Tải bản đầy đủ

NGHIÊN cứu THỰC TRẠNG NHIỄM sán lá GAN NHỎ và CHẾ tạo bộ KIT LAMP để CHẨN đoán NHIỄM sán lá GAN NHỎ tại NINH BÌNH và PHÚ yên, năm 2018 2021

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG
-----------------*-----------------

PHẠM THỊ HÀ TRANG

NGHIÊN CỨU THỰC TRẠNG
NHIỄM SÁN LÁ GAN NHỎ VÀ CHẾ TẠO BỘ KIT
LAMP ĐỂ CHẨN ĐOÁN NHIỄM SÁN LÁ GAN NHỎ
TẠI NINH BÌNH VÀ PHÚ YÊN, NĂM 2018-2021

CHUYÊN NGÀNH: DỊCH TỄ HỌC
MÃ SỐ: 9720117

ĐỀ CƯƠNG DỰ TUYỂN NGHIÊN CỨU SINH

HÀ NỘI – 2018



MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ.......................................................................................................1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................5
1.1. Đại cương về sán lá gan nhỏ.....................................................................5
1.1.1 Hình thể...............................................................................................5
1.1.2 Chu kỳ phát triển.................................................................................6
1.1.3 Phương thức lây truyền bệnh ở người.................................................7
1.1.4 Bệnh học..............................................................................................7
1.1.5 Triệu chứng.........................................................................................7
1.1.6 Chẩn đoán............................................................................................8
1.2. Thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên thế giới và Việt Nam.....................8
1.3. Đặc điểm và tình hình nhiễm sán lá gan nhỏ tại Ninh Bình và Phú Yên 11
1.4. Các kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán sán lá gan nhỏ.................................13
1.5. Tổng quan về kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt và ứng dụng phát triển kít
phân tử chẩn đoán xác định mầm bệnh tại thực địa.........................................16
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................29
2.1. Đối tượng, địa điểm, thời gian nghiên cứu...............................................29
2.1. Đối tượng nghiên cứu...............................................................................29
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.............................................................29
2.2.1. Thời gian............................................................................................29
2.2.2. Địa điểm nghiên cứu..........................................................................29
2.3. Thiết kế nghiên cứu...................................................................................29
2.3.1. Mục tiêu 1: Đánh giá thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người tại
một số vùng dịch tễ tỉnh Ninh Bình và Phú Yên..........................................29


2.3.2. Mục tiêu 2: Nghiên cứu chế tạo bộ kít LAMP để chẩn đoán nhiễm sán
lá gan nhỏ Clonorchis sinensis và Opisthorchis viverrini nhiễm trên người.
......................................................................................................................30
2.3.3. Mục tiêu 3: Đánh giá khả năng ưng dụng bộ kít LAMP để phát hiện
nhiễm sán lá gan nhỏ trên người tại tỉnh Ninh Bình và Phú Yên.................31
2.4. Nội dung nghiên cứu.................................................................................31
2.5. Thiết bị và vật liệu.....................................................................................32
2.6. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu....................................................35
2.7. Các chỉ số nghiên cứu...............................................................................37
2.8. Thu thập số liệu, xử lý số liệu...................................................................37
2.9. Sai số và khống chế sai số.........................................................................37
2.10. Đạo đức trong nghiên cứu.......................................................................37
Chương 3: DỰ KIẾN KẾT QUẢ......................................................................38
3.1. Đánh giá thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người tại một số vùng dịch
tễ tỉnh Ninh Bình và Phú Yên..........................................................................38
3.1.1.Tỷ lệ nhiễm và cường độ nhiễm sán lá gan nhỏ của người dân tại một
số vùng dịch tễ tỉnh Ninh Bình và Phú Yên.................................................38
3.2. Nghiên cứu chế tạo bộ kít LAMP để chẩn đoán nhiễm sán lá gan nhỏ
Clonorchis sinensis và Opisthorchis viverrini nhiễm trên người.....................38
3.3. Ứng dụng bộ kít LAMP để phát hiện tỉ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ trên
người tại tỉnh Ninh Bình và Phú Yên...............................................................38
Chương 4: DỰ KIẾN BÀN LUẬN...................................................................39
DỰ KIẾN KẾT LUẬN.......................................................................................39
DỰ KIẾN KIẾN NGHỊ.....................................................................................40
KẾ HOẠCH NGHIÊN CỨU.............................................................................40
TÍNH KHOA HỌC, TÍNH MỚI, TÍNH KHẢ THI CỦA ĐỀ TÀI................40


DANH MỤC HÌNH
Hình 1: Các vị trí thiết kế các mồi LAMP...........................................................18
Hình 2. Sơ đồ phản ứng tạo vật liệu khởi đầu......................................................20
Hình 3. Tái bản và kéo dài chuỗi ADN................................................................21
Hình 4. Các bước tiến hành kỹ thuật LAMP........................................................22

DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1 Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ chung
Bảng 3.2. Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ theo giới
Bảng 3.3. Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ theo nhóm tuổi
Bảng 3.4. Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ theo nghề nghiệp
Bảng 3.5. Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ theo trình độ học vấn
Bảng 3.6. Cường độ nhiễm trứng sán lá gan nhỏ
Bảng 3.7: Cường độ nhiễm trứng sán lá gan nhỏ theo giới


1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Sán lá gan nhỏ là loài sán lá gây bệnh trên người với tỷ lệ nhiễm cao tại
nhiều quốc gia vùng Đông Nam Châu Á như Trung Quốc, Hàn Quốc, Triều Tiên,
Nhật Bản, Việt Nam, Lào, Campuchia [1, 2]. Người nhiễm sán lá gan nhỏ thường
không có các triệu chứng cấp tính rõ ràng, nhưng khi bị nhiễm mãn tính thường có
một số biểu hiện lâm sàng như đau bụng, đau thượng vị, mệt mỏi, vàng da, nôn, sốt
nhẹ và tiêu chảy [1]. Tuy vậy, ảnh hưởng nghiêm trọng nhất khi nhiễm sán lá gan
nhỏ là nguy cơ gây ung thư gan cao, theo thống kê sán lá gan nhỏ được xếp vào
nhóm các tác nhân sinh học số 1 gây ung thư gan ở người [3].
Có hai loài sán lá gan nhỏ thường gặp là Clonorchis sinensis, Opisthorchis
viverrini. Trong đó, loài sán lá gan nhỏ C. sinensis phân bố chủ yếu ở Trung
Quốc, Hàn Quốc và Việt Nam. Sán lá gan nhỏ O. viverrini được tìm thấy chủ yếu
ở Campuchia, Lào, Thái Lan và Việt Nam [4].
Tại Việt Nam đã phát hiện được hai loài sán lá gan nhỏ là C. sinensis và
O. viverrini với hai vùng dịch tễ rõ rệt. Loài C.sinensis lưu hành cao ở vùng
đồng bằng Bắc bộ. Theo thống kê của Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng
Trung ương từ năm 1976 đến 2004, đã xác định bệnh sán lá gan nhỏ C. sinensis
lưu hành ít nhất ở 15 tỉnh với tỷ lệ nhiễm trung bình 19%, một số nơi có tỷ lệ
nhiễm cao tới 37% như Nam Định, Hoà Bình, Ninh Bình 20-30%. Trong khi đó
loài sán lá gan nhỏ O. viverrini lưu hành chủ yếu ở các tỉnh phía Nam như Phú
Yên có tỷ lệ nhiễm 36,9%, Bình Định 11,9%, Đăk Lăk 7,6%, Đà Nẵng 0,3%,
Quảng Nam 4,6%, Khánh Hoà 1,4%. Đến nay, đã ghi nhận bệnh sán lá gan nhỏ
lưu hành ở ít nhất 32 tỉnh trong cả nước, tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ có khác nhau
ở mỗi điểm nghiên cứu [4, 5].


