Tải bản đầy đủ

Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng và đối chiếu kết quả xét nghiệm PCR thủy dịch của bệnh nhân bị viêm màng bồ đào trước cấp tính

1

Đặt vấn đề
Viêm màng bồ đào (MBĐ) là một cấp cứu nhãn khoa thường gặp. Nếu
không điều trị có thể để lại hậu quả nặng nề. Viêm MBĐ có nhiều nguyên
nhân khác nhau và cách thức điều trị thay đổi tùy theo các nguyên nhân.
Các nghiên cứu gần đây đã xác định được nhiều nhóm nguyên nhân quan
trọng. Tỷ lệ các nhóm nguyên nhân này theo đổi tùy theo mỗi quốc gia.
Viêm MBĐ do nhiễm trùng ngày càng thường gặp và tác nhân gây bệnh đã
được xác định cụ thể ở nhiều trường hợp nhờ những tiến bộ về huyết thanh
học, sinh học phân tử và các nghiên cứu lâm sàng .
Nhóm Herpes bao gồm Cytomegalovirus (CMV), Herpes Simplex
virus (HSV) và Herpes Zoster virus (HZV) đã được nhiều báo cáo chứng tỏ
là nguyên nhân gây bệnh quan trọng. Nhóm virus Herpes gây bệnh cảnh
lâm sàng rất đặc thù như: teo mống mắt, tủa sau giác mạc, nhãn áp cao , .
Chúng có thể gây viêm MBĐ đơn độc hay phối hợp với viêm giác mạc.
Tại Việt Nam, ứng dụng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) đã phát
hiện thấy kháng nguyên Herpes trong thủy dịch của bệnh nhân bị glôcôm
thể mi. Viêm MBĐ trước một mắt hay cả hai mắt gần đây xuất hiện rất
nhiều. Điều trị phổ thông bằng corticosteroid có thể làm bệnh nặng lên nếu
tác nhân không được xác định. Chính vì vậy nghiên cứu tìm hiểu đặc điểm

lâm sàng, nguyên nhân gây bệnh nhằm cụ thể hóa các dấu hiệu lâm sàng để
có hướng điều trị cụ thể mang ý nghĩa quan trọng và có giá trị thực tiễn.
Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng và đối chiếu kết quả xét nghiệm PCR
thủy dịch của bệnh nhân bị viêm màng bồ đào trước cấp tính”.


2

Với 2 mục tiêu nghiên cứu:
1. Mô tả đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân bị viêm màng bồ đào
trước cấp tính.
2. Nhận xét sự phù hợp giữa bệnh cảnh lâm sàng và kết quả xét
nghiệm PCR thủy dịch của bệnh nhân bị viêm màng bồ đào
trước cấp tính.


3

Chương 1
Tổng quan
1.1. Màng bồ đào
Màng bồ đào (MBĐ) thuộc tổ chức trung bì, còn gọi là mạch mạc, bao
gồm 3 phần: Mống mắt ở trước, thể mi ở giữa và hắc mạc ở sau. Màng bồ
đào có năm nhiệm vụ chính: điều chỉnh ánh sáng, dinh dưỡng, tiết thể dịch,
điều tiết và tạo buồng tối để ảnh hiện rõ trên võng mạc .
* Mống mắt
- Mống mắt là phần trước của MBĐ được nuôi dưỡng bởi hai vòng
động lớn và nhỏ có nguồn gốc từ động mạch mi dài sau. Cơ co đồng tử do
dây thần kinh số III chi phối với giới hạn ở 1/3 trong mống mắt. Cơ giãn
đồng tử do dây thần kinh giao cảm chi phối. Nhu mô mống mắt ở trước và
biểu mô sắc tố ở sau, biểu mô sắc tố mống mắt liên tục với biểu mô sắc tố
thể mi và biểu mô sắc tố võng mạc. Teo mống mắt xuất hiện do tắc mạch là
dấu hiệu thường gặp trong một số bệnh lý mống mắt.
- Chức năng: mống mắt có nhiệm vụ như một màn chắn, để điều chỉnh
lượng ánh sáng vào trong nhãn cầu nhờ thay đổi đường kính đồng tử do
hoạt động của các cơ vòng và cơ nan hoa của mống mắt.


4

Mống mắt

Thể thủy tinh

Hình 1.1. Mống mắt
Nguồn: http://en.wikipedia.org/iris_ (anatomy)

* Thể mi
- Thể mi có vai trò quan trọng đối với điều tiết thông qua sự co giãn
của các cơ thể mi và các dây chằng Zinn làm thay đổi kích thước thể thủy
tinh. Hoạt động co giãn của các cơ thể mi do dây thần kinh giao cảm và dây
thần kinh số III chi phối. Biểu mô thể mi có vai trò quan trọng trong sản
xuất thủy dịch.

