Tải bản đầy đủ

Tinh sạch và đánh giá tính chất lý hóa của enzym xylanase từ chủng Aspergillus oryzae VTCCF187

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HOÀNG THU HUYỀN

TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ
TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENZYM
XYLANASE TỪ CHỦNG
ASPERGILLUS ORYZAE VTCC-F-187
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HOÀNG THU HUYỀN
MÃ SINH VIÊN: 1401284

TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ

TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENZYM
XYLANASE TỪ CHỦNG
ASPERGILLUS ORYZAE VTCC-F-187
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Đào Thị Mai Anh
2. TS. Đỗ Thị Tuyên
Nơi thực hiện:
1. Viện Công nghệ sinh học
2. Bộ môn Hóa Sinh

HÀ NỘI - 2019


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, em xin được gửi lời cảm ơn đến toàn thể các thầy cô giáo của Trường
Đại học Dược Hà Nội, những người đã dạy dỗ và truyền đạt những kiến thức quý báu
cho em trong suốt thời gian năm năm học tập và rèn luyện tại trường. Em xin chân thành
cảm ơn các thầy cô bộ môn Hóa Sinh, trường Đại học Dược Hà Nội, cũng như các anh
chị tại phòng Công nghệ sinh học Enzym – Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện
thuận lợi và tận tình hướng dẫn em trong quá trình thực tập, nghiên cứu.
Em xin chân thành cảm ơn TS. Đỗ Thị Tuyên đã định hướng ý tưởng nghiên
cứu, tận tình hướng dẫn thí nghiệm, thường xuyên chỉ dạy kiến thức chuyên môn và tạo
điều kiện tốt nhất giúp em học tập, rèn luyện và thực hiện khóa luận trong suốt quá trình
thực tập tại phòng Công nghệ sinh học Enzym – Viện Công nghệ sinh học.
Đặc biệt, em gửi lời cảm ơn và lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Đào Thị Mai Anh.
Cô không những là một người thầy tận tâm giúp em tìm ra đam mê của mình, giúp em
định hướng bước đi trên con đường học tập và nghiên cứu khoa học, mà cô còn là một
điểm tựa cho em những lời khuyên chân thành trong cuộc sống, tiếp thêm động lực cho
em trong suốt thời gian qua. Đây sẽ là những hành trang quý giá để em có thể tự tin,
vững chãi hơn trên con đường sự nghiệp và cuộc sống mai này.
Cuối cùng, em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới ba mẹ, người thân trong
gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh, động viên và tiếp thêm niềm tin, động lực cho em
trên con đường học tập và rèn luyện bản thân.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 19 tháng 5 năm 2019
Sinh Viên
Hoàng Thu Huyền


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ......................................................................................... 3
1.1. Enzym xylanase ................................................................................................. 3
1.1.1. Định nghĩa.......................................................................................................3
1.1.2. Phân bố trong tự nhiên ....................................................................................3
1.1.3. Phân loại ........................................................................................................4
1.1.4. Cấu trúc ...........................................................................................................4
1.1.5. Gen mã hóa ....................................................................................................7
1.1.6. Đặc điểm xúc tác, cơ chất ...............................................................................7
1.1.7. Tính chất lý hóa ...........................................................................................10
1.1.8. Ứng dụng .....................................................................................................10
1.2. Chủng Aspergillus oryzae ................................................................................ 13
1.2.1. Nguồn gốc, phân loại ....................................................................................13
1.2.2. Hình thái, bộ gen di truyền. ..........................................................................13
1.2.3. Điều kiện nuôi cấy ........................................................................................14
1.2.4. Ứng dụng ......................................................................................................14
1.3. Xylanase từ chủng Aspergillus oryzae ............................................................. 15
1.3.1. Cấu trúc .........................................................................................................15
1.3.2. Đặc điểm lý hóa ............................................................................................17
1.4. Tình hình nghiên cứu và sản xuất xylanase ..................................................... 17
1.4.1. Trên thế giới..................................................................................................17
1.4.2. Ở Việt Nam ...................................................................................................19
PHẦN 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................. 21
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị. .............................................................................. 21
2.1.1. Chủng giống..................................................................................................21
2.1.2. Hóa chất ........................................................................................................21
2.1.3. Môi trường ....................................................................................................22
2.1.4. Thiết bị thí nghiệm........................................................................................23
2.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 23


2.3. Phương pháp .................................................................................................... 24
2.3.1. Nuôi cấy sinh tổng hợp enzym xylanase ......................................................24
2.3.2. Xác định hoạt tính enzym xylanase ..............................................................24
2.3.3. Xác định hàm lượng protein .........................................................................26
2.3.4. Tinh sạch xylanase ........................................................................................27
2.3.5. Điện di SDS-PAGE ......................................................................................29
2.3.6. Xác định tính chất lý hóa của xylanase ........................................................29
2.3.7. Xử lý số liệu ..................................................................................................30
PHẦN 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ......................................... 32
3.1. Kết quả ............................................................................................................. 32
3.1.1. Kết quả tinh sạch xylanase ...........................................................................32
3.1.2. Kết quả nghiên cứu tính chất lý hóa của xylanase........................................38
3.2. Bàn luận ........................................................................................................... 46
3.2.1. Tinh sạch xylanase từ chủng A.oryzae VTCC-F-187 ...................................46
3.2.2. Đánh giá tính chất lý hóa của xylanase tinh sạch từ chủng A.oryzae VTCCF-187 .......................................................................................................................49
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN ........................................................................................... 52
CHƯƠNG 5. KIẾN NGHỊ .......................................................................................... 53


