Tải bản đầy đủ

Bước đầu thiết kế mồi để phát hiện alen đa hình HLAC03:02

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐẶNG MAI HƯƠNG

BƯỚC ĐẦU THIẾT KẾ MỒI ĐỂ
PHÁT HIỆN ALEN ĐA HÌNH
HLA-C*03:02
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐẶNG MAI HƯƠNG

MÃ SINH VIÊN: 1401302

BƯỚC ĐẦU THIẾT KẾ MỒI ĐỂ

PHÁT HIỆN ALEN ĐA HÌNH
HLA-C*03:02
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. PGS.TS. Phùng Thanh Hương
2. NCS. Phạm Trần Thu Hà
Nơi thực hiện:
1. Viện Dinh dưỡng Quốc Gia

HÀ NỘI - 2019



LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin chân thành cám ơn sự giúp đỡ của PGS.TS. Phùng Thanh
Hương, người cô giáo luôn nhiệt huyết, ở bên hỗ trợ và định hướng cho tôi rất nhiều
kiến thức, phương pháp và cách trình bày đề tài.
Tiếp theo, tôi muốn gửi lời cảm ơn tới NCS. Phạm Thu Hà, người cũng giúp đỡ
tôi rất nhiều về kiến thức chuyên môn, kinh nghiệm thực nghiệm và đồng hành cùng tôi
vượt qua mọi khó khăn trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin cảm ơn Phòng Thí nghiệm trung tâm - Viện Dinh dưỡng và Phòng Thí
nghiệm sinh học phân tử - Viện Vệ Sinh Dịch Tễ TW đã hỗ trợ, tạo điều kiện thuận lợi
cho tôi được học tập và tiến hành thực nghiệm.
Trân trọng cảm ơn tới các thầy cô Bộ môn Hóa sinh, phòng Đào Tạo Trường Đại
học Dược Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và
hoàn thành khóa luận.
Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè, đã động viên và luôn
bên cạnh ủng hộ tôi.
Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2019

Đặng Mai Hương


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ......................................................... iii
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU..................................................................................iv
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ .........................................................................v
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ...........................................................................................3
1.1. Human Leukocyte Antigen (HLA) .......................................................................3
1.1.1. Giới thiệu về gen HLA ...................................................................................3
1.1.2. Đặc điểm gen HLA ........................................................................................5
1.2. HLA-C và alen HLA-C*03:02 ..............................................................................5
1.2.1. Tổng quan về HLA-C .....................................................................................5
1.2.2. Tổng quan về alen HLA-C*03:02 .................................................................8
1.3. Tổng quan về kỹ thuật AS-PCR (Allele-specific polymerase chain reaction) ...11
1.3.1. Giới thiệu về AS-PCR ..................................................................................11
1.3.2. Thiết kế mồi đặc hiệu alen ...........................................................................12
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................15
2.1. Đối tượng, nguyên liệu nghiên cứu ....................................................................15
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................15
2.1.2. Hóa chất, trang thiết bị .............................................................................15
2.2. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................15
2.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................16
2.3.1. Phương pháp thiết kế mồi đặc hiệu alen .....................................................16
2.3.2. Phương pháp thiết kế mồi chung .................................................................17
2.3.3. Phương pháp kiểm tra tính đặc hiệu của cặp mồi.......................................17
2.3.4. Phương pháp khuếch đại ADN bằng PCR ..................................................18
2.3.5. Phương pháp điện di ADN trên gel agarose ...............................................19
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ....................................20
i


3.1 Kết quả thiết kế quy trình PCR alen HLA-C*03:02 bằng công cụ tin sinh học ..20
3.1.1. Kết quả thiết kế mồi và kiểm tra tính đặc hiệu mồi PCR exon 2 – exon 3 gen
HLA-C ....................................................................................................................20
3.2.2. Kết quả thiết kế cặp mồi PCR đặc hiệu alen HLA-C*03:02 .......................23
3.2. Kết quả bước đầu triển khai quy trình trên thực nghiệm....................................33
3.2.1. Kết quả triển khai thực nghiệm PCR bước 1 ..............................................33
3.2.2. Kết quả triển khai thực nghiệm PCR bước 2 ..............................................34
3.3. Bàn luận chung ...................................................................................................38
3.3.1. Về kết quả thiết kế quy trình PCR alen HLA-C*03:02 bằng công cụ tin sinh
học .........................................................................................................................38
3.3.2. Về kết quả bước đầu triển khai quy trình trên thực nghiệm ........................39
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................................41
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................... 1