Thể mi

Hình 1.2. Thể mi
Nguồn: http://en.wikipedia.org/ciliary_ (anatomy)

* Hắc mạc:
- Hắc mạc là phần có diện tích lớn nhất của MBĐ, bao gồm nhiều
mạch máu, các xoang mạch và không có hàng rào máu – hắc mạc. Các


5

mạch máu hắc mạc có tác dụng dinh dưỡng cho các lớp võng mạc ngoài và
tham gia vào quá trình lưu thông của dịch nội nhãn
Võng mạc
Hắc mạc
Củng mạc

Hình 1.3. Hắc mạc
Nguồn: http://en.wikipedia.org/choroid_ (anatomy)

- Biểu mô sắc tố là phần trong của hắc mạc, là hàng rào ngăn giữa hắc
mạc và võng mạc, có tác dụng thực bào các đĩa của các tế bào cảm quang.
Biểu mô sắc tố tham gia vào hàng rào võng mạc ngoài, ngăn những chất
hữu hình không xâm lấn vào võng mạc và nội nhãn. Biểu mô sắc tố tham
gia vào quá trình làm sẹo võng mạc và nó có thể bị tổn thương trong một số
bệnh lý của MBĐ hay di thực tạo nên hình ảnh tế bào xương trong bệnh
võng mạc sắc tố, một số bệnh viêm hắc võng mạc khác [6].
1.2. Bệnh viêm màng bồ đào
1.2.1. Định nghĩa
Catalan, Nelson (1992) định nghĩa về viêm màng bồ đào như sau [7]:
Viêm MBĐ là một tên gọi chung về hình thái viêm nhiễm của MBĐ. Sự
viêm nhiễm không chỉ giới hạn trong cấu trúc của MBĐ mà còn bao gồm
các cấu trúc không phải của MBĐ như: dịch kính, võng mạc, mạch máu
võng mạc, củng mạc và thượng củng mạc.
1.2.2. Nguyên nhân
Có rất nhiều cách phân loại viêm MBĐ khác nhau. Nussenblatt, Van
Lathaem, Chan đã mô tả các cách phân loại sau [8], [9], [10]:


6

* Theo tác nhân:
- Viêm MBĐ do nhiễm trùng và viêm MBĐ không do nhiễm trùng.
+ Nguyên nhân do nhiễm trùng: có thể do [11]:
. Virus (nhóm Herpes gồm có: HSV, HZV, CMV) là nguyên
quan trọng.
. Viêm MBĐ do vi khuẩn: Hiện đã được xác định theo mức độ phổ
biến là giang mai, lao, Lyme, Bartonella, Ricketsia và viêm mủ nội nhãn.
. Viêm MBĐ do nấm: Thường gặp ở những bệnh nhân suy giảm miễn
dịch (ghép tạng, bệnh tự miễn, HIV, đặt sonde niệu đạo kéo dài). Các tác
nhân cụ thể thường gặp là Candida, Aspergillus, Histoplasma...
. Viêm MBĐ do Toxoplasma rất thường gặp, có liên quan đến ký sinh
trùng chó, mèo. Ấu trùng có trong thịt động vật sống như lợn, bò và đến
khu trú ở võng mạc người gây ra viêm hắc võng mạc điển hình.
+ Viêm MBD không do nhiễm trùng: do các nguyên nhân khác nhau.
. Liên quan đến bệnh lý tự miễn như bệnh Vogt – Koyanagi – Harada,
Behcet, HLA B27, HLA A19, là một nhóm bệnh khó điều trị.
. Một số hội chứng giả viêm MBĐ như khối u nội nhãn
(Retinoplastoma), u lympho làm cho chẩn đoán trở nên phức tạp.
* Theo giải phẫu: viêm MBĐ trước, viêm MBĐ trung gian (pars plana),
viêm MBĐ sau và viêm MBĐ toàn bộ.
* Theo diễn biến: viêm MBĐ cấp, viêm MBĐ mạn tính và viêm MBĐ tái phát.
- Viêm MBĐ mạn tính là viêm MBĐ tái phát sau 2 đến 3 ngày sau khi
dừng điều trị.


7

- Viêm MBĐ tái phát là viêm MBĐ đã ổn định và tái xuất hiện sau 1
thời gian dài có hay không có điều trị.
Viêm MBĐ mạn tính thường hay xảy ra biến chứng hơn viêm MBĐ tái
phát .
* Theo thời gian:
- Viêm MBĐ cấp tính khi bệnh kéo dài liên tục dưới 3 tháng.
- Viêm MBĐ mạn tính khi bệnh kéo dài liên tục trên 3 tháng.
1.2.3. Cơ chế bệnh sinh viêm MBĐ
Viêm MBĐ cũng diễn biến theo các cơ chế sinh lý bệnh của mọi quá
trình viêm khác bao gồm: cương tụ và giãn mạch, thoát dịch viêm, di thực
tế bào viêm, thực bào và làm sẹo. Quá trình viêm MBĐ trước làm mạch
máu mống mắt, thể mi cương tụ, giãn mạch, thoát dịch viêm vào thủy dịch
gây đục thủy dịch (Tyndall tiền phòng). Viêm mạch máu võng mạc thường
đi kèm gây tắc mạch và thiếu máu võng mạc. Hoại tử võng mạc do tác dụng
của độc tố hay tắc mạch dẫn đến rách và bong võng mạc. Phù hoàng điểm
do tác động của cytokin. Phù hoàng điểm kéo dài dẫn đến phù hoàng điểm
dạng nang và lỗ hoàng điểm gây giảm thị lực nghiêm trọng. Một số thể
viêm MBĐ có xuất tiết nhiều, ổ viêm gần vùng hoàng điểm tạo sao hoàng
điểm. Bong thanh dịch là đặc điểm của một số thể viêm MBĐ như hội
chứng Vogt – Koyanagi – Harada. Tăng sinh xơ, di thực các tế bào thần
kinh đệm và biểu mô sắc tố có thể xuất hiện ở giai đoạn cuối của quá trình
viêm tạo nên màng trước võng mạc gây co kéo, có thể gây bong võng mạc.
Sẹo hắc võng mạc hình thành làm teo tổ chức, hở lộ củng mạc và thường có
lắng đọng sắc tố.


