Tải bản đầy đủ

CÁC CHỈ số ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG sắt VITAMIN a và PHƯƠNG PHÁP xác ĐỊNH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BỘ Y TẾ

NGUYỄN THỊ DIỆP ANH

CÁC CHỈ SỐ ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG SẮT
VITAMIN A VÀ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH

CHUYÊN ĐỀ TIẾN SĨ

HÀ NỘI – 2016


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BỘ Y TẾ

NGUYỄN THỊ DIỆP ANH


CÁC CHỈ SỐ ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG SẮT,
VITAMIN A VÀ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHUYÊN ĐỀ:

PGS.TS. Lê Bạch Mai

CHO ĐỀ TÀI NCS:
Nghiên cứu một số chỉ số hóa sinh liên quan đến tình trạng dinh dưỡng
sắt, vitamin A ở phụ nữ mang thai được bổ sung thực phẩm

Chuyên ngành

: Hóa Sinh Y Học

Mã số

: 62720112

CHUYÊN ĐỀ TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI – 2016


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU...........................................................................................................1
I. VAI TRÒ CỦA SẮT VÀ VITAMIN A TRONG CƠ THỂ.........................2
1.1. Vai trò của sắt trong cơ thể...................................................................2
1.2. Vai trò của vitamin a đối với cơ thể.....................................................2
II. MỘT SỐ CHỈ SỐ ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG SẮT VÀ PHƯƠNG
PHÁP XÁC ĐỊNH.........................................................................................4
2.1. Sắt huyết thanh.....................................................................................5
2.2. FERRITIN..........................................................................................12
2.3. TRANSFERRIN................................................................................16
2.4. THỤ THỂ TRANSFERRIN...............................................................18
2.5. HEPCIDIN.........................................................................................20
2.6. Xét nghiệm khả năng mang sắt toàn cơ thể.......................................24
2.7. Xét nghiệm đo lượng sắt trong cơ thể ..............................................25
2.8. Xét nghiệm đánh giá độ bão hòa sắt..................................................25
III. MỘT SỐ CHỈ SỐ ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG VITAMIN A VÀ
PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH......................................................................26
3.1. Vitamin a huyết thanh........................................................................26
3.2. Vitamin a trong sữa mẹ......................................................................29
3.3. Retinol Binding Protein.....................................................................31
KẾT LUẬN....................................................................................................34
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC HÌNH

Hình 1:

Vai trò của vitamin A.........................................................................2

Hình 2:

Quá trình phân giải và tổng hợp Rodopxin.......................................3

Hình 3:

Mô hình của hệ thống AAS...............................................................8

Hình 4:

Hình ảnh mô tả các giai đoạn phản ứng của phương pháp ELISA. 16

Hình 5:

Chu trình vật chuyển sắt trong cơ thể.............................................21

Hình 6:

Hepcidin tương tác với ferroportin kiểm soát sắt trong cơ thể.......22

Hình 7:

Mô tả giai đoạn phản ứng xác định hepcidin bằng ELISA.............23

Hình 8:

Sơ đồ các bước tiến hành phản ứng xác định nồng độ hepcidin bằng
phương pháp ELISA.......................................................................24

Hình 9:

Bộ dụng cụ iCheck FRORO............................................................30

Hình 10: Sơ đồ các bước tiến hành phản ứng xác định nồng độ RBP bằng
phương pháp ELISA.......................................................................33


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AAS

Hấp thụ nguyên tử: Atomic Absorption Spectroscopy

ELISA

Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Fer

Ferritin

Hb

Hemoglobin

HPLC

High- Performance liquid chromatography

IB

Iron Body

ICP-MS

Khối phổ plasma cảm ứng: Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer

IGF-I

Insulin-Like Growth Factor-1

RBP

Retinol Binding Protein

RSD

Relative standard deviation

Tf

Transferrin

Tf-R

Transferrin receptor

TIBC

Total Iron Binding Capacity

VitA

Vitamin A


1

MỞ ĐẦU
Sắt và Vitamin A là hai trong ba vi chất quan trọng (sắt, vitamin A, iốt)
cần thiết cho sự sống [1]. Trong cơ thể, sắt có mặt ở tất cả các tế bào với rất
nhiều chức năng như vận chuyển oxy từ phổi tới các tổ chức dưới dạng
hemoglobin (Hb), tăng cường sử dụng oxy ở các tổ chức cơ bắp dưới dạng
myoglobin, đóng vai trò trung gian vận chuyển các điện tử trong tế bào dưới
dạng cytochrom, sắt còn tham gia vào thành phần một số enzym oxy hóa khử
trong các tế bào [2], [3], [4]. Thiếu hụt sắt trong cơ thể sẽ gây ảnh hưởng
nghiêm trọng đến sự tổng hợp hemoglobin, gây thiếu máu thiếu sắt, ảnh
hưởng đến hoạt động chuyển hóa của các tế bào. Ngược lại sự quá tải sắt
trong cơ thể rất nguy hiểm nó thúc đẩy sản xuất các gốc tự do, gây những hậu
quả nghiêm trọng do ứ đọng sắt ở các mô làm rối loạn chức năng các mô và
các cơ quan đó [5]. Cũng như sắt, vitamin A có vai trò quan trọng đối với sự
phát triển của cơ thể, vitamin A tham gia và duy trì tính nhạy cảm của mắt đối
với sự thu nhận ánh sáng, đảm bảo cho mắt hoạt động bình thường. Vitamin A
có vai trò đối với sự tăng trưởng, tham gia vào biệt hóa tế bào cũng như bảo
vệ sự toàn vẹn của biểu mô và niêm mạc - hàng rào quan trọng bảo vệ cơ thể
khỏi sự xâm nhập của vi khuẩn từ bên ngoài, khi thiếu vitamin A quá trình lớn
có thể bị ngừng trệ [6].
Nhờ sự nỗ lực của các nhà khoa học trong việc nghiên cứu, ngày nay có
nhiều chỉ số đánh giá tình trạng sắt cũng như Vitamin A trong cơ thể. Một số
xét nghiệm đã trở nên thường quy trong dự phòng cũng như chẩn đoán bệnh.
Nhiều tiến bộ về kỹ thuật như kỹ thuật đo quang, miễn dịch, kỹ thuật sắc ký
… đã được ứng dụng để đánh giá tình trạng sắt, vitamin A.
Chuyên đề này nhằm 2 mục tiêu chính sau:
1. Phân tích các chỉ số và ý nghĩa của chúng trong đánh giá tình trạng
sắt trong cơ thể.
2. Đánh giá các kỹ thuật xác định chỉ số đánh giá tình trạng vitamin A
trong cơ thể.