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt

Tiếng Anh

APS

Ammonium persulphat

BSA

Bovine Serum Albumin

cs

Tiếng Việt

Albumin huyết thanh bò
Cộng sự

CBB

Coomassie brilliant blue

DNS

Dinitro salysilic acid

DEAE

Diethylaminoethyl

EC

The Enzyme Commission

EDTA

Ethylen diamin tetraacetic acid

EST

Expressed Sequence Tag

GH

Glycosid hydrolase

KP

Kali phosphat

MW

Molecular weight

OD

Optical density

SDS

Sodium dodecyl sulfat

PAGE

Polyacrylamid gel electrophoresis

TEMED

N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamin

Tris

Tris –(hydroxymethyl)-aminomethan

VTCC

Vietnam Type Culture Collection

Tiểu ban Enzym


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Đặc điểm hóa lý của một số xylanase ngoại bào A. oryzae .......................... 17
Bảng 1.2. Đặc điểm, tính chất của một số xylanase sinh tổng hợp từ các vi sinh vật...18
Bảng 2.1. Các hóa chất sử dụng .................................................................................... 21
Bảng 2.2. Thành phần các loại đệm và dung dịch ......................................................... 22
Bảng 2.3. Các thiết bị sử dụng....................................................................................... 23
Bảng 2.4. Thành phần gel cô và gel tách ....................................................................... 29
Bảng 3.1. Kết quả xác định hoạt tính của xylanase từ chủng A. oryzae VTCC-F-187..33
Bảng 3.2. Hoạt tính xylanase các phân đoạn sau khi qua cột sắc ký lọc gel Sephadex
G-75...............................................................................................................................33
Bảng 3.3. Hoạt tính xylanase các phân đoạn sau khi qua cột sắc ký trao đổi ion DEAESephadex ........................................................................................................................ 36
Bảng 3.4. Tóm tắt quá trình tinh sạch xylanase từ chủng A. oryzae VTCC-F-187 ...... 38
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng lên hoạt tính xylanase của chủng nấm
A. oryzae VTCC-F-187 ................................................................................................. 39
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính xylanase từ chủng A. oryzae
VTCC-F-187 .................................................................................................................. 40
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của pH phản ứng lên hoạt tính xylanase từ chủng A. oryzae
VTCC-F-187 .................................................................................................................. 41
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên độ bền xylanase từ chủng A. oryzae VTCC-F-187
theo thời gian ................................................................................................................. 42
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của pH tới độ bền của xylanase từ chủng A. oryzae VTCC-F-187
theo thời gian ................................................................................................................. 44
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của các chất ức chế lên hoạt tính của xylanase từ chủng A. oryzae
VTCC-F-187 ................................................................................................................. 45


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Vị trí xúc tác của xylanase và các enzym khác trong quá trình thủy phân xylan
......................................................................................................................................... 3
Hình 1.2. Các yếu tố tương đồng trong chuỗi acid min của một số xylanase ................. 5
Hình 1.3. Cấu trúc cuộn thùng của xylanase họ 10 (2F8Q) ........................................... 6
Hình 1.4. Cấu trúc không gian của xylanase họ 11 tách chiết từ chủng Bacillus
subtilis .............................................................................................................................. 6
Hình 1.5. Cấu trúc một phần chuỗi nucleotid của gen mã hóa xylanase của chủng
Clostridium acetobutylicum P262 ................................................................................... 7
Hình 1.6. Dạng tồn tại của xylan ở gỗ cứng .................................................................... 8
Hình 1.7. Dạng tồn tại của xylan ở gỗ mềm .................................................................... 8
Hình 1.8. Mô hình hoạt động của xylanase ..................................................................... 9
Hình 1.9. Cấu trúc phân tử của một số dẫn xuất trung gian để tổng hợp thuốc điều trị
ung thư, kháng virus được điều chế từ xylose ............................................................... 12
Hình 1.10. Đặc điểm hình thái của A. oryzae ................................................................ 13
Hình 1.11. Cấu trúc bộ NST của A. oryzae ................................................................... 14
Hình 1.12. Cấu trúc không gian của xylanase từ A. oryzae HML366 .......................... 16
Hình 1.13. Các cấu trúc 3D của điểm đầu cuối N của AoXyn11A và ATX11A41 ...... 16
Hình 1.14. Các cấu trúc 3D của vùng “cord” của AoXyn11A và ATX11A41 ............. 17
Hình 2.1. Sơ đồ nội dung nghiên cứu ............................................................................ 24
Hình 2.2. Đường chuẩn xylose ...................................................................................... 26
Hình 2.3. Đường chuẩn protein sử dụng BSA làm chất chuẩn ..................................... 27
Hình 2.4. Sơ đồ quy trình tinh sạch xylanase từ chủng A. oryzae VTCC-F-187 .......... 27
Hình 3.1. Hoạt tính xylanase của dịch enzym thô từ chủng A. oryzae VTCC-F-187 định
tính trên đĩa thạch .......................................................................................................... 32
Hình 3.2. Ống đối chứng và ống thử trong phản ứng xác định hoạt độ xylanase ......... 33
Hình 3.3. Sắc ký đồ qua cột Sephadex G-75 ................................................................. 34
Hình 3.4. Hoạt tính xylanase định tính trên đĩa thạch của một số phân đoạn qua cột
Sephadex G-75 .............................................................................................................. 35
Hình 3.5. Điện di đồ SDS-PAGE qua cột Sephadex G-75............................................ 35
Hình 3.6. Sắc ký đồ qua cột DEAE-Sephadex .............................................................. 36
Hình 3.7. Hoạt tính xylanase định tính trên đĩa thạch của một số phân đoạn qua cột


DEAE-Sephadex ............................................................................................................ 37
Hình 3.8. Điện di đồ SDS-PAGE qua cột DEAE-Sephadex ......................................... 37
Hình 3.9. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng lên hoạt tính xylanase của chủng nấm A.
oryzae VTCC-F-187 ...................................................................................................... 39
Hình 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính xylanase từ chủng A. oryzae
VTCC-F-187 .................................................................................................................. 40
Hình 3.11. Ảnh hưởng của pH phản ứng lên hoạt tính xylanase từ chủng A. oryzae
VTCC-F-187 .................................................................................................................. 41
Hình 3.12. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên độ bền xylanase từ chủng A. oryzae VTCC-F187 theo thời gian .......................................................................................................... 43
Hình 3.13. Ảnh hưởng của pH tới độ bền của xylanase từ chủng A. oryzae VTCC-F-187
theo thời gian ................................................................................................................. 44
Hình 3.14. Ảnh hưởng của các chất ức chế lên hoạt tính của xylanase từ chủng A. oryzae
VTCC-F-187 ................................................................................................................. 45