ii


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Tiếng Anh

Nghĩa tiếng Việt

AS

Allele-specific

Đặc hiệu alen

AS-PCR

Allele-specific polymerase
chain reaction

Phản ứng khuếch đại chuỗi đặc
hiệu allele

BLAST

Basic Local Alignment Search
Tool

Công cụ tìm kiếm các trình tự
tương đồng

CTL

Cytotoxic T Lymphocyte

Tế bào lympho T độc

HLA

Human Leukocyte Antigen

Kháng nguyên bạch cầu người
Thụ thể giống kháng thể của tế
bào diệt tự nhiên

MHC

Killer-cell Imunoglobulin-like
receptor
Major Histocompability
Complex

NGS

New generation sequencing

Giải trình tự thế hệ mới

PCR

Polymerase Chain Reaction

Phản ứng chuỗi polymerase

SCARs

Severe Cutaneous Adverse
Reactions

Phản ứng bất lợi nghiêm trọng ở
da

SJS

Stevens Johnson Syndrome

Hội chứng Stevens-Johnson

TEN

Hoại tử biểu bì nhiễm độc

SNP

Toxic Epidermal Necrolysis
Single Nucleotid
Polymorphisms

Ta

Annealing Temperature

Nhiệt độ bắt cặp

Tm

Melting Temperature

Nhiệt độ biến tính

UTR

Untranslated Region

Vùng không mã hóa

KIRs

iii

Phức hợp hòa hợp tổ chức chính

Đa hình đơn nucleotid


DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
Bảng 1.1. Tần suất các alen HLA-C ở cộng đồng người Kinh Việt Nam .......................7
Bảng 1.2. Cấu trúc alen HLA-C*03:02 ...........................................................................8
Bảng 2.1. Quy tắc thiết kế mismatch .............................................................................17
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR bước 1 ............................................................... 18
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR bước 2 ............................................................... 18
Bảng 3.1. Đặc điểm cặp mồi PCR exon 2 – exon 3 của Cereb và cộng sự ...................20
Bảng 3.2. Đặc điểm cặp mồi PCR exon 2 – exon 3 sau thiết kế và điều chỉnh ............22
Bảng 3.3. Vị trí các nucleotid đặc trưng của 3 alen HLA-C*03:02, HLA-C*03:03, HLAC*03:04 .........................................................................................................................27
Bảng 3.4. Kết quả thiết kế mồi ngược đặc hiệu 3 alen HLA-C*03:02, HLA-C*03:03,
HLA-C*03:04 và mồi ngược đặc hiệu 15 alen .............................................................. 28
Bảng 3.5. Kết quả thiết kế mồi xuôi chung cho 18 alen HLA-C ...................................28
Bảng 3.6. Vị trí các nucleotid đặc trưng của alen HLA-C*03:02 .................................30
Bảng 3.7. Kết quả thiết kế mồi ngược đặc hiệu alen HLA-C*03:02 và mồi ngược đặc
hiệu 2 alen HLA-C*03:03, HLA-C*03:04 .....................................................................31
Bảng 3.8. Kết quả thiết kế mồi xuôi chung cho 3 alen HLA-C*03:02, HLA-C*03:03,
HLA-C*03:04 ................................................................................................................31

iv


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Vị trí và cấu trúc gen HLA ...............................................................................4
Hình 1.2. Tên alen HLA có đủ 4 cặp chữ số ....................................................................5
Hình 1.3. Cấu trúc gen HLA-C ........................................................................................6
Hình 1.4. So sánh trình tự 3 alen HLA-C*03 ở cộng đồng người Kinh Việt Nam ........8
Hình 1.5. Số lượng SNP alen HLA-C*03:02 tại 8 exon và 7 intron ............................... 8
Hình 2.1. Sơ đồ nội dung nghiên cứu ............................................................................16
Hình 3.1. Vị trí gắn mồi ngược của Cereb 3BCIn3-12 và mồi ngược chỉnh sửa CRE2E3
trên 18 alen HLA-C ........................................................................................................21
Hình 3.2. Các vị trí thiết kế mồi xuôi CFE2E3 trong vùng intron 1 ............................. 22
Hình 3.3. Kết quả blast cặp mồi PCR exon 2 – exon 3 .................................................23
Hình 3.4. Kết quả so sánh trình tự exon 2 – exon 3 của 18 alen HLA-C ......................26
Hình 3.5. Kết quả so sánh trình tự 3 alen HLA-C*03:02, HLA-C*03:03, HLA-C*03:04
.......................................................................................................................................30
Hình 3.6. Sơ đồ quy trình PCR xác định kiểu gen của alen HLA-C*03:02 ..................33
Hình 3.7. Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR bước 1 .............................................................. 34
Hình 3.8. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của 4 mẫu nghiên cứu và 1 mẫu trắng ở 3
mức nhiệt độ bắt cặp mồi khác nhau (63oC, 65oC, 67oC) .............................................34
Hình 3.9. Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR bước 2 (28 chu kỳ) ..........................................35
Hình 3.10. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR bước 2 của cặp mồi đặc hiệu 3 alen ở 28
vòng và 3 mức nhiệt độ bắt cặp khác nhau (54oC, 56oC, 58oC) ....................................35
Hình 3.11. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR bước 2 của cặp mồi đặc hiệu 15 alen ở 28
vòng và 3 mức nhiệt độ bắt cặp khác nhau (54oC, 56oC, 58oC) ....................................36
Hình 3.12. Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR bước 2 (27 chu kỳ) ........................................36
Hình 3.13. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR bước 2 của cặp mồi đặc hiệu 3 alen ở 27
vòng và 3 mức nhiệt độ bắt cặp khác nhau (54oC, 56oC, 58oC) ....................................37
Hình 3.14. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR bước 2 của cặp mồi đặc hiệu 15 alen ở 27
vòng và 3 mức nhiệt độ bắt cặp mồi khác nhau (54oC, 56oC, 58oC)............................. 37

v


ĐẶT VẤN ĐỀ
Họ gen HLA (Human Leukocyte Antigen – HLA) được biết đến với vai trò mã
hóa cho các phức hợp hòa hợp tổ chức chính (Major Histocompability Complex - MHC)
[54]. Chức năng chiếm ưu thế của các phân tử MHC lớp I và lớp II này là liên kết các
peptid từ môi trường của tế bào và trình diện các peptid này trên bề mặt tế bào để hệ
thống miễn dịch kiểm tra. Đây là một quá trình quan trọng trong phản ứng của hệ thống
miễn dịch để tiêu diệt mầm bệnh xâm nhập và để ngăn ngừa hệ thống miễn dịch nhắm
vào các tế bào của chính nó [45].
Với chức năng quan trọng trong miễn dịch, hơn một trăm bệnh (đã được xác định
ở hầu hết các hệ cơ quan chính) có liên quan đến các gen HLA lớp I và II ở người, cũng
như với một số gen không phải là HLA trong khu vực này (ví dụ, bổ thể C4) và phần
lớn trong số chúng được coi là bệnh tự miễn [15], [54]. Trong đó, phản ứng quá mẫn do
thuốc là mối quan tâm lớn và là gánh nặng cho các hệ thống chăm sóc sức khỏe quốc
gia do mức độ thường nghiêm trọng, tỷ lệ nhập viện cao và tỷ lệ tử vong cao, và đã được
chứng minh có mối liên quan với các alen HLA của người [2].
Phản ứng dị ứng thuốc phổ biến nhất xảy ra ở da. Mức độ của các phản ứng thay
đổi đa dạng, từ các ban ngứa dị ứng đến các triệu chứng có khả năng đe dọa đến tính
mạng. Dị ứng thuốc là một nguyên nhân quan trọng của bệnh suất và tử vong do thuốc.
Hội chứng Stevens Johnson (Stevens Johnson syndrome - SJS) và hoại tử biểu bì nhiễm
độc (toxic epidermal necrolysis -TEN) là những phản ứng bất lợi nghiêm trọng ở da gây
ra bởi thuốc, được đặc trưng bởi sự bong lan rộng của lớp biểu bì (SJS: <10% diện tích
bề mặt cơ thể và TEN: >30% diện tích bề mặt cơ thể) và sự bào mòn của màng nhầy [2].
Cho đến nay, đã có nhiều nghiên cứu lâm sàng cho thấy mối liên quan chặt chẽ
giữa một số alen cụ thể với phản ứng quá mẫn do thuốc gây ra. Trong đó, tiêu biểu là
phản ứng dị ứng 3 thuốc abacavir, carbamazepin và allopurinol đã được chứng minh có
mối liên quan với một số alen HLA [13]. Các phản ứng dị ứng có thể phát triển thành
các phản ứng bất lợi nghiêm trọng ở da, như SJS/TEN cùng nhiều biến chứng nguy hiểm
và tỷ lệ tử vong dao động từ 10% đến hơn 30% [13]. Chính vì vậy, việc xác định các
alen HLA liên quan đến dị ứng thuốc có vai trò lớn trên chăm sóc lâm sàng, cho phép
xác định có hay không có alen ở bệnh nhân trước khi quyết định sử dụng thuốc, làm
giảm nguy cơ gặp các phản ứng dị ứng nghiêm trọng cho bệnh nhân. Do đó, một số alen
HLA được chứng minh mối liên quan với phản ứng dị ứng thuốc đã được xây dựng quy
1