2
Bệnh sán lá gan nhỏ được chẩn đoán dựa vào một số yếu tố như dịch tễ,
lâm sàng, các xét nghiệm cận lâm sàng. Hiện nay, xét nghiệm tìm trứng hoặc sán
lá gan nhỏ trưởng thành trong phân hoặc dịch tá tràng được xem là tiêu chuẩn
chẩn đoán “vàng” trong chẩn đoán xác định bệnh sán lá gan nhỏ [2]. Phương
pháp Kato-Katz được WHO (1994) khuyến cáo sử dụng để xét nghiệm phân phát
hiện trứng giun sán tại những vùng dịch tễ có tỷ lệ nhiễm giun ≥ 20%, các loài
sán ≥ 10%. Đây là kỹ thuật có thể phát hiện được trứng giun, sán lá gan nhỏ, sán
lá ruột, sán dây, sán lá gan lớn trong phân, áp dụng được tại thực địa. Tuy nhiên,
do lượng trứng trong phân thấp nên các phương pháp xét nghiệm phân tìm trứng
giun sán có độ nhạy không cao (chỉ khoảng 30%), độ đặc hiệu phụ thuộc nhiều
vào kinh nghiệm của kỹ thuật viên, dễ nhầm lẫn giữa trứng của các loài sán lá gan
nhỏ và với trứng của sán lá ruột nhỏ [2]. Phương pháp tập trung trứng bằng ly tâm
lắng cặn theo Esteban và CS (1997) [6] hoặc ly tâm lắng cặn formalin–ether cải tiến
là phương pháp có độ chính xác cao, ngoài trứng giun sán còn có thể phát hiện
được đơn bào thể kén, dễ dàng kiểm tra lại các mẫu nghi ngờ do mẫu phân có thể
được bảo quản trong formalin 10%. Tuy vậy, do lượng trứng trong phân ít nên dễ
bỏ sót bệnh nhân, khó áp dụng xét nghiệm tại thực địa [7], [2].
Các xét nghiệm miễn dịch phản ứng kháng nguyên gián tiếp (Indirect
hemagglutination test: IHA), phản ứng kháng thể huỳnh quang gián tiếp (Indirect
Fluorescent anlibody (IFA), phản ứng ELISA (enzyme-Linked immunosorbent
assay) có độ nhạy cao, độ đặc hiệu tùy thuộc vào từng loại test và còn nhiều
tranh luận do có hiện tượng dương tính kéo dài và lai chéo giữa các loài, khó
triển khai tại thực địa [2, 8, 9].
Chẩn đoán bằng sinh học phân tử sử dụng các gen đích ITS1, ITS2 và
ADN ty thể với các kỹ thuật PCR, real time PCR để chẩn đoán sán lá gan nhỏ O.
viverrini hay C. sinensis cho độ nhạy và độ đặc hiệu cao [10-12]. Tuy vậy chưa


3
được áp dụng rộng rãi do giá thành cao và khâu kỹ thuật phức tạp, không triển
khai được tại thực địa mà chủ yếu được ứng dụng trong đánh giá hiệu lực của
thuốc điều trị, giám sát tái nhiễm hay phát hiện các vùng dịch tễ mới của sán lá
gan nhỏ tại khu vực Đông Nam Á [13].
Để khắc phục những giới hạn của phương pháp PCR truyền thống và Real
time PCR trong chẩn đoán xác định mầm bệnh tại thực địa, các nghiên cứu gần
đây có xu hướng chuyển sang các phương pháp khuếch đại ADN đẳng nhiệt với
những ưu điểm là độ nhạy và đặc hiệu tương đương kỹ thuật PCR nhưng loại bỏ
được các bước luân nhiệt nên chỉ cần các thiết bị xét nghiệm đơn giản, nhỏ gọn,
thời gian xét nghiệm được rút ngắn xuống còn 30 - 60 phút, đặc biệt các kỹ thuật
khuếch đại đẳng nhiệt có khả năng phát triển thành các bộ kít phân tử cho phép
ứng dụng được tại thực địa [4, 14].
Kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt LAMP (Loop-Mediated Isothermal
Amplification được nghiên cứu và phát triển từ năm 1998 [15]. Đây một phương
pháp nhân bản gen mới, có thể tổng hợp một đoạn ADN lớn mà không cần chu
trình biến nhiệt. Đặc điểm phương pháp là sử dụng 4 mồi khác nhau được thiết
kế đặc biệt để nhận ra 6 vùng riêng biệt trên gen đích và phản ứng diễn ra ở một
nhiệt độ duy nhất (650C). Thành phần phản ứng gồm có ADN khuôn, mồi,
enzyme Bst DNA polymerase. Những ưu điểm vượt trội của công nghệ này so
với các kỹ thuật đang sử dụng hiện nay như:
+ Độ nhạy, độ đặc hiệu cao tương đương với các phương pháp PCR.
+ ADN làm khuôn khuếch đại không đòi hỏi độ tinh sạch cao, do đó có thể
sử dụng các phương pháp tách chiết đơn giản, tiết kiệm được kinh phí,
thời gian.
+ Phát hiện kết quả trực tiếp bằng mắt thường hoặc sử dụng các thuốc
nhuộm hoặc que thử miễn dịch: Đơn giản, chính xác, tránh được tạp