2

I. VAI TRÒ CỦA SẮT VÀ VITAMIN A TRONG CƠ THỂ
1.1. Vai trò của sắt trong cơ thể
Sắt là một trong những thành phần dinh dưỡng có tầm quan trọng cơ
bản đối với sự sống . Trong cơ thể sắt có mặt ở tất cả các tế bào với rất nhiều
chức năng như vận chuyển oxy từ phổi tới các tổ chức dưới dạng hemoglobin
(Hb), tăng cường sử dụng oxy ở các tổ chức cơ bắp dưới dạng myoglobin,
đóng vai trò trung gian vận chuyển các điện tử trong tế bào dưới dạng
cytochrom, sắt còn tham gia vào thành phần một số men oxy hóa khử trong
các tế bào. Thiếu hụt sắt trong cơ thể sẽ gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự
tổng hợp hemoglobin, gây thiếu máu thiếu sắt, ảnh hưởng đến hoạt động
chuyển hóa của các tế bào [2],[3],[4]. Ngược lại sự quá tải sắt trong cơ thể rất
nguy hiểm nó thúc đẩy sản xuất các gốc tự do, gây những hậu quả nghiêm
trọng do ứ đọng sắt ở các mô làm rối loạn chức năng các mô và các cơ quan
đó .
1.2. Vai trò của vitamin a đối với cơ thể
Tên hóa học của vitamin A là retinol. Trong cơ thể người, vitamin A tồn
tại dưới một số dạng hoạt động khác nhau như aldehyd (retinal), acid (retinoic
adid).

Hình 1: Vai trò của vitamin A


3

Một trong những vai trò quan trọng nhất của vitamin A là chức năng
đặc hiệu trong cơ chế nhìn, tham gia duy trì tính nhạy cảm của mắt đối với sự
thu nhận ánh sáng. Sắc tố nhạy cảm với ánh sáng nằm ở tế bào que, võng mạc
là Rodopxin. Trong bóng tối, retinal kết hợp với opsin (là một protein) để tổng hợp
rhodopsin, giúp võng mạc nhận được các hình ảnh trong điều kiện thiếu ánh sáng.
Sau đó, khi ra sáng rhodopsin lại bị phân huỷ cho opsin và all-trans-retinal, rồi alltrans-retinal vào máu để trở lại thành cis-retinol [7]. Hình 2 biểu diễn quá trình

phân giải và tổng hợp Rodopxin.
Ánh sáng

Rodopxin

Opsin

+

Retinal

Tối

Retinol
Hình 2: Quá trình phân giải và tổng hợp Rodopxin
Trong điều kiện bình thường, sự phân giải và tổng hợp quá trình trên
được duy trì ở trạng thái cân bằng, tốc độ phân giải và tổng hợp bằng nhau.
Khi thiếu vitamin A tốc độ tái tạo Rodopxin chậm lại. Vì thế việc bổ sung
vitamin A thường xuyên từ thức ăn hàng ngày là cần thiết để duy trì quá trình
trên, đảm bảo cho mắt hoạt động bình thường [7],[8].
Vitamin A có một vai trò quan trọng trong sự hình thành và duy trì chức
năng và bảo vệ sự toàn vẹn của các biểu mô, hàng rào bảo vệ chống nhiễm
trùng. Khi thiếu vitamin A các tế bào tiết chất nhày tại phần lớn các biểu mô
giảm số lượng và kích thước được thay thế bằng tế bào sản xuất keratin. Hậu
quả là chứng khô giác mạc với hiện tượng sừng hoá kết mạc và giác mạc mắt
và các mô khác, cuối cùng dẫn đến mù lòa [11]. Những mô nhạy cảm nhất với
VitA là da, đường hô hấp, tuyến nước bọt, mắt và tinh hoàn .