trình để xác định các alen này. Ví dụ như quy trình PCR xác định alen HLA-B*58:01
liên quan đến phản ứng dị ứng allopurinol hay quy trình RFLP-PCR xác định alen HLAA*31:01 liên quan đến phản ứng dị ứng Carbamazepin [52], [55].
Alen HLA-C*03:02 cũng đã được chứng minh có mối liên quan chặt chẽ giữa
phản ứng bất lợi nghiêm trọng trên da (SJS hoặc TEN) với allopurinol ở nhiều cộng
đồng trên thế giới như Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Châu Âu [22], [10], [28],
[50]. Tuy nhiên, cho đến nay chưa có nghiên cứu nào hay quy trình nào để xác định
riêng kiểu gen của alen HLA-C*03:02.
Với những lý do trên, đề tài “Bước đầu xây dựng quy trình phát hiện alen đa
hình HLA-C*03:02” được thực hiện với 2 mục tiêu:
 Thiết kế mồi và xây dựng quy trình xác định kiểu gen đối với alen HLAC*03:02.
 Bước đầu triển khai quy trình đã xây dựng trên thực nghiệm.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Human Leukocyte Antigen (HLA)
1.1.1. Giới thiệu về gen HLA
Họ gen HLA mã hóa cho một nhóm các protein được gọi là phức hợp phù hợp tổ
chức chính (Major Histocompatibility Complex – MHC) hay phức hợp kháng nguyên
bạch cầu người (HLA), nằm trong vùng 6p21.3 trên cánh tay ngắn của nhiễm sắc thể số
6, có chiều dài tổng cộng là 3.600kb hoặc 4,6 x 106 bazơ nitơ gồm hơn 250 gen và giả
gen (pseudogenes) trong đó ít nhất 150 gen được biểu hiện thành protein [1], [45], [54].
Phức hợp HLA giúp hệ thống miễn dịch phân biệt các protein của cơ thể với các
protein được tạo ra bởi những nhân tố xâm nhập ngoại lai như virus và vi khuẩn. HLA
được chia thành ba khu vực là lớp I, lớp II và lớp III. Trong đó, vùng HLA lớp I gồm
các gen mã hóa cho chuỗi nặng α của các phân tử MHC lớp I "cổ điển" (HLA-A, HLAB và HLA-C) và các gen lớp I khác của HLA như HLA-E, HLA-F, HLA-G cùng một loạt
các gen khác, nhưng không phải tất cả đều liên quan đến miễn dịch [1], [45], [54]. Các
gen mã hóa cho phân tử MHC lớp I "cổ điển" chứa 8 exon với chức năng của từng exon
là: exon 1 mã hóa vùng 5’ UTR (vùng không mã hóa) và peptid dẫn đường, exon 2 và 3
mã hóa miền alpha1 và alpha2 - vùng liên kết với peptid, exon 4 mã hóa miền alpha3,
exon 5 mã hóa vùng xuyên màng và exon 6 và 7 mã hóa đuôi tế bào chất nội bào. Vùng
3’ UTR và vị trí đuôi poly A được mã hóa bởi exon 8. Các đa hình trong exon 2 và exon
3 chịu trách nhiệm về tính đặc hiệu liên kết peptid của mỗi lớp phân tử [45]. Vùng HLA
lớp II gồm các gen mã hóa cho cả chuỗi nặng α và chuỗi nhẹ β của các phân tử MHC
lớp II (HLA-DP, HLA-DQ và HLA-DR) cùng một số gen khác hỗ trợ trong việc xử lý và
trình diện kháng nguyên [1], [54]. Và vùng ở giữa HLA lớp I và lớp II được gọi là HLA
lớp III. Mặc dù khu vực này không chứa bất kỳ gen nào của HLA, nhưng nó chứa nhiều
gen quan trọng trong đáp ứng miễn dịch, bao gồm một số thành phần bổ thể (C2, C4 và
yếu tố B) và một số cytokin có vai trò trong quá trình viêm [45], [54].
Vị trí và cấu trúc họ gen HLA được thể hiện trong hình 1.1.

3


Hình 1.1. Vị trí và cấu trúc gen HLA [54]
Các gen HLA có thể có nhiều biến thể khác nhau. Một số gen HLA có hàng trăm
phiên bản đã được xác định – mỗi phiên bản gọi là một alen HLA [69], mỗi alen có ít
nhất một phân loại bốn chữ số (ví dụ HLA-A*02:12), cụ thể:
 Chữ A: biểu thị tên gen trong họ HLA.
 Cặp chữ số đầu tiên: mô tả loại alen, thường tương ứng với các kháng nguyên
được xác định bằng phương pháp huyết thanh học.
 Cặp chữ số thứ hai: cho biết protein HLA nào được tạo ra. Chúng được đặt
tên theo thứ tự phát hiện.
 Ngoài ra, tên các alen còn có thể có cặp chữ số thứ 3 và thứ 4 – thể hiện sự
khác nhau của các trình tự nucleotid không mã hóa hay các thay thế nucleotid
đồng nghĩa trong vùng mã hóa, sự khác biệt này không có ý nghĩa nhiều trên
lâm sàng [65].
Ví dụ tên của một alen HLA đủ 4 chữ số được thể hiện trong hình 1.2.

