Tải bản đầy đủ

Nghiên cứu định tính, định lượng đồng thời ketoconazol và climbazol trong dầu gội đầu

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ THUỲ ANH

NGHIÊN CỨU ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG
ĐỒNG THỜI KETOCONAZOL VÀ
CLIMBAZOL TRONG DẦU GỘI ĐẦU
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ THUỲ ANH
1401018

NGHIÊN CỨU ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG
ĐỒNG THỜI KETOCONAZOL VÀ

CLIMBAZOL TRONG DẦU GỘI ĐẦU
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn :
1. GS.TS. Thái Nguyễn Hùng Thu
2. TS. Lê Thị Hường Hoa
Nơi thực hiện:
Khoa Mỹ phẩm
Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung Ương

HÀ NỘI – 2019


LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc tới
GS.TS. Thái Nguyễn Hùng Thu và TS. Lê Thị Hường Hoa, hai người thầy đã trực
tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện để tôi có thể hoàn thành luận văn.
Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới DS. Phùng Thị Hồng cùng với sự giúp
đỡ, hướng dẫn của các cán bộ, nhân viên thuộc Khoa Mỹ Phẩm – Viện Kiểm Nghiệm
Thuốc Trung Ương.
Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các Thầy, Cô giáo tại Trường Đại học Dược Hà
Nội, đặc biệt các thầy cô Bộ môn Hoá Phân tích – Độc chất đã trang bị cho tôi kiến
thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã động viên,
đóng góp ý kiến, hỗ trợ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn
thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên

Đỗ Thùy Anh


MỤC LỤC
TRANG
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ

1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

3

1.1.

TỔNG QUAN VỀ KETOCONAZOL

3

1.1.1. Đặc điểm chung

3

1.1.2. Ứng dụng của ketoconazol

3

1.1.3. Độc tính của ketoconazol

5

1.1.4. Sự đề kháng của vi khuẩn với ketoconazol và kháng sinh

6

1.1.5. Một số nghiên cứu về phân tích ketoconazol trong mỹ phẩm

7

1.2.

TỔNG QUAN VỀ CLIMBAZOL

8

1.2.1. Đặc điểm chung

8

1.2.2. Ứng dụng của climbazol

9

1.2.3. Độc tính của climbazol

10

1.2.4. Sự đề kháng của vi khuẩn với climbazol và kháng sinh

11

1.2.5. Một số nghiên cứu về phân tích climbazol trong mỹ phẩm

12

1.3.

SƠ LƯỢC VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC

13

1.3.1. Nguyên tắc của quá trình sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao

13

1.3.2. Cấu tạo máy HPLC

14

1.3.3. Ứng dụng HPLC

15

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

17

2.1.

HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ

17

2.1.1. Dung môi và hoá chất

17

2.1.2. Thiết bị và dụng cụ

17

2.2.

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

17

2.3.

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

18

2.4.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

19

2.5.

XỬ LÝ THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM

21


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN

22

3.1.

22

KHẢO SÁT LỰA CHỌN CÁCH XỬ LÝ MẪU

3.1.1. Lựa chọn dung môi hoà tan mẫu

22

3.1.2. Cách chuẩn bị mẫu

22

3.2.

23

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

3.2.1. Lựa chọn điều kiện sắc ký

23

3.2.2. Thẩm định phương pháp

25

3.2.3. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

34

3.3.

ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐỂ KIỂM TRA MỘT SỐ MẪU
DẦU GỘI ĐẦU LƯU HÀNH TRÊN THỊ TRƯỜNG

35

3.4.

BÀN LUẬN

37

3.4.1. Về các hợp chất nghiên cứu

37

3.4.2. Về phương pháp xử lý mẫu

38

3.4.3.

Về xây dựng quy trình phân tích

38

3.4.4.

Về thẩm định phương pháp

39

3.4.5.

Về kiểm tra các mẫu dầu gội đầu lưu hành trên thị trường

40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

41


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AOAC

Hiệp hội các Nhà hoá học Phân tích Chính thức (Association of
Official Analytical Chemists)

ASEAN

Hiệp hội các Quốc gia Đông Nam Á (Association of Southeast Asian
Nations)

CBZ

Climbazol

CHMP

Hội đồng các Chế phẩm Thuốc dùng cho Con người ở Châu Âu
(Committee of Medicinal Products for Human Use)

CYP

Cytochrom P450

DĐVN V

Dược Điển Việt Nam V

DPSC

Hội đồng Quản lý Thuốc và Độc chất (Drugs and Poisons Scheduling
Committee)

EEC

Hiệp hội các nước Châu Âu về các sản phẩm mỹ phẩm (European
Commission Cosmetics)

EMA

Cơ quan Quản lý Thuốc Châu Âu (European Medicines Agency)

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High – Performance Liquid
Chromatography)

ICH

Hội nghị Quốc tế về hài hoà hoá các thủ tục đăng ký dược phẩm sử
dụng cho con người (The International Council for Harmonisation)

IN

Indigo carmine

KCZ

Ketoconazol

LC

Sắc ký lỏng (Liquid Chromatography)

LOD

Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ

Giới hạn định lượng (Limit of Quantification)

MB

Xanh Methylen (Methylene Blue)

MEC

Hội đồng Phê duyệt Thuốc (Medicines Evaluation Committee)


MS

Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry)

PEG

Polyethylene Glycol

PSC

Hội đồng Quản lý Độc chất (Poisons Scheduling Committee)

r

Hệ số tương quan (Relative coefficient)

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

UPLC

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng (Ultra Performance Liquid
Chromatography)

UV

Tia tử ngoại (UltraViolet)

VIS

Bức xạ khả kiến (Visible)


DANH MỤC CÁC BẢNG
Tên bảng

Trang

Bảng 1.1.

Tính chất của ketoconazol

3

Bảng 1.2.

Tính chất của climbazol

8

Bảng 2.1.

Các mẫu nền được sử dụng để xây dựng phương pháp phân tích

18

Bảng 2.2.

Giá trị độ chính xác và độ thu hồi yêu cầu theo AOAC

21

Bảng 3.1.

Độ thích hợp của hệ thống sắc ký

26

Bảng 3.2.

Thời gian lưu và hệ số phân giải của các chất nghiên cứu trên
các mẫu khác nhau

27

Bảng 3.3.

Chuẩn bị các dung dịch chuẩn hỗn hợp

28

Bảng 3.4.

Kết quả khảo sát độ tuyến tính của CBZ và KCZ

28

Bảng 3.5.

Bảng 3.6.

Bảng 3.7.

Bảng 3.8.

Bảng 3.9.

Bảng 3.10.

Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với KCZ và
CBZ trên nền mẫu placebo 1 (P1)
Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với KCZ và
CBZ trên nền mẫu placebo 2 (P2)
Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp đối với KCZ và
CBZ trên nền mẫu thử M1 thêm chuẩn KCZ (M1K)
Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp đối với KCZ và
CBZ trên nền mẫu thử M2 thêm chuẩn KCZ (M2K)
Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp đối
với KCZ và CBZ trên nền mẫu thử M1 thêm chuẩn KCZ (M1K)
Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp đối
với KCZ và CBZ trên nền mẫu thử M2 thêm chuẩn KCZ (M2K)

30

31

32

32

33

34

Bảng 3.11. LOD và LOQ của climbazol và ketoconazol

34

Bảng 3.12. Kết quả kiểm tra các mẫu thử thu thập được trên thị trường

35


DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ
Tên hình, đồ thị
Hình 2.1.

