một số thuốc có thêm tác dụng hạ sốt. Một trong những
cơ chế tác dụng của thuốc được biết rõ là ức chế enzym cyclooxygenase làm
giảm sinh tổng hợp prostaglandin [6], [8]. Vì vậy, đối với các thuốc giảm đau
mới, ngoài việc đánh giá tác dụng của thuốc đối với cyclooxygenase trên in
vitro thì thuốc còn được đánh giá tác dụng giảm đau trên in vivo [11], [12].
Các mô hình đánh giá tác dụng giảm đau ngoại biên được thực hiện phổ biến
nhất là mô hình gây quặn đau trên chuột nhắt và mô hình Randall-Selitto trên
chuột cống [17], [37].
1.2.1.1. Phương pháp gây quặn đau
Đau được gây ra bằng cách tiêm các chất kích thích vào khoang màng
bụng của chuột và gây nên những cơn đau quặn bụng điển hình. Các chất kích
thích được sử dụng có thể là phenylquinon hoặc acid acetic, trong đó acid
acetic được sử dụng phổ biến hơn [17], [36].
Các thuốc chứng dương có thể là indomethacin (10mg/kg), aspirin
(200mg/kg), hoặc diclofenac (10mg/kg). Nhóm chứng sinh học có thể bôi dung


9
môi là nước muối sinh lý (10mg/kg) hoặc hỗn hợp dung môi đồng tan gồm
nước, propylen glycol và tween (10mg/kg) [32]. Đánh giá tác dụng giảm đau của
thuốc dựa vào phần trăm ức chế cơn quặn đau, tính theo công thức [17]:
% ức chế cơn quặn đau =
Trong đó: C: số cơn quặn đau trung bình ở nhóm chứng sinh học
D: số cơn quặn đau trung bình ở nhóm bôi thuốc thử
Thuốc có phần trăm ức chế cơn quặn đau < 70% được coi là thuốc có tác
dụng giảm đau tối thiểu.
1.2.1.2. Mô hình Randall-Selitto
Mô hình đánh giá tác dụng giảm đau này dựa trên nguyên lý: phản ứng
viêm làm tăng mức độ nhạy cảm với đau, ngưỡng nhận cảm giác đau có thể
được tăng lên bởi các thuốc giảm đau gây nghiện và không gây nghiện. Nấm
men Brewer là tác nhân thường được sử dụng để gây viêm trong mô hình
Randall-Selitto [37], ngoài ra có thể dùng một số chất gây viêm khác như
carrageenin [19], bradykinin [17].

Hình 1.6. Một số máy đo ngưỡng đau khác dùng trong mô hình RandallSiletto


10
1.2.2. Mô hình nghiên cứu tác dụng giảm đau trung ương
Các mô hình thực nghiệm nghiên cứu tác dụng giảm đau trung ương trên
in vivo là cần thiết để đánh giá hiệu quả giảm đau của một thuốc trước khi đưa
vào sử dụng trên con người. Các loài động vật gặm nhấm, chủ yếu là chuột
cống và chuột nhắt, được sử dụng làm động vật thực nghiệm trong các mô
hình nghiên cứu này, trong một số trường hợp, cần thiết phải sử dụng động
vật bậc cao hơn, ví dụ như khỉ.
Một số mô hình nghiên cứu tác dụng giảm đau trung ương hiện nay:
-

Phương pháp kẹp đuôi Haffner trên chuột nhắt
Phương pháp tail-flick hoặc các phương pháp bức xạ nhiệt khác
Test ngâm đuôi
Phương pháp mâm nóng ở chuột nhắt hoặc chuột cống
Kích thích điện (shock lưới điện, kích thích tủy răng hoặc đuôi)
Test formalin trên chuột cống