4


Hình 1.2. Tên alen HLA có đủ 4 cặp chữ số [65]
1.1.2. Đặc điểm gen HLA
Gen HLA ở người, đặc biệt là gen HLA lớp I và lớp II, có tính đa hình cao. Ví dụ,
đến nay, hơn 4300 alen đã được biết đến với gen HLA-B và hơn 1900 alen với gen HLADRB1 [54]. Số lượng SNP (Single Nucleotid Polymorphisms - đa hình đơn nucleotid)
trong hệ gen HLA tương đối lớn với một SNP mỗi 200 - 300 bp (base pair – cặp base).
Các loại biến thể có thể xảy ra bao gồm các đột biến điểm, indel (đột biến thêm hoặc
bớt một nucleotid) và các trình tự đơn lặp lại (ví dụ GCGCGC, AAAAA...). Đặc biệt,
trong các vùng exon đa hình cao, có thể có 50 - 100 SNP nằm trong khu vực dài 100200 bp, nhiều biến thể trong số đó gây ra thay đổi trình tự axit amin. Vì tính đa hình cao
nên các phương pháp nghiên cứu về HLA cần được điều chỉnh cho phù hợp, ví dụ: thay
đổi vị trí mồi PCR trong intron hoặc vùng xa hơn nơi có mức độ đột biến thấp hơn hoặc
nhận dạng lại toàn bộ các biến thể của trình tự HLA để không bỏ sót alen trong phản
ứng chuỗi polymerase và phát hiện được các tổ hợp alen cụ thể [3].
1.2. HLA-C và alen HLA-C*03:02
1.2.1. Tổng quan về HLA-C
1.2.1.1. Vị trí và cấu trúc
Gen HLA-C thuộc họ gen HLA lớp I ở người, nằm trên cánh ngắn của nhiễm sắc
thể số 6 tại ví trí 6p21.33, có tổng chiều dài là 3388 nucleotid và bắt đầu từ nucleotid
31.268.749 đến nucleotid 31.272.136. Cấu trúc gen HLA-C gồm 8 exon, 7 intron dài

5


2894 nucleotid và hai vùng UTR (untranslated region) không mã hóa cho protein ở 2
đầu của gen (hình 1.3) [68].

Hình 1.3. Cấu trúc gen HLA-C [64]
1.2.1.2. Chức năng HLA-C
Gen HLA-C mã hóa cho chuỗi nặng alpha (3 vùng alpha 1, alpha2, alpha 3) của
phân tử HLA-C (MHC) lớp I. Phân tử này tham gia vào trình diện kháng nguyên nội
sinh tương tự các phân tử MHC lớp I. Khác với HLA-A và HLA-B, mức độ biểu hiện
bề mặt của phân tử HLA-C thấp hơn trên các tế bào xôma. Đồng thời, dù HLA-C cũng
giới hạn sự nhận diện kháng nguyên của các tế bào lympho T độc (CTL- Cytotoxic T
Lymphocyte) nhưng chúng ít gặp hơn nhiều so với CTL bị giới hạn bởi HLA-A hoặc
HLA-B. Thay vào đó, HLA-C đóng vai trò là một phối tử chính đối với các các thụ thể
giống kháng thể của tế bào diệt tự nhiên (KIRs – Killer-cell Imunoglobulin-like
receptor) - điều chỉnh hoạt động gây độc tế bào của các tế bào này [41].
Gen HLA nói chung và HLA-C nói riêng được biết đến là hệ kháng nguyên đa
hình và phức tạp ở người, có liên quan đến rất nhiều bệnh. Trong cơ sở dữ liệu của
GWAS Catalog, có 37 nghiên cứu về các SNP nằm trong gen HLA-C liên quan đến 44
kiểu hình khác nhau ở người [72]. Ví dụ SNP tại vị trí rs11967684-A liên quan đến tăng
tỷ lệ phần trăm hồng cầu lưới (P = 2 x 10-24) [4]; SNP tại vị trí rs2853953-A liên quan
đến nhiễm viêm gan B mạn tính (P = 5 x 10-20) [24]; SNP tại vị trí rs116718137-C liên
quan đến ung thư phổi (P = 8 x 10-17) [40];…
Ngoài ra, các alen của gen HLA-C cũng có vai trò quan trọng liên quan đến phản
ứng có hại của thuốc hoặc tác dụng của thuốc, cụ thể đã có 11 thuốc được nghiên cứu
liên quan đến các alen này: allopurinol, carbamazepin, methazolamid, methotrexat,
nevirapin, pegINF alpha-2b,... [68]. Ví dụ alen HLA-C*08:01 làm tăng nguy cơ gặp hoại
tử biểu bì, hội chứng Stevens-Johnson khi sử dụng carbamazepin [46]; Alen HLAC*01:02 làm tăng nguy cơ gặp hoại tử biểu bì, hội chứng Stevens-Johnson khi sử dụng
methazolamid [30], [59]; Alen HLA-C*04:01 làm tăng nguy cơ gặp phản ứng thuốc với
tăng bạch cầu ái toan và các triệu chứng toàn thân, hoại tử biểu bì, nhiễm độc, mẫn cảm,
hội chứng Stevens-Johnson khi sử dụng nevirapine [29], [36]…
6


1.2.1.3. Các alen HLA-C ở người Kinh Việt Nam
Theo nghiên cứu của Bạch Khánh Hòa trên 170 người Kinh Hà Nội, có 18 alen
HLA-C đã được ghi nhận. Trong đó 3 alen HLA-C*01:02; HLA-C*07:02; HLAC*08:01 có tần suất lớn nhất; 3 alen HLA-C*03:02; HLA-C*03:03; HLA-C*03:04 có
tần suất xấp xỉ nhau và alen HLA-C*03:02 có tần suất cao thứ 4 trong cộng đồng (Bảng
1.1) [20].
Bảng 1.1. Tần suất các alen HLA-C ở cộng đồng người Kinh Việt Nam [67]

So

sánh

trình

tự

các

alen

trên

bằng

trang

web

http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/, cho thấy số lượng SNP của các alen nói trên
tập trung nhiều nhất từ exon 2 đến exon 3 với 65 trên tổng số 183 vị trí có SNP nằm
trong 8 exon và 7 intron của 18 alen này. Trong đó, 3 alen HLA-C*03 ở người Kinh Việt
Nam gồm HLA-C*03:02, HLA-C*03:03 và HLA-C*03:04 có trình tự rất giống nhau,
chỉ khác nhau 4 nucleotid, với 3 nucleotid ở exon 2 và 3, 1 nucleotid ở exon 5 (được thể
hiện trong hình 1.4). Vì vậy, quy trình thiết kế mồi PCR để xác định alen HLA-C*03:02
và phân biệt với 2 alen HLA-C*03:03 và HLA-C*03:04 tương đối phức tạp và khó khăn.