4

Vitamin A có vai trò quan trọng trong việc duy trì nồng độ bình thường
của hormon tăng trưởng IGF-I (Insulin-Like Growth Factor - I) và sự phát
triển bình thường của trẻ , [12]. Khi thiếu vitamin A quá trình lớn của trẻ sẽ bị
ngừng trệ, thậm chí tụt cân. Thiếu vitamin A làm xương mềm và mảnh hơn
bình thường, quá trình vôi hoá bị rối loạn [11],[13].
Vitamin A tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể. Vitamin A có tác
dụng qua trung gian tế bào, hơn là qua đáp ứng miễn dịch dịch thể. Liên quan
lympho T, B, bạch cầu đa nhân trung tính. Thiếu vitamin A làm giảm sức đề
kháng với bệnh tật, dễ mắc bệnh nhiễm khuẩn, dễ bị nhiễm khuẩn nặng, đặc
biệt là sởi, tiêu chảy, viêm đường hô hấp làm tăng nguy cơ tử vong ở trẻ nhỏ.
Mới đây, người ta thấy vitamin A có khả năng làm tăng sức đề kháng với bệnh
nhiễm khuẩn, uốn ván, lao, sởi, phòng ngừa ung thư…. [9]. VitA có vai trò đối
với tạo máu. Thiếu vitamin A làm cho chuyển hoá sắt bị rối loạn. Giảm vitamin
A, có thể ảnh hưởng đến hàm lượng hemoglobin. Người ta thấy bổ sung
vitamin A đơn thuần hoặc kết hợp với kẽm, sắt… làm giảm tỷ lệ thiếu máu tại
cộng đồng. Bổ sung vitamin A, còn làm tăng huyết sắc tố, giảm receptor
transferin huyết thanh, cải thiện chỉ số erythropoiesis [6].
II. MỘT SỐ CHỈ SỐ ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG SẮT VÀ PHƯƠNG
PHÁP XÁC ĐỊNH
Tình trạng sắt của cơ thể có thể thay đổi từ mức thừa sắt cho đến thiếu
máu thiếu sắt. Từ trước đã có rất nhiều phương pháp được sử dụng để đánh
giá tình trạng sắt của mỗi cá thể bao gồm xác định lượng sắt ăn vào, Hb, thể
tích trung bình tế bào, chỉ số trung bình hồng cầu, proporphyrin của hồng cầu
tự do, nhuộm sắt trong tủy xương… Ngày nay có thêm nhiều chỉ số để đánh
giá tình trạng sắt của cơ thể như: đo sắt huyết thanh, ferritin, transferrin (Tf),
transferrin- receptor (Tf-R), khả năng gắn sắt toàn phần, độ bão hòa Tf. [14].


5

2.1. Sắt huyết thanh
Trong điều kiện bình thường, nồng độ sắt trong huyết thanh phản ánh
Fe3+ được gắn với transferrin mà không phải với Hb tự do trong huyết tương.
Xét nghiệm định lượng sắt huyết thanh giúp thăm dò tình trạng thiếu máu.
Tình trạng thiếu hụt sắt sẽ gây thiếu máu hồng cầu nhỏ và nhược sắc:
Nồng độ sắt huyết thanh rất thấp (thường nhỏ hơn 4 µmol/L) với hệ số bão
hòa của transferrin giảm nặng (<10%). Tình trạng thiếu hụt sắt này thường là
hậu quả của các chảy máu âm thầm với nguyên nhân chính thường gặp là
rong kinh, chảy máu dạ dày, trĩ. Các biến đổi nồng độ sắt huyết thanh trong
một số tình trạng thiếu máu có thể phản ánh hoạt động của tủy xương. Các
tình trạng tăng tạo máu sau thiếu máu (như: sau chảy máu hay tan máu)
thường là nguyên nhân gây giảm nồng độ sắt huyết thanh do tăng quá trình
tạo hồng cầu và tủy xương tiêu thụ sắt quá mức sắt. Đây cũng là cơ chế giải
thích cho tình trạng giảm nồng độ sắt huyết thanh trong bệnh đa hồng cầu.
Trái lại, các thiếu máu bất sản và các rối loạn sinh hồng cầu với rối loạn tổng
hợp Hb sẽ đi kèm với tình trạng tăng nồng độ sắt huyết thanh (thiếu máu
không đáp ứng với điều trị, thiếu máu tăng nguyên bào sắt) [15].
Xét nghiệm nồng độ sắt huyết thanh để đánh giá đáp ứng của cơ thể đối với
điều trị bổ sung sắt trong quá trình điều trị thiếu máu do thiếu sắt.
2.1.1. Phương pháp xác định nồng độ sắt trong huyết thanh
Sắt có thể được xác định bởi một số phương pháp như: phương pháp đo
quang, phương pháp hấp thụ nguyên tử (AAS) hoặc phương pháp khối phổ
plasma cảm ứng (ICP-MS).
Mẫu bệnh phẩm: Lấy 2 ml máu tĩnh mạch cho vào ống nghiệm không
có chất chống đông. Ly tâm mẫu lấy huyết thanh.


6

Mẫu có thể làm ngay trong ngày hoặc bảo quản ở -20 0C hoặc -800C
trong 3 năm.
2.1.1.1. Phương pháp đo quang
Nguyên lý:
Nhiều phương pháp đo quang khác nhau đã được sử dụng để đo lượng
sắt trong huyết thanh. Nhìn chung các phương pháp đều dựa trên nguyên lý
giải phóng sắt ở Transferrin(Fe3+)2 trong huyết thanh thành Fe2+, tiếp theo
Fe2+ sẽ phản ứng với 1 chất để tạo phức chất có màu. Đo độ hấp thụ tại bước
sóng trong khoảng 578 nm hoặc từ 580-600nm. Độ hấp thụ của màu sắc tỷ lệ
thuận với nồng độ sắt.
Ví dụ:
• Với bộ kít Iron FS Ferene của hãng Diasys, mẫu bệnh phẩm là huyết
thanh. Trong môi trường đệm có acid ascorbic, Fe 3+ có trong
Transferrin(Fe3+)2 được giải phóng thành Fe2+. Bộ kít sử dụng chất tạo phức
Ferene: (5,5’(3-(2-pyridyl)-1,2,4-triazine-5,6-diyl)bis-2-furansulfonic acid,
disodium salt). Ferene sẽ kết hợp với Fe2+ tạo phức màu xanh. Phức màu
xanh-Ferene có độ hấp thụ tối đa ở bước sóng 595nm, độ hấp thụ tỷ lệ thuận
với nồng độ sắt.
Phản ứng:
Ascorbic acid, buffer
Transferrin(Fe )2 -----------------→ 2 Fe2+ + Transferrin
3+