1.2.1.3. Phương pháp kẹp đuôi Haffner (Haffner’s tail clip method)
Phương pháp này được mô tả lần đầu tiên bởi Haffner [18]. Ông đã quan
sát thấy hiện tượng đuôi chuột cong lên (hiện tượng Straub) khi chuột được
dùng morphin hoặc các thuốc opioid tương tự morphin, và tìm ra rằng sau khi
dùng thuốc, mức độ nhạy cảm của đuôi chuột giảm đi với các tác nhân kích
thích bên ngoài. Theo Haffener, phương pháp này có độ nhạy cao với morphin
[12], [22].
Thuốc

chứng

dương



thể



morphin

(10mg/kg)

hoặc

dextropropoxyphen (65 mg/kg), codein 20mg/kg [21].
1.2.1.4. Mô hình tail-flick
Phương pháp dùng bức xạ nhiệt (radiant heat method)
Ban đầu, phương pháp này được phát triển bởi Schumacher và cộng sự.
Wolff và cộng sự nhằm xác định ngưỡng đau của con người với bức xạ nhiệt
và đánh giá tác dụng giảm đau của các opioat. Sau đó, các nhà khoa học đã sử


11
dụng phương pháp này để đánh giá sự thay đổi mức độ nhạy cảm của đuôi
chuột với các stress nhiệt sau khi cho chuột dùng thuốc thử. Test này phù hợp
để phân biệt thuốc giảm đau giống morphin tác dụng trên thần kinh trung
ương và thuốc giảm đau không opioat [17], [22], [31].

Hình 1.7. Phương pháp xác định ngưỡng đau bằng bức xạ nhiệt
Phương pháp ngâm đuôi (tail immersion test)
Phương pháp này được sử dụng để đánh giá các hợp chất giống morphin.
Nguyên lý của phương pháp này dựa trên những quan sát cho thấy các thuốc
giống morphin có khả năng kéo dài thời gian phản ứng của phản xạ rút đuôi chuột
đặc trưng khi nhúng phần cuối của đuôi chuột vào nước ấm 550C [11],[17].
1.2.1.5. Mô hình mâm nóng (hot plate method)
Bàn chân của chuột nhắt rất nhạy cảm với nhiệt độ mà ở nhiệt độ đó vẫn
chưa gây tổn thương da. Đáp ứng của chuột bao gồm: động tác nhảy lên, rút
bàn chân và liếm bàn chân. Thuốc giảm đau trung ương có khả năng kéo dài
thời gian xuất hiện những đáp ứng này, trong khi thuốc giảm đau ngoại biên
như các acid acetylsalicylic hoặc acid phenyl-acetic thường không ảnh hưởng
đến những phản ứng này [17].
1.2.1.6. Mô hình formalin (formalin test)


12
Test formalin giúp đánh giá tác dụng của các thuốc giảm đau trung ương,
còn các thuốc giảm đau ngoại biên hầu như không có tác dụng trên mô hình này.
Do đó, test formalin cho phép phân biệt giữa đau do viêm và đau không do viêm,
một cách phân loại của các thuốc giảm đau dựa vào vị trí tác dụng và cơ chế tác
dụng của chúng [4]. Test formalin gây ra tình trạng đau mạn tính, trong khi hầu
hết các mô hình khác chỉ gây ra tình trạng đau cấp tính [4], [17].
1.3. Các nghiên cứu chống viêm in vivo [41]
Phản ứng viêm với các biểu hiện đặc trưng gồm sưng, nóng, đỏ, đau, có
thể được khởi động bởi nhiều yếu tố kích thích khác nhau như nhiễm khuẩn,
thiếu máu cục bộ, tương tác kháng nguyên-kháng thể, tác nhân hóa học, nhiệt
độ hay các chấn thương cơ học. Đáp ứng viêm được chia thành 3 pha với các
cơ chế khác nhau: viêm cấp, bán cấp và viêm mạn, từ đó có các mô hình thực
nghiệm đánh giá các pha của quá trình viêm tương ứng trên in vivo.
+ Đánh giá phản ứng viêm cấp và bán cấp
+ Gây ban đỏ trên da chuột lang bằng tia UV
+ Gây tăng tính thấm thành mạch
+ Gây phù tai chuột nhắt bằng oxazolon
+ Gây phù tai chuột nhắt và chuột cống và dầu croton
+ Gây phù chân chuột cống (với các chất kích thích gây viêm khác nhau)
+ Thử nghiệm gây viêm màng phổi bằng formaldehyd
- Đánh giá quá trình viêm mạn dựa vào các thử nghiệm về sự hình
thành u hạt
+ Gây u hạt bằng bông cotton
+ Gây u hạt bằng sợi thủy tinh
+ Gây u hạt bằng hạt nhựa PVC, amiant
- Thêm vào đó, các nghiên cứu đánh giá các yếu tố miễn dịch cũng
ngày càng phát triển, như:
+ Gây viêm khớp trên chuột cống bằng các hóa chất
+ Mô hình thực nghiệm gây viêm não tủy dị ứng
+ Phản ứng Schultz-Dale
+ Sốc phản vệ thụ động trên da
+ Phản ứng quá mẫn tức thì dạng Arthus