Các mẫu dầu gội đầu lưu hành trên thị trường được sử dụng để
kiểm tra phương pháp xây dựng

Trang
18

a) Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn với hệ pha động methanol – dung
dịch amoni acetat 0,5% tỷ lệ 80:20 (v/v)
Hình 3.1.

b) Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn với hệ pha động methanol – dung
dịch amoni acetat 0,5% tỷ lệ 75:25 (v/v)

24

c) Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn với hệ pha động methanol – dung
dịch amoni acetat 0,5% tỷ lệ 70:30 (v/v)
Hình 3.2.
Hình 3.3.

Hình 3.4.
Hình 3.5.

Sắc ký đồ độ đặc hiệu với KCZ, CBZ trên nền dầu gội đầu
Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ
climbazol
Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ
ketoconazol
Sắc ký đồ thu được khi phân tích các mẫu dầu gội đầu

27
29

29
36


ĐẶT VẤN ĐỀ
Kinh tế phát triển, chất lượng cuộc sống của người dân được nâng cao nên mỹ
phẩm trở thành mặt hàng tiêu dùng quen thuộc. Mỹ phẩm là loại hàng hóa có lợi nhuận
cao nên khó tránh khỏi việc sản xuất, kinh doanh, buôn bán các sản phẩm kém chất
lượng, không đảm bảo độ an toàn vì lợi nhuận. Do đó, việc đảm bảo chất lượng các
sản phẩm mỹ phẩm cần được quan tâm và chú trọng nhiều hơn, đặc biệt là với các cơ
quan quản lý.
Trong số các sản phẩm tẩy rửa và chăm sóc cá nhân, dầu gội đầu (shampoo)
thuộc về một trong những lĩnh vực lớn của ngành dược học nói chung và ngành mỹ
phẩm nói riêng. Thực tế, dựa trên những công dụng đa dạng có thể khai thác ở loại sản
phẩm này, một loạt các mặt hàng dầu gội đầu thuộc nhiều dạng bào chế khác nhau
được đưa ra thị trường nhưng chưa thực sự được quản lý và đánh giá chất lượng một
cách phù hợp.
Ketoconazol (KCZ) và climbazol (CBZ) là hai hợp chất thuộc dẫn xuất imidazol
có hoạt tính chống nấm, tác dụng trên nhiều loại nấm da, niêm mạc và nội tạng (KCZ).
Hai hợp chất này thường được lựa chọn và đưa vào trong các sản phẩm dầu gội đầu
nhằm tăng khả năng sát khuẩn cũng như điều trị một số bệnh lý về da đầu, đồng thời
CBZ còn đóng vai trò là chất bảo quản (CBZ). Đã có những nghiên cứu ghi nhận về
khả năng chống nấm của CBZ đơn độc hoặc trong dạng phối hợp với các hoạt chất
chống nấm khác và một số tác dụng không mong muốn của nó nhưng đến nay sản
phẩm dầu gội đầu chứa thành phần CBZ vẫn được dùng với vai trò chất bảo quản
trong mỹ phẩm nhưng không được quá 0,5%. Theo bản cập nhật của Uỷ ban Khoa học
Mỹ phẩm ASEAN vào năm 2018, KCZ được liệt kê vào danh mục các chất bị cấm sử
dụng trong mỹ phẩm (với Số tham chiếu là 1380 trong Phụ lục II, phần 1) và CBZ
được liệt kê vào danh sách các chất bảo quản được phép sử dụng trong mỹ phẩm với
mức giới hạn hàm lượng 0,5% (Số tham chiếu là 32 trong Phụ lục VI, phần 1) [14]. Do
vậy nếu dầu gội đầu có chứa thành phần KCZ mà sản phẩm không được đăng kí dưới
dạng thuốc thì không được phép lưu hành.
Với mục đích đảm bảo an toàn cho người sử dụng, đồng thời cung cấp thông tin
và công cụ giúp các cơ quan có biện pháp quản lý phù hợp nhóm mặt hàng dầu gội, đề
-1-


tài: “Nghiên cứu định tính, định lượng đồng thời ketoconazol và climbazol trong
dầu gội đầu” được thực hiện nhằm 2 mục tiêu sau:
1. Nghiên cứu xây dựng được quy trình phân tích ketoconazol và climbazol
trong dầu gội đầu bằng phương pháp HPLC.
2. Áp dụng phương pháp xây dựng để kiểm tra một số mẫu dầu gội đầu lưu
hành trên thị trường nhằm sơ bộ đánh giá việc sử dụng hai chất này trong các chế
phẩm cùng nhóm.

-2-


CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ KETOCONAZOL
1.1.1. Đặc điểm chung
Tên khoa học: 1- acetyl - 4 - [4-[[(2RS, 4SR)-2-(2,4-dichlorophenyl)-2-(1H imidazol1-yl methyl)-1,3-dioxolan-4-yl] methoxy] phenyl] piperazin
Công thức phân tử: C26H28Cl2N4O4
Khối lượng mol: 531,43 g/mol.
Ketoconazol là hợp chất hoá học thuộc dẫn xuất của imidazol, là bột kết tinh
màu trắng hoặc gần trắng.
KCZ là một piperazin, trong cấu trúc phân tử của nó có chứa chức ceton, dioxolan, (dicloro) phenyl và ether. KCZ không tan trong nước, dễ tan trong dicloromethan,
tan trong methanol và hơi tan trong ethanol 96% [3][9].
Bảng 1.1. Tính chất của KCZ [4][5][44][57]
Một số tính chất
Áp suất hơi (mmHg, 25 oC)
Nhiệt độ nóng chảy
Độ tan trong nước (20oC)
Hằng số phân ly (pKa)
Hệ số phân tán octanol/nước
(log Kow)

Thông số

Công thức cấu tạo

6,41.10-14
148 - 152oC
0,29 mg/l
pKa1 = 2,94
pKa2 = 6,51
4,34

1.1.2. Ứng dụng của Ketoconazol
Năm 1981, KCZ được tổng hợp và phát triển bởi Công ty Dược phẩm Janssen
Pharmaceutica (Bỉ) và trong suốt một thập kỷ liệu pháp sử dụng KCZ đường uống đã
được ghi nhận là tiêu chuẩn để điều trị nhiễm nấm toàn thân [31][26]. KCZ có hoạt
tính chống nấm với hoạt phổ kháng khuẩn rộng [3][4][5].
KCZ nằm trong danh mục thuốc thiết yếu tân dược ban hành lần thứ VI (2013)
[4], được ghi nhận là thuốc có hoạt phổ kháng nấm rộng, tác dụng trên nhiều loại nấm
gây bệnh, bao gồm các loại nấm bề mặt da, niêm mạc, nấm nội tạng và trên cả một số
vi khuẩn Gram (+) [7]. Do đó, KCZ thường được sử dụng với vai trò là hoạt chất
chống nấm trong các chế phẩm như kem bôi ngoài, viên nén, dầu gội đầu và một số
chế phẩm khác [3][4].
KCZ thường có tác dụng kìm hãm nấm nhưng thuốc cũng có thể diệt nấm ở
nồng độ cao và dùng kéo dài hoặc trên nấm rất nhạy cảm [4]
Cơ chế hoạt động của KCZ cũng như các dẫn chất azol chống nấm khác. KCZ
ức chế  - demethylase (thuộc hệ enzym Cytochrom P450) là enzym cần thiết cho quá
-3-


