Tải bản đầy đủ

Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 191.16

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VANHNASIN NAMMASAY

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN
TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ
STREPTOMYCES 191.16
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VANHNASIN NAMMASAY
Mã sinh viên: 1401411

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN
TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ

STREPTOMYCES 191.16
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
PSG.TS. Cao Văn Thu
ThS. Tạ Thu Lan
Nơi thực hiện:
Bộ môn Vi sinh – Sinh học

HÀ NỘI – 2019


LỜI CẢM ƠN
Với sự biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy giáo PGS.TS
Cao Văn Thu, cô giáo ThS. Tạ Thu Lan – những người đã trực tiếp hướng dẫn và chỉ
bảo giúp đỡ tận tình để giúp tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên đang giảng
dạy và công tác tại bộ môn Vi sinh – Sinh học, Viện hóa học – Viện hàn lâm khoa học
và công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện
khóa luận này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến các thầy cô giáo trường Đại
học Dược Hà Nội đã chỉ dạy, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại trường.
Đồng thời tôi cũng gửi lời cảm ơn tới gia dình, bạn bè đã quan tâm, ủng hộ và giúp
đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Do thời gian có hạn, điều kiện nghiên cứu và trình độ của bản thân còn hạn chế
nên không thể tránh khỏi những sai sót trong khóa luận. Vì vậy, tôi rất mong nhận
được sự đóng góp ý kiến, chỉ bảo của các thầy cô để khóa luận được hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên
Vanhnasin Nammasay


MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1: TÔNG QUAN...................................................................................... 2
1.1. Đại cương về kháng sinh ..................................................................................... 2
1.1.1.

Định nghĩa kháng sinh ................................................................................. 2

1.1.2.

Phân loại kháng sinh.................................................................................... 2

1.1.3.

Cơ chế tác dụng của kháng sinh: ................................................................. 2

1.2.

Đại cương về xạ khuẩn .................................................................................... 3

1.2.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn .................................................................... 3
1.2.2. Đặc điểm hình thái và sinh lý của xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces ............... 3
1.2.3. Phân loại Streptomyces ................................................................................... 4
1.3. Bảo quản và cải tạo giống ................................................................................... 4
1.3.1. Bảo quản giống xạ khuẩn ................................................................................ 4
1.3.2. Phương pháp cải tạo giống .............................................................................. 5
1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh .................................................................... 5
1.4.1. Lên men bề mặt .............................................................................................. 6
1.4.2. Lên men chìm ................................................................................................. 6
1.4.3. Một số yếu tố ảnh hưởng quá trình lên men .................................................... 6
1.5. Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men ............................................ 7
1.5.1. Vai trò cuả chiết tách và tinh chế kháng sinh .................................................. 7
1.5.2. Phương pháp chiết tách và tinh chế kháng sinh ............................................... 7
1.6. Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc kháng sinh ........................................... 8
1.6.1. Phổ khối lượng (MS) ...................................................................................... 8
1.6.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ............................................................... 9
1.6.3. Phổ hồng ngoại (IR)........................................................................................ 9
1.6.4. Phổ tử ngoại - khả kiến (UV-Vis) ................................................................... 9
1.7. Nghiên cứu về xạ khuẩn loài Streptomyces vietnamensis sp.Nov, một
Streptomyces có sắc tố khếch tán màu xanh tím được phân lập từ đất tại Việt Nam ... 10
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 11
2.1. Nguyên liệu, thiết bị .......................................................................................... 11


2.1.1. Chủng giống vi sinh vật ................................................................................ 11
2.1.2. Các môi trường nuôi cấy ............................................................................... 11
2.1.3. Dụng cụ, dung môi và hóa chất ..................................................................... 13
2.2. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................... 14
2.3. Phương pháp thực nghiệm ............................................................................... 14
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy giữ giống trong ống thạch nghiêng ............................ 14
2.3.2. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán ....................... 14
2.3.3. Phương pháp cải tạo và chọn giống............................................................... 15
2.3.4. Phương pháp lên men chìm tổng hợp kháng sinh .......................................... 17
2.3.5. Phương pháp tách kháng sinh bằng sắc ký .................................................... 17
2.3.6. Phương pháp kết tinh kháng sinh .................................................................. 18
2.3.7. Sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh tinh khiết thu được................................. 18
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN ................................ 19
3.1. Kết quả cải tạo giống ........................................................................................ 19
3.1.1. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên ......................................................................... 19
3.1.2. Kết quả đột biến............................................................................................ 20
3.2. Kết quả lên men chìm sinh tổng hợp kháng sinh ............................................ 22
3.2.1. Chọn môi trường lên men chìm tốt nhất ........................................................ 22
3.2.2. Chọn dạng chủng, biến chủng lên men tốt nhất ............................................. 23
3.3. Kết quả tinh chế kháng sinh ............................................................................. 24
3.3.1. Kết quả tách kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng ............................................. 24
3.3.2. Kết quả chạy sắc ký cột lần 1 ........................................................................ 25
3.3.3. Kết quả chạy sắc ký cột lần 2 ........................................................................ 26
3.3.4. Kết quả chạy sắc ký cột lần 3 ........................................................................ 27
3.3.5. Kết quả quá trình tinh chế kháng sinh ........................................................... 28
3.4. Kết quả sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh tinh khiết thu được ................... 29
3.4.1. Phổ khối lượng (MS) .................................................................................... 29
3.4.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân.......................................................................... 29
3.4.3. Phổ tử ngoại – khả kiến ................................................................................ 29
3.4.4. Phổ hồng ngoại ............................................................................................. 30
3.9. Bàn luận............................................................................................................. 31
3.9.1. Chọn lọc và cải tạo giống .............................................................................. 31