13
+ Phản ứng quá mẫn chậm
1.3.1. Mô hình gây tăng tính thấm thành mạch
Nghiên cứu này được tiến hành nhằm mục tiêu đánh giá khả năng của
thuốc thử làm giảm tính thấm thành mạch gây ra do các chất gây viêm [17].
Các chất trung gian hóa học của quá trình viêm như histamin, các
prostaglandin và các leucotrien gây giãn các tiểu động mạch và tiểu tĩnh mạch
và làm tăng tính thấm thành mạch, dẫn đến thoát dịch và protein huyết tương
và gây phù. Các thuốc kháng histamin H1, các chất ức chế chuyển hóa acid
arachidonic, các chất đối kháng receptor của leucotrien có thể làm giảm tác
dụng gây giãn mạch của các chất trung gian hóa học này. Các thuốc có tác
dụng ổn định màng tế bào cũng thể hiện tác dụng làm giảm tính thấm thành
mạch. Tiêm trong da hợp chất 48/80 gây khử hạt của tế bào mast là một phương
pháp làm tăng tính thấm thành mạch. Đánh giá mức độ tăng tính thấm thành
mạch dựa vào mức độ thâm nhiễm của thuốc nhuộm xanh Evan trên các vị trí
tiêm trên da [23, [24], [25].
1.3.2. Mô hình gây phù tai chuột bằng oxazolon
Mô hình gây phù tai bằng oxazolon trên chuột nhắt được mô tả lần đầu
tiên bởi Evan. Mô hình này gây ra phản ứng quá mẫn do tiếp xúc nhằm đánh
giá tác dụng chống viêm tại chỗ và toàn thân của các thuốc thử dùng theo
đường tại chỗ [17], [25].
1.3.3. Mô hình gây phù tai chuột bằng dầu croton
Mô hình thích hợp để đánh giá tác dụng chống viêm của các steroid dùng
tại chỗ cũng như các thuốc chống viêm không steroid [28], [40].
Mô hình gây phù tai bằng dầu croton có thể được tiến hành trên cả chuột
nhắt và chuột cống. Hỗn hợp dầu croton được sử dụng để gây kích ứng bao
gồm các thành phần: dầu croton, ethanol, pyridin và ethyl ether. Tỷ lệ các


14
thành phần trong hỗn hợp dầu croton khác nhau đối với mỗi loài động vật
thực nghiệm [28], [29], [30].
1.3.4. Mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenin
Trong các mô hình thực nghiệm được sử dụng để sàng lọc các loại thuốc
chống viêm, mô hình gây phù chân sau của chuột bằng cách tiêm một chất có
khả năng gây viêm (chất kích ứng) là một trong những mô hình được sử dụng
phổ biến nhất. Nhiều tác nhân gây viêm đã được sử dụng, như formaldehyd,
dextran, albumin trứng, kaolin, aerosil, các polysaccharid sulfat như
carrageenin hoặc naphthoylheparamin [16], [17], [19]. Một số chất chỉ gây
viêm trong khoảng thời gian ngắn, một số chất khác lại có thể kéo dài tình
trạng phù chân chuột hơn 24 giờ.

Hình 1.8. Máy đo viêm Plethysmometer No 7250 của Ugo - Basile (Italy)
1.3.5. Mô hình gây viêm khớp
Động vật thực nghiệm được chia thành 3 nhóm: nhóm bôi thuốc thử, nhóm
bôi thuốc chứng dương và nhóm chứng sinh học bôi dung môi được sử dụng để
pha thuốc thử và thuốc chứng dương. Mô hình viêm khớp trên chuột cống có thể
được gây ra bằng cách tiêm một số tác nhân gây viêm như carrageenan [19],
collagen [20] hoặc chất kích thích miễn dịch (adjuvant) [35], [38].