ĐẶT VẤN ĐỀ
Xylanase (Endo-1,4--xylanase (EC 3.2.1.8)) là nhóm enzym có khả năng thủy
phân các polysaccharid mạch thẳng -1,4-xylan, loại hemicellulose phổ biến nhất trong
tự nhiên, thành các oligosacharid ngắn (oligoxylose) và xylose. Trên thế giới, mặc dù
xylanase đã được nghiên cứu từ khá lâu [27], [74], [77],... nhưng phải mãi tới những
năm gần đây, nhu cầu sử dụng xylanase mới đang dần tăng cao. Với đặc tính thủy phân
của mình, xylanase không chỉ được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp giấy,
sản xuất thức ăn chăn nuôi, sản xuất cồn nhiên liệu,... mà còn là một công cụ hiệu quả
trong tổng hợp xylose, một loại đường chức năng đang ngày càng có nhiều ứng dụng
quan trọng trong ngành Dược. Trong số các ứng dụng được quan tâm nhiều của xylose
trong ngành Dược, có thể kể đến vai trò thay thế glucose trong chế độ ăn cho người bị
tiểu đường [22], là chất ức chế ngăn chặn sự gia tăng glucose và insulin sau ăn [15] hay
được sử dụng trong thử nghiệm đánh giá khả năng hấp thu chất dinh dưỡng hợp lý của
đường tiêu hóa [88]. Đặc biệt, những năm gần đây các nhà Dược học còn chú ý tới một
ứng dụng tiềm năng khác của xylose là sử dụng chúng để tổng hợp dẫn xuất trung gian
trong điều chế thuốc điều trị ung thư, kháng virus HIV [12]. Nhiều dạng chế phẩm
xylanase đã được thương mại hóa và bán trên thị trường thế giới. Theo một báo cáo mới
được công bố bởi Gen Consulting Company, thị trường xylanase toàn cầu được dự đoán
sẽ tăng trưởng với tỷ lệ tăng trưởng hàng năm kép là 6,6% vào năm 2023 [26]. Đây là
lý do thôi thúc các nhà khoa học quan tâm, nghiên cứu về các nguồn tổng hợp, các đặc
tính vượt trội, các phương pháp làm tăng hiệu suất, độ tinh sạch của xylanase. Không
nằm ngoài xu hướng chung này, ở Việt Nam, xylanase cũng bắt đầu được quan tâm
nghiên cứu cả về sinh tổng hợp tự nhiên và sử dụng công nghệ protein tái tổ hợp [1],
[2], [3], [5], [6], [10].
Trong những nguồn sinh vật sản xuất xylanase, chi nấm Aspergillus sp là một trong
trong những nhân tố có năng suất sinh tổng hợp xylanase cao nhất. Đặc biệt, loài
Aspergillus oryzae (A. oryzae) đang là một đối tượng tiềm năng được các nhà khoa học
trên thế giới quan tâm nghiên [30], [43], [45], [49]. Bên cạnh ưu điểm sinh tổng hợp
được xylanase có hoạt tính cao, xylanase sản xuất từ A. oryzae còn có một số đặc tính
vượt trội như có những vùng cấu trúc đặc hiệu có thể dùng kỹ thuật đột biến, protein tái
tổ hợp tác động làm tăng đáng kể hiệu quả xúc tác và khả năng chịu nhiệt [40], [56],
[57].
1


Chính vì vậy, nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã thực hiện chuỗi đề tài nghiên cứu
về sinh tổng hợp xylanase tự nhiên từ một số loài thuốc chi nấm Aspergillus [1], [2],
[35], [36]. Kết quả các nghiên cứu ban đầu đã sàng lọc được chủng A. oryzae VTCC-F187 là một trong những chủng có khả năng sinh tổng hợp xylanase với hoạt tính cao
nhất, hứa hẹn sẽ là một nguồn sản xuất xylanase hiệu quả. Để có thể góp phần khai thác
tối đa tiềm năng của nguồn enzym quan trọng này, cung cấp thêm một công cụ hiệu quả
cho ngành công nghiệp, nông nghiệp và đặc biệt là ngành Dược nước nhà, chúng tôi tiến
hành đề tài “Tinh sạch và đánh giá hoạt tính lý hóa của enzym xylanase từ chủng
Aspergillus oryzae VTCC-F-187” với mục tiêu là:
1. Bước đầu tinh sạch xylanase từ chủng A. oryzae VTCC-F-187
2. Đánh giá hoạt tính lý hóa của enzym xylanase tinh sạch được từ chủng A. oryzae
VTCC-F-187

2


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Enzym xylanase
1.1.1. Định nghĩa
Xylanase (Endo-1,4--xylanase (EC 3.2.1.8)) là một nhóm enzym endohydrolysis
trong hệ enzym thủy phân xylan. Chúng thủy phân các liên kết -D-(1,4) xylosidic của
xylan tạo thành các oligosacharid ngắn (oligoxylose) và xylose (Hình 1.1) [87].

Hình 1.1. Vị trí xúc tác của xylanase và các enzym khác trong quá trình
thủy phân xylan [25]
1.1.2. Phân bố trong tự nhiên
Trong tự nhiên, xylanase được sản xuất bởi nhiều loại vi sinh vật bao gồm vi khuẩn,
xạ khuẩn, nấm sợi và một số loại nấm khác [82]. Hai chi vi khuẩn đã được biết đến phổ
biến với khả năng sinh tổng hợp xylanase cao là Bacillus và Streptomyces. Trong đó,
Bacillus sp sản xuất xylanase hoạt độ cao trong điều kiện pH kiềm và nhiệt độ cao.
Ngoài ra, một số vi khuẩn khác cũng có hoạt tính xylanase như vi khuẩn kị khí ưa nhiệt
(Dictyoglomus sp), vi khuẩn sống ở vùng khí hậu khắc nghiệt như suối nước nóng, hồ
muối... Bên cạnh vi khuẩn, nấm cũng là một nhóm vi sinh vật quan trọng sản sinh
xylanase với nhiều nghiên cứu và ứng dụng. Đặc biệt nấm sợi có khả năng sinh tổng
hợp xylanase cao hơn nhiều so với vi khuẩn và nấm men. Aspergillus là một chi nấm
sợi có ý nghĩa công nghiệp do có khả năng sản sinh xylanase với hiệu suất cao. Không
những thế, đa số các chủng trong chi này có khả năng sản sinh xylanase trên nhiều cơ