3.9.2. Chiết tách, cất quay, tinh chế kháng sinh tinh khiết ...................................... 31
3.9.3: Nghiên cứu cấu trúc kháng sinh .................................................................... 31
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................. 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 34
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIÊU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

16S rADN

16S ribosomal Acid 2’-deoxyribonucleic

COSY

Corelation Spectroscopy – Phổ NMR tương quan
Đường kính trung bình

DMHC

Dung môi hữu cơ

DEPT

Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

dNTP

deoxynucliotide triphosphate

ddNTP

dideoxynucliotide triphosphate

ĐBHH

Đột biến hóa học

Gr (-)

Gram âm

Gr (+)

Gram dương

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Coleration – Phổ tương quan đa
liên kết dị nhân

HSQC

Heteronuclear Single Quantum Coherence – Phổ kết hợp lượng
tử đơn dị nhân

HTKS

Hoạt tính kháng sinh

IR

Infra Red – Phổ hồng ngoại

ISP

International Streptomyces Project (Chương trình Streptomyces
quốc tế)

KS

Kháng sinh

MS

Mass spectrometry – Phổ khối

MT

Môi trường

MTdt

Môi trường dịch thể

NMR

Nuclear Magnetic Resonance – Phổ cộng hưởng từ hạt nhân


NXB

Nhà xuất bản

PCR

Polymerase Chain Reaction – Phản ứng khuếch đại gen

S

Sai số chuẩn có hiệu chỉnh

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

SLNN

Sàng lọc ngẫu nhiên

SSC

Saline-sodium citrate – Dung dịch đệm muối citrat

UV-Vis

Ultraviolet–visible: Phổ tử ngoại – khả kiến

VK

Vi khuẩn

VSV

Vi sinh vật


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Các vi sinh vật kiểm định
Bảng 2.2: Thành phần các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn
Bảng 2.3: Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định
Bảng 3.1: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên
Bảng 3.2: Kết quả thử HTKS đột biến lần 1
Bảng 3.3: Kết quả thử HTKS đột biến lần 2
Bảng 3.4: Kết quả thử HTKS chọn môi trường lên men
Bảng 3.5: Kết quả thử HTKS chọn dạng, biến chủng lên men
Bảng 3.6: Kết quả tách kháng sinh trong dịch chiết bằng SKLM
Bảng 3.7: Kết quả thử hoạt tính của các phân đoạn sau chạy sắc ký cột lần 1
Bảng 3.8: Kết quả thử hoạt tính các phân đoạn sau chạy sắc ký cột lần 2
Bảng 3.9: Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn sau chạy sắc ký cột lần 2
Bảng 3.10: Kết quả thử hoạt tính các phân đoạn sau chạy sắc ký cột lần 3
Bảng 3.11: Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn sau chạy sắc ký cột lần 3
Bảng 3.12: Kết quả phổ IR của KS1
Bảng 3.13: Kết quả phổ IR của KS2
Bảng PB.1: Các dung môi sử dụng
Bảng PB.2: Các hóa chất sử dụng
Bảng PB.3: Kết quả thử hoạt tính kháng sinh sàng lọc ngẫu nhiên


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Hình PH.1: Thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khối thạch
Hình PH.2: Thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp giếng thạch
Hình PH.3: Thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khoanh giấy
Hình PH.4: Lên men chìm
Hình PH.5: Hình ảnh chạy sắc ký cột
Hình PH.6: Phổ khối lượng của kháng sinh KS1
Hình PH.7: Phổ khối lượng của kháng sinh KS2
Hình PH.8: Phổ 13C-NMR của KS1
Hình PH.9: Phổ 1H-NMR của KS2
Hình PH.10: Phổ DPET của KS2
Hình PH.11: Phổ UV – VIS của KS1
Hình PH.12 Phổ UV – VIS của KS2
Hình PH.13: Phổ IR của KS1
Hình PH.14: Phổ IR của KS2