4
nhiễm, tiết kiệm thời gian, kinh phí, không tiếp xúc với hóa chất độc hại
giúp đảm bảo sức khỏe cho người thực hiện.
+ Thời gian xét nghiệm nhanh, xét nghiệm đồng thời nhiều mẫu.
+ Thực hiện được tại thực địa, dễ chuyển giao kỹ thuật cho y tế tuyến cơ sở.
+ Hóa chất, vật tư để chế tạo kít phổ biến trên thị trường nên dễ mua, giá
thành rẻ hơn so với các công nghệ khuếch đại đẳng nhiệt khác như RPA,
NASBA....
+ Chi phí cho xét nghiệm rẻ do không đòi hỏi đầu tư các thiết bị đắt tiền so
với các phương pháp sinh học phân tử khác như PCR, RT-qPCR. Hoạt
động phản ứng LAMP diễn ra trong điều kiện đẳng nhiệt (ví dụ như ở
650C).
Nhằm đánh giá thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên cộng đồng dân cư tại
vùng dịch tễ sán lá gan nhỏ tại Ninh Bình và Phú Yên và chế tạo bộ kít phân tử
có độ nhạy, độ đặc hiệu cao để đáp ứng nhu cầu nâng cao chất lượng chẩn đoán
bệnh sán lá gan nhỏ, chúng tôi thực hiện đề tài Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán
lá gan nhỏ và chế tạo bộ kit lamp để chẩn đoán nhiễm sán lá gan nhỏ tại ninh
bình và phú yên, năm 2018-2021 với 3 mục tiêu sau:
1. Đánh giá thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người tại một số vùng
dịch tễ tỉnh Ninh Bình và Phú Yên.
2. Nghiên cứu chế tạo bộ kít LAMP để chẩn đoán nhiễm sán lá gan nhỏ
Clonorchis sinensis và Opisthorchis viverrini nhiễm trên người.
3. Ứng dụng bộ kít LAMP để phát hiện tỉ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ trên
người tại tỉnh Ninh Bình và Phú Yên.


5
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đại cương về sán lá gan nhỏ
Sán lá gan nhỏ là một trong những loài sán lá chính gây bệnh trên người.
Trên thế giới đã tìm thấy có 3 loài sán lá gan nhỏ là Clonorchis sinensis,
Opisthorchis viverrini và Opisthorchis felineus.
1.1.1 Hình thể
Sán trưởng thành.
Sán lá gan nhỏ C.sinensis có hình lá, thân dẹt, màu đỏ nhạt. Sán dài 1012mm, rộng 2-4mm, có hai mồm hút, mồm hút phía trước thông với đường tiêu
hoá có đường kính 600 µm, mồm hút phía sau (mồm hút bụng) có đường kính
500µm. Ống tiêu hoá chạy dọc 2 bên thân và là ống tắc, không nối thông với
nhau. Sán không có hậu môn vì dinh dưỡng của sán chủ yếu là thẩm thấu các
chất dinh dưỡng qua bề mặt sán. Do vậy trên thân sán có nhiều tuyến dinh
dưỡng.
Trên thân sán có cả bộ phận sinh dục đực và cái. Tinh hoàn chia nhánh,
chiếm gần hêt phía sau thân. Buồng trứng ở khoảng giữa thân, tử cung chạy
ngoằn ngoèo, trong chứa nhiều trứng.
Trứng
Trứng sán lá gan rất nhỏ, kích thước 16-17µm x 26-30µm, hình bầu dục,
một cực có nắp giống hình chóp mũ, một cực phình to hơn giống chiếc lọ phình
đáy và có gai nhỏ. Trứng mầu vàng sẫm. Vỏ mỏng, nhẵn, có đường viền kép.
Bên trong là khối nhân có thể có hình ảnh ấu trùng.

1.1.2 Chu kỳ phát triển


6
Sán lá gan nhỏ ký sinh ở các ống mật nhỏ trong gan. Nếu nhiều, sán có thể
phá huỷ nhu mô gan và ký sinh ở tổ chức gan. Sán dinh dưỡng bằng cách thẩm
thấu các chất dinh dưỡng từ dịch mật.
Sán lá gan đẻ trứng tại các ống mật. Trứng theo mật xuống ruột và theo
phân ra ngoài. Trứng cần có môi trường nước để phát triển thành ấu trùng lông.
Ấu trùng lông bơi tự do trong nước tìm tới ký sinh ở một số loài ốc để phát triển
thành vĩ ấu trùng (ấu trùng đuôi) sau khi vào ốc từ 21-30 ngày. Sán lá gan nhỏ có
vật chủ chính là người, ngoài ra các loài động vật khác như chó, mèo, lợn, chuột,
chồn cũng là vật chủ của sán lá gan nhỏ. Để gây nhiễm được cho người hay vật
chủ khác, sán lá gan nhỏ phải ở giai đoạn ấu trùng có khả năng gây nhiễm (giai
đoạn ấu trùng lông). Khi ăn phải thức ăn có chứa ấu trùng sán lá gan nhỏ ở giai
đoạn có khả năng gây nhiễm, ấu trùng này theo thức ăn từ thực quản đi xuống dạ
dày rồi tá tràng, tại đây các ấu trùng đó sẽ tìm cách chui lên đường mật và đến
khu trú tại các nhánh đường dẫn mật trong gan. Các ấu trùng sẽ mất khoảng vài
tháng để trở thành sán lá gan nhỏ trưởng thành và sán lá gan nhỏ trưởng thành có
thể tồn tại trong gan tới 20 - 25 năm. Trong quá trình đó trứng của sán lá gan nhỏ
tạo ra sẽ lại theo đường dẫn mật đi xuống ruột và theo phân thải ra ngoài môi
trường - nguồn nước. Trong môi trường nước, trứng sán lá gan nhỏ được vật
chủ trung gian thứ nhất là ốc ăn, trong cơ thể của ốc trứng của sán lá gan nhỏ
sẽ phát triển qua ba giai đoạn. Khi đã ở dạng trùng lông, chúng sẽ được đào
thải ra ngoài và bơi lội trong môi trường nước, khi gặp một số loài cá nước
ngọt giữ vai trò vật chủ trung gian thứ hai, ấu trùng này sẽ xuyên qua da cá để
kết thành nang trong thịt cá và trở thành dạng ấu trùng nang có khả năng gây
nhiễm cho người [16].
1.1.3 Phương thức lây truyền bệnh ở người.