trình khử (demethyl hoá) các 14  - methyl sterol thành ergosterol (sterol chủ yếu của
màng tế bào nấm). Lượng ergosterol bị giảm sẽ làm thay đổi tính thấm và chức năng
của màng tế bào. Tác dụng diệt nấm của KCZ ở nồng độ cao có thể do tác dụng hoá lý
trực tiếp của thuốc trên màng tế bào nấm [4][7].
Ngoài ra, với đặc tính ức chế hệ enzym Cytochrom P450, KCZ còn được sử
dụng trong điều trị một số bệnh lý như: tăng calci máu, rối loạn nội tiết và u ác tính,
hội chứng Cushing... Dự phòng suy hô hấp cấp tính bằng KCZ ở những bệnh nhân có
nguy cơ mắc phải cao cũng được ghi nhận ở một số nghiên cứu [9].
Tính linh động của KCZ giúp thuốc được lưu hành trên thị trường dưới nhiều
dạng bào chế khác nhau, đưa tới sự đa dạng trong mục đích sử dụng của các chế phẩm:
- Thuốc dùng đường uống (viên nén, hỗn dịch) có tác dụng điều trị nhiễm nấm toàn
thân; các bệnh lý nấm tại chỗ (sau khi điều trị tại chỗ không hiệu quả) như bệnh nấm
Candida ở da, niêm mạc nặng, mạn tính; bệnh nấm Candida âm đạo mạn tính, nhiễm
khuẩn ở da và móng tay (trừ móng chân). Ngoài ra, thuốc còn có tác dụng dự phòng
bệnh nấm ở người có chức năng miễn dịch suy giảm [4].
- Thuốc dạng dùng ngoài (kem, gel, dầu gội đầu) có tác dụng điều trị và dự phòng các
bệnh lý nấm ở da và niêm mạc (do nấm Candida, Trichophyton rubrum, Malassezia
furfur…), bệnh lang ben, viêm da tiết bã nhờn hay các bệnh lý liên quan tới da đầu như
gàu, viêm da tiết bã… [4][9].
Đến 1999, KCZ đã được đánh giá là an toàn khi đưa vào làm thành phần trong
các sản phẩm mỹ phẩm, với nồng độ tối đa cho phép là 2% [35].
Năm 2002, trong khuôn khổ thích nghi với sự tiến bộ kỹ thuật theo các Phụ lục
thuộc Chỉ thị 76/768/EEC của Hiệp hội các nước Châu Âu về các sản phẩm mỹ phẩm,
nhiều quốc gia đã đặt nghi vấn về sự an toàn của việc sử dụng KCZ trong công thức
bào chế mỹ phẩm, khi tình trạng đề kháng hoặc kháng chéo của nấm với KCZ đang có
khả năng ngày càng gia tăng. Tuy nhiên, chưa có bằng chứng khoa học cụ thể phản
ánh về tình trạng đề kháng hoặc kháng chéo khi sử dụng KCZ làm thành phần trong
công thức của các sản phẩm dầu gội trị gàu ở mức hàm lượng dưới 2% [35][36]. Mặc
dù được các chuyên gia đánh giá là an toàn nhưng việc mở rộng kiểm soát tình trạng
đề kháng và kháng chéo của nấm với thuốc vẫn cần được quan tâm để đảm bảo lợi ích
cho người tiêu dùng [35].
Tuy nhiên theo bản phê duyệt của Uỷ ban Khoa học Mỹ phẩm ASEAN vào
năm 2018, KCZ được liệt kê vào danh mục các chất bị cấm sử dụng trong mỹ phẩm
(với Số tham chiếu là 1380 trong Phụ lục II, phần 1) [14]. Do vậy nếu dầu gội đầu có
chứa KCZ mà sản phẩm không được đăng kí dưới dạng thuốc thì không được phép lưu
hành.
-4-


1.1.3. Độc tính của Ketoconazol
1.1.3.1. Độc tính trên người
KCZ hấp thu nhanh qua đường tiêu hoá, tốt nhất khi ở pH acid. Phần lớn KCZ
liên kết với protein huyết tương (84 – 99%), chủ yếu là với albumin. Thuốc được tìm
thấy phân bố nhiều trong sữa mẹ và được chuyển hoá qua gan tạo ra các hợp chất
không có hoạt tính, sau đó được thải trừ khỏi cơ thể chủ yếu qua phân, một số ít thải
trừ qua nước tiểu. Nồng độ thuốc trong huyết tương diễn biến qua 2 pha: thời gian bán
thải của pha đầu khoảng 2 giờ và pha cuối khoảng 8 giờ [4][9][13].
Một số nghiên cứu ghi nhận những tác dụng bất lợi điển hình mà KCZ gây ra
cho con người như sau [4][9][13]:
- Rối loạn đường tiêu hoá (chán ăn, buồn nôn, đau dạ dày, táo bón…) là tác dụng phụ
thường gặp nhất của KCZ và xuất hiện với tần suất cao hơn nếu tăng liều dùng của
thuốc. Nhiều nghiên cứu cũng ghi nhận tình trạng nhiễm độc gan ở các mức độ khác
nhau dẫn tới viêm gan, hoại tử gan khi sử dụng KCZ liều cao trong thời gian kéo dài.
Rối loạn nội tiết tố xảy ra ở cả 2 giới với liều cao kéo dài của thuốc và suy thượng thận
là tác dụng không mong muốn của KCZ được ghi nhận ngay cả khi sử dụng ở mức
liều thấp.
- Các tác dụng không mong muốn khác: các phản ứng quá mẫn trên da (nổi mề đay,
ngứa da, kích ứng da nơi bôi thuốc...), phản ứng phản vệ, tác động lên hệ thần kinh,
kích ứng mắt, giảm tiểu cầu, bạch cầu, tăng triglycerid máu, đau yếu cơ xương, rụng
tóc, lông…
KCZ (dạng đường uống) phân bố nhiều trong sữa mẹ, có khả năng qua được
nhau thai, do đó dạng chế phẩm này của thuốc được khuyến cáo là không nên sử dụng
trên phụ nữ đang trong thời kỳ mang thai và cho con bú. Mặc dù chưa có những
nghiên cứu đầy đủ về vấn đề sử dụng KCZ trên các đối tượng bệnh nhân đặc biệt, song
thuốc chỉ được sử dụng cho người mang thai khi lợi ích điều trị xác đáng hơn các nguy
cơ có thể gây ra cho thai nhi, đồng thời, tồn tại một số các nghiên cứu ghi nhận về mức
độ an toàn của việc sử dụng KCZ trong thời kỳ cho con bú [4][9].
Bên cạnh đó, dạng dùng ngoài của KCZ với mức hàm lượng tối đa 2% gần như
không tạo ra sự hấp thu toàn thân, do đó KCZ không được tìm thấy trong huyết tương
ngay cả khi sử dụng với một lượng lớn loại chế phẩm này, đảm bảo tránh được các tác
dụng bất lợi do thuốc gây ra [18][53]. Tuy nhiên, việc kiểm soát sử dụng các chế phẩm
dùng ngoài của KCZ trên các đối tượng bệnh nhân đặc biệt là cần thiết nhằm đảm bảo
an toàn cho người sử dụng [54].
Tình trạng kích ứng da, ngứa, rát, cảm giác bỏng nhẹ da đầu... là những tác
dụng bất lợi thường gặp khi sử dụng các chế phẩm dầu gội đầu ketoconazol 2%. Ngoài
-5-