ĐẶT VẤN ĐỀ
Việc phát minh ra kháng sinh được coi là một trong những thành tựu khoa học lớn
nhất của con người trong thế kỷ XX, giúp cứu sống hàng triệu người khỏi các căn
bệnh do vi khuẩn gây ra. Tuy nhiên, một thực trạng đang nhận được sự quan tâm cấp
thiết trên toàn cầu đó là tình trạng “đề kháng kháng sinh”. Theo CDC, mỗi năm tại
Hòa Kỳ có ít nhất 2 triệu người bị nhiễm vi khuẩn có khả năng kháng thuốc kháng
sinh và ít nhất 23.000 người chết mỗi năm do hậu quả trực tiếp của tình trạng này.
Với tình hình đó, thách thức đặt ra cho các nhà khoa học trong cuộc chiến chống
lại các vi khuẩn kháng thuốc là việc tìm kiếm các loại kháng sinh mới, cải tạo, nâng
cao khả năng kháng khuẩn của kháng sinh. Chi Streptomyces là một chi xạ khuẩn lớn,
gồm nhiều xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh.[14], [15]
Xuất phát từ những thực tế trên,chúng tôi đã chọn đề tài nghiên cứu: “Tiếp tục
nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 191.16” với các mục tiêu
sau:
♦ chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh.
♦ Lên men, chiết tách, tinh chế để thu kháng sinh tinh khiết.
♦ Sơ bộ xác định một số tính chất và cấu trúc của kháng sinh thu được.

1


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Đại cương về kháng sinh
1.1.1. Định nghĩa kháng sinh
Kháng sinh là những chất có nguồn gốc vi sinh vật, được bán tổng hợp hoặc tổng
hợp hoặc tổng hợp hóa học, với liều thấp có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt chọn lọc
vi sinh vật nhiễm sinh hoặc tế bào ung thư mà không hoặc tác dụng yếu lên vật
chủ.[1], [5]
1.1.2. Phân loại kháng sinh
Kháng sinh được phân loại dựa vào cấu trúc hóa học, cơ chế tác dụng, hay theo phổ
tác dụng… trong đó phân loại theo cấu trúc hóa học được áp dụng phổ biến nhất. Các
chất được phân loại theo cấu trúc hóa học chia làm các nhóm sau:[1], [5]
 Nhóm β-lactam: Amoxicillin, cephalosporin bán tổng hợp thế hệ 1,2,3
 Phenicol: chloramphenicol
 Aminoglycosid: Streptomycin, gentamicin
 Tetracyclin: tetracyclin, doxycyclin
 Macrolid: erythromycin, clarythromycin, tylosin
 Peptid: polymyxin, vancomycin,…
 Nhóm lincosamid: lincomycin, clindamycin,..
 Nhóm quinolon: acid nalidixic, ciprofloxacin, ofloxacin
1.1.3. Cơ chế tác dụng của kháng sinh:
- Ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn: beta-lactam, vancomycin,…
- Ức chế hoặc thay đổi tổng hợp protein của vi khuẩn: chloramphenicol, tetracyclin,
macrolid,…
- Ức chế chuyển hóa: sulfonamide
- Ức chế tổng hợp acid nucleic: quinolon, rifampicin,..
- Thay đổi tính thấm màng tế bào: polymyxin, amphotericin,…[1]

2


1.2.

Đại cương về xạ khuẩn
Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram (+), phát triển thành dạng sợi phân nhánh,

có tỷ lệ G + C >55%, phân bố rộng rãi trong thiên nhiên (trong đất, nước và các cơ
chất hữu cơ), trong số khoảng 1000 chi và 5000 loài sinh vật nhân sơ đã công bố có
khoảng 100 chi và 1000 loài xạ khuẩn.
Trong mỗi gam đất nói chung thường có chứa hàng triệu xạ khuẩn. Đại đa số xạ
khuẩn là các VSV hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh.Xạ khuẩn được
quan tâm và nghiên cứu nhiều do có khả năng sản xuất các sản phẩm trao đổi chất
quan trọng. [4], [7]
1.2.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
Ở trên môi trường đặc, xạ khuẩn sinh trưởng thành những khuẩn lạc đặc thù, kích
thước khuẩn lạc thay đổi tùy từng loài và điều kiện ngoại cảnh. Khuẩn lạc xạ khuẩn
không trơn, ướt như ở vi khuẩn, nấm men mà thường có dạng thô ráp,có nếp gấp tạo
các đường tròn đồng tâm hay các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ. Màu sắc của
khuẩn lạc rất đa dạng: đỏ, da cam, vàng, lam, trắng… tùy thuộc vào loài và điều kiện
dinh dưỡng. [4], [7]
1.2.2. Đặc điểm hình thái và sinh lý của xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces
Xạ khuẩn chiStreptomyces thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí, Gram (+), không nhuộm
kháng acid-cồn, hóa dị dưỡng hữu cơ, catalase dương tính. Thường có khả năng khử
nitrate thành nitrit, phân hủy adenine, esculin, casein, gelatin, hypoxanthine, tinh bột
và L-tyrosine. Có khả năng sử dụng nhiều hợp chất hữu cơ làm nguồn cacbon. Nhiệt
độ sinh trưởng tối ưu là 25-35 oC, pH tối ưu là 6,5-8,0. Thành tế bào chứa L-DAP,
không chứa acid mycolic.Tỷ lệ mol G + C trong ADN là khá cao trên 55 %.
Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường có dạng khô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có
thể có nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ, dùng que cấy không di chuyển được khuẩn
lạc vì khuẩn ti cơ chất bám sâu vào trong thạch vì khuẩn ti cơ chất bám sâu vào trong
thạch.
Hệ sợi sinh dưỡng phân nhánh nhiều lần, ít khi đứt đoạn, đường kính 0,5-2,0 μm.
Đa số khuẩn ty xạ khuẩn không có vách ngăn, màu sắc phong phú: đỏ, cam, đen, lục,
nâu …