7
Miền Bắc nước ta, cá được rửa sạch, đánh vẩy, lọc thịt, thịt cá được thấm
khô, thái nhỏ rồi trộn cùng với nước chát củ búp ổi. Sau đó thịt cá được trộn
thính cùng gia vị và ăn kèm cùng nhiều loại lá thơm.
Miền Nam (Phú Yên) có tập quán ăn gỏi cá là “gỏi sinh cầm”, nghĩa là ăn
cả con cá còn đang sống, đang bơi trong chậu dùng vó vớt từng con, nhắm rượu
với đủ loại lá thơm, tập quán này cũng có từ lâu đời trong nhân dân địa phương.
Do vậy tỷ lệ nhiễm O.viverrini khá phổ biến [16].
Một số trường hợp trong vùng dịch tễ sán lá gan nhỏ, tuy không ăn gỏi cá
nhưng cũng bị nhiễm bệnh do ăn cá rán chưa chín (phần thịt còn sống).
1.1.4 Bệnh học
Sán lá gan gây những tổn thương nghiêm trọng ở gan. Sán gây kích thích
thường xuyên đối với gan, đồng thời chiếm thức ăn và gây độc. Vị trí ký sinh và
kích thước của sán dễ gây hiện tượng tắc. Do sán thường bám chặt vào ống mật,
dùng mồm để hút thức ăn nên lâu dần gan sẽ bị xơ hóa lan toả ở khoảng cửa, tổ
chức gan bị tăng sinh và có thể đẩn tới hiện tượng xơ hoá gan, cổ chướng , thoái
hoá mỡ ở gan. Độc tố do sán tiết ra có thể gây nên các tình trạng dị ứng, đôi khi
có thể gây thiếu máu, tăng bạch cầu ái toan.
Về thương tổn bệnh học, gan bị to rõ rệt. Trọng lượng của gan có thể tới
4kg. Ở mặt gan có những điểm phình giãn, những chỗ phình giãn thường có màu
trắng nhạt và tương ứng với sự giãn nở của ống mật. Nếu cắt các điểm phình
giãn thấy chảy ra dịch màu xanh xám.
1.1.5 Triệu chứng
Biểu hiện lâm sàng của bệnh sán lá gan nhỏ phụ thuộc vào cường độ
nhiễm và phản ứng của vật chủ. Trong trường hợp nhiễm ít không có triệu chứng
gì đặc biệt. Trường hợp nhiễm sán lá gan với số lượng trên 100 con thì bệnh biểu
hiện qua 2 giai đoạn sau: Giai đoạn khởi phát người bệnh thường bắt đầu với các


8
biểu hiện của rối loạn dạ dày ruột như chán ăn, ăn không tiêu, đau âm ỉ vùng
gan, tiêu chảy hoặc táo bón thất thường. Kèm theo có thể thấy toàn thân phát
ban, nổi mẩn. Giai đoạn toàn phát người bệnh đau vùng gan nhiều hơn, kèm theo
thiếu máu, vàng da và cổ trướng có thể xuất hiện ở giai đoạn muộn. Nếu có bội
nhiễm do vi khuẩn, bệnh nhân có thể sốt thành từng cơn hoặc sốt kéo dài.
1.1.6 Chẩn đoán
* Lâm sàng: Không đặc hiệu vì dễ nhầm với các bệnh gan mật khác.
* Xét nghiệm: Xét nghiệm phân tìm trứng bằng kỹ thuật trực tiếp hoặc tập trứng.
- Xét nghiệm phân tìm trứng sán là biện pháp đơn giản nhưng có tính chất
khẳng định việc mắc bệnh. Trường hợp nhiễm ít cần phải xét nghiệm dịch tá tràng.
- Trong trường hợp không tìm thấy trứng sán, các xét nghiệm miễn dịch
cùng với hình ảnh siêu âm có giá trị chẩn đoán. Các xét nghiệm đánh giá chức
năng gan có giá trị trong việc đánh giá thương tổn và tiên lượng bệnh.
* Siêu âm: Siêu âm vùng gan có thể phát hiện được sán lá gan và các thương
tổn do sán lá gan.
1.2. Thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên thế giới và Việt Nam
Hai loài sán lá gan nhỏ chính thường gặp gây bệnh ở người là Clonorchis
sinensis, Opisthorchis viverrini. Các vùng dịch tễ của sán lá gan nhỏ là khu vực
Đông Nam Á (Lào, Việt Nam, Campuchia và Thái Lan), khu vực Đông Á (Trung
Quốc, Hàn Quốc, Đài loan, Nhật Bản) và một phần Đông Bắc của Nga. Trong
đó, loài sán lá gan nhỏ C. sinensis phân bố chủ yếu ở Trung Quốc, Hàn Quốc và
Việt Nam. Sán lá gan nhỏ O. viverrini được tìm thấy chủ yếu ở Campuchia, Lào,
Thái Lan và Việt Nam [4]. Clonorchis sinensis được Mcconell tìm ra đầu tiên
năm 1875 trên tử thi người Trung Quốc ở Calcutta Ấn Độ và được Cobbold đặt
tên là Distoma sinense. Dựa vào hình thái học, Loose (1907) và Kobayashi
(1912) thống nhất đặt tên là Clonorchis sinensis.


9
Bệnh phân bố phía Đông từ Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc (trừ Tây
Nam), Đài Loan và miền Bắc của Việt Nam. Năm 1947, Stoll thông báo có 19
triệu người bị nhiễm sán lá gan nhỏ Clonorchis. Tại Nhật: 1886-1898, tỷ lệ
nhiễm sán lá gan 30-67% dọc sông Ton, hồ Kasumigaura, đồng bằng Nobi, Aichi
và Gifu, vùng hồ Biwa, sông Onga và sông Chigugo, năm 1963 có nơi tỷ lệ
nhiễm là 40-50%. Tại Triều Tiên: Trường hợp C. sinensis đầu tiên được công bố
năm 1915 (Matsumoto). Seo và CS (1958) công bố tỷ lệ nhiễm 11,7%, năm 1969
tỉ lệ nhiễm 4,7% bằng xét nghiệm phân Kato. Tỷ lệ nhiễm 11,1-21,1% bằng test
trong da (Wathon và Chyn, 1959 và Rim và cs, 1973). Bằng test trong da với
kháng nguyên C. sinensis xét nghiệm ở học sinh tiểu học sống dọc sông lớn như
sông Han, sông Nakdong, sông Kuno, sông Yeongsan và sông Mangyong và trên
4676 giáo viên có tỷ lệ dương tính 11,1%. Tại sông Nakdong gần Pusan miền
Đông Hàn Quốc tỷ lệ nhiễm tới 82,9%, ở làng Kimhae Gun và cường độ nhiễm
10.698 trứng/gam phân trong số 284 trường hợp (Rim, 1973). Gần đây Seo và
CS (1981) xét nghiệm phân 13.373 người, tỷ lệ nhiễm trung bình là 21,5% trong
đó cao nhất ở sông Nakdong (40,2%) và thấp nhất ở sông Mangyong (8%) ước
tính có 830.000-890.000 người trong số 4 triệu người trong vùng lưu hành bệnh.
Tại Trung Quốc: C. sinensis phân bố ở hầu hết các vùng ở Trung Quốc, trừ
vùng Tây - Nam. Miền Nam Trung Quốc, đặc biệt ở tỉnh Kwangtung tỷ lệ nhiễm
trên 40%, có làng nhiễm 100% (Komiya, 1966). Bệnh phân bố ở ít nhất 21 tỉnh
của Trung Quốc với tỷ lệ nhiễm từ 0,08-57%, nhiều vùng nhiễm trên 5% (Xu
Long Qi, 2004).
Tại Đài Loan: Trường hợp đầu tiên C. sinensis được phát hiện năm 1915
(Choi) và được nghiên cứu chi tiết bởi Chow (1960), Kim và Kuntz (1964),
Cross (1969). Có 3 vùng lưu hành bệnh như Meinung, Kaohsing, Hsien ở miền
Nam, hồ Sun-Moon và Miao-Li ở miền Trung. Bằng xét nghiệm phân tại