ra, các trường hợp rụng tóc, thay đổi tính chất tóc tự nhiên trên những bệnh nhân sử
dụng loại chế phẩm này cũng được ghi nhận ở một số nghiên cứu [47][53].
1.1.3.2. Độc tính trên các sinh vật khác
KCZ gây quái thai ở chuột (dính ngón và thiếu ngón) ở liều 80 mg/kg/ngày
(gấp 10 lần liều uống tối đa cho người) [4].
Chuột được điều trị bằng KCZ có sự suy giảm mạnh về khả năng sinh sản và
đường sinh sản có sự thay đổi về môi trường sinh hoá. Ở chuột đực, tốc độ di chuyển
và mật độ của tinh trùng trong mào tinh hoàn giảm đáng kể, hàm lượng protein và acid
sialic của tinh hoàn, mào tinh hoàn, túi tinh và tuyến tiền liệt cũng giảm mạnh [55]. Ở
chuột cái, KCZ được cho là làm giảm hàm lượng estradiol trong huyết tương dẫn tới
chứng phì đại nhau thai quá mức, do thuốc có khả năng ức chế hoạt động của các enzym tham gia vào quá trình sinh tổng hợp steroid ở động vật có vú (như 17,20 – lyase,
estrogen synthase) [55].
Ở thỏ, độc tính thuộc về mẹ, độc tính trên phôi và gây quái thai do sử dụng
KCZ với liều cao 40 mg/kg/ngày cũng được ghi nhận ở một số nghiên cứu [55].
Do có khả năng ức chế hệ enzym CYP450, một số nghiên cứu nhận thấy KCZ
ức chế hoạt động của CYP3A và CYP1A, là các enzym quan trọng tham gia vào quá
trình chuyển hoá các hợp chất thân dầu có cấu trúc hoá học đa dạng xuất hiện nhiều
trong các chất gây ô nhiễm môi trường, dẫn đến giảm khả năng thải độc ở một số loài
động vật thuỷ sinh (cá hồi cầu vồng, cá killi) [48][55].
Ảnh hưởng tới chức năng tiêu hoá (gây chán ăn, buồn nôn, nôn, tiêu chảy), làm
thay đổi màu sắc bộ lông, gây ngứa và rụng lông ở chó. Ngoài ra, sử dụng KCZ kéo
dài điều trị bệnh cầu trùng ở chó còn có khả năng gây đục thuỷ tinh thể [19][21][32].
Mèo được đánh giá là nhạy cảm hơn với KCZ, tuy nhiên, sử dụng dạng dùng
ngoài của thuốc có thể gây khô lông ở mèo [19][56].
1.1.4. Sự đề kháng của vi khuẩn với KCZ và kháng sinh
Ngoài các chủng có khả năng kháng tự nhiên với một số loại thuốc chống nấm,
việc sử dụng không hợp lý các chế phẩm thuốc kháng nấm và kháng sinh cũng góp
phần làm gia tăng đề kháng của vi khuẩn với thuốc theo nhiều cơ chế khác nhau, đặc
biệt thường xuất hiện ở các loài Candida spp. phổ biến [52][29].
Ghi nhận của Horsburgh và cộng sự cho thấy tình trạng đề kháng của vi khuẩn
với KCZ đã xuất hiện ở loài Candida albicans. Khi tiến hành nuôi cấy vi sinh từ các
mẫu bệnh phẩm thu được từ người bệnh, họ quan sát thấy trong môi trường thạch nuôi
cấy có sự xuất hiện của các tiểu quần thể “subpopulation” xảy ra ở cả những mẫu bệnh
phẩm của bệnh nhân chưa có sự phơi nhiễm với thuốc. Kết luận đưa ra chưa rõ ràng,

-6-


tuy nhiên, khoảng giá trị MIC có sự biến động trên một khoảng rộng được đánh giá là
có liên quan tới hiện tượng này [30].
Candida tropicalis được ghi nhận in vivo là có đề kháng với KCZ trong một
báo cáo ca lâm sàng của Hann và cộng sự về bệnh nhi 13 tháng tuổi có chứng loét da
sử dụng KCZ để điều trị nhưng không cho thấy hiệu quả [30].
Tình trạng đề kháng của vi khuẩn đối với KCZ được đánh giá là ít hơn so với
các azol khác (fluconazol, itraconazol…) do tính kém phổ biến trong ứng dụng điều
trị. Tuy nhiên, việc kháng chéo của vi khuẩn đối với KCZ và các azol khác được ghi
nhận ở nhiều nghiên cứu và xuất hiện ngày càng gia tăng [10][24][49].
Như vậy, đối diện với tình trạng đề kháng của vi khuẩn với các nhóm thuốc
kháng nấm và kháng sinh hiện nay, việc sử dụng các chế phẩm của KCZ cần được
quản lý và tuân thủ nghiêm ngặt.
1.1.5. Một số nghiên cứu về phân tích ketoconazol trong mỹ phẩm
 Định lượng ketoconazol trong dầu gội đầu bằng phương pháp HPLC [27]:
Cột LiChrospher® 100 RP-8 (150 mm × 4,6 mm, 5 µm); nhiệt độ cột: 20 ± 1oC.
Pha động: Hỗn hợp của monoisopropylamin – methanol (2:500) và amoni acetat –
nước (1:200 w/v) với tỷ lệ 7:3 (v/v). Dung dịch acid acetic được sử dụng để điều chỉnh
độ pH của pha động tới giá trị 5,5. Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút. Detector UV, bước sóng
225 nm. Khoảng nồng độ tuyến tính: 60,0 – 480,0 µg/ml (R2 = 0,9998).
 Xét nghiệm vi sinh thành phần ketoconazol trong dầu gội đầu [45]:
Mẫu vi sinh vật: Candida albicans ATCC 10231.
Môi trường thạch: Sabouraud 2% (Merck).
Dung dịch chuẩn: 25,0 mg chất chuẩn ketoconazol (São Paulo, Brazil) được hoà
tan trong bình định mức 25,0 ml với hỗn hợp các chất: 1,0 ml HCl 1N, 1,25 g dầu gội
đầu ketoconazol 2%, 0,25 ml polysorbat 80 và methanol vừa đủ. Lọc và pha loãng với
dung dịch đệm KH2PO4 1N pH 6,0 thu được các mức nồng độ 20,0; 100,0 và 500,0
µg/ml.
Dung dịch mẫu: 1,25 g dầu gội đầu ketoconazol 2% được hoà tan trong bình
định mức 25,0 ml với hỗn hợp các chất: 0,25 ml polysorbat 80 và methanol vừa đủ.
Lọc và pha loãng với dung dịch đệm KH2PO4 1N pH 6,0 thu được các mức nồng độ
20,0; 100,0 và 500,0 µg/ml.
6 ống bằng thép không gỉ có kích thước đồng đều (đường kính trong 6 mm cao
10 mm), 3 ống chứa dung dịch mẫu, 3 ống chứa dung dịch chuẩn.
Nhiệt độ thực hiện: 37oC. Thời gian thực hiện: 18 giờ.
Khoảng nồng độ tuyến tính: 20 - 500 µg/ml (R2 = 0,9964).
Độ chính xác của phương pháp: RSD = 2,57%.
-7-