3


Khuẩn ty cơ chất phát triển một thời gian dài ra trong không khí thành khuẩn ty
khí sinh. Khuẩn ty khí sinh phát triển rất mạnh mẽ, sinh nhiều loại sắc tố khác nhau có
khả năng khuếch tán ra môi trường. Trong môi trường đặc hiệu, có loài có thể tạo ra
sắc tố melanoid màu sẫm đen. Rất nhiều chủng sản sinh ra một hoặc nhiều loại chất
kháng sinh. [4], [7]
1.2.3. Phân loại Streptomyces
Để phân loại xạ khuẩn người ta sử dụng các tiêu chuẩn như trình tự 16S rADN, lai
ADN, hình thái, sinh lý sinh hóa và hóa phân loại.
Để phân loại xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces trong họ Streptomycetaceae, khóa
phân loại Streptomyces thuộc Chương trình Streptomyces quốc tế (International
Streptomyces Project) do Shirling và Gotlieb đề xuất (1970) được sử dụng rộng rãi.
Trong khóa phân loại này, các đặc trưng được sử dụng bao gồm: màu sắc khuẩn lạc,
màu khuẩn ty cơ chất, sắc tố melanoid, sắc tố hòa tan, hình dạng chuỗi bào tử, bề mặt
bào tử và khả năng tiêu thụ các nguồn hydratcarbon.
Ngày nay, với việc áp dụng kĩ thuật xác định trình tự gen 16S rADN để phân loại
đã và đang được áp dụng.Ưu điểm là cho kết quả khá chính xác, đáng tin cậy. [4], [7],
[16]
1.3. Bảo quản và cải tạo giống
1.3.1. Bảo quản giống xạ khuẩn
Việc giữ giống bằng phương pháp thích hợp có thể duy trì những hoạt tính ưu việt
của chúng, chống thoái hóa giống, mất hoạt tính. Một số phương pháp giữ giống:
♦ Bảo quản trên môi trường thạch: các ống giống được bảo quản trong tủ lạnh ở
nhiệt độ 20C, định kì kiểm tra cấy truyền.
♦ Giữ giống trong cát hoặc trong đất vô trùng: Cát và đất là những cơ chất tốt
mang các tế bào VSV, chủ yếu là nhóm VSV có bào tử. Cát và đất sau khi được xử lý
sạch, sàng lọc qua rây, xử lý pH trung tính, sấy khô và khử trùng. Sau đó trộn bào tử
vào cơ chất cát hoặc đất trong các ống nghiệm.Nút bông có phết một lớp parafin nóng
chảy để ống giống không bị ẩm trở lại.

4


♦ Giữ giống bằng phương pháp đông lạnh: phương pháp dựa trên sự ức chế phát
triển của VSV khi được đưa vào điều kiện lạnh sâu ở -250C đến -700C. Với phương
pháp này giống sẽ bảo quản được lâu.
♦ Giữ giống bằng phương pháp đông khô: phần nước ở trong tế bào và môi trường
có chất bảo vệ được thăng hoa ở nhiệt độ thấp để đảm bảo an toàn hơn cho sự sống của
tế bào giống. Hỗn hợp tế bào giống và dung dịch bảo vệ được chứa trong các ampul
được hàn kín bảo vệ ở 3-50C hoặc nhiệt độ phòng.[3], [12]
1.3.2. Phương pháp cải tạo giống
Vi sinh vật tổng hợp kháng sinh phân lập được từ cơ chất thiên nhiên thường có
hoạt tính rất thấp. Vì vậy để thu được các chủng có hoạt tính cao cần phải cải tạo chọn
giống bằng các phương pháp khác nhau.
♦ Phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên
Các VSV có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống thuần khiết,
có cá thể hoạt tính kháng sinh mạnh gấp 10-30% những cá thể khác. Cần phải chọn lấy
cá thể có hoạt tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp.
♦ Phương pháp đột biến nhân tạo
Là đột biến xảy ra dưới tác động của tác nhân đột biến mạnh với mục đích nâng
cao tần suất đột biến.Một số tác nhân đột biến:
- Vật lý: tia UV, tia rơnghen
- Hóa học: HNO2, Ethylenimin, N-mustard…
Các tác nhân với liều lượng và thời gian thích hợp sẽ giết chết các VSV, những cá
thể nào còn sống sót sẽ có sự đột biến gen làm thay đổi tính trạng dẫn đến hoặc làm
giảm khả năng sinh kháng sinh (đột biến âm), hoặc làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp
kháng sinh (đột biến dương).[3], [12]
1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh
Lên men là giai đoạn nuôi cấy VSV để chúng tạo ra sản phẩm hoặc sinh khối VSV
hoặc là sản phẩm trao đổi chất.Để thực hiện lên men người ta thường sử dụng hai
phương pháp là lên men bề mặt và lên men chìm.