7


Hình 1.4. So sánh trình tự 3 alen HLA-C*03 ở
cộng đồng người Kinh Việt Nam [66]
1.2.2. Tổng quan về alen HLA-C*03:02
1.2.2.1. Cấu trúc
Alen HLA-C*03:02 có 2894 nucleotid với 933 G; 595 T (%GC=53%), gồm 8
exon và 7 intron (Bảng 1.2) [71].
Bảng 1.2. Cấu trúc alen HLA-C*03:02 [71]
Exon 1:

1..73

Exon 5:

1979..2098

Intron 1:

74..203

Intron 5:

2099..2537

Exon 2:

204..473

Exon 6:

2538..2570

Intron 2:

474..718

Intron 6:

2571..2677

Exon 3:

719..994

Exon 7:

2678..2725

Intron 3:

995..1581

Intron 7:

2726..2889

Exon 4:

1582..1857

Exon 8:

2890..2894

Intron 4:

1858..1978

So với alen nguyên bản HLA-C*01:02:01:01, alen HLA-C*03:02 có 37 SNP,
trong đó exon 2 và exon 3 có nhiều SNP nhất (hình 1.5) [35]

Hình 1.5. Số lượng SNP alen HLA-C*03:02 tại 8 exon và 7 intron [35]

8


1.2.2.2. Liên quan giữa alen HLA-C*03:02 với bệnh tật và thuốc
Alen HLA-C*03:02 được tìm thấy và báo cáo đầu tiên vào năm 1992 bởi J.
Zemmour [63]. Đến năm 2005, lần đầu tiên có một nghiên cứu công bố về mối liên quan
giữa các bệnh nhân có alen HLA-C*03:02 được điều trị bằng allopurinol có thể tăng
nguy cơ phản ứng bất lợi nghiêm trọng ở da (Severe cutaneous adverse reactions SCARs) ở cộng đồng người Trung Quốc với mối tương quan mạnh: OR = 97,7 (P =
1,4x10-19) giữa bệnh nhân sử dụng allopurinol gặp SCARs có alen HLA-C*03:02 với
bệnh nhân dung nạp allopurinol có alen HLA-C*03:02 và OR = 62,3 (P = 2,5x10-13)
giữa bệnh nhân sử dụng allopurinol gặp SCARs có alen HLA-C*03:02 với dân số nói
chung có alen HLA-C*03:02 [22].
Sau đó, đã có thêm một loạt các nghiên cứu chứng minh và khẳng định hơn nữa
việc làm tăng nguy cơ gặp hội chứng Stevens-Johnson (Stevens Johnson syndrome SJS) hoặc hoại tử biểu bì nhiễm độc (toxic epidermal necrolysis -TEN) ở bệnh nhân có
alen HLA-C*03:02 sử dụng allopurinol trong các cộng đồng khác nhau. Nghiên cứu của
Cristallo AF và cộng sự vào năm 2011 trong cộng đồng người Châu Âu cho thấy: 8,6%
bệnh nhân sử dụng allopurinol gặp SJS/TEN có alen HLA-C*03:02 so với 0% ở nhóm
chứng (P = 0,00105) [10]. Cùng trong năm đó, một nghiên cứu trên người Hàn cũng cho
giá trị có sự khác biệt lớn với P = 9,39x10-11 giữa bệnh nhân sử dụng allopurinol gặp
SCARs có alen HLA-C*03:02 với bệnh nhân dung nạp allopurinol có alen HLAC*03:02 và P = 8,58x10-12 với dân số nói chung [28]. Đến năm 2013, một nghiên cứu
trên cộng đồng người Nhật cũng cho kết quả tương tự với p < 5,62x10-8 so với mẫu
chứng là dân số khỏe mạnh [50].
Ngoài việc làm tăng nguy cơ gặp SCARs, alen HLA-C*03:02 cũng cho thấy làm
tăng phát ban trên da ở bệnh nhân sử dụng allopurinol: OR= 4,94 (P= 0,05) so với bênh
nhân dung nạp allopurinol và OR= 5,17 (P= 0,04) so với dân số chung Hàn Quốc [26].
Tuy nhiên đây chỉ là kết quả phụ của nghiên cứu, giá trị OR rất gần 1 (1,03 với 1,08)
đồng thời mới chỉ có một nghiên cứu cho thấy nguy cơ trên.
Đối với bệnh, alen HLA-C*03:02 làm tăng nguy cơ bệnh nhân viêm khớp dạng
thấp bị viêm mạch so với bệnh nhân viêm khớp dạng thấp không có bệnh lý ngoài khớp
với p < 0,001 [51]. Và mới đây vào năm 2018, một nghiên cứu phân tích meta trên 1,3
triệu dân Trung Quốc trưởng thành khỏe mạnh cho thấy alen HLA-C*03:02 có liên quan