15
1.3.6. Mô hình gây viêm khớp bằng carrageenan
Carrageenan được pha trong một số dung môi như dung dịch đệm
phosphat hoặc nước muối sinh lý, và được tiêm vào khớp gối của chuột với thể
tích 10μL hoặc 50μL. Lô chứng sinh học chỉ tiêm khớp gối carrageenan và bôi
nước cất. Lô chứng dương được tiêm khớp gối carrageenan và tiêm nội khớp
hoặc tiêm màng bụng dexamethason. So sánh mức độ thay đổi của nồng độ
NGF trong dịch khớp của lô chứng sinh học và lô thuốc thử là chỉ tiêu đánh giá
khả năng ức chế viêm khớp gây ra bằng carrageenan của thuốc thử [17], [19].
1.3.7. Mô hình gây viêm khớp bằng formaldehyd
Mô hình gây viêm khớp bằng formaldehyd được thực hiện bằng cách
tiêm formaldehyd (0,1mL dung dịch formaldehyd 4%) vào bàn chân trái của
động vật thực nghiệm vào ngày thứ nhất và ngày thứ 3 của nghiên cứu. Theo
dõi sự thay đổi kích thước bàn chân hàng ngày, và kích thước bàn chân ở lô
thuốc thử sẽ được so sánh với lô chứng sinh học[17].
1.3.8. Mô hình gây viêm khớp bằng collagen
Mô hình gây viêm khớp bằng collagen trên chuột cũng được sử dụng khá
phổ biến để đánh giá tác dụng chống viêm của một thuốc. Collagen I, III (có
nguồn gốc từ da và nhiều mô trong cơ thể) và collagen II (có nguồn gốc từ
sụn) đều có thể dùng làm tác nhân gây viêm khớp trên thực nghiệm [20].
Đường kính khớp cổ chân (được đo bằng thước kẹp fowler) được so
sánh giữa lô thuốc thử với lô chứng sinh học và lô mô hình.
1.3.9. Mô hình gây viêm khớp bằng chất kích thích miễn dịch
Chuột cống được tiêm trong da 0,1mL (0,25mg) hỗn dịch dầu
Mycobacterium [35] hoặc 0,1mL (1mg) hỗn dịch dầu Mycobacterium ở gốc
đuôi. Một số nghiên cứu khác lại lựa chọn tiêm vào gốc đuôi chuột cống
0,1mL (0,5mg) hỗn dịch Mycobacterium butyricum trong parrafin lỏng. Độ
dày mắt cá chân ở lô bôi thuốc thử được đo và so sánh với các lô chứng.


16
1.3.10. Mô hình gây u hạt
Mô hình này được mô tả lần đầu tiên với Meier và cộng sự [17]. Khối u
hạt có thể được hình thành bằng cách cấy hạt bông vào dưới da gáy chuột
cống. Đánh giá tác dụng chống viêm của thuốc thử dựa vào:
- Trọng lượng trung bình của khối u hạt của nhóm bôi thuốc so với nhóm
chứng
- Phần trăm thay đổi trọng lượng u hạt của nhóm bôi thuốc so với nhóm
chứng


17

Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Thuốc và các hoá chất nghiên cứu
2.1.1.1. Thuốc nghiên cứu: Dịch chiết Sóng rắn tươi và khô
Liều dùng lâm sàng (kinh nghiệm dân gian): 2-3 lá giã/nhai, đắp trực
tiếp lên vết thương.
Dịch chiết Sóng rắn:
- Chiết từ lá tươi: 1kg cho 33 ml cao.
Liều dùng: 3 lá = 3g = 3*33/1000 = 0,1 ml
- Chiết từ lá khô: 1,5kg cho 90 ml cao
Liều dùng: 3 lá = 1g = 1*90/1500 = 0,06 ml
Dịch chiết nước lá cây sóng rắn tươi và khô thu hái tại Thái Nguyên.
Mẫu dược liệu được Ths. Nông Thị Anh Thư, Bộ môn Dược liệu, Trường Đại
học Y Dược Thái Nguyên định tên khoa học và lưu giữ tiêu bản tại…….
2.1.1.2. Hoá chất và máy móc:
- Kit định lượng các enzym và chất chuyển hoá trong máu : ALT
(alanin aminotransferase), AST (aspartat aminotransferase), bilirubin toàn
phần, albumin, cholesterol, creatinin của hãng Hospitex Diagnostics (Italy) và
hãng DIALAB GmbH (Áo), định lượng trên máy Screen master của hãng
Hospitex Diagnostics (Italy).
- Các dung dịch xét nghiệm máu của hãng Exigo, định lượng trên máy
Exigo - Boule Medical AB của Thụy Điển.
- Các hoá chất xét nghiệm và làm tiêu bản mô bệnh học.
Voltaren (diclofenac) dạng kem bôi 1 % của hãng Novartis. Lidocain
2% dạng kem bôi của hãng Pymepharco. Các hóa chất carrageenin, natri
clorid… đủ tiêu chuẩn phòng thí nghiệm - Trường Đại học Y Hà Nội.