5


1.4.1. Lên men bề mặt
♦ Là thực hiện nuôi cấy VSV trên bề mặt môi trường dịch thể hoặc bán rắn.
+ Nuôi cấy trên bề mặt dịch thể: dùng cho VSV hiếu khí. Môi trường được pha
loãng với nồng độ thích hợp sau đó bổ sung nguồn nitrogen, nguồn khoáng…
+ Nuôi cấy trên bề mặt môi trường bán rắn: có thể dùng cho VSV hiếu khí hoặc kị
khí.Với phương pháp này nguyên liệu thường là gạo, đậu tương, bột sắn, ngô…Các
nguyên liệu chứa tinh bột trước khi sử dụng phải xử lý bằng cách nấu chín.
♦ Phương pháp lên men bề mặt có các ưu nhược điểm:
+ Ưu điểm: thao tác đơn giản, dễ thực hiện, dễ xử lý cục bộ, đầu tư trang thiết bị
thấp.
+ Nhược điểm: hiệu suất sử dụng môi trường thấp, tốn diện tích, khó cơ giới tự
động hóa, tốn nhân công.
1.4.2. Lên men chìm
Là phương pháp lên men mà VSV phát triển trong môi trường lỏng.
- Ưu điểm: hiệu suất cao, môi trường dinh dưỡng được sử dụng triệt để, tiết kiệm
mặt bằng sản xuất, dễ cơ giới hóa, tự động hóa.
- Nhược điểm: đầu tư trang thiết bị ban đầu lớn, khó xử lý cục bộ, cần cán bộ
chuyên môn hóa, phế liệu thải ra dễ ô nhiễm môi trường.
Các kiểu lên men chìm: lên men mẻ (gián đoạn), lên men có bổ sung, lên men
liên tục, lên men bán liên tục. [3], [6], [9], [12]
1.4.3. Một số yếu tố ảnh hưởng quá trình lên men
♦ Tốc độ khuấy trộn: khuấy trộn ngăn cản sự kết lắng của tế bào, tăng tiếp xúc
giữa tế bào và môi trường dinh dưỡng, oxy; tuy nhiên, khuấy trộn mạnh có thể gây phá
vỡ tế bào, tăng tạo bọt, vì vậy cần điều chỉnh tốc độ khuấy trộn hợp lý.
♦ pH môi trường lên men: trong quá trình lên men, VSV tạo ra các sản phẩm mang
tính axit hoặc kiềm làm thay đổi pH môi trường gây ảnh hưởng đến hoạt động sống
của chính VSV ấy.

6


♦ Nhiệt độ: quá trình lên men luôn có sự tỏa nhiệt mạnh, do đó nhiệt độ thiết bị lên
men sẽ tăng mạnh, có thể vượt ngưỡng nhiệt độ thích hợp của VSV. Vì vậy, các thiết
bị lên men cần trang bị hệ thống làm mát để điều chỉnh nhiệt độ phù hợp.
♦ Sự tạo bọt trong quá trình lên men: quá trình khuấy đảo và sục khí mạnh, liên
tục, trong nồi lên men sẽ tạo ra bọt, nó có khuynh hướng trào ra khỏi nồi lên men và
gây nhiễm tạp môi trường lên men, gây cản trở sự tiếp xúc giữa VSV và môi trường
dinh dưỡng. Do vậy, cần kiểm soát lượng bọt tạo thành và phá hủy chúng.
♦ Độ hòa tan oxy: thiếu oxy nhất thời sẽ phá vỡ trao đổi chất trong tế bào, vì thế
cần cung cấp oxy sao cho tốc độ hòa tan oxy bằng tốc độ sử dụng oxy của VSV.
♦ Độ thông khí: đối với nhiều VSV, sự thông khí sẽ làm tăng tốc độ sinh trưởng,
rút ngắn pha tiềm phát, nâng cao sinh khối đồng thời ảnh hưởng đến sản phẩm trao đổi
chất (kháng sinh, vitamin, enzym,…).
Như vậy, để quá trình lên men đạt được hiệu suất cao nhấtcần nghiên cứu các yếu
tố ảnh hưởng để có biện pháp giám sát và điều chỉnh hợp lý.[3], [12]
1.5. Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men
1.5.1. Vai trò cuả chiết tách và tinh chế kháng sinh
Việc chiết tách và tinh chế kháng sinh là bước rất quan trọng, quyết định rất nhiều
đến hiệu quả quá trình lên men.Việc đầu tiên là tách tế bào VSV ra khỏi pha lỏng của
dịch lên men: có thể dùng phương pháp lọc (đối với VSV có cấu tạo hệ sợi như nấm,
tảo) hay phương pháp li tâm ở tốc độ cao (đối với VSV đơn bào, kích thước nhỏ như
nấm men, vi khuẩn…). Các sản phẩm của quá trình tổng hợp VSV hoặc được tích lũy
ở trong tế bào hoặc trong dịch nuôi cấy. Đối với mỗi loại sẽ có phương pháp chiết tách
và tinh chế khác nhau để đảm bảo thu được kháng sinh có độ tinh khiết đạt tiêu chuẩn
dược điển và hiệu suất cao.[11], [12]
1.5.2. Phương pháp chiết tách và tinh chế kháng sinh
Các phương pháp sử dụng để tinh chế kháng sinh: lọc, ly tâm, kết tủa, chiết bằng
dung môi, hấp phụ, điện di, thẩm tích, lọc màng chọn lọc, sắc kí…
Một số phương pháp tinh chế:
♦ Chiết xuất