9


mạnh mẽ đến BMI (P = 4,45×10-8) dẫn đến gây nguy cơ thừa cân (P = 2,08x10-5) và
béo phì (P = 4,05x10-3) [48].
1.2.2.3. Các phương pháp đã được sử dụng để xác định alen HLA-C*03:02
Cho đến nay, chưa có nghiên cứu nào công bố quy trình phát hiện riêng alen
HLA-C*03:02 ở người. Việc xác định alen này chủ yếu trong các nghiên cứu về tần
xuất các alen HLA nói chung trong các cộng đồng với các phương pháp như giải trình
tự Sanger [44], giải trình tự thế hệ mới NGS (New generation sequencing) [5], [17],
multiplex real-time PCR [31]. Cả ba phương pháp này được sử dụng với mục đích chính
để sàng lọc các gen, trong đó có alen HLA-C*03:02.
Giải trình tự Sanger được tác giả Peterson TA. và cộng sự áp dụng cho các sản
phẩm PCR exon 2 – exon 3 của gen HLA-C để xác định loại và tần xuất alen HLA-C
[44]. Đây là một kỹ thuật phổ biến trong nghiên cứu di truyền phân tử, cung cấp phân
tích các ADN ở cấp độ nucleotid [39]. Vì vậy, ưu điểm lớn nhất trong phát hiện SNP
bằng phương pháp này là thông tin đầy đủ mà nó mang lại. Trong một thí nghiệm, loại,
vị trí và trình tự chuỗi của mỗi chuỗi đa hình đều được xác định hoàn toàn. Tuy nhiên,
phương pháp này cần các công cụ phân tích trình tự tự động đắt tiền [34].
Phương pháp khác được sử dụng xác định HLA-C*03:02 là giải trình tự thế hệ 2
– pyrosequencing 454 [5], [17]. Phương pháp phân tích này dựa trên nguyên lý "giải
trình tự bằng tổng hợp" được gọi là pyrosequencing với thời gian chạy 10h, đầu ra cho
mỗi lần chạy là 0,5 – 1 Gb (1Gb = 1 tỷ cặp base). Vì vậy phương pháp này thích hợp
với các nghiên cứu về toàn bộ bộ gen người với ưu điểm độ chính xác, đặc hiệu cao, đến
95 – 98%, nhưng thời gian chậm và rất tốn kém (dựa trên giá niêm yết hiện tại cho hệ
thống GS-FLX, chi phí hiện tại cho tất cả các thuốc thử để thực hiện một thử nghiệm
duy nhất là 7000 đô la) [19], [27].
Áp dụng kỹ thuật multiplex real-time PCR để xác định các alen HLA-C, tác giả
Koehler RN. và cộng sự thực hiện hai phản ứng real-time PCR song song với khuôn là
vùng exon 2 – exon 3 gen HLA-C: một phản ứng chứa cặp mồi đặc hiệu các alen có gắn
đầu dò phát huỳnh quang thích hợp; một phản ứng gồm cặp mồi khuếch đại một vùng
bất biến gắn đầu dò phát huỳnh quang khác, với vai trò nội kiểm, giúp xác định phản
ứng chứa cặp mồi đặc hiệu là dương hay âm tính [31]. Kỹ thuật này cho kết quả khuếch
đại ADN mục tiêu được hiển thị sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng [13]. Vì vậy, ngoài
định tính, real-time PCR có thể định lượng gen mục tiêu ban đầu có trong mẫu và không
10


cần thêm các phân tích sau khuếch đại (ví dụ điện di trên gel agarose). Hơn nữa, kỹ thuật
real-time PCR sử dụng phát hiện sản phẩm dựa trên huỳnh quang nên mang lại độ nhạy
cao hơn [39], [49]. Mặc dù vậy, phương pháp này cũng có một số nhược điểm như thiết
bị, hóa chất sinh phẩm sử dụng đắt hơn so với kỹ thuật PCR cơ bản, cán bộ thực hiện
cần được đào tạo chuyên sâu về các quy trình phân tích như thao tác trên thiết bị realtime,
thiết kế đầu dò, đọc kết quả [12], [21].
Vì vậy, khóa luận này đề xuất một phương pháp mới để phát hiện alen HLAC*03:02, là kỹ thuật AS-PCR (Allele-specific polymerase chain reaction) cùng việc sử
dụng công cụ tin sinh học để thiết kế mồi và thiết kế quy trình PCR, với độ đặc hiệu cao,
thời gian thực hiện ngắn, chi phí thấp, kỹ thuật tương đối đơn giản, cho thấy tiềm năng
áp dụng trong lâm sàng của kỹ thuật này [14].
1.3. Tổng quan về kỹ thuật AS-PCR (Allele-specific polymerase chain reaction)
1.3.1. Giới thiệu về AS-PCR
Phản ứng khuếch đại chuỗi đặc hiệu allele (AS-PCR) là một ứng dụng của phản
ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction - PCR). PCR là một quá trình tuần
hoàn; với mỗi chu kỳ, số lượng ADN mục tiêu tăng gấp đôi. Các chuỗi xoắn kép trong
mỗi ADN mục tiêu được phân tách bằng nhiệt độ và sau đó được làm nguội, cho phép
các mồi gắn vào các chuỗi đó. Sau đó, ADN polymerase kéo dài các mồi bằng cách
thêm nucleotid vào theo quy luật bổ sung. Như vậy, rất nhiều các bản sao của các chuỗi
ADN mục tiêu ban đầu được tạo ra sau các chu kỳ của phản ứng PCR [42].
Kỹ thuật PCR nói chung cũng như AS-PCR nói riêng đòi hỏi 4 thành phần chính:
 ADN polymerase chịu nhiệt xúc tác phản ứng tổng hợp trình tựADN mới sau
khi mồi bắt cặp với ADN mục tiêu.
 Các nucleotid triphosphat (nguyên liệu để tạo ADN).
 Khuôn ADN được khuếch đại: ADN của bộ gen, được phân lập từ các tế bào
hoặc mô, hoặc ADN thu được từ các mẫu ARN thông qua phiên mã ngược.
 Mồi đặc hiệu gen (Primer): mồi là các oligonucleotid đặc trưng, trình tự ngắn,
có trình tự bổ sung với hai đầu của đoạn ADN cần nhân bản. Mồi bên trái bổ
sung cho sợi ADN 3’5’ – gọi là mồi xuôi (Forward primer, ký hiệu là F);
ngược lại, mồi bên phải bổ sung cho sợi ADN 5’3’ – gọi là mồi ngược
(reverse primer, ký hiệu R) [23]. Trong AS – PCR, các mồi AS đặc hiệu với
alen mục tiêu, nhưng không bổ sung với các alen khác tại đầu 3’ hoặc gần
11