10
Meinung cho thấy 10-52% nhiễm C. sinensis (Chow 1960, Hsieh 1989, Huang
1957, Kuntz 1961), tại vùng gần hồ Sun-Moon tỷ lệ nhiễm 39-51% (Clarke
1971) và tại Miao-Li tỷ lệ nhiễm 57% (Ong và Lu, 1979).
Hiện nay, ước lượng số người nhiễm bệnh trên toàn cầu với C. sinensis là
khoảng 35 triệu và gần một nửa trong số bệnh nhân này (khoảng 15 triệu) ở
Trung Quốc [17].
Sán lá gan nhỏ Opisthorchis viverrini lần đầu tiên được Lieper mô tả
(1911), lấy từ tử thi của hai tù nhân ở một nhà tù Chiengmai, phía Bắc Thái Lan
vào năm 1911. Bedier và Chesneau (1929) đã phát hiện thấy O. viverrini nhiễm
ở những người dân tại (15%) và Takhet (23%). Sau này Sadun (1955) đã nghiên
cứu về hình thái và dịch tễ học của loài sán lá gan này ở Đông Bắc Thái Lan và
đã đi đến kết luận là những trường hợp bị nhiễm sán ở Thái Lan là do O.
viverrini, và đã cũng được (Wykoff và cs, 1965) xác nhận lại.
Hiện nay, sán lá gan nhỏ O. viverrini đã được xác định có phân bố ở các
nước Đông Nam Á như Thái Lan, Lào, Malaysia, Việt Nam, Campuchia, Trung
Quốc. Ước tính có khoảng 10 triệu người nhiễm trong đó có gần 8 triệu người
nhiễm tại Thái Lan, gần 2 triệu người nhiễm tại Lào. Đặc biệt ở Thái Lan điều tra
60 làng trong 7 tỉnh Đông Bắc có tỉ lệ nhiễm 8-68% (Sithithaworn và cs., 1994),
ở Lào có tới 1,7 triệu người nhiễm, có nơi tỉ lệ nhiễm tới 54,4-100% [18].
- Ở Việt Nam: Từ năm 1908 Mouzel, 1909 Mathis và Leger đã tìm thấy
C.sinensis. Năm 1924 Railiet phát hiện được O.felineus ở Hà Nội. Năm 1965
Đặng Văn Ngữ và Đỗ Dương Thái bắt gặp một trường hợp O.felineus phối hợp
với C.sinensis.
Tại Việt Nam đã phát hiện được hai loài sán lá gan nhỏ là C. sinensis và
O. viverrini với hai vùng dịch tễ khác nhau rõ rệt. Loài C. sinensis lưu hành cao
ở vùng đồng bằng Bắc bộ. Theo thống kê của Viện Sốt rét - KST - CTTƯ từ năm


11
1976 đến 2004, đã xác định bệnh sán lá gan nhỏ C. sinensis lưu hành ít nhất ở 15
tỉnh với tỷ lệ nhiễm trung bình 19%, một số nơi có tỷ lệ nhiễm cao tới 37 % như
Nam Định, Hoà Bình, Ninh Bình 20-30%. Trong khi đó loài sán lá gan nhỏ O.
viverrini lưu hành chủ yếu ở các tỉnh phía Nam như Phú Yên có tỷ lệ nhiễm
36,9%, Bình Định 11,9%, Đăk Lăk 7,6%, Đà Nẵng 0,3%, Quảng Nam 4,6%,
Khánh Hoà 1,4%... Đến nay, đã ghi nhận bệnh sán lá gan nhỏ lưu hành ở ít nhất
32 tỉnh trong cả nước, tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ có khác nhau ở mỗi điểm
nghiên cứu [19].
1.3. Đặc điểm và tình hình nhiễm sán lá gan nhỏ tại Ninh Bình và Phú Yên
Kết quả nghiên cứu đề tài “ Tình hình nhiễm sán lá gan và biến động của
tỷ lệ nhiễm tại một số điểm điều tra có can thiệp một phần bằng điều trị đặc
hiệu” giai đoạn 1991-1995 do PTS. Nguyễn Văn Đề làm chủ nhiệm đề tài cho
thấy: Tại các điểm nghiên cứu ở miền Bắc Việt Nam (Kim Sơn - Ninh Bình)
nhân dân có tập quán ăn sỏi cá mè Hypophtalmichthic molitrix. Loài sán nhiễm
là Clonorchis sinensis, tỷ lệ nhiễm trên người là 18,5-29,6 phần trăm, tỷ lệ nhiễm
trên chó là 4/14, trên mèo là 8/19. Tỷ lệ nhiễm Metacerania trên cá mè là 26,8
phần trăm - 56,4 phần trăm. Tại điểm miền Nam (An Mỹ - Phú Yên) nhân dân có
tập quán ăn sỏi cá diếc Carassins carassius. Loài sán nhiễm là Opisthorchis
Viverrini. Tỷ lệ nhiễm trên người là 36,9 phần trăm, trên mèo là 6/10. Tỉ lệ
nhiễm Cereaniac trên ốc M. tuberculatus là 8 phần trăm. Tỉ lệ nhiễm
Metacercaniac trên cá diếc là 40-49 tuổi. Tại các điểm nghiên cứu tỷ lệ nhiễm
sán lá gan tăng dần theo nhóm tuổi và tỷ lệ cao nhất ở nhóm 40-49 tuổi.
Nguyễn Văn Đề (2003) đã xét nghiệm phân trên 30.000 người, phát hiện
bệnh sán lá gan nhỏ ở 15 tỉnh miền Bắc và miền Trung. Tỉ lệ nhiễm trên người
biến động từ 0,2% (Thái Bình) đến 36,9% (Phú Yên). Chó nhà nhiễm 28,6%,
mèo nhà nhiễm 64,2%. Nguyễn Văn Chương (2004) xét nghiệm 2249 mẫu phân