Fe2+ + 3 Ferene -----------------→ Ferrous Ferene (phức màu xanh)
 Với bộ kít Iron FS sử dụng chất tạo phức Nitro-PAPS: [2-(5-nitro-2pyridyl-azo-)-5-(n-propyl-n-(3-sulfopropyl)amino)phenol]. Mẫu bệnh phẩm


7

có thể là huyết thanh hoặc huyết tương được chống đông bằng heparin. Fe 3+
có trong Transferrin(Fe3+)2 được giải phóng thành Fe2+ trong môi trường kiềm.
Fe2+ tạo thành phức màu đỏ với Nitro-PAPS. Đo độ hấp thụ ở bước sóng
587nm, độ hấp thụ của màu là tỷ lệ thuận với nồng độ sắt.
Phản ứng
Guanidinium chloride
Transferrin(Fe )2 -----------------→ 2 Fe2+ + Transferrin
3+

detergents
Fe2+ + 3 Ferene ----------------→ Ferrous-Nitro-PAPs (phức màu đỏ)
Giá trị tham chiếu [16]:
Trẻ nhỏ: 4 – 24 µmol/L
Phụ nữ: 4 – 26 µmol/L
Phụ nữ có thai: 2,9 – 27 µmol/L
Nam giới: 7,2 – 30,1 µmol/L
Ngưỡng đo của phương pháp: 1 – 179 µmol/L.
Độ nhậy của phương pháp:
Giới hạn phát hiện thấp: 1µmol/L, với hệ số biến thiên CV < 2%
Độ nhậy và độ đặc hiệu kém hơn so với phương pháp AAS và ICP-MS.
2.1.1.2. Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS: Atomic
Absorption Spectroscopy) [17].
Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử được sử dụng để đo nồng
độ sắt trong huyết thanh bằng cách đo độ hấp thụ bức xạ bởi hơi nguyên tử tự
do của nguyên tố sắt đã được hóa hơi từ chất thử.
MONOCHROMATOR

gương

Ghi nhận tín hiệu


8

Nguồn bức
xạ

Nguyên tử hóa

DETECTOR

Vạch phổ

Hình 3: Mô hình của hệ thống AAS
Nguyên tắc xét nghiệm:
Khi nguyên tử ở trạng thái hơi có thể hấp thụ các bức xạ có bước sóng
xác định. Phổ hấp thụ của các nguyên tử là phổ vạch. Vì vậy muốn thực hiện
được phép đo quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) cần phải có các quá trình
sau:
• Đầu tiên, mẫu được đốt cháy để chuyển từ trạng thái ban đầu thành
trạng thái hơi của nguyên tử tự do.
• Chọn các điều kiện và trang thiết bị phù hợp để chuyển mẫu phân
tích từ trạng thái ban đầu thành trạng thái hơi của nguyên tử tự do.
• Chiếu chùm tia sáng thích hợp (với nguyên tố cần phân tích và còn
được gọi là bức xạ cộng hưởng) qua đám hơi nguyên tử vừa tạo ra ở trên. Các
nguyên tử của nguyên tố cần phân tích trong đám hơi sẽ hấp thụ một phần bức
xạ và tạo ra phổ hấp thụ nguyên tử. Phần bức xạ hấp thụ phụ thuộc vào nồng
độ của nguyên tử đó trong môi trường hấp thụ.
• Nhờ các bộ phận của máy quang phổ mà người ta thu, phân ly và
chọn vạch phổ của nguyên tố cần nghiên cứu và đo cường độ của nó.


9

Điều kiện đo nguyên tố sắt trong mẫu huyết thanh:
-

Vạch phổ đo sắt: 248,3 nm

-

Dòng đốt đèn catốt rỗng của nguyên tố sắt: 4,0 mA

-

Khe đo: 0,2 nm

-

Chiều cao đầu đốt: 6 mm

-

Khí ngọn lửa: không khí nén và Acetylen

-

Tốc độ dẫn mẫu: 5 – 6 mL/phút

-

Tốc độ dẫn thuốc thử HNO3: 2ml/phút

-

Thời gian đo: 5 giây

Giới hạn đo của phương pháp:
Độ nhậy của phương pháp:
2.1.1.3. Phương pháp khối phổ plasma cảm ứng (ICP-MS: Inductively
Coupled Plasma - Mass Spectrometer)
Kỹ thuật phân tích ICP-MS là một kỹ thuật phân tích đa nguyên tố. Sử
dụng nguồn ion hóa nhiệt độ cao 6000-7000K của plasma để phân rã, nguyên
tử hóa và ion hóa mẫu cần phân tích. Kỹ thuật này sử dụng bộ phân tích khối
tứ cực, phân tích các nguyên tố bằng những phép scan liên tiếp. Giới hạn phát
hiện dưới rất thấp từ ng/L tới 10 -6 ng/L, khoảng đo rộng từ 0,5 ppt đến
500ppm. Năng suất đo cao chỉ mất 3 đến 5 phút cho một phép đo đa nguyên
tố [18]. Trước khi phân tích, mẫu cần phải qua bước chuẩn bị với mục đích
hòa loãng mẫu trong dung dịch đồng thể (thường là nước trao đổi ion hoặc
HNO3 2% sạch), không chứa cặn lơ lửng, huyền phù và ở khoảng nồng độ
phù hợp cho thiết bị phân tích.