đầu 3' của đoạn mồi đặc hiệu này. Alen mục tiêu được khuếch đại dễ dàng,
trong khi các alen khác không hoặc kém bị khuếch. Sự khuếch đại kém là kết
quả của sự không phù hợp giữa mẫu ADN và đầu 3’ mồi AS, ngăn cản hiệu
quả kéo dài đầu 3' của Taq polymerase [6].
Nguyên tắc của phản ứng PCR là tổng hợp và khuếch đại sợi ADN mục tiêu từ
mạch khuôn nhờ hoạt động enzym polymerase và cặp mồi đặc hiệu cho đoạn ADN này
bằng ba bước:
 Bước 1 – Biến tính: ADN sợi kép bị biến tính thành các sợi đơn bằng cách
làm nóng đến 94-96oC.
 Bước 2 – Bắt cặp mồi: Phản ứng hạ nhiệt độ, các đoạn ADN ngắn đặc biệt
được gọi là mồi được bắt cặp với các sợi ADN này ở nhiệt độ thích hợp để
mồi ghép cặp bổ sung đặc hiệu với sợi ADN cần khuếch đại. Nhiệt độ bắt
cặp (Ta – annealing temperature) phụ thuộc vào nhiệt độ biến tính (Tm –
melting temperature) của mồi, thường được xác định bằng cách tối ưu hóa.
 Bước 3 – Khuếch đại: Hỗn hợp được gia nhiệt đến 72°C, đó là nhiệt độ tối
ưu cho hoạt động của Taq ADN polymerase. Polymerase xúc tác sự tổng hợp
các sợi ADN mới, sử dụng các nucleotid triphosphat có mặt trong hỗn hợp
để tạo ra chuỗi bổ sung (bắt đầu từ mồi) với trình tự cụ thể, được gọi là quá
trình kéo dài [23], [32].
Ngoài nguyên tắc chung của phản ứng PCR, AS-PCR còn cần 3 mồi tương ứng
với 2 phản ứng PCR được thực hiện song song cho mỗi SNP để xác định kiểu gen đồng
hợp tử, dị hợp tử của alen mục tiêu: một phản ứng gồm mồi đặc hiệu alen thứ nhất (xuôi
hoặc ngược) và một mồi chung (ngược hoặc xuôi tương ứng) để khuếch đại alen mục
tiêu; và một phản ứng cũng gồm mồi đặc hiệu alen thứ hai và một mồi chung để khuếch
đại các alen còn lại [14].
1.3.2. Thiết kế mồi đặc hiệu alen
Tiêu chí của thiết kế mồi PCR nói chung là để cân bằng giữa tính đặc hiệu và
hiệu quả của phản ứng khuếch đại. Kích cỡ mồi tối ưu là từ 18-28 nucleotid (kích thước
ngắn hơn ít giảm tính đặc hiệu nhưng tăng hiệu quả, dài hơn thì ngược lại). Nhiệt độ
biến tính của mỗi mồi nên cách nhau từ 2-5oC để đảm bảo đạt được nhiệt độ bắt cặp
thích hợp cho cả hai mồi. Nhiệt độ biến tính các mồi lớn hơn 50oC thường sẽ làm tăng
tính đặc hiệu và hiệu quả của phản ứng khuếch đại. Với các sản phẩm PCR dài, Tm từ
12


62 đến 72oC được khuyến cáo (Tm có thể được tính trong các chương trình thiết kế mồi
hoặc tính bằng công thức tính Tm= 2(A+T) + 4(G+C)). Cần hạn chế trình tự bổ sung
trong một mồi hoặc giữa hai mồi do tạo cấu trúc thứ cấp trong mồi và làm giảm lượng
sản phẩm. Nồng độ GC mồi lý tưởng là 40-60% [16].
Phương pháp AS-PCR là phương pháp phù hợp để phát hiện nucleotid SNP, cho
phép phát hiện trực tiếp các SNP trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử được
trang bị tối thiểu bằng cách phân tích các sản phẩm PCR trong gel agarose nhuộm màu
ethydium hoặc polyacrylamid [14], [53]. Vì vậy, ngoài tiêu chí chung của mồi PCR, cặp
nucleotid đầu 3’ của hai mồi đặc hiệu alen (allele specific – AS) được lựa chọn cần trùng
với vị trí SNP của alen cần xác định để phân biệt các alen. Tuy nhiên, sự khác biệt cặp
nucleotid duy nhất ở đầu 3' của hai mồi AS không phải lúc nào cũng đảm bảo phân biệt
chính xác hai alen. Vì vậy, cần một cải tiến quan trọng cho mồi AS là ngoài cặp nucleotid
khác biệt tại đầu 3’ của hai mồi, thiết kế thêm một nucleotid mismatch (là nucleotid
không bổ sung với khuôn cần khuếch đại của các alen) trong bốn nucleotid gần đầu 3'
của mồi AS để làm giảm nguy cơ khuếch đại sai alen. Nucleotid không bổ sung này làm
tăng tính đặc hiệu của mồi và được sử dụng hiệu quả trong thực tế [14].
Để thiết kế mồi đặc hiệu cho alen, bước đầu cần so sánh trình tự các alen có thể
có để xác định vị trí SNP của alen mục tiêu, từ đó thiết kế mồi dựa trên vị trí SNP đã
xác định được, và cuối cùng là kiểm tra lại tính đặc hiệu của đoạn mồi đã thiết kế. Các
bước này có thể được hỗ trợ bằng kỹ thuật tin sinh học (là một lĩnh vực liên ngành, chủ
yếu liên quan đến sinh học phân tử, di truyền học và áp dụng các kỹ thuật tin học (như
toán học ứng dụng, khoa học máy tính và thống kê) để hiểu và sắp xếp thông tin liên
quan đến các phân tử sinh học theo quan điểm tính toán [7], [38]).
Các công cụ so sánh cấu trúc chuỗi ADN, ARN và chuỗi protein là một trong
những công cụ phổ biến nhất trong các lĩnh vực tin sinh học. Đây là phương pháp sử
dụng thuật toán để sắp xếp hai hoặc nhiều trình tự nhằm đạt được sự giống nhau tối đa.
Các trình tự này có thể được xen bằng các khoảng trống (thường được diễn tả bằng các
gạch nối ngang) tại các vị trí có thể sao chotạo thành các cột giống nhau hoặc tương tự
nhau. Các bắt cặp không giống nhau trong trình tự tương ứng với các đột biến thay đổi
nucleotid/acid amin và các khoảng trống tương ứng với phần đột biến thêm vào hoặc
xóa đi [7], [58]. Hiện nay có bốn thuật toán khác nhau để so sánh cấu trúc các chuỗi,