12
người ở tỉnh Phú Yên, Bình Định, Quảng Ngãi và Quảng Nam cho thấy tỉ lệ
nhiễm sán lá gan ở cả 4 địa điểm là 13,16%. Người nhiễm chủ yếu là do tập quán
ăn gỏi cá sống.
Kết quả nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học bệnh sán lá
gan nhỏ tại huyện Yên Khánh, Kim Sơn tỉnh Ninh Bình năm 2016 và đề xuất
biện pháp phòng chống.” của Học viện Quân Y do TS. Lê Trần Anh làm chủ
nhiệm nhiệm vụ cho thấy:
Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ trên người tại hai huyện Kim Sơn, Yên Khánh
là 19,5%; chưa có sự khác biệt tỷ lệ nhiễm giữa hai huyện. Tỷ lệ nhiễm ở nam
giới (26,6%) cao hơn ở nữ (8,3%) (p< 0,001; OR = 3,994). Cường độ nhiễm sán
trung bình ở nam cao hơn ở nữ.
Người ăn gỏi cá có nguy cơ nhiễm sán cao gấp 5,8 lần không ăn gỏi cá
(p<0,001). Cường độ nhiễm sán trung bình là 564,10; đa số (87,2%) đối tượng
nhiễm nhẹ, không có đối tượng nào nhiễm mức độ nặng.
Tình hình nhiễm ấu trùng sán trên cá mè (Hypophthalmichthys molitrix), cá mòi
(Konosirus punctatus) thu được tại địa điểm nghiên cứu: 71,4% cá mè nhiễm
nang ấu trùng sán, cá mòi không nhiễm nang ấu trùng sán. Chưa phát hiện được
ấu trùng sán Clonorchis sinensis trên cá tại địa điểm nghiên cứu. 71,4% cá mè
nhiễm nang ấu trùng sán lá ruột Haplorchis pumilio, mật độ trung bình 8,75 ấu
trùng/cá, 0,0299 ấu trùng/gam cá. 2,6% cá mè nhiễm Haplorchis taichui, mật độ
0,0390 ấu trùng/cá; 0,00001 ấu trùng/gam cá.
Tỷ lệ, cường độ nhiễm chưa có sự khác biệt giữa cá thu được tại ba xã
nghiên cứu.
1.4. Các kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán sán lá gan nhỏ


13
Chẩn đoán bệnh sán lá gan nhỏ dựa vào một số yếu tố như dịch tễ, lâm
sàng, xét nghiệm cận lâm sàng (Xét nghiệm tìm trứng sán lá gan nhỏ trong phân
hoặc dịch tá tràng, các xét nghiệm miễn dịch, sinh học phân tử).
Yếu tố dịch tễ: Đã từng ăn gỏi cá, ăn cá chưa nấu chín hoặc sống ở trong
vùng có tập quán ăn gỏi cá.
Dấu hiệu lâm sàng: Có một số biểu hiện của các triệu chứng lâm sàng như:
đau tức vùng gan, ậm ạch khó tiêu, kém ăn, thường có rối loạn tiêu hóa (phân nát
hoặc bạc màu, phân không thành khuôn….), đôi khi có xạm da, vàng da. Bệnh nhân
có thể có dấu hiệu gan to hay xơ gan tùy mức độ và thời gian mắc bệnh.
Xét nghiệm tìm trứng, hoặc sán lá gan nhỏ trưởng thành trong phân hoặc
dịch tá tràng được xem là tiêu chuẩn chẩn đoán “vàng” trong chẩn đoán xác định
bệnh sán lá gan nhỏ. Có nhiều phương pháp xét nghiệm phân tìm trứng sán lá
gan nhỏ khác nhau như xét nghiệm trực tiếp bằng nước muối sinh lý hoặc
Lugôn, xét nghiệm phân theo phương pháp Kato (định tính) và Kato-Katz (định
lượng); Phương pháp ly tâm lắng cặn Formalin-Ether (FECT-. Formalin-Ether
concentration technique).
Phương pháp tập trung trứng bằng ly tâm lắng cặn theo Esteban và CS
(1997) hoặc ly tâm lắng cặn formalin–ether cải tiến là phương pháp tập trung
trứng giun sán và bào nang đơn bào dựa trên nguyên lý ly tâm lắng cặn có độ
chính xác cao, ngoài trứng giun sán có thể phát hiện được đơn bào thể kén, dễ
dàng kiểm tra lại các mẫu nghi ngờ do phân có thể được bảo quản trong
Formalin 10%. Đến nay có nhiều cải tiến kỹ thuật này để có thể đánh giá cả định
tính và định lượng được số trứng giun sán trong một gram phân. Tuy vậy, do
lượng trứng trong phân ít nên dễ bỏ sót bệnh nhân, khó áp dụng trong xét
nghiệm tại thực địa.


14
Phương pháp Kato (1954), Kato-Katz (1972) được WHO (1994) khuyến
cáo sử dụng để xét nghiệm phân phát hiện trứng giun sán tại những vùng dịch tễ
có tỷ lệ nhiễm giun ≥ 20%, các loài sán ≥ 10%. Đây là kỹ thuật có thể phát hiện
được trứng giun, sán lá gan nhỏ, sán lá ruột, sán dây, sán lá gan lớn trong phân,
áp dụng được tại thực địa. Tuy nhiên, do lượng trứng trong phân thấp nên các
phương pháp xét nghiệm phân tìm trứng giun sán có độ nhạy không cao (chỉ
khoảng 30%), độ đặc hiệu phụ thuộc nhiều vào kinh nghiệm của kỹ thuật viên,
dễ nhầm lẫn giữa trứng của các loài sán lá gan nhỏ và với trứng của sán lá ruột
nhỏ. Một nghiên cứu khám nghiệm tử thi tìm sán trưởng thành và sử dụng các
phương pháp xét nghiệm phân tìm trứng sán O. viverrini cho thấy ngưỡng xét
nghiệm phân có thể xác định được trên các mẫu có tỷ lệ nhiễm trên 20 sán
trưởng thành hoặc 1000 trứng/ 01 gram phân do vậy ước tính ít nhất 20% số
người nhiễm sán không được phát hiện [20].
Các xét nghiệm miễn dịch: Thử test trong da (intradernal test), phản ứng
cố

định

bổ

thể

(complement

Fixation

test),

miễn

dịch

điện

di

(immuroelectrophoresis), phản ứng kháng nguyên gián tiếp (Indirect
hemagglutination test: IHA), phản ứng kháng thể huỳnh quang gián tiếp (Indirect
Fluorescent anlibody (IFA), phản ứng ELISA (enzyme-Linked immunosorbent
assay). Các kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch có độ nhạy cao, độ đặc hiệu tùy thuộc
vào từng loại test và còn nhiều tranh luận, có hiện tượng dương tính kéo dài và
lai chéo giữa các loài, khó triển khai tại thực địa. Một loạt xét nghiệm huyết
thanh học được sử dụng như: Thử test trong da (intradernal test) với kháng
nguyên C. sinensis (Min 1984, Rim 1973). Độ nhạy 83,1%, độ đặc hiệu 77,8%,
có 14% dương tính giả ở nhiễm nhẹ, 3% dương tính giả nhiễm trung bình và 2%
dương tính giả ở nhiễm nặng. Phản ứng kháng thể huỳnh quang gián tiếp
(Indirect Fluorescent anlibody (IFA) test) (Cho và Soh 1974, 1976) có 15% chéo