 Xác định thành phần ketoconazol trong các chế phẩm bằng các phương pháp
quang phổ [23]:
Nguyên tắc: đo gián tiếp nồng độ KCZ thông qua độ hấp thụ của lượng thuốc
nhuộm còn lại sau khi bị các chất oxy hoá dư của phản ứng oxy hoá thuốc làm mất
màu, sử dụng hệ thống đo quang phổ 2 chùm tia SpectroScan 80D UV – VIS. Nhiệt độ
thực hiện: 25oC.
Phương pháp A: Sử dụng chất oxy hóa là Ce (IV), thuốc nhuộm IN (Aldrich) và độ
hấp thụ được đo ở bước sóng 610 nm.
Khoảng nồng độ tuyến tính: 5,0 – 30,0 µg/ml (R2 = 0,996).
Giới hạn phát hiện (LOD): 1,5 µg/ml. Giới hạn định lượng (LOQ): 4,5 µg/ml
Phương pháp B: Sử dụng chất oxy hóa là KMnO4, thuốc nhuộm MB (Merck) và độ
hấp thụ được đo ở bước sóng 660 nm.
Khoảng nồng độ tuyến tính: 5,0 – 35,0 µg/ml (R2 = 0,995).
Giới hạn phát hiện (LOD): 2,3 µg/ml. Giới hạn định lượng (LOQ): 6,9 µg/ml.
 Định lượng ketoconazol trong shampoo gel trị gàu chứa ketoconazol [2]:
Cột Apollo C18 (250 mm x 4,6 mm; 5m). Pha động: Hỗn hợp methanol - dung
dịch đệm phosphat pH 3,0 (65:35). Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút. Thể tích tiêm mẫu: 20
l. Detector UV, bước sóng 254 nm. Khoảng nồng độ tuyến tính: 50 – 500 g/ml
(R2= 0,999).
 Định lượng ketoconazol trong hệ tiểu phân nano lipid sử dụng qua da [6] bằng
phương pháp HPLC:
Hệ thống sắc ký Agilent Infinity 1260, cột Alltech C18 (250 × 4,6 mm; 5 m).
Pha động: Hỗn hợp methanol - dung dịch đệm phosphat pH 3,0 (65:35). Tốc độ dòng:
1,0 ml/phút. Thể tích tiêm mẫu: 20 l; Detector UV, bước sóng 254 nm. Khoảng nồng
độ tuyến tính: 4 – 190 g/ml (R2 = 0,9998).
1.2. TỔNG QUAN VỀ CLIMBAZOL
1.2.1. Đặc điểm chung
Bảng 1.2. Tính chất của CBZ [16][20][39][58]
Một số tính chất

Thông số

Áp suất hơi (mmHg, 25 oC)

2,1.10-7

Nhiệt độ nóng chảy

96,8oC

Độ tan trong nước (21oC)

5,5 mg/l

Hằng số phân ly (pKa)

7,5

Hệ số phân tán octanol/nước(log Kow)

3,76

Công thức cấu tạo

Tên khoa học: (RS)-1-(4-chlorophenoxy)-1-imidazol-1-yl-3,3- dimethyl-2-butanon
Công thức phân tử: C15H17ClN2O2
-8-


Khối lượng mol: 292,76 g/mol.
Climbazol là hợp chất hoá học thuộc dẫn xuất của imidazol, là bột hoặc tinh thể
màu trắng đến nâu nhạt.
Climbazol là một halogen thơm, trong cấu trúc phân tử của nó có chứa chức
ether và ceton [58].
CBZ gần như không tan trong nước, tan tốt trong cyclopropanol, cyclohexanon
và một số dung môi hữu cơ khác như PEG 200, PEG 400 [20]. Độ tan của CBZ trong
các hợp chất alcol rất đa dạng và thay đổi theo nhiệt độ ở mỗi hợp chất [28].
1.2.2. Ứng dụng của climbazol
Climbazol có hoạt tính chống nấm với hoạt phổ kháng khuẩn rộng [16][40]. Từ
khi tìm ra cho đến nay, CBZ được ghi nhận rộng rãi bởi tác dụng hiệu quả trong điều
trị gàu, là hoạt chất quan trọng trong nhiều sản phẩm chăm sóc cá nhân như dầu gội,
dầu xả và dưỡng tóc [16]. Climbazol là hoạt chất chống nấm tại chỗ thuộc nhóm azol
được sử dụng trong điều trị nhiễm nấm da ở người như gàu, eczema và viêm da tiết bã
[11][12]. Thời gian bán hủy (t1/2) ở nhiệt độ 50oC là 228,7 ngày, ở nhiệt độ 70oC là
140,6 ngày và ở nhiệt độ 90oC là 91,1 ngày [20].
Do cùng thuộc nhóm dẫn chất của imidazol, CBZ có cơ chế hoạt động tương tự
KCZ. CBZ ức chế  - demethylase (thuộc hệ enzym Cytochrome P450) là enzym cần
thiết cho quá trình khử (demethyl hoá) các 14 - methyl sterol thành ergosterol (sterol
chủ yếu của màng tế bào nấm). Lượng ergosterol bị giảm sẽ làm thay đổi tính thấm và
chức năng của màng tế bào, ảnh hưởng trực tiếp tới hoạt động của màng tế bào nấm
dẫn đến tác dụng chống nấm của CBZ [33].
Theo ghi nhận của Pople và cộng sự (2014), CBZ có khả năng điều chỉnh tính
biệt hoá của tế bào sừng (keratinocyte), thúc đẩy sự biểu hiện của các protein giàu prolin trong các tế bào sừng quan trọng. Ngoài ra, một báo cáo nghiên cứu in vitro của
Bhogal và cộng sự (2014) đã chứng minh tác dụng ức chế của CBZ trên các protease
trong tóc có liên quan đến đặc tính của sợi tóc [37].
CBZ có tác dụng tốt trên các loài nấm thuộc Malassezia spp., gồm M. globosa,
M. restricta và M. furfur, là các vi sinh vật đóng vai trò chính trong nguyên nhân gây
ra các bệnh về gàu ở người [25][40][41]. So sánh với các hoạt chất điều trị gàu hiệu
quả khác, nhiều nghiên cứu đã ghi nhận tính vượt trội trong tác dụng của CBZ [37].
Tháng 11 năm 1980, CBZ lần đầu tiên được cân nhắc đưa vào danh sách độc
chất bởi Hội đồng Quản lý Độc chất (PSC - Poisons Scheduling Committee). Tuy
nhiên, tới tháng 11 năm 1986, CBZ được đưa vào mục sửa đổi và cho phép xuất hiện
trong thành phần của mỹ phẩm với vai trò chất bảo quản ở mức hàm lượng tối đa 0,5%
theo khuyến cáo của Tiêu chuẩn Mỹ phẩm Úc (Australian Cosmetics Standards) bởi
-9-