8

1.2.4. Viêm MBĐ trước cấp tính
Viêm MBĐ trước cấp tính là thể loại viêm MBĐ hay gặp nhất. Có thể
xác định nguyên nhân thông qua khai thác bệnh sử và thăm khám lâm sàng
cẩn thận. Các xét nghiệm có ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán nguyên
nhân nhưng không thể thay thế được khai thác bệnh sử và khám lâm sàng.
Trong các xét nghiệm cận lâm sàng, xét nghiệm PCR và nuôi cấy mang ý
nghĩa quan trọng. Sinh thiết có thể được áp dụng để chẩn đoán phân biệt
với khối u nội nhãn.
Khai thác bệnh sử bao gồm xác định các yếu tố như: sốt, sụt cân, các
dấu hiệu da, cơ, xương, đường tiêu hóa, đường tiết niệu, tiền sử bị côn
trùng đốt hay điều trị trước đó (thuốc chống ung thư, đặt sonde niệu đạo).
Nhiễm HIV cũng mang ý nghĩa quan trọng. Khai thác bệnh sử cũng cần
lưu ý đến tiền sử phẫu thuật (glôcôm, thể thủy tinh), tiền sử chấn thương
(rách giác mạc, dị vật nội nhãn, rách củng mạc), nhãn viêm giao cảm. Tiền
sử dùng thuốc như corticoid, các thuốc chống miễn dịch là những yếu tố
thuận lợi gây viêm MBĐ.
Thăm khám cần chú ý đến thị lực, các phản xạ đồng tử, vận nhãn.
Khám sinh hiển vi nhằm phát hiện các nốt hay u hạt bất thường ở kết mạc
(viêm MBĐ trong hội chứng Wegener). Các dấu hiệu của giác mạc nếu có
cũng mang ý nghĩa vô cùng quan trọng như: mất biểu mô giác mạc (viêm
loét giác mạc hình cành cây), viêm nhu mô (viêm giác mạc hình đĩa). Các
dấu hiệu ở nội mô giác mạc như tủa giác mạc. Cần đánh giá chi tiết: tủa
nhỏ (bụi), tủa trung bình, mức độ đều nhau hay không đều nhau (tủa mỡ
cừu). Màu sắc của tủa như: màu trắng (thường do virus), có sắc tố (thường
do vi khuẩn) . Phân bố tủa cũng có tác dụng gợi ý xác định nguyên nhân , .


9

Khám tiền phòng cần xác định độ sâu tiền phòng để đánh giá khả năng
đóng góc, mủ, máu trong tiền phòng và tế bào sắc tố tiền phòng. Soi góc
tiền phòng nhằm xác định khả năng dính trước.
Mống mắt cần được xác định các khối tổ chức bất thường (u hạt trong
bệnh sarcoid hay lao), teo mống mắt (do nhóm Herpes), tân mạch mống mắt
(viêm MBĐ mạn tính).
Thể thủy tinh bị đục trong viêm MBĐ mạn tính kéo dài. Màng xuất tiết
diện đồng tử xảy ra trong viêm MBĐ trước cấp tính. Đục bao sau hay lắng
đọng chất bất thường hay gặp trong viêm MBĐ trung gian hay viêm MBĐ
sau. Cần lưu ý đục dưới bao sau hay do dùng corticoid kéo dài.

Hình 1.4. Đục dưới bao sau thể thủy tinh do corticoid
Nguồn: http://en.wikipedia.org/cataract

Đo nhãn áp thường đi kèm soi góc tiền phòng nếu thấy nhãn áp tăng
cao. Giãn đồng tử soi đáy mắt nhằm xác định tổn thường hoàng điểm
(phù hoàng điểm, teo hoàng điểm), viêm mạch máu, viêm hắc võng mạc,
bong thanh dịch võng mạc. Soi võng mạc chu biên có ý nghĩa quan trọng
nhằm tránh bỏ sót tổn thương như: viêm mạch máu chu biên, viêm pars
plana .


10

Xác định nguyên nhân viêm MBĐ hiện nay được coi là mấu chốt với
tất cả các bệnh nhân. Các dấu hiệu cơ bản gợi ý nguyên nhân bao gồm:
mắt bị bệnh (bệnh xuất hiện một bên hay cả hai bên). Những viêm MBĐ
do virus nhóm Herpes, Toxocara, Toxoplasma thường chỉ ở một bên mắt.
Viêm MBĐ do Herpes thường kèm theo tăng nhãn áp, teo mống mắt, sẹo
và phù giác mạc hoặc kèm theo các những dấu hiệu điển hình khác (sốt,
người mệt mỏi, mụn nước trên da, loét miệng). Tuy nhiên có nhiều loại
viêm MBĐ trước biểu hiện ở cả hai mắt như viêm MBĐ do HLA B27,
viêm củng mạc .
Các dấu hiệu toàn thân cần khai thác vì có ý nghĩa quan trọng. Mụn bọng
hay phát ban ngoài da có liên quan đến Herpes. Phát ban lòng bàn tay, bàn
chân có liên quan đến giang mai. Ban ngoài da di chuyển liên quan đến bệnh
Lyme và tiền sử côn trùng đốt. Những bệnh da như vảy nến cũng cần được
phát hiện .
Một số dạng viêm MBĐ có kèm theo viêm tuyến lệ (hội chứng
Mikulicz), viêm tuyến mang tai (hội chứng Heerfordt).
Hình thái của mủ tiền phòng nếu có cũng mang ý nghĩa quan trọng.
Mủ tiền phòng có thể vô khuẩn, nhiễm trùng hay do khối u nội nhãn.
Viêm dịch kính cũng cần được xác định để loại trừ viêm MBĐ toàn bộ
hay viêm MBĐ sau lan ra trước.
Xét nghiệm xác định nguyên nhân viêm MBĐ: Theo các nghiên cứu
về viêm MBĐ hiện nay, xét nghiệm nên tập trung vào nhiễm HSV, HZV,
CMV, Toxoplasma, sarcoid, giang mai, lao, viêm khớp và các bệnh tự
miễn khác .