18
Máy đo phản ứng đau bằng phương pháp rê kim, sản xuất bởi Ugo Basile, Italy
- Máy đo viêm Plethysmometer No 7250 của hãng Ugo - Basile (Italy).
- Thước đo độ dày (Độ chính xác: 0,02mm): MC 555 của hãng
Hangzhou tools and measuring tools Co., Ltd (China)
2.1.2. Động vật thực nghiệm
Cả hai giống, khoẻ mạnh
Thỏ chủng Newzealand White, lông trắng, trọng lượng 1,8-2,5 kg do
Trung tâm chăn nuôi Dê và Thỏ Sơn Tây cung cấp.
- Chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả 2 giống, khoẻ mạnh, trọng lượng 26
± 2 (g) do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp.
- Chuột cống trắng chủng Wistar, cả hai giống, khoẻ mạnh, trọng lượng
180 - 200g, do Trung tâm chăn nuôi động vật Đan Phượng, Hà Tây cung cấp
Động vật được nuôi trong phòng thí nghiệm 5-10 ngày trước khi
nghiên cứu bằng thức ăn chuẩn dành riêng (do Công ty liên doanh
Guyomarc’h-VCN sản xuất), nước tự do.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Nghiên cứu kích ứng da trên thỏ
Nghiên cứu khả năng gây kích ứng da của sản phẩm thuốc bôi Sóng rắn tươi,
Sóng rắn khô được tiến hành theo hướng dẫn của OECD và ISO 10993-10 về
việc đánh giá kích ứng da dành cho các sản phẩm dùng ngoài da.
Số lượng thỏ nghiên cứu: 03


19
Quy trình nghiên cứu được tiến hành trên thỏ như sau:
- Mỗi thỏ được nuôi trong chuồng riêng, cho ăn bằng thức ăn riêng, giữ
ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 tuần trước khi tiến hành nghiên cứu.
- Trước ngày nghiên cứu 24 giờ, thỏ được cạo lông ở phần hông và lưng
với diện tích 10 cm x 15 cm ở cả 2 bên cột sống để bôi thuốc và quan
sát các vị trí thử nghiệm.
- Trước khi tiến hành nghiên cứu, kiểm tra tình trạng da thỏ. Chỉ đưa vào
nghiên cứu những thỏ có tình trạng da bình thường, còn nguyên vẹn,
không có bất kỳ tổn thương nào.
- Chia phần da đã cạo lông thành 2 phần tương ứng với 2 bên cột sống,
chọn mỗi bên một diện tích 2,5 cm x 2,5 cm trên mỗi thỏ. Các thỏ
được bôi thuốc như sau:
 Một bên bôi mẫu nghiên cứu: bôi 0,5 ml mẫu nghiên cứu
 Một bên để làm chứng: bôi 0,5 ml nước sạch
- Đắp gạc sạch (kích thước 2,5 cm x 2,5 cm) lên cả 2 vùng bôi thuốc và
phần dùng làm chứng
- Lưng thỏ được băng (không băng quá chặt) bằng băng gạc và băng
dính, để trong 4 giờ
- Sau 4 giờ, tháo bỏ toàn bộ băng gạc ra khỏi lưng thỏ, rửa sạch mẫu thử
đã bôi trên da thỏ bằng nước sạch
- Đánh giá và tính điểm các chỉ số về ban đỏ (erythema), phù nề (edema)
tại thời điểm 1 giờ, 24, 48, 72 giờ sau khi loại bỏ mẫu thử. Nếu có tổn
thương, theo dõi thỏ 14 ngày để đánh giá khả năng phục hồi. Khi tổn
thương đã hồi phục thì ngừng theo dõi.


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×

×