Hội đồng Quản lý Thuốc và Độc chất (DPSC – Drugs and Poisons Scheduling Committee) [12].
Theo các cơ quan y tế của Úc, Hội đồng Phê duyệt Thuốc (MEC – Medicines
Evaluation Committee) đã cho phép sử dụng CBZ chỉ với mục đích ngoài da. Nồng độ
CBZ trong các sản phẩm chăm sóc đọng lại (leave – on products) có giới hạn tối đa là
0,5% và không quá 2% với các sản phẩm tẩy rửa (rinse – off products) [12].
Tuy nhiên, tại Việt Nam, quy định về nồng độ hoạt chất này trong mỹ phẩm vẫn
phải tuân theo bản cập nhật của Uỷ ban Khoa học Mỹ phẩm ASEAN (2018), với vai
trò là chất bảo quản có giới hạn hàm lượng là 0,5%.
1.2.3. Độc tính của climbazol
1.2.3.1. Độc tính trên người
Ở người, CBZ chỉ được phép sử dụng với mục đích ngoài da, do đó, giống với
dạng dùng ngoài của KCZ, các chế phẩm với mức hàm lượng CBZ lên tới 2% có sinh
khả dụng tối đa là 0,15% so với liều áp dụng gần như không tạo ra sự hấp thu toàn
thân [38]. Tuy nhiên, việc kiểm soát sử dụng các loại sản phẩm này trên các đối tượng
bệnh nhân đặc biệt là cần thiết nhằm đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng [42].
CBZ được đánh giá có khả năng hấp thu tốt qua các lớp ngoài của cấu trúc da
và tóc, với mức độ thẩm thấu đa dạng tuỳ thuộc vào loại chế phẩm sử dụng [37][42].
Độ an toàn khi sử dụng các sản phẩm có chứa thành phần CBZ được đảm bảo khi diện
tích bề mặt da tiếp xúc với chế phẩm không quá 2400 cm2 [12]. Tuy nhiên, kích ứng
da là tác dụng bất lợi điển hình của CBZ đã được ghi nhận với các triệu chứng như dị
ứng, ngứa, nổi mẩn đỏ... [33]. Kết quả thử nghiệm của nhiều tác giả khi nghiên cứu
test phản ứng trên da với nồng độ CBZ 2% đã cho thấy khả năng tình trạng da kích
ứng là rất thấp và nếu có cũng chỉ xuất hiện ở mức độ nhẹ [20][42].
Hiện nay, phần lớn kết luận về độc tính của CBZ đều dựa trên những báo cáo
về các hoạt chất chống nấm thuộc nhóm azol khác như econazol, miconazol, fluconazol... CBZ đã được chứng minh là không có khả năng gây ung thư và đột biến tế bào
trong một số nghiên cứu, đặc biệt trên các báo cáo thử nghiệm in vivo, mặc dù vậy, tồn
tại một vài các thử nghiệm in vitro cho kết quả dương tính về độc tính trên hệ gen của
hợp chất này [12][38].
Cho đến nay, mặc dù chưa có những nghiên cứu cụ thể và toàn diện về vấn đề
sử dụng CBZ trên các đối tượng bệnh nhân đặc biệt, song thuốc chỉ được sử dụng cho
phụ nữ mang thai khi lợi ích điều trị vượt trội hơn các nguy cơ có thể gây ra cho người
mẹ và thai nhi, đồng thời, việc cân nhắc sử dụng CBZ trên trẻ nhỏ cũng cần được lưu ý
và kiểm soát chặt chẽ [11].

- 10 -


1.2.3.2. Độc tính trên các sinh vật khác
Một trong những đặc tính nổi bật của CBZ là độc tính của hợp chất này trên hệ
sinh thái [33]. Trong khoảng thời gian trở lại đây, các hoạt chất chống nấm trở thành
các nhân tố mới gây ra những hậu quả ô nhiễm vô cùng nghiêm trọng tới môi trường,
đặc biệt là môi trường thuỷ sinh. CBZ có độc tính rất mạnh với tảo và đậu lăng nước,
có khả năng gây rối loạn nội tiết, ảnh hưởng lớn tới các quá trình chuyển hoá và sản
xuất hormon ở cá [22][39].
Đối với các sinh vật trên cạn, do có khả năng ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng
hợp sterol và gibberellin - là các yếu tố quan trọng đảm bảo sự phát triển bình thường
của cây, CBZ có độc tính cao chủ yếu trên thực vật, làm chậm tốc độ tăng trưởng của
các loài cây nói chung và hệ thực vật bậc cao nói riêng [39].
CBZ gây kích ứng trên da ở chuột lang cái với nồng độ 10% và kích ứng nhẹ ở
loài thỏ trắng New Zealand ở mức nồng độ 0,5% [12].
Một số nghiên cứu về độc tính liều lặp lại của CBZ trên chuột cho thấy hiện
tượng men gan tăng ở mức liều từ 15 mg/kg cân nặng/ngày trở lên [12].
Kết quả thử nghiệm CBZ đường uống cho thấy tình trạng co giật, suy giảm khả
năng phối hợp vận động ở chuột phụ thuộc vào liều, ở thỏ và chó biểu hiện co giật
xuất hiện hạn chế hơn [43].
Ngoài Malassezia spp., Pityrosporum ovale cũng được ghi nhận là một trong
những tác nhân hàng đầu gây ra tình trạng viêm da tiết bã. Trong nhiều báo cáo nghiên
cứu cả in vivo và in vitro, CBZ được đánh giá là hoạt chất chống nấm có tác dụng tốt
trên loại vi khuẩn này [51].
1.2.4. Sự đề kháng của vi khuẩn với CBZ và kháng sinh
Mặc dù đã có nhiều báo cáo nghiên cứu đánh giá tích cực về khả năng chống
nấm hiệu quả của CBZ, hợp chất này cho đến nay vẫn chưa được đưa vào danh sách
các dược chất có hoạt tính. Do đó, việc sử dụng CBZ với vai trò chất bảo quản hoặc
hoạt chất trong các sản phẩm chăm sóc cá nhân rất dễ bị thiếu kiểm soát, dẫn đến tình
trạng gia tăng đề kháng của vi khuẩn đối với nhóm thuốc chống nấm cũng như một số
loại kháng sinh.
Do nằm trong nhóm các hoạt chất azol có khả năng chống nấm, không những
có tác dụng hiệu quả trên các loài thuộc Malassezia spp., CBZ còn được ghi nhận về
khả năng ức chế hoạt động của các loài nấm khác như Aspergillus, Candida, Penicilium. Đồng thời, với tình trạng đề kháng hiện nay của vi khuẩn, kết hợp với lượng cơ sở
dữ liệu còn hạn chế về tính mẫn cảm của các chủng nấm với các hợp chất azol sẵn có,
việc nghi ngờ về khả năng gia tăng đề kháng của vi khuẩn đối với CBZ là khó tránh
khỏi [46].
- 11 -