3


chất tự nhiên bao gồm cả các phế phẩm phụ nông nghiệp như bột lõi ngô, bột đậu
tương..., những nguồn cơ chất này khá dồi dào và sẵn có.
Ngoài nguồn gốc vi sinh vật, cũng có những nghiên cứu chỉ ra xylanase có thể được
tạo ra từ thực vật như nghiên cứu về sinh tổng hợp endo-xylanase trong quả lê chín Nhật
Bản, nghiên cứu tinh chế endo-xylanase từ lúa mì châu Âu [24], hay từ nấm rơm rạ [3],
cà chua [75].
1.1.3. Phân loại
Các xylanase có thể được phân loại dựa vào khối lượng phân tử, điểm đẳng điện.
Dựa trên những tiêu chí này, các nhà khoa học đã phân chia xylanase thành 2 nhóm
chính:
Nhóm 1: có khối lượng phân tử lớn (MW trên 30 kDa) và điểm đẳng điện thấp.
Nhóm 1 gồm các xylanase thuộc họ glycosid hydrolase 10 hay GH 10, còn gọi là họ F.
Họ này ngoài hoạt tính xylanase còn thủy phân cellulose (thể hiện hoạt tính
endocellulase), phức tạp và đa dạng hơn. Tuy nhiên, xylanase thuộc họ F vẫn hoạt động
chủ yếu với xylan [29], [37].
Nhóm 2: có khối lượng phân tử nhỏ (MW dưới 30 kDa) và điểm đẳng điện cao.
Nhóm 2 thuộc họ GH 11. Tính linh hoạt xúc tác của nhóm này thấp hơn các thành viên
GH 10 và các sản phẩm thủy phân bởi chúng có thể bị thủy phân thêm bởi xylanase
thuộc GH 10. Tuy nhiên, các xylanase họ này có thể coi là các xylanase thực sự vì chúng
nhất quán hơn về cấu trúc, không có hoạt tính cellulase [29].
Subramaniyan và cs (2002) tiếp tục chia xylanase họ GH 11 thành 6 nhóm chính:
- Nhóm I, II, III chủ yếu là enzym của nấm mốc. Nhóm I, II thường có MW khoảng
20 kDa được sản xuất từ Ascomycetes và Basidiomycetes. Nhóm III chủ yếu là sản phẩm
của các nấm kị khí.
- Nhóm A, B, C chủ yếu là các xylanase của vi khuẩn. Nhóm A chủ yếu từ họ
Actinomycetaceae và Bacillaceae, là những vi khuẩn hiếu khí gram dương. Nhóm B, C
thì chủ yếu từ vi khuẩn kỵ khí gram dương sống trong dạ cỏ.
Tuy nhiên, cũng có một vài trường hợp ngoại lệ, khoảng 30% các xylanase đã được
xác định không được phân loại theo hệ thống này [7].
1.1.4. Cấu trúc
1.1.4.1. Cấu trúc bậc 1

4


Các xylanase từ các nguồn gốc khác nhau có số lượng và trình tự acid amin khác
nhau. Tuy nhiên, điều thú vị là gần như tất cả các xylanase đều có một số nét tương
đồng. Cụ thể là, các xylanase đều có: 2 đoạn peptid được bảo tồn trong cấu trúc, vùng
peptid tín hiệu ở đầu chuỗi acid amin và Glutamat đóng vai trò xúc tác cốt lõi trong
trung tâm hoạt động (Hình 1.2) [13].

Hình 1.2. Các yếu tố tương đồng trong chuỗi acid min của một số xylanase [13]
thuộc họ GH 10 (A) và họ GH 11 (B).
(A) P. chrysosporyum, Q9HEZ1; A. sojae, Q9P955; M. grisea, Q8J1Y4; S. reilianum, E7A3D3; U. hordei, I2FW
(B) F. oxysporum, Q9C1R1; M. grisea, Q92245; M. oryzae, G4NA54; A. niger, Q6QJ75; A. pullulans, Q96TR7;
F. graminearum, Q7ZA57
Các con số cho biết số lượng acid amin hoặc vị trí của peptid tín hiệu (SP).Vùng được bảo tồn trong tất cả các
protein được hiển thị bằng màu xanh lam. Glutamat chịu trách nhiệm xúc tác được biểu thị bằng chữ E với một
số theo sau là vị trí của nó trong chuỗi.

Có thể thấy rằng, vùng bảo tồn của các xylanase xác định chúng thuộc họ GH 10 và
GH 11 có chiều dài lần lượt là 294 - 315 và 177 -185 acid amin. Chuỗi peptid tín hiệu
của các xylanase có chiều dài 15-26 acid amin. Glutamat chịu trách nhiệm cho xúc tác
được hiển thị trong tất cả các trình tự. Do tính không đồng nhất về số lượng acid amin,
đối với xylanase thuộc GH 10, vị trí của Glutamat đầu tiên được tìm thấy giữa các acid
amin 133 đến 222, Glutamat thứ hai trong khoảng từ 263 đến 327. Còn xylanase thuộc
GH 11, Glutamat được tìm thấy ở những vị trí gần hơn, đầu tiên ở khoảng 106-126 và
thứ hai ở khoảng giữa 197-219 [13].
Phân tử protein của xylanase gồm vùng chức năng, vùng không chức năng và vùng
nối. Vùng nối thường giàu acid amin hydroxyl được glycosyl hóa ở vị trí O, giúp chúng
không bị protease phân cắt. Vùng chức năng gồm vùng xúc tác và vùng bám cơ chất, có
thể có cấu trúc giống nhau hoặc tách biệt [47].
1.1.4.1. Cấu trúc không gian
Sự khác nhau trong hoạt động xúc tác của các xylanase của họ GH 10 và GH 11
5


được cho là do sự khác nhau trong cấu trúc bậc ba của chúng.
Cấu trúc toàn thể của xylanase họ GH 10 như là một cái thùng hình trụ cuộn 8 lần
được tạo thành từ các chuỗi 𝛼/ (Hình 1.3). Cơ chất bám vào rãnh nông ở đáy của ống
trụ. Vị trí bám cơ chất của xylanase họ này có vẻ không sâu như họ GH 11. Điều này
giúp khả năng thay đổi hình dạng linh hoạt của xylanase họ GH 10 tốt hơn xylanase họ
GH 11 khi liên kết với các cơ chất có kích thước nhỏ [78]; nhưng cũng do vậy mà tính
đặc hiệu cơ chất của xylanase họ GH 10 lại thấp hơn [29].