11

1.3. Phản ứng chuỗi polymerase (PCR)
Năm 1983, Kary Mullis đã phát hiện ra các nguyên tắc cơ bản giúp
ông có thể phát triển và triển khai thành công kỹ thuật PCR . Phương pháp
PCR là phương pháp dùng khuếch đại đoạn gen đích, ưu điểm lớn nhất của
phương pháp này là có xác định được hàm lượng DNA rất thấp trong mẫu,
khoảng 102 copies/ml .
Nguyên lý của PCR là phản ứng hóa học tổng hợp DNA dựa trên sợi
DNA khuôn mẫu ban đầu nhờ hoạt động của enzym DNA-polymerase.
Phản ứng dựa trên sự thay đổi nhiệt độ theo chu kỳ, ban đầu DNA khuôn
được biến tính từ sợi đôi thành sợi đơn ở nhiệt độ cao (khoảng 92 0C), tiếp
theo nhiệt độ được giảm xuống khoảng 55 0C đến 650C để tạo điều kiện
cho mồi gắn vào DNA khuôn, sau bước này nhiệt độ lại tăng lên khoảng
720C cho enzym hoạt động tổng hợp kéo dài chuỗi DNA từ trình tự mồi,
sau 3 bước nhiệt độ, quá trình được quay lại từ bước một đến bước 3, cứ
như vậy quá trình lặp lại liên tiếp khoảng 30 đến 35 chu kỳ. Kết thúc
phản ứng, lượng DNA tạo ra là Ax2n (A là số DNA khuôn ban đầu trong
mẫu, n là chu kỳ nhiệt)
Thành phần chính tham gia phản ứng PCR là:
- DNA khuôn: là DNA của vius, vi khuẩn hay của tế bào sinh vật khác
- Mồi: là 2 trình tự nucleotide ngắn, đặc trưng cho gen cần nhân lên
- Enzym: Là emzym có hoạt tính DNA polymerase
- dNTPs: là các nucleotide dùng làm nguyên vật liệu tổng hợp DNA
- Đệm: là môi trường cho phản ứng, đệm chứa nước và một số ion cần thiết


12

Hình 1.5. Sơ đồ minh họa các bước phản ứng PCR
(1) Biến tính; (2) Gắn mồi; (3) Kéo dài chuỗi; (4) Sản phẩm
Nguồn: PCR và một số kỹ thuật y sinh học phân tử/Tạ Thành Văn/2010

Trong một số kít thương mại như hãng Amplicor dùng một đoạn 104bp
trên vùng bảo tồn của gen pre-core. Ngoài ra PCR giúp phát hiện đột biến
trên gen pre-core hay core promoter cũng như định lượng cccDNA
(covalently closed circular DNA) trong quá trình điều trị với thuốc kháng
vius và interferon trên bệnh nhân.
Trong kỹ thuật PCR, sau khi hoàn tất khuyếch đại đoạn DNA đích,
người làm thí nghiệm phải tiếp tục làm một số bước thí nghiệm để đọc kết
quả xác định có sản phẩm khuyếch đại mong muốn trong ống phản ứng hay
không. Giai đoạn này được gọi là giai đoạn thí nghiệm sau PCR. Trong giai
đoạn này người làm thí nghiệm có thể thực hiện điện di sản phẩm PCR trên
gel agarose để xem có vạch sản phẩm khuyếch đại đúng kích thước mong
muốn hay không, cũng có thể thực hiện thí nghiệm lại với các đoạn dò đặc


13

hiệu (trên màng, trên giếng hay phiến nhựa…) để xem sản phẩm khuyếch
đại có trình tự mong muốn hay không. Kỹ thuật PCR mà cần phải có giai
đoạn thí nghiệm để đọc và phân tích sau khi hoàn tất phản ứng khuyếch đại
được gọi là PCR cổ điển (classical PCR).
Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuyếch đại DNA đích
hiển thị được ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, chính vì vậy nên
được gọi là real-time. Do đặc điểm này nên với real-time PCR người làm thí
nghiệm không cần thiết phải làm tiếp các thí nghiệm để đọc và phân tích kết
quả để xác định có sản phẩm khuyếch đại đích hay không vì kết quả cuối
cùng của phản ứng khuyếch đại cũng được hiển thị ngay sau khi hoàn tất
phản ứng khuyếch đại.
* Nguyên lý phản ứng real-time PCR
Phản ứng real-time sử dụng TaqMan probe được thiết kế gồm: Một bộ
mồi đặc hiệu và một chuỗi oligonucleotide (probe) có trình tự bổ sung với
đoạn trình tự khuôn nằm giữa hai mồi.
Mẫu dò oligonucleotide được thiết kế với đầu 5’ gắn chất phát tín hiệu
huỳnh quang (reporter) và đầu 3’ gắn một chất kìm hãm sự phát tín hiệu
huỳnh quang phát ra từ reporter được gọi chung là quencher. Mẫu dò này ở
trạng thái nguyên vẹn (không bị phân hủy). Ở trạng thái bình thường (không
bị kích hoạt) thì toàn bộ năng lượng phát ra từ reporter được truyền sang
quencher khiến cho reporter không phát được tín hiệu huỳnh quang mà chỉ
có quencher phát được, nhưng máy chủ sẽ không nhận được tín hiệu vì hệ
thống kính lọc không phù hợp với bước sóng phát ra từ quencher.
Khi phản ứng PCR diễn ra, mẫu dò sẽ bắt cặp bổ sung vào DNA khuôn
sau đó bị phân cắt bởi 5’exonuclease của TaqDNA polymerase trong quá