Theo nhận định của Hội đồng các Chế phẩm Thuốc dùng cho Con người ở
Châu Âu (CHMP - Committee of Medicinal Products for Human Use)
EMA/CHMP/618632/2011, việc sử dụng CBZ trong các sản phẩm mỹ phẩm có thể
làm tăng nguy cơ kháng chéo của vi khuẩn với các thuốc chống nấm azol khác, ảnh
hưởng trực tiếp tới hệ sinh vật trên da ở người và đặc biệt ở những bệnh nhân có hệ
miễn dịch suy giảm [34][46].
Cho đến nay, tình trạng đề kháng của chủng nấm Malassezia spp. với CBZ
chưa được quan sát thấy ở nhiều nghiên cứu [46], tuy nhiên, việc lạm dụng CBZ là yếu
tố thuận lợi làm gia tăng khả năng đề kháng của loài vi khuẩn này với CBZ cũng như
các hoạt chất chống nấm khác [8].
Như vậy, đối diện với tình trạng đề kháng của vi khuẩn với các nhóm thuốc
kháng nấm và kháng sinh hiện nay, việc sử dụng các chế phẩm của CBZ cần được
quản lý và tuân thủ nghiêm ngặt. Ngoài ra, ứng dụng kết hợp đa dạng các hoạt chất
chống nấm trong cùng một chế phẩm có thể góp phần cải thiện tình trạng đề kháng và
kháng chéo của vi khuẩn đối với các nhóm thuốc [8].
1.2.5. Một số nghiên cứu về phân tích climbazol trong mỹ phẩm
Tại Việt Nam, cho tới nay chưa tìm thấy nghiên cứu nào nói về việc phân tích
CBZ nói chung và phân tích thành phần CBZ trong mỹ phẩm nói riêng. Một số nghiên
cứu phân tích climbazol trong mỹ phẩm trên thế giới như:
 Định lượng thành phần CBZ có trong dầu gội đầu [50] bằng HPLC và phương pháp
vi sinh:
- Phương pháp HPLC:
Máy HPLC Shimadzu (bơm LC-10AD, detector UV-Vis SPD-10AV)
Cột LiChrospher® RP-8 (150 mm × 4,6 mm, 5 µm). Nhiệt độ cột: 20 ± 1oC
Pha động: Hỗn hợp monoisopropylamin – methanol (2:500) và amoni acetat –
nước (1:200) với tỷ lệ 7:3. Dung dịch acid acetic được sử dụng để điều chỉnh độ pH
của pha động tới giá trị 5,5. Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút. Detector UV, bước sóng 225
nm.
Khoảng nồng độ tuyến tính: 60,0 – 480,0 µg/ml (R2 = 0,9797).
- Điều kiện của phương pháp vi sinh:
Mẫu vi sinh vật: Candida albicans ATCC 10231.
Môi trường thạch: Sabouraud 2%.
Dung dịch chuẩn: 25,0 mg chất chuẩn climbazol được hoà tan trong bình định
mức 25,0 ml với hỗn hợp các chất: 1,0 ml HCl 1N, 1,25 g dầu gội đầu climbazol 2%,
0,25 ml polysorbat 80 và methanol vừa đủ. Lọc và pha loãng với dung dịch đệm
KH2PO4 1N pH 6,0 thu được các mức nồng độ 20,0; 100,0 và 500,0 µg/ml.
- 12 -


Dung dịch mẫu: 1,25 g dầu gội đầu climbazol 2% được hoà tan trong bình định
mức 25,0 ml với hỗn hợp các chất: 0,25 ml polysorbat 80 và methanol vừa đủ. Lọc và
pha loãng với dung dịch đệm KH2PO4 1N pH 6,0 thu được các mức nồng độ 20,0;
100,0 và 500,0 µg/ml.
4 ống bằng thép không gỉ có kích thước đồng đều (đường kính trong 6 mm cao
10 mm), 2 ống thép chứa dung dịch mẫu, 2 ống thép chứa dung dịch chuẩn.
Nhiệt độ thực hiện: 37oC. Thời gian thực hiện: 18 giờ.
Khoảng nồng độ tuyến tính: 20 - 500 µg/ml (R2 = 0,9766). Độ chính xác của
phương pháp: RSD = 2,45%.
 Định lượng climbazol đọng lại trên da đầu từ các chế phẩm dầu gội trị gàu bằng
UPLC – MS/MS [15]:
Với mục đích đánh giá đồng thời độ nhạy cảm và hàm lượng của thành phần
kẽm pyrithion và climbazol đọng lại trên da đầu từ các chế phẩm dầu gội trị gàu. Hệ
thống sắc ký lỏng siêu cao áp Waters ACQUITY UPLC kết hợp với máy đo khối khổ
Quattro Micro API (Waters, Manchester, UK).
Cột Waters ACQUITY UPLC BEH C18 (50 mm × 2,1 mm; 1,7 µm).
Pha động: Hỗn hợp của amoni acetat 20 mM – methanol ở chế độ gradient
tuyến tính.
Khoảng nồng độ tuyến tính của climbazol: 5,0 – 5000,0 ng/ml.
Giới hạn phát hiện (LOD) của climbazol là 1 ng/ml và giới hạn định lượng
(LOQ) là 4 ng/ml.
Ngoài ra còn có các phương pháp HPLC được xây dựng nhằm định lượng thành
phần climbazol trong dung dịch sau khi bị chiếu xạ bởi tia UV để đánh giá ảnh hưởng
của độ pH tới động học phân huỷ quang dưới tác động của tia cực tím trên dung dịch
climbazol [17] và đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phân huỷ climbazol trong
các dung dịch pha loãng [16].
1.3. SƠ LƯỢC VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC
1.3.1. Nguyên tắc của quá trình sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký là kỹ thuật được ứng dụng trong nhiều ngành khoa học, gồm các phương
pháp dùng để phân tách các thành phần của một hỗn hợp dựa trên sự phân bố liên tục
của các cấu tử chất phân tích trên hai pha luôn tiếp xúc và không hoà lẫn vào nhau:
pha tĩnh và pha động [1].
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography, HPLC)
là kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh.
Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha, tức
là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa
- 13 -


giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó. Thành phần pha động đưa
ra các chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân
tích với thời gian hợp lý [1]. Pha tĩnh được nhồi vào cột theo một kỹ thuật nhất định.
Pha tĩnh là yếu tố quyết định bản chất của quá trình sắc ký (sắc ký phân bố, sắc ký hấp
phụ, sắc ký trao đổi ion…).
Thực hiện quá trình sắc ký là đặt chất phân tích lên pha tĩnh ở đầu cột rồi cho
pha động liên tục đi qua. Yếu tố quyết định hiệu quả sự tách sắc ký là các tương tác:
giữa các chất phân tích với pha tĩnh; giữa các chất phân tích với pha động và giữa pha
tĩnh với pha động.
Mẫu phân tích được hòa tan trong pha động. Pha động có thể là một chất lỏng (có
thể ở trạng thái siêu tới hạn) hoặc chất khí được cho qua pha tĩnh một cách liên tục và
không hòa lẫn vào pha tĩnh. Pha tĩnh được cố định trong cột. Các chất tan sẽ di chuyển
qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào tương tác giữa: chất tan –
pha tĩnh – pha động. Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau mà các thành phần của mẫu cần
phân tích sẽ được tách ra riêng biệt.
1.3.2. Cấu tạo máy HPLC
Do bản chất hóa học của các chất phân tích rất khác nhau nên có nhiều kỹ thuật
để tách định lượng bằng sắc ký lỏng. Tuy vậy, nguyên tắc cấu tạo của một máy sắc ký
lỏng đều giống nhau, có cùng một số bộ phận được kết nối với nhau.
1.3.2.1. Hệ thống cấp pha động
Pha động thường được chứa trong bình thủy tinh. Có 2 cách sử dụng pha động:
- Đẳng dòng: thành phần pha động không thay đổi trong quá trình sắc ký.
- Chương trình hóa dung môi: pha động là một hỗn hợp của nhiều dung môi, thường là
2 – 4 dung môi được đựng trong các loại bình khác nhau. Tỷ lệ các thành phần thay
đổi trong quá trình sắc ký theo chương trình đã định. Có hai kiểu thực hiện chương
trình dung môi:
+ Chương trình dung môi áp suất thấp: các dung môi đựng trong các bình riêng.
Mỗi bình có van riêng lấy lượng dung môi xác định đưa vào bình hòa trộn, sau đó
dùng một bơm đưa pha động vào van tiêm mẫu.
+ Chương trình dung môi áp suất cao: điểm khác chủ yếu là mỗi dung môi có
một bơm riêng, việc hòa trộn được thực hiện ở áp suất cao. Chương trình này có tốn
kém và cồng kềnh hơn với loại hòa trộn ở áp suất thấp. Tuy nhiên, nó có độ đúng và
độ lặp lại cao hơn.
1.3.2.2. Hệ thống bơm
Hệ thống bơm trong sắc ký lỏng cần đáp ứng những yêu cầu sau:
- Có khả năng hoạt động ở áp suất đầu vào khoảng 5000 psi trở lên (1 psi = 0,068 atm)
- 14 -


- Đảm bảo lưu lượng lặp lại trong khoảng 0,01 – 5,00 ml/phút
- Có thể chịu được sự tác động của nhiều loại dung môi (không bị ăn mòn)
- Những máy sắc ký lỏng hiện đại có cấu hình hoàn thiện hơn. Khoảng bơm có lưu
lượng dao động từ 2 – 3 ml/phút, áp suất có thể lên tới 10000 psi.
1.3.2.3. Hệ tiêm mẫu
Để đưa mẫu vào cột có thể tiêm mẫu bằng tay hay bằng hệ thống tiêm mẫu tự
động. Thể tích tiêm được xác định nhờ vào vòng chứa mẫu (tiêm bằng tay) hay trong
hệ tiêm mẫu tự động.
1.3.2.4. Cột sắc ký
Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao thường được chế tạo bằng thép không gỉ, thủy
tinh hoặc chất dẻo có chiều dài 10 – 30 cm, đường kính trong 4 – 10 mm, thường có
cột nhồi và cột bảo vệ. Cột nhồi thường có hạt cỡ 5 – 10 µm, gần đây có loại cột nhỏ
với đường kính trong 1 – 2 mm, dài 3 – 7,5 cm. Chất nhồi cột thường là silicagel có
bao một lớp mỏng chất hữu cơ (hoặc liên kết hóa học với một chất hữu cơ). Ngoài silicagel người ta còn dùng một số loại hạt khác như nhôm oxyd, polymer xốp, chất trao
đổi ion.
Cột bảo vệ được đặt trước cột sắc ký để loại các chất có mặt trong pha động và
trong mẫu phân tích làm tăng tuổi thọ của cột.
1.3.2.5. Detector và bộ phận ghi tín hiệu
Detector là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho tín hiệu
được ghi trên sắc ký đồ. Detector trong sắc ký lỏng cần đáp ứng các yêu cầu sau:
- Đáp ứng nhanh và lặp lại
- Độ nhạy cao, có thể phát hiện chất phân tích ở khối lượng hoặc nồng độ thấp.
- Vận hành ổn định, sử dụng dễ dàng
- Khoảng hoạt động tuyến tính rộng
- Ít thay đổi theo nhiệt độ và tốc độ dòng
Bộ phận ghi tín hiệu gồm có máy ghi, máy phân tích, máy tính.
1.3.3. Ứng dụng HPLC
HPLC có 3 ứng dụng chính là định tính, định lượng và điều chế.
1.3.3.1. Định tính
Sắc ký đồ cho ta thời gian lưu của chất phân tích cùng điều kiện sắc ký (pha
động, pha tĩnh, nhiệt độ) là những thông tin định tính giúp khẳng định sự có mặt của
chất phân tích trong mẫu. Với mẫu nhiều thành phần, việc định tính bằng quang phổ
thường gặp khó khăn. Do vậy, HPLC thường được sử dụng để phân tách các thành
phần trước khi phân tích bằng quang phổ hay bằng các nguyên tắc phát hiện khác.
1.3.3.2. Phân tích định lượng
- 15 -


Dữ liệu thực nghiệm dùng trong định lượng là chiều cao pic hoặc diện tích pic.
Chiều cao pic thường dễ đo, tuy nhiên chỉ dùng được khi pic hẹp, cân đối. Diện tích
pic được sử dụng phổ biến hơn và đảm bảo cho kết quả tin cậy.
Những phương pháp thường dùng trong phân tích sắc ký:
- Phương pháp chuẩn ngoại: tiến hành chạy sắc ký ở cả hai mẫu chuẩn và thử trong
cùng điều kiện. So sánh diện tích pic của mẫu thử với diện tích pic của mẫu chuẩn sẽ
tính được nồng độ của các chất trong mẫu thử. Có 2 phương pháp:
+ Chuẩn hóa một điểm: chọn nồng độ mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ mẫu thử.
+ Chuẩn hóa nhiều điểm: xây dựng đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa diện
tích pic với nồng độ của chất chuẩn. Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính
toán nồng độ của chất cần xác định.
- Phương pháp thêm chuẩn: thêm vào mẫu thử những lượng đã biết của các chất chuẩn
tương ứng với các thành phần có trong mẫu thử rồi tiến hành xử lý mẫu và sắc ký
trong cùng điều kiện. Nồng độ chưa biết của chất trong mẫu thử được tính dựa vào sự
chênh lệch nồng độ ΔC và sự tăng của diện tích pic ΔS.
- Phương pháp chuẩn nội: người ta chọn một chất chuẩn nội đưa vào trong mẫu phân
tích và trong dung dịch đối chiếu. Tỷ số diện tích của chất phân tích và chất chuẩn nội
là thông số phân tích được dùng để xây dựng đường chuẩn. Một số yêu cầu đối với
chất chuẩn nội là: pic của chất chuẩn nội phải tách khỏi pic của các thành phần khác;
pic của chất chuẩn nội phải gần với pic của chất phân tích.
- Phương pháp chuẩn hóa diện tích: hàm lượng phần trăm của chất phân tích được xác
định bằng tỷ số (tính theo %) của diện tích pic chất đó và diện tích các pic có trong
mẫu (trừ pic của dung môi, thuốc thử và pic các chất có hàm lượng nhỏ hơn giới hạn
phát hiện).

- 16 -


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×

×