10

Nguyên lý:
1. Chuẩn bị mẫu: Sử dụng mẫu huyết thanh.
- Các phương pháp phá mẫu bao gồm: phá mẫu bằng acid, phá mẫu lò
vi sóng, phá mẫu dùng bom nhiệt.
- Sau khi mẫu được phân hủy, hòa loãng mẫu với hàm lượng acid
khoảng 2% (thường sử dụng HNO3).
2. Bơm mẫu vào máy:
- Mẫu được đưa vào thiết bị ICP-MS bằng bơm nhu động, qua vòi
phun sương (nebulizer). Bơm nhu động có tốc độ ổn định giúp kết quả có độ
lặp lại cao.
- Vòi phun nebulizer có tác dụng biến mẫu thành các dạng giọt sương.
Dưới tác dụng của dòng khí Argon, dòng mẫu được phun thành các hạt sương.
Các hạt sương thô có kích thước > 10 µm được đẩy ra ngoài, còn các hạt
sương nhỏ mịn (thường < 10 micromet) được đưa vào đèn plasma (plasma
torch). Nhiệt độ buồng phun sương được giữ thấp ở 20C để tránh nước bay hơi
vào plasma làm giảm năng lượng của đèn.
3. Ion hóa nguyên tử trong môi trường plasma:
- Trong môi trường plasma có nhiệt độ cao (~ 8000K), các giọt mẫu bị
hóa hơi, phân ra thành nguyên tử tự do và tiếp tục bị ion hóa. Dưới điều kiện
plasma tạo bởi nền khí Ar, năng lượng của môi trường ion hóa là khoảng 15.4
eV, nguyên tố Fe bị ion hóa, hình thành nên các ion Fe từ -2 cho đến + 6.
- Dưới tác động của điện trường và chân không, các ion kim loại đo
cùng nền mẫu bị hút vào bộ giao diện (gồm sampling cone và skimmer cone
và các lens). Các phân tử trung hòa (dung môi, nền mẫu, không khí..) bị bơm
chân không hút loại bỏ hầu hết, chỉ còn các ion dương đi tiếp vào buồng phản
ứng va đập (Octapole Reaction System: ORS).


11

4. Buồng phản ứng va đập: Tại buồng ORS có hai tác dụng, thứ nhất
là để hội tụ chùm ion dương và thứ hai là để loại nhiễu polyatomic.
- Sử dụng khí He để loại nhiễu theo nguyên lý KED (kinetic engergy
discrimination). Các dạng nhiễu đa nguyên tử (ví dụ ArO = 56 sẽ gây nhiễu
cho 56Fe) thường có tiết diện lớn hơn ion đơn sẽ va chạm với khí He trong
buồng ORS và bị mất năng lượng do đó không thể đi tiếp vào phần lọc khối.
- Sau khi loại nhiễu, các ion mẫu và nền mẫu sẽ đi vào bộ lọc khối dạng
tứ cực (quadrupole). Dưới tác động của sự kết hợp giữa điện áp một chiều DC
và điện áp cao tần (RF), chỉ những ion có số khối quan tâm đi qua được bộ
lọc khối và đi vào detector để tạo tín hiệu. Bộ lọc khối chỉ cho một ion nhất
định đi qua tại một thời điểm. Khi bộ lọc khối quét liên tục trong một khoảng
đo từ khối thấp nhất lên khối cao nhất sẽ có dải phổ.
Với kỹ thuật ICP-MS, ta có thể áp dụng 2 chế độ phân tích là định
lượng toàn phần (full quant) và bán định lượng (semi-quant).
- Trong chế độ định lượng toàn phần, (gọi tắt là định lượng), ta chọn
mảnh ion của cấu tử cần đo (có thể chọn nhiều mảnh ion cho phân tích đa
nguyên tố). Thiết bị ICP-MS sẽ đo tập trung ở các mảnh ion đó trên mẫu
chuẩn và trên mẫu thực. Phần mềm sẽ dựng đường chuẩn và tính toán ra nồng
độ thực của từng nguyên tố phân tích. Kỹ thuật phân tích định lượng toàn
phần có độ chính xác cao, tuy nhiên cần có chuẩn của các nguyên tố đo.
- Trong chế độ bán định lượng, thiết bị ICP-MS sẽ quét toàn bộ khoảng
khối, như vậy ta đo được hầu hết các nguyên tố trong bảng tuần hoàn, trừ một
số nguyên tố không thể đo như F, C, N, O, Ar... Với chế độ bán định lượng, ta
không cần có chuẩn của tất cả các nguyên tố mà chỉ cần một vài nguyên tố đại
diện. Ưu điểm của phương pháp bán định lượng là nhanh, chi phí thấp. Tuy
nhiên độ chính xác cũng chỉ mang tính tham khảo và có thể sai số tới 30%.