14

trình tổng hợp chuỗi. Chính nhờ sự phân cắt này, reporter được giải phóng
khỏi quencher để phát tín hiệu huỳnh quang, đồng thời loại bỏ mẫu dò khỏi
khuôn DNA cho phép kéo dài tiếp sản phẩm PCR. Reporter bị phân cắt khỏi
khuôn DNA sau mỗi chu kỳ của phản ứng PCR có nghĩa là tín hiệu huỳnh
quang thu được tỷ lệ với sự nhân lên của sản phẩm PCR.

Hình 1.6. Nguyên lý phản ứng định lượng real-time PCR sử dụng TaqMan probe
Nguồn: PCR và một số kỹ thuật y sinh học phân tử/Tạ Thành Văn/2010

* Kỹ thuật PCR bao gồm 3 giai đoạn khác biệt nhau và được điều hòa bởi
nhiệt độ:
- Giai đoạn 1: chuỗi xoắn kép DNA khuôn bị biến tính, tách khỏi nhau
thành hai chuỗi đơn nhờ nhiệt độ tăng lên (khoảng 94 - 95°C).
- Giai đoạn 2: Nhiệt độ được hạ xuống về nhiệt độ gắn mồi (40- 72°C,
thường là 55°C) cho phép các đoạn oligonucleotid gắn với sợi DNA khuôn.
Trong quá trình gắn mồi, enzym DNA polymerase bền với nhiệt sẽ được
hoạt hóa và bắt đầu giai đoạn kéo dài mồi.


15

- Giai đoạn 3: Nhiệt độ lại được nâng lên đến nhiệt độ tối ưu của
enzyme (khoảng 72°C), xúc tác cho quá trình kéo dài phân tử DNA bắt đầu
từ hai đoạn mồi.

Hình 1.7. Kỹ thuật PCR (P1 và P2: các đoạn mồi)
Nguồn: PCR và một số kỹ thuật y sinh học phân tử/Tạ Thành Văn/2010

Chu kỳ nhiệt gồm ba giai đoạn trên được nhắc lại 25-40 lần. Số lượng
chu kỳ tùy thuộc vào từng mục đích ứng dụng cụ thể.
Cuối cùng sản phẩm của phản ứng được làm lạnh về nhiệt độ phòng
hoặc 4°C, tùy theo mục đích ứng dụng và loại thiết bị tạo chu kỳ nhiệt được
sử dụng.
* Vai trò của cặp mồi:
- Cặp mồi và đầu dò (probe) được thiết kế dựa trên chương trình
Beacon designer, trình tự mồi và đầu dò được thiết kế trên vùng bảo tồn đặc
trưng cho DNA genome của virus CMV và HSV, HZV.
-Tất cả các trình tự mồi và đầu dò đều được khảo sát các đặc tính về
trình tự nucleotide A,T,G,C; cấu trúc thứ cấp bằng phần mềm Beacon


16

designer. Kết quả các thông số phải nằm trong giới hạn cho phép để đảm
bảo sự hoạt động tốt nhất của mồi và đầu dò. Các trình tự này cũng được
BLAST với các trình gen trên NCBI để kiểm tra độ tương đồng của chúng
với các trình tự gen đích của CMV và HSV, HZV và các trình tự gen khác.
Mồi được lựa chọn khi kết quả cho thấy các trình tự có độ tương đồng
100% với DNA genome của CMV,HSV, HZV và không có sự tương đồng
với các trình tự khác hoặc nếu có thì rất thấp .
- Các đoạn mồi (primers) xuôi và ngược là các đoạn oligonucleotide có
chiều dài khoảng 20- 30 nucleotide có trình tự bổ sung một cách đặc hiệu
với trình tự của hai đầu đoạn DNA sẽ được nhân bản. Ở giai đoạn 2 các
đoạn mồi tìm đến bắt cặp bổ sung vào hai đầu của đoạn DNA đích. Giai
đoạn 3 dưới hoạt tính của men Taq polymerase để kéo các dNTP lại đầu 3’
của đoạn mồi đang bắt cặp trên đầu 5’ của sợi DNA đích để bắt nguồn cho
sự tổng hợp nên mạch bổ sung. Như vậy qua một chu kỳ nhiệt một DNA
đích đã được nhân bản thành hai bản sao. Nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại
liên tục 25 đến 40 lần thì từ một DNA đích đã nhân bản được thành 2 25 đến
240 bản sao, tức là đến hàng tỷ bản sao.
1.3.1. Cytomegalovirus (CMV)
CMV thuộc họ Herpes viridae có acid nucleic là DNA hai sợi thẳng,
capsid có đối xứng hình khối bao gồm 162 capsome, có vỏ ngoài, virus
được lấy từ màng nhân tế bào, có dạng hình cầu, đường kính từ 120 200nm, lắp ráp trong nhân tế bào, nhạy cảm Ether, gây nhiễm nhiều loài
động vật và người . Trên cơ thể người CMV nhân lên trong tế bào của nhiều
cơ quan như tế bào tuyến nước bọt, tế bào gan, thận, phổi. Gần đây virus
này được xác định trong tế bào lympho ở máu người bệnh khỏe mạnh có
phản ứng huyết thanh dương tính .