7


Là quá trình chuyển chất tan từ pha này sang pha khác, thường dùng dung môi hữu
cơ (đơn hay hỗn hợp) để tách lấy một chất hay một nhóm chất từ hỗn hợp nghiên cứu.
Nguyên tắc: Dựa vào sự phân bố chất tan giữa haipha không hòa lẫn vào nhau.
Đối với kháng sinh ngoại bào có thể dùng phương pháp chiết lỏng – lỏng với các
phép chiết đơn, lặp hay ngược dòng. Kháng sinh nội bào tồn tại trong tế bào sử dụng
phương pháp chiết lỏng - rắn.
♦ Sắc kí lớp mỏng:
Là phương pháp tách các chất dựa trên khả năng hấp phụ khác nhau của chúng
trên bề mặt một chất rắn hấp phụ.Pha tĩnh là một lớp mỏng gồm các hạt có kích thước
đồng nhất được kết dính lại trên một giá đỡ bằng nhôm, thủy tinh hay chất dẻo. Pha
động là một hệ thống dung môi hoặc hỗn hợp dung môi. Pha động di chuyển qua bản
mỏng nhờ lực mao dẫn. Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất là hệ
số Rf. Sắc kí lớp mỏng chế hóa có thể sử dụng để tinh chế kháng sinh.
♦ Sắc ký cột:
Là phương pháp tách các chất dựa trên sự phân bố khác nhau của các chất giữ hai
pha: pha tĩnh là các chất lỏng bao bọc thành tấm phim màng mỏng trên bề mặt chất rắn
trơ (chất mang) được nhồi vào cột, pha động là dung môi thấm qua toàn bộ bề mặt pha
tĩnh. Quá trình rửa giải được thực hiện bằng cách thêm liên tục một lượng mới của pha
động.[3], [11], [12]
1.6. Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc kháng sinh
1.6.1. Phổ khối lượng (MS)
Phổ khối là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được
tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu.
Các ion được tạo thành trong buổng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ
phận phân tích khối trước khi đến detector.Tín hiệu tương ứng với các ion được thể
hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau, tập hợp lại thành phổ khối (MS).

8


1.6.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Cộng hưởng từ hạt nhân được xem xét là phương pháp ưu việt áp dụng vào việc
nghiên cứu, biện giải và xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ.Có rất nhiều hạt nhân
được nghiên cứu nhưng Hydro và Carbon là phổ biến nhất.
1.6.3. Phổ hồng ngoại (IR)
Kỹ thuật này dựa trên hiệu ứng: các hợp chất hoá học có khả năng hấp thụ chọn
lọc bức xạ hồng ngoại. Sau khi hấp thụ các bức xạ hồng ngoại, các phân tử của các
hơp chất hoá học dao động với nhiều vận tốc khác nhau và làm xuất hiện dải phổ hấp
thụ gọi là phổ hấp thụ bức xạ hồng ngoại.Một trong những ưu điểm quan trọng nhất
của phương pháp phổ hồng ngoại là cung cấp thông tin về cấu trúc phân tử nhanh,
không đòi hỏi các phương pháp tính toán phức tạp.
1.6.4. Phổ tử ngoại - khả kiến (UV-Vis)
Quá trình hấp thụ ánh sáng tử ngoại gây ra biến đổi năng lượng điện tử của phân
tử từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích. Đường cong biểu diễn sự phụ thuộc độ
hấp thụ ánh sáng UV vào bước sóng hay số sóng là phổ tử ngoại. Phổ tử ngoại – khả
kiến giúp ta có thể xác định các đặc điểm liên quan đến cấu trúc hóa học của phân tử
chất cần nghiên cứu. [2], [8], [10]