15
với Paragonimus, đạt tỷ lệ dương tính với nhiễm nhẹ là 28,1%, nhiễm trung bình
là 68,9%, nhiễm nặng là 77,8-84,6%. Phản ứng ELISA (enzyme-Linked
immunosorbent assay) được Ruitenberg và cộng sự giới thiệu năm 1975 dựa trên
cơ sở của Voller và cộng sự năm 1974 trong nghiên cứu sốt rét. Sau đó nhiều tác
giả đã nghiên cứu áp dụng ELISA trong chẩn đoán sán lá gan (Lee và cộng sự,
1981, Yang và cộng sự, 1983). Độ nhạy của phản ứng ELISA đạt 86,4-93% và độ
đặc hiệu đạt 95,7-98,6%. Kết quả ELISA cũng dương tính kéo dài sau khi điều
trị, thường 1-3 tháng, có trường hợp đến 1-2 năm, song về hiệu giá kháng thể
giảm dần đến âm tính (ngoài trừ bệnh nhân tái nhiễm).
Chẩn đoán bằng sinh học phân tử: Nhiều nghiên cứu sử dụng các gen
đích ITS1 (Internal Transcribed Spacer 1), ITS2 và ADN ty thể phát triển các kỹ
thuật PCR, real time PCR để chẩn đoán sán lá gan nhỏ O. viverrini hay C.
sinensis cho độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Wongratanacheewin và CS (2002) [21]
sử dụng kỹ thuật PCR để xác định O. viverrini trên các mẫu phân người cho độ
nhạy là 100% và độ đặc hiệu là 98% với các mẫu phân có mật độ nhiễm trứng
sán > 1000 trứng/1gam phân, tuy vậy độ nhạy giảm còn 68% với các mẫu có mật
độ nhiễm trứng sán < 200 trứng/1 gam phân. Kỹ thuật PCR đã phát hiện được
thêm 29% các mẫu dương tính với sán lá gan nhỏ từ số các mẫu âm tính bằng kỹ
thuật soi kính hiển vi. Sử dụng kỹ thuật real time PCR để chẩn đoán định lượng
nhiễm C. sinensis đã được nhiều tác giả nghiên cứu phát triển [22, 23]. Các kỹ
thuật phân tử này đã được ứng dụng trong kiểm nghiệm an toàn thực phẩm phát
hiện giai đoạn ấu trùng sán lá gan nhỏ trong cá thành phẩm. Tuy vậy chưa được
áp dụng rộng rãi do giá thành cao và khâu kỹ thuật phức tạp mà chủ yếu được
ứng dụng trong đánh giá hiệu lực của thuốc điều trị, giám sát tái nhiễm hay phát
hiện các vùng dịch tễ mới của sán lá gan nhỏ tại khu vực Đông Nam Á [24, 25].


16
1.5. Tổng quan về kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt và ứng dụng phát triển
kít phân tử chẩn đoán xác định mầm bệnh tại thực địa
Để khắc phục những giới hạn của phương pháp PCR truyền thống và Real
time PCR trong chẩn đoán xác định mầm bệnh tại thực địa, các nghiên cứu gần
đây có xu hướng chuyển sang các phương pháp khuếch đại ADN đẳng nhiệt với
những ưu điểm là độ nhạy và đặc hiệu tương đương kỹ thuật PCR nhưng loại bỏ
được các bước luân nhiệt nên chỉ cần các thiết bị xét nghiệm đơn giản, nhỏ gọn,
thời gian xét nghiệm được rút ngắn xuống còn 30 - 60 phút, đặc biệt các kỹ thuật
khuếch đại đẳng nhiệt có khả năng phát triển thành các bộ kít phân tử cho phép
ứng dụng được tại thực địa.
Đến nay có khoảng hơn 10 phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt khác nhau
được phát triển như: Kỹ thuật khuếch đại dựa trên trình tự ADN (NASBANucleic acid sequence-based amplification) (Mugagas và CS, 2009), kỹ thuật
TMA (Transcription Mediated Amplification), kỹ thuật RCA (Rolling Circle
Amplification) (Lizardi và CS, 1998 [95], kỹ thuật LAMP (Loop-Mediated
Isothermal Amplification (Notomi và CS, 2000); kỹ thuật RPA (Recombinase
Polymerase Amplificaion)…Trong đó, kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt mạch
vòng trung gian (LAMP - Loop Isothermal Median Ampification) là kỹ thuật
khuếch đại đẳng nhiệt được sử dụng nhiều nhất, dựa trên nguyên lý của kỹ thuật
LAMP nhiều bộ kít chẩn đoán mầm bệnh được phát triển, thương mại hóa trên
thị trường. Đây là kỹ thuật khuếch đại ADN tương tự như PCR, nhưng quá trình
thực hiện khuếch đại ADN được hoàn thành trong một bước duy nhất và ở một
nhiệt độ ổn định. Kết quả của phản ứng được phát hiện dựa vào độ đục của sản
phẩm tạo thành hoặc sử dụng các chất nhuộm màu huỳnh quang mà không cần
phải điện di. Kỹ thuật LAMP về lý thuyết có độ nhạy và độ đặc hiệu tương
đương hoặc thậm chí cao hơn so với kỹ thuật PCR, máy móc, thiết bị cần thiết để


17
tiến hành kỹ thuật thì đơn giản (gồm máy ly tâm để tách chiết ADN và máy ủ
nhiệt để thực hiện phản ứng LAMP), không cần trang bị các máy móc phân tích
đắt tiền như máy PCR, hệ thống điện di ADN. Do đó, LAMP có thể thực hiện
trong phòng xét nghiệm tuyến cơ sở (bệnh viện huyện, trạm y tế xã…) và rất phù
hợp cho việc phát hiện tác nhân gây bệnh tại thực địa.

 Kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt mạch vòng LAMP (Loop-Mediated
Isothermal Amplification)
Kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt LAMP được nghiên cứu và phát triển bởi
công ty Eiken Chemical Co. Ltd năm 1998 [26]. Đây một phương pháp nhân bản
gen mới, có thể tổng hợp một đoạn ADN lớn mà không cần chu trình biến nhiệt.
Đặc điểm phương pháp là sử dụng 4 mồi khác nhau được thiết kế đặc biệt để
nhận ra 6 vùng riêng biệt trên gen đích và phản ứng diễn ra ở một nhiệt độ duy
nhất. Quá trình tái bản và phát hiện gen đích chỉ diễn ra trong một bước duy
nhất. Thành phần phản ứng gồm có ADN khuôn, mồi, enzyme Bst DNA
polymerase, hỗn hợp phản ứng được ủ ở 65 0C. Phương pháp này có hiệu quả
khuyếch đại cao khoảng 109 - 1010 bản sao trong thời gian từ 15 - 60 phút.
LAMP là phản ứng nhân bản DNA hết sức đặc hiệu, chỉ xảy ra khi có
điều kiện cần và đủ cho phản ứng, đó là chỉ khi cả 4 chuỗi mồi, bao
gồm các mồi đơn F3, B3, các mồi FIP (F1c+F2), BIP (B1c+B2) bám được
vào 6 chuỗi đích của khuôn, thì sản phẩm DNA-vòng mới được tạo ra. Chỉ
một hay vài mồi không hoạt động, hoặc không bám đặc hiệu, sản phẩm ADNvòng sẽ không được tạo ra. Đặc biệt sản phẩm của phản ứng có thể quan sát bằng
mắt thường do sự kết tủa của muối pyrophotphate (Mg2P2O7) dưới dạng vẩn
đục màu trắng hoặc phát quang khi nhuộm bằng các thuốc nhuộm (SYBR
green). Do vậy, LAMP thường được sử dụng để tạo các bộ kít chẩn đoán nhanh.


18
Tổng giá thành có thể được giảm vì LAMP không đòi hỏi hoá chất đặc biệt và
thiết bị phức tạp [4].


Các thành phần cơ bản của phản ứng LAMP:

- Mồi: Thiết kế 4 loại mồi (mô tả như bên dưới) dựa theo 6 đoạn riêng biệt
trên đoạn gene quan tâm: đoạn F3c, F2c và F1c ở đầu 3' và đoạn B1, B2
và B3 ở đầu 5'.

Hình 1: Các vị trí thiết kế các mồi LAMP
FIP : Forward Inner Primer (FIP) bao gồm đoạn F2 (ở đầu 3') bổ sung
cho đoạn F2c, và đoạn giống như đoạn F1c ở đầu 5'.
F3 : Forward Outer Primer bao gồm đoạn F3 bổ sung cho đoạn F3c.
BIP : Backward Inner Primer (BIP) bao gồm đoạn B2 (ở đầu 3’) bổ sung
cho đoạn B2c và đoạn giống như B1c ở đầu 5’.
B3 : Backward Outer Primer bao gồm đoạn B3 bổ sung cho đoạn B3c.
- Enzym: sử dụng phổ biến trong phản ứng LAMP là enzym Bst polymerase
được phân lập từ vi khuẩn Bacillus stearothermophilus có khả năng xúc
tác tổng hợp ADN và tự tách chuỗi cao, hoạt động tối ưu ở 660 C.
- dNTPs và buffers: tương tự như kỹ thuật PCR.


19
- ADN khuôn: ADN khuôn sử dụng cho kỹ thuật LAMP không đòi hỏi mức
độ tinh sạch cao, có thể sử dụng các phương pháp tách ADN đơn giản, để
rút ngắn thời gian chuẩn bị.
- Thuốc nhuộm biểu hiện kết quả: SYBR green là một thuốc nhuộm cyanine
bất đối xứng được sử dụng như là một chất nhuộm acid nucleic trong sinh
học phân tử. Nó được dùng trong kỹ thuật real-time PCR và cũng để hiện
ADN trong điện di thay cho Ethidium bromide. SYBR green liên kết với
ADN hình thành phức hợp ADN-nhuộm hấp thụ ánh sáng màu xanh
(λmax = 488 nm) và phát ra ánh sáng màu xanh lá cây (λmax = 522 nm).
SYBR green ưu tiên gắn với ADN sợi đôi, nhưng sẽ vẫn liên kết với ADN
sợi đơn nhưng với hiệu suất thấp hơn. Nguyên tắc nhuộm của SYBR
Green là khi chèn vào sợi đôi ADN sẽ phát huỳnh quang, số lượng ADN
càng nhiều thì lượng huỳnh quang phát ra càng cao. Ngoài ra có thể sử
dụng một số loại thuốc nhuộm khác như Hydroxyl Naphthol Blue (HNB)
hoặc Calcein.
 Cơ chế phản ứng LAMP gồm ba bước chính: tạo vật liệu khởi đầu, tái bản
và kéo dài chuỗi, cuối cùng là lặp lại chu kỳ (Notomi và CS, 2002).
Bước 1- Tạo vật liệu khởi đầu:
Một trong những mồi LAMP sẽ bám vào trình tự ADN đích (Hình 2A),
sau đó dưới tác dụng của enzyme Bst polymerase có hoạt tính tách sợi và
kéo dài sợi mới theo chiều 3’-5’. Ví dụ: Mồi FIP bám vào vị trí F2c sau đó kéo
dài mạch (Hình 2B). Tiếp theo mồi F3 sẽ bám vào vị trí F3c trên 2 mạch mới để
kéo dài mạch (hình 2D). Ở bước này sẽ tách mạch vừa tổng hợp bởi mồi F1c ra
(hình 2F), sau đó ở đầu 5’ của mạch này, do trình tự F1c bổ sung với với
F1 nên sẽ hình thành cấu trúc vòng ở đầu 5’ này (hình 2G). Tương tự mồi
BIP và B3 sẽ bám vào và tổng hợp sợi mới. Kết quả thu được sản phẩm ADN


20
đơn có giới hạn bởi 2 mồi là FIP và BIP (hình 2I). Sợi ADN này có 2
đầu cuộn lại hình thành cấu trúc gốc vòng (stem-loop) (do trình tự F1 bắt cặp
bổ sung với F1c và B1c bắt cặp bổ sung với B1). Cấu trúc này sẽ là cấu trúc khởi
đầu cho quá trình tái bản của phương pháp LAMP (chu kỳ lặp lại LAMP).

Hình 2. Sơ đồ phản ứng tạo vật liệu khởi đầu
Bước 2- Chu kỳ tái bản và kéo dài chuỗi:
Trong chu kỳ tái bản và kéo dài chuỗi, mồi FIP liên kết với vòng trong cấu
trúc ADN gốc vòng (stem-loop DNA) ở vùng F2/F2c và tổng hợp sợi ADN
thay thế, đồng thời do cấu trúc vòng ở đầu 3’ (do trình tự FIP tạo thành) sẽ được


21
kéo dài và hình thành cấu trúc vòng ở vị trí kết thúc của trình tự BIP. Cấu trúc
vòng của trình tự BIP lại được kéo dài hình thành nên cấu trúc sợi kép
được gấp khúc ở giữa và một sợi đơn có cấu trúc vòng ở hai đầu. Cả hai
sản phẩm này đều là ADN khuôn cho mồi BIP trong các chu kỳ tái bản tiếp theo.
Sản phẩm cuối cùng là hỗn hợp ADN gốc vòng với cấu trúc gấp khúc và độ dài
khác nhau của cùng một trình tự (Hình 3).

Hình 3. Tái bản và kéo dài chuỗi ADN


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×

×