17

Đặc điểm cơ bản của bệnh do CMV gây ra là những thể vùi khổng lồ
trong nhân tế bào bị nhiễm. CMV có ba hình thái nhiễm trùng là gây hủy
hoại tế bào (bệnh cấp tính), tiềm tàng và nhiễm virus thể ẩn .
Đa số người bị nhiễm CMV không có triệu chứng lâm sàng. Các cá
thể có biểu hiện lâm sàng thường là các đối tượng có nguy cơ cao nhất như
bị nhiễm ở thời kỳ chu sinh, điều trị ức chế miễn dịch, truyền máu hoặc
ghép cơ quan. Nhiễm CMV ở người lớn là khá phổ biến, tỉ lệ nhiễm CMV
tăng dần từ thời thơ ấu đến tuổi thành niên. Sự lây nhiễm virus dễ dàng do
tiếp xúc gần gũi với các cá thể. Người ta biết đến viêm võng mạc do CMV
là một trong những nhiễm trùng cơ hội hay gặp nhất trên các bệnh nhân
AIDS, điển hình đặc trưng là có CD4+ lymphocyte < 50 tế bào/ µL. Dù số
lượng ca bệnh giảm khi sử dụng phác đồ HAART nhưng các ca mới vẫn
được ghi nhận. Các bệnh nhân viêm võng mạc do CMV bị giảm thị lực, có
thể dẫn đến mù nếu không được điều trị. Bệnh có thể biểu hiện ở một mắt
hoặc hai mắt. Điều trị viêm võng mạc do CMV cần phải kéo dài để ngăn
ngừa tái phát. Viêm mống mắt do CMV có thể biểu hiện từng đợt, thường
sợ ánh sáng, giảm thị lực, đau nhãn cầu. Một số bệnh nhân có phù hoàng
điểm dẫn đến mất thị lực hoặc bệnh lý màng bồ đào và võng mạc tăng sinh,
xuất huyết võng mạc tự phát và bong võng mạc , .

Hình 1.8. Viêm võng mạc do CMV
Nguồn: Viêm nội nhãn và viêm màng bồ đào/ Nhà xuất bản Y học/1995


18

1.3.2. Herpes Simplex virus (HSV)
HSV gây nhiễm cho tế bào người bởi đặc trưng gây tổn thương lớp
niêm mạc và xuất hiện các tiểu thể nội bào. Sự xuất hiện của virus ở nhân
và chất nguyên sinh đã được chứng minh bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh
quang .
HSV có hai type huyết thanh là HSV1 và HSV2. Chúng có kháng
nguyên rất giống nhau nhưng vẫn tách biệt được bằng kỹ thuật trung hòa
hoặc huỳnh quang. Hai type này cũng gây nhiễm những cơ quan khác nhau:
- HSV1: Thường gây nhiễm phần trên thắt lưng như mắt, mồm, môi, da…
- HSV2: Thường gây nhiễm phần dưới thắt lưng, đặc biệt là nhiễm
virus đường sinh dục và tiết niệu.
Nhiễm HSV lần đầu thường nặng, biểu hiện toàn thân và có thể tử
vong. Sơ nhiễm thường xảy ra với người chưa bị nhiễm hoặc chưa có kháng
thể trung hòa. HSV gây sơ nhiễm thường không thể loại trừ ra khỏi cơ thể
mà nó tồn tại tiềm ẩn. Tái nhiễm HSV có thể với Serotype khác. Với các cá
thể đã có kháng thể trung hòa chỉ bị nhiễm HSV khu trú mà không bị nhiễm
toàn thân.
Tại mắt HSV có thể gây ra viêm kết mạc - giác mạc,viêm màng bồ
đào...Viêm màng bồ đào do HSV có ba hình thái: viêm mống mắt - thể mi
-giác mạc, viêm mống mắt - thể mi không có viêm giác mạc, viêm hắc võng
mạc .
+ Viêm mống mắt - thể mi - giác mạc do HSV: Hay gặp viêm mống
mắt - thể mi nhẹ, thoáng qua và tự ổn định. Có ít tủa giác mạc, ít tế bào
trong thủy dịch. Tổn thương giác mạc thường là loét giác mạc hình cành
cây hoặc viêm giác mạc hình đĩa, cảm giác giác mạc giảm.


19

Có thể thấy viêm mống mắt - thể mi - giác mạc nặng: cương tụ rìa
nhiều, tủa giác mạc to và nhiều ở toàn bộ giác mạc, thủy dịch đục nhiều, có
thể xuất huyết hoặc mủ tiền phòng, dính sau. Thường có tăng nhãn áp do
nghẽn hoặc viêm vùng bè. Hình thái này có thể do virus xâm nhập trực tiếp ở
màng bồ đào.

A

B
Hình 1.9. Viêm giác mạc do HSV

A: Viêm giác mạc biểu mô/ B: Viêm giác mạc nhu mô
Nguồn: Viêm nội nhãn và viêm màng bồ đào/ Nhà xuất bản Y học/1995

+ Viêm mống mắt - thể mi không có viêm giác mạc do HSV: Tổn
thương do virus xâm nhập trực tiếp ở màng bồ đào, có thể kèm theo tổn
thương Herpes ở mặt hoặc ở đường sinh dục. Mắt đau đỏ, tủa giác mạc
nhiều, Tyndall dương tính, tiền phòng có thể có mủ hoặc máu, dính sau, có
thể teo mống mắt từng mảng và thường teo mống mắt ở gần cơ vòng đồng
tử. Hay có tăng nhãn áp do viêm vùng bè hoặc dính trước. Có thể có biến
chứng đục thủy tinh thể .