9


1.7. Nghiên cứu về xạ khuẩn loài Streptomyces vietnamensis sp.Nov, một
Streptomyces có sắc tố khếch tán màu xanh tím được phân lập từ đất tại Việt Nam
Một xạ khuẩn được đặt tên là GIMV4.0001, được phân lập từ mẫu đất rừng tại
Việt Nam.Chúng tạo ra các sợi khuẩn ty khí sinh có màu trắng và sắc tố khuyếch tán
màu xanh tím trên môi trường thạch tổng hợp của Gauze.Màu sợi bề mặt không nhạy
cảm pH. Quan sát chuỗi bào tử chủng GIMV4.0001 dưới kính hiển vi thấy chuỗi bào
tử thẳng, dài, hình trụ, và thông tin vềkhóa định dạng khẳng định rằng chủng này
thuộc các chi Streptomyces. Chủng có sinh sắc tố melanoid nhưng không có hoạt tính
kháng khuẩn với Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis,
Candida albicans hoặc Penicillium citrium. Phân tích trình tự gen 16S rADN. của
chủngGIMV4.0001 cho thấy chủng có sự tương đồng cao nhất (99.4%) là
Streptomyces bikiniensis ATCC 11062. Tuy nhiên, sự liên quan DNA-DNA giữa
chủng GIMV4.0001 và S.bikiniensis ATCC 11062 được tìm thấy chỉ là 50.3%. Chủng
GIMV4.0001 cũng có thể được phân biệt với S. bikiniensis ATCC 11062 và các loài
Streptomyces có trình tự gen 16S rADN giống nhau cao (98-99%) dựa trên đặc điểm
hình thái, sinh lý và sinh hóa. Trên cơ sở tính chất sinh lý và phân tử của nó, rõ ràng là
chủng

GIMV4.0001 đại diện cho một loài mới thuộc chi Streptomyces, mà tên

Streptomyces vietnamensis sp.Nov được đề xuất. Loại chủng là GIMV4.0001
(=CCTCC M 205.143 = IAM 15.340).[17]

10


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu, thiết bị
2.1.1. Chủng giống vi sinh vật
♦ Giống xạ khuẩn
Chủng xạ khuẩn: chủng xạ khuẩn Streptomyces 191.16 được phân lập từ đất ven
biển trên đảo Cát Bà, Việt Nam, do bộ môn Vi sinh-Sinh học Trường Đại học Dược
Hà Nội cung cấp.
♦ Vi sinh vật kiểm định
Vi sinh vật kiểm định do bộ môn Vi sinh-Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội
cung cấp (bảng 2.1) [13].
Bảng 2.1: Các vi sinh vật kiểm định
Đặc trưng

VSV kiểm định

Viết tắt

Vi khuẩn Gram (+)

Bacillus cereus ATCC 9946

B. cereus

Vi khuẩn Gram (-)

Escherichia coli ATCC 25922

E. coli

2.1.2. Các môi trường nuôi cấy
♦ Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn được giới thiệu trong bảng 2.2:

11


Bảng 2.2: Thành phần các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (g/100ml)
Thành phần
Tinh bột

MT1

MT2

2

2

Lastose

MT3

MT4

MT5

MT6

MT7

2,4
3

Glucose

2

1

Saccarose

2

Bột đậu

1

tương
Bột ngô

2

0,1

Pepton

0,3

0,5

Cao thịt

0,3

0,3

KNO3

0,1

KCl

0,05

NaNO3

0,2

NH4NO3

0,2

0,2

CaCO3

0,3

0,4

0,2

0,05

0,1

FeSO4.7H2O

0,001

K2HPO4

0,05

0,1

0,1

0,05

MgSO4.7H2O

0,05

0,05

0,25

0,15

NaCl

0,05

0,4

0,1

Cao nấm

0,5

0,5

0,5
0,5

men
Thạch

1,6-1,8

1,6-1,8

1,6-1,8

1,6-1,8

1,6-1,8

1,6-1,8

1,6-1,8

Nước

100

100

100

100

100

100

100

7,0-7,2

6,8-7,2

7,0-7,2

7,0-7,2

7,0-7,2

7,0-7,2

7,4-7,6

pH

12


Với môi trường lên men dịch thể sử dụng để lên men chìm thì các thành
phầntương tự như môi trường nuôi cấy xạ khuẩn nhưng không có thạch.
♦ Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định (bảng 2.3).
Bảng 2.3: Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định
NaCl

Cao thịt

Pepton

Thạch

Nước

pH

(g)

(g)

(g)

(g)

(ml)

Canh thang

0,5

0,3

0,5

-

100

7,0-7,4

Thạch thường

0,5

0,3

0,5

1,6-1,8

100

7,0-7,4

Các môi trường được tiệt trùng trong nồi hấp từ 118-120 oC trong 20-30’.
2.1.3. Dụng cụ, dung môi và hóa chất
♦ Các dung môi sử dụng được giới thiệu trong bảng PB.2(phần Phụ lục trang PL.28)
♦ Các hóa chất sử dụng được giới thiệu trong bảng PB.3(phần Phụ lục trang PL.29)
♦ Vật liệu chạy sắc ký:
- Bản mỏng sắc ký: Silicagel 60F254 Merck.
- Dung môi chạy sắc ký: các DM trên, pha thành các hỗ hợp chạy.
- Bình chạy sắc ký, buret.
- Silicagel 60F254 hạt có đường kính 0,04-0,063mm chạy sắc khí cột, cột chạy sắc kí
là các buret 50 ml.
♦ Máy móc, thiết bị:
- Đèn UV (λ=254nm), nguồn phát Toshiba 15W, điện thế 220V.
- Nồi hấp vô trùng Hirayama Model HL3030.
- Cân kỹ thuật Sartorius TE 210, cân phân tích Sartorius BP 121S.
- Tủ ấm Memmert, Binder.
- Tủ lạnh Deawoo, Sanyo.
- Tủ cấy vô trùng AuraVF 48, tủ sấy SL Shellab.