13


trong đó khóa luận sử dụng chương trình Multalin dùng thuật toán sắp thẳng hàng lũy
tiến với ưu điểm nhanh, tốn ít thời gian, bộ nhớ [25].
Sau khi lựa chọn được vị trí SNP từ kết quả so sánh cấu trúc chuỗi, mồi đặc hiệu
alen có thể được thiết kế thủ công hoặc sử dụng một số công cụ cho phép thiết kế riêng
mồi đặc hiệu alen như công cụ WASP hoặc BatchPrimer3… [56], [61]. Ngoài ra, trong
thiết kế mồi đặc hiệu alen, chọn được mồi đặc hiệu trong phản ứng PCR là yếu tố quan
trọng nhất ảnh hưởng đến kết quả phản ứng chuỗi polymerase [60]. Để kiểm tra tính đặc
hiệu của mồi, cần có một công cụ tin sinh học chứa ngân hàng dữ liệu về di truyền và
có khả năng so sánh trình tự các chuỗi sinh học này. Trong đó, công cụ khai thác dữ liệu
phổ biến nhất là BLAST (Basic Local Alignment Search Tool - Công cụ tìm kiếm các
trình tự tương đồng) [9]. Tuy nhiên, việc kiểm tra mục tiêu tiềm năng của cặp mồi bằng
BLAST không phải là một quá trình dễ dàng vì cần kiểm tra nhiều đặc điểm giữa mồi
và mục tiêu, chẳng hạn như số lượng và vị trí của các nucleotid bổ sung phù hợp, hướng
của mồi và khoảng cách giữa mồi xuôi và mồi ngược. Việc này thường làm tốn nhiều
thời gian và khó khăn cho người dùng. Hơn nữa, mặc dù chương trình BLAST đã được
sử dụng rộng rãi để phát hiện các mục tiêu của mồi, nhưng thực tế nó không phải là một
công cụ lý tưởng cho mục đích này vì thuật toán BLAST sử dụng không nhất thiết phải
trả về thông tin khớp hoàn toàn trên toàn bộ phạm vi mồi. Vì vậy, một công cụ mới
Primer-BLAST là sự kết hợp của Blast và một thuật toán khác, vừa kế thừa ưu điểm của
Blast như ngân hàng dữ liệu lớn, vừa khắc phục các nhược điểm kể trên của Blast, giúp
kiểm tra tính đặc hiệu của mồi dễ dàng, nhanh chóng hơn. Công cụ này cũng giúp thiết
kế mồi thích hợp còn lại dựa trên đoạn trình tự đích và một mồi sẵn có [60]. Do đó, có
thể sử dụng để thiết kế mồi chung phù hợp trong AS-PCR sau khi đã thiết kế được mồi
đặc hiệu alen.

14


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng, nguyên liệu nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Bốn mẫu ADN dân tộc Kinh ở Hà Nam được sử dụng để khảo sát quy trình xác
định kiểu gen trên thực nghiệm. Các mẫu được thu thập trong dự án “Nghiên cứu thuần
tập 5 năm về bệnh đái tháo đường typ 2 và hội chứng chuyển hóa ở người Việt Nam:
Vai trò yếu tố di truyền và lối sống” lưu trữ ở tủ -80oC tại Viện Dinh dưỡng.
2.1.2. Hóa chất, trang thiết bị
2.1.2.1. Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong đề tài gồm: GoTaq Green Master mix 2x (Promega,
Mỹ), nước tinh sạch GIBCO® UltraPure Distilled Water (Invitrogen, Mỹ), thạch
Agarose (Bio basic, Canada), thuốc nhuộm RedsafeTM (Intron Biotechnology, Hàn
Quốc), đệm điện di UltraPureTM 10X TBE Buffer (Invitrogen, Mỹ), Sizer-100DNA
marker (Intron Bio, Hàn Quốc), các mồi PCR (IDT, Mỹ).
2.1.2.2. Trang thiết bị
Máy NanoDrop 2000 (Nhật Bản), Lò vi sóng SANYO EM – G7560 V/W (Nhật
Bản), máy PCR mastercycler gradient (Eppendorf, Mỹ), máy PCR 2720 Thermal Cycler
(Nhật Bản), máy điện di Mulpid® - 2 plus (Nhật Bản), máy minispin Hermle Z130M
(Đức), máy chụp Geldoc (Bio Rad, Mỹ), máy lắc vortex (Eppendorf, Mỹ), tủ an toàn
sinh học, tủ lạnh – 40C (Toshiba, nhật Bản), tủ lạnh – 200C (Toshiba, nhật Bản), Pipet.
2.2. Nội dung nghiên cứu
Đề tài gồm hai mục tiêu: Thiết kế mồi và xây dựng quy trình xác định kiểu gen
đối với alen HLA-C*03:02; Bước đầu triển khai quy trình đã xây dựng trên thực nghiệm.
Để giải quyết mục tiêu thứ nhất, cần ba nội dung chính:
 Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho exon 2 – exon 3 của gen HLA-C và kiểm tra
tính đặc hiệu của cặp mồi này trên toàn bộ hệ gen của người bằng công cụ
Primer-BLAST.
 Thiết kế ba mồi gồm hai mồi ngược đặc hiệu alen và một mồi xuôi chung để
thực hiện song song hai phản ứng PCR: khuếch đại đặc hiệu 3 alen HLAC*03:02, HLA-C*03:03 và HLA-C*03:04 và khuếch đại đặc hiệu 15 alen
HLA-C còn lại trong tổng số 18 alen HLA-C ở cộng đồng người Kinh Việt
Nam [20].
15


 Thiết kế ba mồi gồm hai mồi ngược đặc hiệu alen và một mồi xuôi chung để
thực hiện song song hai phản ứng PCR: khuếch đại đặc hiệu alen HLAC*03:02 và khuếch đại đặc hiệu hai alen HLA-C*03:03 và HLA-C*03:04.
Với mục tiêu thứ hai, chúng tôi tiến hành khảo sát trên thực nghiệm hai bước đầu
của quy trình đã xây dựng và kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di. Nội dung nghiên
cứu được trình bày trong hình 2.1.

Hình 2.1. Sơ đồ nội dung nghiên cứu
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp thiết kế mồi đặc hiệu alen
2.3.1.1. Phương pháp thiết kế mồi đặc hiệu alen
Nguyên tắc: Để thiết kế mồi đặc hiệu alen, đầu tiên cần xác định các alen HLAC có trong cộng đồng người Kinh Việt Nam từ nghiên cứu của Bạch Khánh Hòa và cộng
sự năm 2018 [20]. Sau đó, lấy trình tự các alen HLA-C có trong cộng đồng người Kinh
Việt Nam từ cơ sở dữ liệu HLA https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html và so
sánh các trình tự này bằng công cụ Multalin http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/ để
xác định vị trí SNP thiết kế mồi đặc hiệu alen. Cuối cùng là thiết kế hai mồi đặc hiệu
alen

dựa

vào

vị

trí

SNP

đã

lựa

chọn

bằng

công

cụ

BatchPrimer3

https://probes.pw.usda.gov/cgi-bin/batchprimer3/batchprimer3.cgi để cho mồi có các
thông số phù hợp nhất.
2.3.1.2 Phương pháp thiết kế mismatch bổ sung cho mồi đặc hiệu alen
16


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×

×