(a)

(b)

Hình 1.3. Cấu trúc cuộn thùng của xylanase họ GH 10 (2F8Q), (a) từ trên
xuống (b) bên cạnh [19]
Cấu trúc của các thành viên họ GH 11 đặc trưng bởi 2 dải nếp gấp  cuộn chặt gọi
là “jellyroll”, tạo thành một vùng lõm hai lớp xung quanh vị trí xúc tác (Hình 1.4).
Chúng đặc hiệu với xylan hơn và thường không có các domain phụ. Vùng lõm này giống
như lòng bàn tay và các ngón tay (vùng P và vùng F). Các gốc khử Glu 78 và Glu 75
nằm giữa hai vùng trên có tác dụng gắn dính cơ chất vào khu trung tâm hoạt động của
protein.Vùng nhánh nhô ra giống như ngón tay cái là nơi đóng, mở vùng trung tâm hoạt
động. Do đó nó có chức năng điều hòa sự ra vào của cơ chất đối với vùng xúc tác của
enzym [1].

Hình 1.4. Cấu trúc không gian của xylanase họ GH 11 tách chiết từ chủng
Bacillus subtilis [86]
6


1.1.5. Gen mã hóa
1.1.5.1. Cấu trúc
Trên thế giới đã có những nghiên cứu xác định cấu trúc gen mã hóa xylanase từ một
số chủng sinh vật. Ví dụ như, trong nghiên cứu của mình, Banik và cs đã sử dụng
Genomic Southern blots để phân tích gen mã hóa (1 4)--xylanase từ lúa mạch. Kết
quả cho thấy xylanase lúa mạch được mã hóa bởi một nhóm ít nhất 3 gen riêng biệt và
đều nằm trên nhiễm sắc thể 7 (5H) [16]. Các kết quả nghiên cứu giải trình tự gen ở vi
khuẩn cho thấy, gen mã hóa xylanase từ Clostridium acetobutylicum tương đồng đến
64% với gen của B. pumilus và 40% với gen từ B. subbtilis. Vùng sườn 3' chứa một cặp
trình tự với sự lặp lại đảo ngược có thể liên quan đến sự chấm dứt phiên mã (Hình 1.5)
[84]. Đây có thể là đặc điểm chung của gen mã hóa cho xylanase ở vi khuẩn khi trình tự
lặp lại đảo ngược này cũng được tìm thấy trên gen của B. circulans [74]

Hình 1.5. Cấu trúc một phần chuỗi nucleotid
của gen mã hóa xylanase của chủng C. acetobutylicum P262 [84]
Phần lặp lại đảo ngược có vai trò chấm dứt phiên mã được gạch chân bằng mũi tên

1.1.5.2. Nguyên nhân di truyền dẫn đến nhiều dạng xylanase
Có một thực tế rất thú vị là, từ cùng một gen mã hóa, các vi sinh vật còn có thể tạo
ra nhiều dạng xylanase khác nhau. Sự hiện diện của nhiều dạng xylanase có thể là do
đột biến di truyền, khác biệt trong xử lý mARN, sửa đổi sau dịch mã như glycosyl hóa,
[27] .Các xylanase này có thể có các tính chất hóa học, cấu trúc, hoạt động và các đặc
tính chồng chéo nhưng không giống nhau, do đó làm tăng sự phong phú về dạng
xylanase cũng như hiệu quả quá trình xúc tác. Nhiều xylanase có thể là kết quả của các
alen khác nhau từ cùng một gen, ví dụ, Streptomyces sp. B-12-2 tạo ra năm endoxylanase
khi được nuôi trong môi trường chứa xylan yến mạch [39]. Trong một vài trường hợp,
một số xylanase có thể là sản phẩm của các gen độc lập [77]. Sản phẩm gen XynC từ
Fibrobacter succinogenes S85 đã mã hóa hai miền xúc tác xylanase khác nhau [85].
1.1.6. Đặc điểm cơ chất, xúc tác
1.1.6.1. Cấu trúc cơ chất xylan

7


Xylanase chủ yếu thủy phân xylan và một phần nhỏ cellulose. Xylan là thành phần
chính cấu tạo hemicellulose tập trung chủ yếu ở cấu trúc thứ cấp của thành tế bào thực
vật, và là một trong số polysaccharid quan trọng trong tự nhiên [52]. Cấu trúc xylan là
chất trùng hợp D-xylose với các liên kết  (1 4) mức độ trùng hợp từ 150 đến 200.
Xương sống này được thay thế bởi một số loại đường hoặc acid hữu cơ, như arabinose,
acid glucuronic, acid ferulic... [29] (Hình 1.1).
Ở cây gỗ cứng, xylan tồn tại ở dạng O-acetyl-4-O-methylglucuronoxylan (Hình
1.6), còn ở cây gỗ mềm là arabino-4-O-methylglucuronoxylan (Hình 1.7). Ở các loài
ngũ cốc, thành phần cấu tạo xylan là acid D-glucuronic, có hoặc không có liên kết ete
4-Omethyl và arabinose.

Hình 1.6. Dạng tồn tại của xylan ở gỗ cứng

Hình 1.7. Dạng tồn tại của xylan ở gỗ mềm
1.1.6.2. Cơ chế xúc tác
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về cơ chế xúc tác của xylanase [25], [47], [54],
[55], [80] . Một cách tổng quát, cơ chế hoạt động xúc tác của xylanase được sơ đồ hóa
qua Hình 1.8:
8


(1) Xylanase nhận diện xylan và liên kết nó bằng cách thay đổi cấu hình ở phần cánh
trái (cuộn xoắn lại 3 lần); cơ chất xylan hình xoắn ốc được đặt ở vị trí đối diện
với khe giữa Tyr 65 và Tyr 69 [47] (a);
(2) Hai gốc glutamat (Glu) được định vị cho phù với vị trí hoạt động (khoảng 5,5 Å).
Glu 172 là chất xúc tác acid/base, Glu 78 là chất cho điện tử [47];
(3) Gốc xylosyl ở vị trí thứ nhất bị vặn méo và hút về phía gốc xúc tác (Glu 78), liên
kết glycosidic bị kéo căng và bẻ gãy tạo thành dạng trung gian đồng hóa trị enzym
– cơ chất [55] (b);
(4) Dạng trung gian bị tấn công bởi một phân tử nước hoạt động, nó tách thành ion
𝐻 + gắn vào gốc glycosyl vừa được tách ra trong khi 𝑂𝐻 − gắn vào đầu khử của
mạch xylan vừa tạo theo cơ chế thủy phân glycosyl, nhờ đó sản phẩm được giải
phóng [54], [82] (c),(d);
(5) Enzym dịch chuyển đến vị trí tiếp theo trên cơ chất nhờ sự phân tách và phân tán
các đường (xylose) [47].