12

Độ lặp lại của phương pháp được tính theo RSD % càng thấp độ lặp
càng cao.
Máy ICP-MS đạt RSD = 1-2 %.
Khoảng đo rộng: 0,5 ppt đến 500ppm
Giới hạn phát hiện dưới rất thấp từ ng/L tới 10-6 ng/L.
2.2. FERRITIN
Ferritin là protein dự trữ sắt có trọng lượng phân tử 465 KDa. Vỏ
protein khi chưa liên kết với sắt gọi là apoferritin. Sau khi apoferritin liên kết
với sắt tạo thành ferritin. Lượng sắt chứa trong ferritin chiếm khoảng 20%
trọng lượng protein này. Mỗi phân tử apoferritin có thể liên kết với 4000 –
5000 nguyên tử sắt. Ferritin được dữ trữ ở gan, lách, tủy xương và hệ thống
cơ xương. Một lượng nhỏ ferritin được lưu hành trong huyết tương. Ở người
khỏe mạnh, hầu hết sắt được dự trữ dưới dạng ferritin (khoảng 70% ở nam
giới và 80% ở phụ nữ) còn một lượng nhỏ được dự trữ dưới dạng hemosiderin
[5]. Khi bị thiếu sắt, cơ thể sẽ phải huy động sắt dự trữ để đảm bảo duy trì các
chức năng cần tới sắt. Khi tình trạng thiếu sắt kéo dài làm cho tổng lượng sắt
dự trữ trong cơ thể bị cạn kiệt sẽ dẫn đến hiện tượng giảm ferritin trong huyết
thanh.
Một trong những phương pháp tốt để đánh giá kho dự trữ sắt có thể huy
động được của cơ thể là định lượng ferritin trong huyết thanh hoặc huyết
tương. Nồng độ ferritin huyết thanh thường phản ánh thực tế tình trạng dự trữ
sắt trong cơ thể nếu người đó không trong tình trạng viêm nhiễm. Ferritin
huyết thanh bình thường trong khoảng 20 – 300 μg/L với mỗi μg/L ferritin
tương đương với 10mg sắt dự trữ. Nồng độ ferritin huyết thanh có thể tăng
một cách đáng kể trong những trường hợp viêm nhiễm mạn và cấp tính, thiếu
vitamin B12, thiếu acid folic, bệnh gan, bệnh bạch cầu, bệnh Hodgkin, uống


13

rượu và tăng năng giáp. Giảm nồng độ ferritin có thể do một số nguyên nhân
như: phẫu thuật đường tiêu hóa, lọc máu, thiếu máu do thiếu sắt, suy dinh
dưỡng, mất máu do kinh nguyệt, có thai. Ngoài ra, giá trị ferritin huyết thanh
trong cùng một cơ thể có thể thay đổi trong khoảng 25 - 40% trong những
ngày khác nhau [14].
Định lượng nồng độ ferritin giúp chẩn đoán phân biệt các loại thiếu
máu khi phối hợp định lượng nồng độ ferritin với nồng độ sắt huyết thanh và
khả năng gắn sắt toàn cơ thể. Nồng độ ferritin bị hạ thấp < 15 µg/L là dấu
hiệu đặc trưng cho tình trạng thiếu máu do thiếu sắt.
2.2.1. Phương pháp xác định Ferritin
Ferritin có thể được xác định bởi một số phương pháp như: phương
pháp miễn dịch phóng xạ (radioimmunoassay: RIA), phương pháp ELISA
(Enzyme-linked

Immunosorbent

Assay),

miễn

dịch

huỳnh

quang

(fluorescence immunoassay: FIA), miễn dịch phát quang (luminescence
immunoassay: LIA).
2.2.1.1 Phương pháp miễn dịch hóa phát quang
Ferritin được định lượng theo nguyên lý miễn dịch sandwich sử dụng
công nghệ hóa phát quang hay điện hóa phát quang.
Nguyên lý: Ferritin có trong mẫu thử đóng vai trò kháng nguyên được
kẹp giữa hai kháng thể, kháng thể thứ nhất là kháng thể đơn dòng đặc hiệu
kháng ferritin đánh dấu biotin, kháng thể thứ hai là kháng thể đơn dòng đặc
hiệu kháng Ferritin đánh dấu ruthenium (chất có khả năng phát quang) tạo
thành phức hợp miễn dịch kiểu sandwich.
Cường độ phát quang tỷ lệ thuận với nồng độ Ferritin có trong mẫu thử.


14

Trang thiết bị cần thiết:
- Máy xét nghiệm miễn dịch Elecsys 2010, Cobas e411, e170, rchitect…
- Hóa chất bao gồm: Hóa chất xét nghiệm Ferritin, chất chuẩn Ferritin,
chất kiểm tra chất lượng Ferritin. - Máy phân tích cần chuẩn bị sẵn sàng để
thực hiện phân tích mẫu: Máy đã được cài đặt chương trình xét nghiệm
Ferritin, Máy đã được chuẩn với xét nghiệm Ferritin. Kết quả kiểm tra chất
lượng với xét nghiệm Ferritin đạt yêu cầu không nằm ngoài dải cho phép và
không vi phạm luật kiểm tra chất lượng.
- Nhập thông tin mẫu cần phân tích vào hệ thống khai báo của máy
phân tích.
- Đưa mẫu bệnh phẩm vào máy phân tích
- Ra lệnh cho máy thực hiện phân tích mẫu bệnh phẩm
- Đợi máy phân tích mẫu theo protocol của máy
Khi có kết quả cần xem xét đánh giá kết quả trước khi công bố kết quả
Giá trị tham chiếu:
- Trị số bình thường:
Nam 30 - 400 ng/mL
Nữ 13 - 150 ng/mL
- Ferritin máu tăng trong: Các bệnh máu như Hodgkin, Lơ xê mi
cấp…, Ung thư gan, tụy, phổi…, Suy thận mạn.
- Ferritin máu giảm trong: Thiểu máu do thiếu sắt.
Kết quả xét nghiệm không bị ảnh hưởng khi:
+ Huyết thanh vàng: Bilirubin < 65 mg/dL .
+ Tán huyết: Hemoglobin < 3300 mg/dL.
+ Sử dụng Biotin 5 mg/ngày cần lấy máu xét nghiệm ít nhất 8h sau khi
sử dụng Biotin lần cuối.
Giới hạn đo tùy thuộc vào máy.