20

Hình 1.10. Viêm mống mắt thể mi do HSV
Nguồn: Viêm nội nhãn và viêm màng bồ đào/ Nhà xuất bản Y học/1995

+ Viêm hắc võng mạc do HSV: Tổn thương do virus xâm nhập vào hắc
mạc hoặc do một quá trình miễn dịch trong đợt nhiễm HSV toàn thân có thể
có viêm não do HSV. Những ổ viêm hắc võng mạc hoại tử ở cả hai mắt,
xuất tiết màu vàng trắng, ranh giới rõ, võng mạc phù đục tỏa lan, đục dịch
kính. Có thể có viêm quanh mạch máu, xuất huyết võng mạc, phù gai thị.
Bong võng mạc xuất tiết là biến chứng phổ biến. Khi viêm thành sẹo, có
biến đổi sắc tố võng mạc, những vùng mất sắc tố và những vùng tăng sinh
sắc tố .
1.3.3. Herpes Zoster virus (HZV)
Thông thường viêm màng bồ đào do HZV là một viêm giác mạc mống mắt thứ phát sau bệnh giác mạc. Đôi khi viêm mống mắt có thể xảy
ra mà không có viêm giác mạc rõ ràng. Trong nhiều trường hợp viêm trở
thành mạn tính. Cần nghĩ đến HZV trong chẩn đoán phân biệt của mống
mắt - thể mi một bên mạn tính, ngay cả khi triệu chứng da đã có trong quá
khứ hoặc thậm chí nếu có thì rất ít , .
Những mụn nước ở cạnh đầu mũi chứng tỏ tổn thương thần kinh mũi –
mi và có nhiều khả năng mắt sẽ bị tổn thương.


21

Tủa trong viêm MBĐ do HZV đôi khi có hình sao. Tủa giác mạc hình
sao thường phân bố tỏa lan, trái ngược với phân bố thông thường ở một
phần ba dưới giác mạc (tam giác Arlt). Ngoài ra tủa giác mạc nhỏ và hình
dạng sợi, thường có hình sao rõ ràng khi khám bằng sinh hiển vi với độ
phóng đại cao. Ở những bệnh nhân có bệnh Herpes và giác mạc đồng
thời, dù nhẹ đến mức nào, viêm phần trước cũng có thể kèm theo giảm
cảm giác giác mạc tỏa lan hoặc khu trú và viêm giác mạc do dinh dưỡng
thần kinh .
Teo mống mắt cũng đặc hiệu cho viêm do Herpes, đặc biệt là Herpes
Zoster. Đối với Herpes Zoster teo thường xảy ra ở gần chân mống mắt.
Teo mống mắt khu vực là đặc điểm của Herpes Zoster, nó gây ra viêm tắc
mạch máu nhu mô mống mắt là nguyên nhân của hình thái khác biệt này ,
.
Viêm võng mạc do HZV có thể gặp, đặc biệt ở những cá thể bị suy
giảm miễn dịch. Viêm mạch máu thường xảy ra trong bệnh Zona mắt và gây
thiếu máu cục bộ phần trước, tắc động mạch võng mạc và viêm củng mạc.
Viêm mạch máu trong hốc mắt có thể dẫn đến liệt cơ .

Hình 1.11. Viêm mống mắt thể mi do HZV
Nguồn: Viêm nội nhãn và viêm màng bồ đào/Nhà xuất bản Y học/1995


22

1.4. Tình hình nghiên cứu về nguyên nhân gây viêm MBĐ trên thế giới
và tại Việt Nam
Năm 2002, nhóm các tác giả gồm Christina Canakis và cộng sự trong
một báo cáo tại tạp chí nhãn khoa Mỹ đã đề cập đến 2 trường hợp bị viêm
MBĐ trước có teo mống mắt khu vực và kèm theo tăng nhãn áp ảnh hưởng
đến thần kinh thị giác mà nguyên nhân gây ra là do CMV . Các tác giả cũng
đã điều trị cho 2 bệnh nhân này bằng thuốc kháng virus Ganciclovir và cho
kết quả đáp ứng khá tốt. Sau quá trình nghiên cứu họ đã đưa ra kết luận là
quá trình nhiễm CMV có thể sản xuất ra những chất tấn công MBĐ gây ra
những đợt tái phát viêm MBĐ với những đặc điểm lâm sàng không thể nhận
biết được từ những dấu hiệu gợi ý trước đó hoặc thậm chí đặc trưng bệnh
viêm do Herpes .
Soon Phaik Chee và cộng sự (2004 – 2006) đã nghiên cứu tại Trung
tâm mắt quốc gia Singapore trên 105 mắt bị viêm MBĐ trước của những
bệnh nhân không bị nhiễm HIV bằng cách lấy thủy dịch và phân tích bằng
xét nghiệm PCR, đã đưa ra kết quả sau: 24 mắt dương tính với CMV, chiếm
tỷ lệ 22,8%; trong đó 18 mắt có hội chứng Posner – Schlossman (tỷ lệ
75%); 12 mắt trong số 24 mắt có CMV dương tính được điều trị bằng
thuốc kháng virus Ganciclovir. Kết thúc điều trị cả 12 mắt đều có đáp
ứng tốt, kết quả làm xét nghiệm PCR chứng minh CMV âm tính trong
thủy dịch. Tuy nhiên sau đó 9 mắt bị tái phát trong vòng 8 tháng sau khi
dừng điều trị và yêu cầu phải điều trị tiếp một đợt Ganciclovir kéo dài
hơn. 81 mắt còn lại có CMV âm tính bao gồm 30 mắt bị hội chứng
Posner – Schlossman, 11 mắt bị viêm mống mắt dị sắc Fush, 27 mắt bị
viêm màng bồ đào tăng nhãn áp không rõ nguyên nhân và 13 mắt viêm
MBĐ trước nghĩ nhiều do Herpes. Sau quá trình nghiên cứu với các kết