Hình 1.8. Mô hình hoạt động của xylanase [47]
9


1.1.7. Tính chất lý hóa
Ảnh hưởng của nhiệt độ: Xylanase từ vi khuẩn thường hoạt động tối ưu ở nhiệt độ
50-80oC ví dụ như xylanase từ chủng Bacillus sp.41 M-1 có nhiệt độ cực thuận ở 50oC
[65], vi khuẩn kị khí ưa nhiệt Caldocellum saccharolyticum ở 70oC và đặc biệt ở
Dictyoglomus sp xylanase hoạt động tốt nhất ở 90oC. Khác với xylanase từ vi khuẩn,
xylanase từ nấm chịu nhiệt kém hơn, bền ở nhiệt độ dưới 60oC, mất hoạt tính khi trên
70 oC, hoạt động hiệu quả ở 35-50oC [1]. Một số xylanase sinh tổng hợp từ A.sydowii
SBS45 [64], A. ficuum AF-98 [58], Aspergillus cf. Niger BC14405 [53] có nhiệt độ tối
ưu lần lượt là 50oC, 45oC, 55oC. Xylanase từ A. awamori VTCC-F-312 bền ở 37-40oC
và hoạt động tốt nhất ở 50-55oC [1].
Ảnh hưởng của pH: Xylanase bền ở dải pH khá rộng và có hoạt tính tối ưu ở các
điểm pH khác nhau, có thể là ưa acid, trung tính hay ưa kiềm và trong dải pH từ 5-10.
Ảnh hưởng của ion kim loại: Các ion kim loại có thể tăng cường hoặc ức chế hoạt
tính của enzym tùy vào bản chất từng enzym. Theo một số nghiên cứu, các ion kim loại
Al3+, Ba2+, Ca2+, Na+, Zn2+ ở nồng độ 10mM đã tăng cường hoạt tính của xylanase từ
A. syowii SBS45 [64]. Hoạt tính xylanase từ A. ficuum AF-98 đã được hoạt hóa lên
116% khi dịch enzym xylanase được ủ với Cu2+ và bị ức chế mạnh bởi Hg2+, Pb2+ với
hoạt tính tương ứng lần lượt là 53%, 89% [58]. Trong khi đó với xylanase từ A. oryzae
DMS1863 Cu2+ lại là ion kim loại ức chế hoạt tính [2]. Đối với xylanase từ A. awamori
VTCC-F-312 thì hầu như không bị ảnh hưởng bởi các ion kim loại ở nồng độ 10mM
ngoại trừ Fe3+ làm giảm hoạt tính còn 55% [1].
Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ: Các dung môi hữu cơ hay các chất tẩy rửa cũng
ảnh hưởng mạnh mẽ đến độ bền và hoạt tính của enzym, hầu như theo hướng làm giảm
hoạt tính. Xylanase từ A. oryzae DMS1863 không bị ảnh hưởng bởi methanol, ethanol;
aceton làm giảm nhẹ và n-butanol làm tăng nhẹ hoạt tính xylanase [2]. Trong khi đó các
dung môi trên đều làm giảm hoạt tính xylanase từ A. oryzae VTCC-F-312, đặc biệt là
methanol làm giảm hoàn toàn sau 1 giờ ủ [1]. Theo Nair và cs, L-tryptophan tăng cường
hoạt tính xylanase ở nồng độ 10, 20, 30 mM [64].
1.1.8. Ứng dụng
1.1.8.1. Trong lĩnh vực nông nghiệp
Xylanase có ứng dụng đáng quan tâm trong sản xuất thức ăn chăn nuôi. Kết quả
nhiều công trình nghiên cứu cho thấy khi bổ sung xylanase độc lập hoặc kết hợp với các
10


enzym khác vào thức ăn làm tăng đáng kể trọng lượng và giảm thiểu bệnh tật ở vật nuôi.
Trong thức ăn chăn nuôi cơ bản là ngũ cốc, chứa chất xơ có chứa lượng peptosan cao
(một dạng xylan có đặc điểm của chất xơ, được cấu tạo từ các gốc đường -Dxylopyranose) khó tiêu hóa bởi những enzym trong đường tiêu hóa của lợn nhưng dễ bị
thủy phân bởi xylanase [8]. Do khả năng phân giải xylan thành xylose và arabinose, việc
bổ sung xylanase vào thức ăn chăn nuôi giúp làm giảm độ nhớt của thức ăn trong đường
tiêu hóa, tăng cường hấp thu thức ăn, giảm rối loạn tiêu hóa, cải thiện hệ vi sinh vật
đường ruột theo hướng có lợi [7].
1.1.8.2. Trong lĩnh vực công nghiệp.
Đối với ngành công nghiệp thực phẩm, xylanase đóng vai trò chìa khóa trong chuyển
hóa sinh học của xylan thành đường xylitol có hàm lượng calo thấp, chuyển hóa này là
một hướng ứng dụng đầy hứa hẹn [70]. Xylanase đã được sử dụng để sản xuất thực
phẩm thương mại của Nhật như sake (một loại rượu từ gạo), shoyu koji (rượu từ đậu
nành và lúa mì) [7].
Xylanase còn được ứng dụng để sản xuất cồn sinh học. Trong sản xuất bioethanol,
cần biến đổi nhiên liệu từ thực vật qua các bước: xử lý nguyên liệu bằng hóa chất, thủy
phân lignocellulose biopolymer thành các đường khử (sử dụng enzym hoặc hóa chất),
rồi lên men các đường khử thành rượu và chưng cất, tinh chế bioethanol [7]. Hiện nay,
việc tiền xử lý nguyên liệu thực vật và sử dụng hóa chất để thủy phân làm giá thành sản
xuất cồn còn cao và gây ảnh hưởng lớn tới môi trường. Do đó việc sử dụng phối hợp
các loại enzym có hoạt lực cao như cellulase, xylanase, laccase đang được đẩy mạnh
nghiên cứu, mở ra một phương pháp tiềm năng cho quá trình này [7].
Trong ngành công nghiệp sản xuất giấy, việc loại bỏ xylan, cũng như lignin, trong
gỗ là một công đoạn quan trọng để thu celluose. Sử dụng xylanase từ vi sinh vật là một
phương pháp đang được chú ý nhằm hạn chế sử dụng hóa chất độc hại và giảm thiểu
gây ô nhiễm môi trường. Cụ thể, xylanase có tác dụng: tăng độ xốp [42]; tăng độ trắng
của bột giấy và tiết kiệm hóa chất tẩy trắng (Adsorbable Organic Halogens – AOX,
chlor- ClO2) [29], [33]; nâng cao độ bền dai của sợi cellulose trong bột giấy Kraft. Như
vậy việc sử dụng xylanase tấy giấy trắng trong ngành công nghiệp này có ý nghĩa quan
trọng cả về kinh tế lần môi trường.
Một ứng dụng nữa của xylanase là sản xuất các chất hoạt động bề mặt. Alkyl
glycosid là một trong những chất hoạt động bề mặt quan trọng. Về phương diện thương
11