15

Ví dụ như máy miễn dịch của Roche / Hitachi 902
Dải đo: 5-400 ng/mL
Máy sẽ tự động pha loãng mẫu 2 lần khi nồng độ ferritin > 400 ng/mL
và kết quả tự động nhân 2.
Với máy Roche / Hitachi 904 / 911/912/917 / MODULAR
Dải đo: 15-800 ng/mL
Dải đo rộng với khả năng phân tích pha loãng tự động: 3-6400 ng/mL.
Khi nồng độ Ferritin cao quá giới hạn đo mà máy đã tự động pha loãng.
Có thể hòa loãng bệnh phẩm bên ngoài và thực hiện lại xét nghiệm sau đó
nhân kết quả với độ hòa loãng.
2.2.1.2. Phương pháp ELISA
Phương pháp miễn dịch ELISA là kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng
thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm. Sử dụng bộ kit dành cho hệ
thống ELISA.
Nguyên lý chính của kỹ thuật dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên kháng thể và gồm các bước cơ bản như sau:
Mẫu dùng phân tích là huyết thanh hoặc huyết tương.
Nguyên tắc xét nghiệm dựa trên 2 giai đoạn:
Giai đoạn 1: Gắn Ferritin huyết thanh người với kháng thể kháng
Ferritin ở pha rắn và đồng thời gắn với kháng thể kháng Ferritin đã được đánh
dấu bằng liên kết với alkaline phosphatase để tạo phức hợp miễn dịch kiểu
sandwich.
Giữa các bước tiến hành, các protein và kháng thể không đặc hiệu,
kháng thể không gắn với kháng nguyên sẽ bị loại bỏ thông qua các bước
rửa. Sau bước rửa cuối cùng chỉ còn kháng thể liên kết với kháng nguyên
được giữ lại.


16

Giai đoạn 2: Phản ứng xúc tác của alkaline phosphatase với
phenylphotphat và 4-amino-antipyrin có trong dung dịch nền. Tiếp theo thêm
Fericyanide để tạo màu.
Đo cường độ màu ở bước sóng 490-510 nm. Mật độ hấp thụ quang tỷ lệ
thuận với nồng độ Ferritin của mẫu.

Hình 4: Hình ảnh mô tả các giai đoạn phản ứng của phương pháp ELISA
2.3. TRANSFERRIN
Sắt được vận chuyển trong máu bởi một protein đặc biệt là Transferrin
(Tf). Tf được tổng hợp tại gan, một phân tử Tf có thể gắn với 2 phân tử sắt,
sau khi sắt tách ra Tf tiếp tục gắn với những nguyên tử sắt mới. Bình thường
có khoảng 1/3 Tf bão hòa sắt. Tỷ lệ này có thể thay đổi trong các bệnh lý
thiếu hoặc quá tải sắt. Transferrin chủ yếu lấy sắt từ các đại thực bào của hệ
liên võng nội mô và một lượng nhỏ sắt được lấy từ sắt hấp thu qua đường tiêu
hóa hàng ngày. Các nguyên hồng cầu lấy sắt cần thiết cho quá trình tổng hợp
hemoglobin từ transferrin. Các nguyên hồng cầu rất giàu các receptor với


17

transferrin. Ngoài ra một lượng nhỏ sắt cũng được chuyển đến các tế bào
không phải là hồng cầu (ví dụ: để tổng hợp các enzym chứa sắt) [15]. Trong
trường hợp quá tải sắt, lượng sắt trong huyết tương tăng lên và transferrin bị
bão hòa hết. Khi đó sắt được chuyển đến các tế bào ở nhu mô các cơ quan
khác nhau như gan, tim, các tuyến nội tiết gây các biểu hiện bệnh lý do ứ
đọng sắt.
Khi lượng sắt dự trữ trong cơ thể bị cạn kiệt độ bão hòa của Tf sẽ giảm
đi. Hậu quả của hiện tượng trên là không có đủ lượng sắt cần thiết cho các
protein mang sắt quan trọng trong cơ thể. Những cá thể có độ bão hòa Tf dưới
15% mà không được bổ sung sắt đầy đủ sẽ không có đủ lượng sắt cần thiết
cho quá trình tân tạo hồng cầu bình thường [14].
Xác định nồng độ transferrin huyết thanh giúp đánh giá tình trạng sắt
trong cơ thể nhằm chẩn đoán tình trạng thiếu máu thiếu sắt hay các rối loạn
quá tải sắt như bệnh hemochromatosis.
2.3.1. Phương pháp xác định Transferrin
Transferrin có thể được xác định bởi một số phương pháp như: phương
pháp miễn dịch, phương pháp ELISA.
2.3.1.1 Phương pháp miễn dịch
Transferin được định lượng bằng phương pháp miễn dịch đo độ đục.
Nguyên lý: Kháng thể kháng Transferin trong thuốc thử kết hợp với
Transferin trong mẫu thử tạo phức hợp miễn dịch kháng nguyên-kháng thể
khiến dung dịch phản ứng có độ đục. Nồng độ Transferin có trong mẫu thử tỷ
lệ thuận với độ đục do phức hợp miễn dịch kháng nguyên-kháng thể tạo ra.
Tiến hành: Máy phân tích cần chuẩn bị sẵn sàng để thực hiện phân tích
mẫu: Máy đã được cài đặt chương trình xét nghiệm Transferin. Máy đã được