23

quả thu được, tác giả đã đưa ra kết luận viêm MBĐ trước do CMV không
phải là hiếm thấy ở bệnh nhân có miễn dịch bình thường và nó có thể như
là đợt tái phát cấp hoặc viêm mạn tính , .
Một số nhóm nghiên cứu khác như Schryver và cộng sự (2006), Van
Boxtel (2007) cũng đề cập tới sự có mặt của CMV trong thủy dịch của bệnh
nhân bị viêm MBĐ trước và cho đây là nguyên nhân gây viêm MBĐ trước
của những bệnh nhân này. Các nhóm tác giả này đã điều trị cho bệnh nhân
bằng thuốc kháng virus Gancicilovir cho kết quả khá tốt, tỷ lệ khỏi bệnh và
ổn định cao, hạn chế tái phát , .
Tại Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu về những biến chứng và di
chứng do viêm MBĐ trước gây ra và các phương pháp điều trị biến chứng
và di chứng. Nguyễn Thị Bạch Tuyết năm 2006 đã nghiên cứu điều trị đục
thủy tinh thể trên mắt có viêm MBĐ cũ bằng phương pháp tán nhuyễn thủy
tinh thể bằng siêu âm đặt thủy tinh thể nhân tạo hậu phòng . Năm 2009, Lê
Xuân Lương, Nguyễn Trọng Khải đã nghiên cứu điều trị tăng nhãn áp và tổ
chức hóa dịch kính sau viêm MBĐ , . Các tác giả trên đều nêu được một số
đặc điểm lâm sàng của bệnh nhưng chưa đề cập đến nguyên nhân gây bệnh.
Chính vì vậy mà những người bệnh bị viêm MBĐ, đặc biệt là viêm MBĐ
trước thường phải điều trị rất dai dẳng, tỷ lệ tái phát cao. Nhiều trường hợp
bệnh tiến triển phức tạp, tái phát nhiều lần kèm biến chứng ảnh hưởng đến
chức năng thị giác [31]. Do đó việc nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, tìm
hiểu mối liên quan giữa bệnh cảnh lâm sàng và kết quả xét nghiệm thủy
dịch của bệnh nhân bị viêm MBĐ trước bằng xét nghiệm PCR để tìm
nguyên nhân gây bệnh là hết sức có ý nghĩa và cần thiết.


24

Chương 2

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Những người bệnh đến khám tại bệnh viện Mắt Trung Ương được
chẩn đoán viêm MBĐ trước cấp tính, thời gian từ tháng 5/2016 đến
tháng 8/2017.
2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân
- Người bệnh được chẩn đoán viêm MBĐ trước cấp tính.
- Người bệnh đồng ý tham gia nghiên cứu.
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ
- Những người bệnh già yếu trên 75 tuổi và trẻ dưới 15 tuổi do khó
hợp tác trong nghiên cứu.
- Những người có bệnh toàn thân không cho phép tham gia nghiên cứu
như mắc bệnh tâm thần, bệnh tăng huyết áp, bệnh tim mạch…
- Người bệnh đang có tổn thương viêm, loét giác mạc kèm theo.
- Viêm MBĐ thứ phát sau chấn thương đụng dập hoặc chấn thương
xuyên nhãn cầu.
- Viêm MBĐ đã xác định được nguyên nhân khác như: hội chứng Vogt
– Koyanagi – Harada, Behcet, Nhãn viêm giao cảm…
2.2. Phương pháp nghiên cứu và phương tiện nghiên cứu
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
- Nghiên cứu tiến cứu, mô tả cắt ngang.


25

- Cỡ mẫu nghiên cứu được tính theo công thức:

N = Z (21−α / 2 )

p.(1 − p)
( p.ε )2

Trong đó: N: là số lượng người bệnh nghiên cứu.
p: là tỉ lệ người bệnh dương tính với CMV trên tổng số người bệnh bị
viêm MBĐ trước cấp tính (p = 22,8%) [39].
Z (1 – α/2): là độ tin cậy của xác suất với α = 0,05 thì Z (1 – α/2) = 1,96.

ε : là khoảng sai lệch tương đối, chọn ε = 0,1.
Qua tính toán, tổng số người bệnh mắc bệnh viêm MBĐ trước cấp
tính cần nghiên cứu là 25 bệnh nhân.
2.2.2. Phương tiện nghiên cứu
- Bảng thử thị lực Snellen.
- Hộp thử kính
- Bộ đo nhãn áp Maclakov với quả cân 10g.
- Máy sinh hiển vi khám bệnh Inami của Nhật Bản.
- Kính Volk +90D soi đáy mắt đảo ngược.
- Kính soi góc Goldman một mặt gương.
- Máy sinh hiển vi phẫu thuật.
- Thuốc tê tra mắt Dicain1%.
- Dung dịch Betadin 5%.
- Kim1ml (30G ×8mm) chọc lấy dịch tiền phòng và đựng bệnh phẩm
(đóng gói vô khuẩn do Mỹ sản xuất).


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×

×