13


- Máy lắc Taitec Bio – Sharker BR 300Lf.
- Máy đo phổ UV-VIS Hitachi U-1900.
- Thước kẹp Palmer độ chính xác 0,02mm.
- Đĩa petri, patuyn, pipet các loại, ống nghiệm, bình nón, cốc có mỏ, que cấy, đèn cồn,
đũa thủy tinh, kim mũi mác, ống đục thạch, que chang, giấy thử pH, bông,…
2.2. Nội dung nghiên cứu
♦ Cải tạo chủng xạ khuẩn nhận được.
♦ Nghiên cứu lên men, chiết xuất, tinh chế kháng sinh thu được.
♦ Nghiên cứu cấu trúc kháng sinh.
2.3. Phương pháp thực nghiệm
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy giữ giống trong ống thạch nghiêng
Chủng Streptomyces 191.16 được cấy zigzac trên ống thạch nghiêng, cho vào tủ
ấm 28°C, sau 6-10 ngày chủng phát triển tốt, cho các ống vào tủ lạnh bảo quản 2°C,
định kỳ 3-6 tháng cấy truyền một lần.[13]
2.3.2. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán
♦ Nguyên tắc: mẫu thử được đưa lên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy VSV kiểm định,
kháng sinh từ mẫu thử khuếch tán vào môi trường thạch sẽ ức chế sự phát triển
củaVSV kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn.
♦ Tiến hành:
- Tạo hỗn dịch VSV kiểm định: vi khuẩn kiểm định được nuôi cấy vào môi trường
canh thang, ủ trong tủ ấm 37°C trong 18-24h, nuôi cấy tạo hỗn dịch vi khuẩn ổn định
có nồng độ 107-108 tế bào/ml.
- Đưa hỗn dịch này vào môi trường thạch thường sau khi đã hấp tiệt trùng và để
nguội đến 45-50°C với tỷ lệ V giống/ V thạch thường = 1/40. Lắc đều để VSV kiểm
định phân tán đều vào môi trường, đổ vào đĩa Petri với thể tích 20ml/ đĩa.
Các phương pháp thử:
- Phương pháp khối thạch: Đưa mẫu thử là các khối thạch đường kính từ 6,26,5mm lấy từ đĩa Petri (cấy zigzac xạ khuẩn) lên bề mặt môi trường VSV kiểm định.

14


- Phương pháp giếng thạch: Đục các giếng thạch đường kính 6,2-6,5mm trên môi
trường VSV kiểm định, sau đó nhỏ 0,05ml mẫu thử dạng dung dịch vào mỗi giếng.
- Phương pháp khoanh giấy lọc:Các khoanh giấy lọc đường kính 6,2-6,5mm tẩm
dung dịch cần thử (3 lần), sấy khô ở 60°C, sau đó đặt các khoanh giấy này lên bề mặt
môi trường VSV kiểm định.
Các đĩa Petri có mẫu thử được đem ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 36-37°C trong 1824h. Sau thời gian ủ tiến hành đánh giá kết quả dựa vào đường kính vòng vô khuẩn đo
bằng thước kẹp Palmer độ chính xác 0,02mm và được đánh giá theo công thức:

Trong đó:

(mm): Đường kính trung bình vòng vô khuẩn
(mm): Đường kính vòng vô khuẩn thứ i.
s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh.
n: Số thực nghiệm làm song song (n=3).

2.3.3. Phương pháp cải tạo và chọn giống
2.3.3.1. Sàng lọc ngẫu nhiên
♦ Mục đích: Chọn ra những cá thể cho hoạt tính kháng sinh cao nhất so với các cá
thể khác từ giống ban đầu.
♦ Chuẩn bị môi trường: cân môi trường MT1, hấp tiệt khuẩn ở 120°C/ 30 phút, đổ
ra đĩa Petri vô trùng.
♦ Pha hỗn dịch bào tử: lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 191.16 cho vào
ống nghiệm chứa 10ml nước vô trùng, lắc đều, thu được hỗn dịch bào tử có độ pha
loãng 10-1 (định ước). Sau đó pha loãng tiếp đến nồng độ 10-6 bằng nước vô trùng.
♦ Phân tán hỗn dịch bảo tử: dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1ml hỗn dịch bào
tử ở ống nghiệm có độ pha loãng 10-4 đến 10-6 nhỏ vào đĩa Petri chứa MT. Dùng que
chang vô trùng dàn đều hỗn dịch bào tử trên bề mặt thạch. Mỗi nồng độ tiến hành trên
3 đĩa. Cho các đĩa đã phân tán bào tử vào tủ ấm 28°C.

15


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×

×