18

chuẩn với xét nghiệm Transferin. Kết quả kiểm tra chất lượng với xét nghiệm
Transferin đạt yêu cầu không nằm ngoài dải cho phép và không vi phạm luật
kiểm tra chất lượng.
- Nhập thông tin mẫu cần phân tích vào hệ thống khai báo của máy
phân tích.
- Đưa mẫu bệnh phẩm vào máy phân tích
- Ra lệnh cho máy thực hiện phân tích mẫu bệnh phẩm
- Đợi máy phân tích mẫu theo protocol của máy
- Khi có kết quả cần xem xét đánh giá kết quả trước khi công bố kết quả.
Giá trị tham chiếu:
- Trị số bình thường: 200 - 400 mg/dl
- Transferrin máu tăng trong: Viêm gan cấp, Đa hồng cầu, Uống thuốc
ngừa thai, có thai.
- Transferrin giảm trong: Thiếu máu tan huyết, Thiếu máu thiếu sắt
mạn tính.
2.4. THỤ THỂ TRANSFERRIN (Transferrin receptor: Tf-R)
Tf-R là thụ thể của transferin ở dạng hòa tan, có trọng lượng phân tử
190 Kda. Tf-R huyết thanh là chỉ số có giá trị trong đánh giá thiếu sắt và mức
độ tân tạo hồng cầu. Trị số Tf-R rất khác nhau tùy theo tình trạng sắt của từng
cá thể. Nồng độ Tf-R tăng ngay khi bắt đầu cơ thể bị thiếu sắt ở mức độ nhẹ.
Nồng độ Tf-R cũng tăng trong bệnh β-thalasemia, thiếu máu tan máu tự miễn,
thiếu máu hồng cầu liềm, thiếu máu hồng cầu tròn bẩm sinh, bệnh đa hồng
cầu bẩm sinh thứ phát, bệnh xơ tủy xương và các bệnh bạch cầu mạn tính.
Không giống như ferritin, nồng độ Tf-R không bị ảnh hưởng bởi tình trạng
viêm nhiễm hay bệnh gan. Nồng độ Tf-R có thể được sử dụng để phân biệt


19

giữa thiếu máu thiếu sắt và thiếu máu do nguyên nhân khác bao gồm cả thiếu
máu trong các bệnh mạn tính [14].
Định lượng Tf-R là một biện pháp có giá trị trong chẩn đoán và theo
dõi thiếu máu do thiếu sắt.
2.4.1 Phương pháp xác định Tf-R
Tf-R có thể được xác định bởi một số phương pháp như: phương pháp
miễn dịch, phương pháp ELISA.
2.4.1.1. Phương pháp miễn dịch
Tf-R trong mẫu huyết thanh của người được xác định theo phương
pháp miễn dịch độ đục. Kháng thể kháng Tf-R trong thuốc thử kết hợp với TfR trong mẫu thử tạo phức hợp miễn dịch kháng nguyên-kháng thể khiến dung
dịch phản ứng có độ đục. Nồng độ Tf-R có trong mẫu thử tỷ lệ thuận với độ
đục do phức hợp miễn dịch kháng nguyên-kháng thể tạo ra.
Phương pháp được tiến hành trên máy xét nghiệm miễn dịch tự động
như Hitachi 904; 912 …
- Hóa chất: sử dụng hóa chất xét nghiệm Tf-R, chất chuẩn Tf-R, chất
kiểm tra chất lượng Tf-R.
- Máy phân tích cần chuẩn bị sẵn sàng để thực hiện phân tích mẫu: Máy
đã được cài đặt chương trình xét nghiệm Tf-R. Máy đã được chuẩn với xét
nghiệm Tf-R. Kết quả kiểm tra chất lượng với xét nghiệm Tf-R đạt yêu cầu
không nằm ngoài dải cho phép và không vi phạm luật kiểm tra chất lượng.
- Nhập dữ liệu về thông tin mẫu cần xét nghiệm vào máy phân tích.
- Nạp mẫu bệnh phẩm vào máy phân tích
- Ra lệnh cho máy thực hiện phân tích mẫu bệnh phẩm
- Đợi máy phân tích mẫu theo protocol của máy


20

- Khi có kết quả cần xem xét đánh giá kết quả trước khi công bố.
Giá trị tham chiếu:
- Nam (18 – 60 tuổi): 2.2 - 5.0 mg/L
- Nữ (18 – 45 tuổi): 1.9 – 4.4 mg/L
Giới hạn đo:
Giới hạn đo thấp nhất trong phương pháp này hay chính là khả năng
phát hiện Tf-R thấp nhất trong mẫu bệnh phẩm cần phân tích là 0,5 mg/L. Với
mẫu có nồng độ cao > 40 mg/L máy sẽ tự động pha loãng và tính kết quả.
2.5. HEPCIDIN
Sự điều chỉnh hấp thu sắt ở ruột, phóng thích sắt dự trữ từ đại thực bào
và tế bào gan được điều tiết bởi hormone hepcidin. Hepcidin là một peptid
gồm 25-amino acid, lần đầu tiên được tinh chế ở trong nước tiểu và máu của
con người giống như một peptid kháng khuẩn được phát hiện chủ yếu ở trong
gan [19].
Hepcidin tác động đến nồng độ của ferroportin. Khi nồng độ Hepcidin
tăng khiến ferroportin bị thoái hóa dẫn tới giảm nồng độ ferroportin làm giảm
nồng độ sắt trong huyết thanh, giảm hấp thu sắt ở ruột và ngăn chặn sự phóng
thích sắt từ các đại thực bào (hình: 5 và hình: 6). Hepcidin chịu ảnh hưởng bởi
lượng sắt trong cơ thể, mức độ sản xuất hồng cầu, số lượng và chất lượng sắt
trong thức ăn và sự có mặt của các chất kích thích hay ức chế hấp thu sắt
trong thức ăn. Khi nồng độ sắt trong cơ thể cao sẽ kích thích làm tăng nồng
độ Hepcidin dẫn tới giảm hấp thu sắt và ngược lại [9], [14]. Hoạt động tăng
tạo hồng cầu sẽ ức chế hepcidin đồng nghĩa với việc tăng ferropotin tạo điều
kiện cho sắt được hấp thu trong ruột và kích thích sắt được phóng thích từ các
đại thực bào và tế bào gan để tổng hợp các hồng cầu mới [22].


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×

×