mại, chúng được sản xuất từ các đường đơn và alcol béo. Nhưng sự glycosyl hóa sử
dụng polysaccharid thì dễ dàng thực hiện hơn trong sản xuất công nghiệp. Xylanase từ
Aureobasidium pullulans được sử dụng cho sự glycosyl hóa của xylan, 1-octanol, 2 ethyl
hexanol thành octyl--D xylobiosid, 2-ethylhexyl--D xylobiosid [7].
1.1.8.3. Trong lĩnh vực y dược
So với các ngành khác, ứng dụng của xylanase trong lĩnh vực y dược vẫn còn ở dạng
tiềm năng, chưa được nghiên cứu nhiều. Tuy nhiên, gần đây, enzym này được các nhà
Dược học chú ý nhiều hơn bởi xylose, sản phẩm thủy phân xylan bởi xylanase, lại có
một số ứng dụng trong y dược đáng để quan tâm.
Ứng dụng tiềm năng và quan trọng nhất của xylose là trong lĩnh vực tổng hợp thuốc
điều trị ung thư, thuốc kháng virus HIV. Những bước chính trong quá trình tổng hợp
bao gồm việc chuyển đổi D-xylose (A) thành 1,2-isopropylidene-α-D-xylofuranose (B),
5-Otert-butyldimethylsilyl-1,2-O-isopropylidene-α-D-xylofuranose (C), 5-O-benzyl1,2-O-isopropylidene-α-D-xylofuranose (D), S-adenosylmethionine (SAM) (E) [12].

(A)

(B)

(C)

(D)
(E)
Hình 1.9. Cấu trúc phân tử của một số dẫn xuất trung gian để tổng hợp thuốc
điều trị ung thư, kháng virus được điều chế từ xylose [12]
Xylose có độ ngọt tương đương sucrose nhưng giá trị năng lượng lại thấp hơn nhiều:
1 gram xylose chứa 2,4 calo [22], [88]. Nhờ tính chất đó, xylose có thể được ứng dụng
thay thế glucose cho người bị tiểu đường hay đơn giản là những người muốn chọn chế
độ ăn lành mạnh hơn cho cơ thể. Đây cũng là một ứng dụng đầy tiềm năng trong mảng
sản xuất thực phẩm chức năng với những sản phẩm bổ sung dinh dưỡng cho những bệnh
nhân bị tiểu đường, béo phì hay những người lựa chọn chế độ ăn uống đặc biệt để phòng
ngừa những loại bệnh như trên [67]. Hơn nữa xylose còn là một chất ức chế sucrase
12


được đề xuất để ngăn chặn sự gia tăng glucose sau ăn. Thử nghiệm trên lâm sàng dùng
D-xylose cho bệnh nhân tiểu đường đã có kết luận: xylose có tác dụng ức chế cấp tính
đối với sự gia tăng glucose và insulin sau ăn [15].
Cuối cùng, xylose có thể được sử dụng để đánh giá mức độ cơ thể hấp thu một loại
đường đơn giản như D-xylose từ ruột. Bằng cách đo lượng D-xylose trong mẫu nước
tiểu và máu sau khi uống một lượng xylose hòa tan, xét nghiệm xác định xem các chất
dinh dưỡng có được hấp thu hợp lý qua đường tiêu hóa của bệnh nhân hay không [88].
Với những ứng dụng tiềm năng trong y dược của xylose như vậy thì ứng dụng của
xylanase trong lĩnh vực này có thể được ví như là cây cầu an toàn, vững chắc giúp chúng
ta đến kho nguyên liệu xylose khổng lồ - xylan.
1.2. Chủng Aspergillus oryzae
1.2.1. Nguồn gốc, phân loại
A.oryzae thuộc phân chi Flavi, chi Aspergillus, họ Trichocomaceae, bộ Eurotiales,

lớp Eurotiomycetes, ngành Ascomycota, giới nấm [4], [32].
A.oryzae được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau như gạo, ngô, sắn, đậu tương...

1.2.2. Hình thái, bộ gen di truyền.
Khuẩn lạc nấm A. oryzae có núm ở trung tâm tỏa dần ra ngoài, có màu vàng hoa cau
khi nuôi cấy sau 3-5 ngày trong môi trường czapek, màu xanh đậm khi để lâu ở nhiệt độ
phòng. Trong môi trường dinh dưỡng lỏng 3 ngày, chúng phát triển thành các hạt pellet
tròn, trắng, mịn, dai.
Sợi nấm có hình trụ, đường kính 5-10 μm. Các sợi nấm có thể phân nhánh liên tiếp
tạo thành hệ sợi nấm khí sinh xù xì như bông trên bề mặt thạch nuôi cấy hoặc các loại
ngũ cốc bị mốc (Hình 1.10).

Hình 1.10. Đặc điểm hình thái của A. oryzae [69]
(A) Khuẩn lạc; (B) cuống bào tử đính (x 500)

13


Năm 1994, kiểu gen của A. oryzae được nghiên cứu bằng phương pháp điện di ngang
với điện trường thay đổi. Bảy dải nhiễm sắc thể đã được tìm thấy với kích thước được
ước tính là 7,0, 5,2, 5,0, 4,5, 4,0, 3,7, 2,8 Mbp. Dải nhỏ nhất di chuyển dưới dạng cặp
đôi và tổng kích thước bộ gen ước tính khoảng 35Mbp [48]. Đây là những kết quả ước
tính ban đầu. Năm 1997, nhóm dự án phân tích Aspergillus oryzae EST đã thực hiện các
phân tích toàn diện về mARN được sản xuất từ A. oryzae ở các điều kiện nuôi cấy khác
nhau. Kết quả cho thấy: tổng kích thước bộ gen là 37,6 Mb chứa 12074 gen trên 8 nhiễm
sắc thể (Hình 1.11) [59], [50], [60]. So sánh với bộ gen của A. nidulans và A. fumigatus
thì bộ gen của A. oryzae có kích thước lớn hơn 25-30%, tương ứng với số lượng gen lớn
hơn 2000-3000 gen [60].

Hình 1.11. Cấu trúc bộ NST của A. oryzae [60]
1.2.3. Điều kiện nuôi cấy
Các chủng A. oryzae khác nhau có điều kiện nuôi cấy tối thích khác nhau. Tuy vậy
chúng cũng có một số đặc điểm chung như: phát triển tốt hơn khi nuôi cấy trên pha rắn;
nhiệt độ 28-32oC; nguồn carbon; nguồn nitrogen .Tùy thuộc vào sản phẩm mong muốn
mà A.oryzae sinh tổng hợp để chọn những điều kiện nuôi cấy tối ưu.
1.2.4. Ứng dụng

14


Ngoài xylanase, A. oryzae còn tiết ra môi trường các enzym ngoại bào thủy phân
như pectinase, cellulase, amylase, oxidoreductase, lipase... khi sống trên môi trường với
nguồn cơ chất tương ứng [14], [68], [69]. Tuy là loài rất gần với A. flavus nhưng
A.oryzae không chứa độc tố aflatoxin và đã được WHO cùng USFDA công nhận là vi
sinh vật an toàn, được liệt kê là GRAS (Generally Recognized as Safe) [81], [69]. Hai
đặc tính này giúp loài nấm A. oryzae có rất nhiều ứng dụng trong quá trình sản xuất,
công nghiệp thực phẩm cũng như công nghiệp sản xuất các enzym.
Ở Nhật Bản, từ gần 1000 năm nay, A. oryzae là một thành phần thiết yếu trong quá
trình sản xuất thực phẩm và đồ uống truyền thống như miso (bột đậu nành), shoyu (nước
tương), rượu sake (rượu nho) [50]. Với tầm quan trọng như vậy, loài nấm này đã được
coi là vi sinh vật quốc gia của Nhật Bản [50].
Trong công nghiệp sản xuất enzym và ứng dụng sản xuất các sản phẩm thương mại,
A. oryzae được ứng dụng đầu tiên vào công nghệ sản xuất lipase dùng cho bột giặt năm
1988 [60]. Một ứng dụng khác với tiềm năng nổi bật của A. oryzae là đã được áp dụng
thành công trong việc phân hủy nhựa có thể bị vi sinh vật phân hủy. Cả hai nhân tố là
cutinase (chịu trách nhiệm cho sự thoái hóa nhựa) và hydrophobin (tăng độ bám của
cutinase trên bề mặt kỵ nước để tăng cường sự thoái hóa nhựa) đã được phát hiện ở
A. oryzae [60].
A. oryzae cũng đã có nhiều ứng dụng quan trọng trong y dược học như ứng dụng
trong sinh tổng hợp một số sản phẩm chuyển hóa sơ cấp và thứ cấp như acid kojic, acid
malic, penicilin [69]. Chủng A. oryzae giàu sắt cũng đã được nghiên cứu ứng dụng trong
việc làm nguồn sắt bổ sung cho bệnh nhân thiếu sắt thay thế nguồn FeSO4 [73].
1.3. Xylanase từ chủng Aspergillus oryzae
1.3.1. Cấu trúc
Mặc dù chưa có nhiều nghiên cứu đào sâu về cấu trúc tổng thể của các xylanase sinh
tổng hợp từ A. oryzae nhưng do các xylanase từ loài nấm này chủ yếu thuộc họ GH 10
và GH 11 nên cấu trúc của chúng có thể tương tự cấu trúc của 2 họ này. Một số ví dụ,
có thể kể đến như, xylanase từ A. oryzae HML366 được tinh sạch và phân tích cấu trúc,
kết quả giống với cấu trúc hình trụ sợi đơn của họ GH 10 (Hình 1.12) [45].
Các xylanase họ GH 11 từ A. oryzae có vẻ có những đặc điểm về cấu trúc khiến khả
năng chịu nhiệt của chúng kém hơn như vùng đầu cuối N, vùng “cord” nên đã có những
nghiên cứu thay đổi hay sử dụng kỹ thuật đột biến gen và protein tái tổ hợp trên những
15


Hình 1.12. Cấu trúc không gian của xylanase từ A. oryzae HML366 [45]
vùng này để cải thiện khả năng chịu nhiệt, các đặc tính nhiệt độ và hiệu quả xúc tác của
xylanase [40], [56], [57].
Trong nghiên cứu của Li và cs (2018), gen xylanase họ GH 11 từ A. oryzae
CICC40186 đã được thay thế cấu trúc và biểu hiện trong Pichia pastoris GS115. Kết
quả tạo các xylanase tái tổ hợp (ATX11A41) có cấu trúc vùng điểm đầu cuối N (Hình
1.13) và vùng “cord” (Hình 1.14) thay đổi so với xylanase tái tổ hợp không gây đột biến
gen (AoXyn11A) và có những cải thiện đáng kể về đặc tính nhiệt độ: nhiệt độ tối ưu
tăng từ 50oC đến 65oC, T1/2 ở 60 oC tăng từ 18 phút lên 55 phút và 83 phút, Tnc tăng thêm
trên 10oC [56].

Hình 1.13. Các cấu trúc 3D
của điểm đầu cuối N của AoXyn11A (a) và ATX11A41 (b) [56]
Hai cầu muối bổ sung (His10-Asp11 và Asp11-Lys49) và ba acid amin tích điện bổ sung (Asp11,
Glam28 và Arg40) trong ATX11A41

16


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×

×