Tải bản đầy đủ

Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa và đánh giá một số tác dụng sinh học của sâm việt nam (panax vietnamensis ha et grushv , araliaceae) tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

DƢƠNG HỒNG TỐ QUYÊN

NGHIÊN CỨU TIÊU CHUẨN HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ
MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA SÂM VIỆT NAM
(PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.,
ARALIACEAE)

NGÀNH: DƢỢC HỌC CỔ TRUYỀN
MÃ SỐ: 62720406

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC

TP. Hồ Chí Minh, năm 2019



Công trình được hoàn thành tại:
Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh

Người hướng dẫn khoa học: GS. TS Nguyễn Minh Đức
PGS.TS. Nguyễn Thị Thu Hương
Phản biện 1: ………………………………………………
Phản biện 2 ………………………………………………
Phản biện 3: ………………………………………………

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường
họp tại Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
vào hồi

giờ

ngày

tháng

năm

Có thể tìm hiểu Luận án tại thư viện:
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
- Thư viện Khoa học Tổng hợp TP. HCM
- Thư viện Đại học Y Dược TP. HCM


DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ
LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI CỦA TÁC GIẢ
Tạp chí trong nƣớc
1. Dƣơng Hồng Tố Quyên, Nguyễn Thị Thu Hương, Nguyễn Minh
Đức (2015), “Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của saponin toàn phần
từ Sâm Việt Nam trồng trên thực nghiệm gây tổn thương gan bằng
carbon tetrachlorid trên chuột nhắt trắng”, Y Học TP.Hồ Chí Minh, tập
19 phụ bản của số 5, tr.143-148.
2. Dƣơng Hồng Tố Quyên, Nguyễn Thị Thu Hương, Vũ Huỳnh Kim
Long, Nguyễn Minh Đức (2015), “Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa
in vitro của saponin toàn phần từ Sâm Việt Nam trồng (Panax
vietnamensis Ha et Grushv.)”, Y Học TP.Hồ Chí Minh, tập 19 phụ bản
của số 5, tr. 157-164.
3. Dƣơng Hồng Tố Quyên, Nguyễn Thị Thu Hương, Lê Huỳnh Thi,
Nguyễn Minh Đức (2015), “Nghiên cứu tác dụng giải lo âu và chống
trầm cảm của cao chiết từ Sâm Việt Nam trồng trên chuột bị stress cô
lập”, Dược liệu, tập 20, số 6/2015 , tr. 378-383.
4. Duong Hong To Quyen, Nguyen Thai Minh Truc, Nguyen Thi Thu
Huong, Nguyen Minh Duc (2015), “Effect of cultivated Vietnamese
ginseng extract on endurance capacity in mice”, Journal of Medicinal
Materials , vol.20, No.3. pp 181-186.
5. Dƣơng Hồng Tố Quyên, Nguyễn Thị Thu Hương, Nguyễn Minh
Đức (2017), “Khảo sát tác dụng của các bột chiết từ Sâm Việt Nam
trồng trên sự rút ngắn giấc ngủ pentobarbital gây bởi stress cô lập”,
Dược liệu, 2 (22), tr.109-113.
6. Duong Hong To Quyen, Nguyen Thi Thu Huong, Nguyen Thuy
Viet Phuong, Nguyen Minh Duc (2017), “Hepatoprotective activity of
cultivated Vietnamese ginseng on oxidative stress-induced liver injury
in mice”, Journal of Medicinal Materials, vol.22, No.3. pp 183-189.
Tạp chí quốc tế
7. Quyen H T Duong, Phuong T V Nguyen, Huong T T Nguyen, Duc
M Nguyen (2016), “Effects of ocotillol-type saponins majonoside-R1
and vina-ginsenoside-R2 on abrogating depression and neuronal
oxidative stress in socially isolated depression mouse model”,
International Journal of Applied Research in Natural Products, Vol. 9
(2), pp. 27-32.


1
GIỚI THIỆU LUẬN ÁN
1. Đặt vấn đề
Sâm Việt Nam (Sâm Ngọc Linh, Sâm Khu 5, Sâm Đốt Trúc)
được tìm thấy ở vùng núi Ngọc Linh tỉnh Kon Tum vào năm 1973.
Đến năm 1985, tên khoa học được xác định là Panax vietnamensis Ha
et Grushv., họ Nhân Sâm (Araliaceae). Hiện nay, Sâm Việt Nam cũng
đã được lựa chọn là cây thuốc hàng đầu trong danh mục sản phẩm
quốc gia. Năm 2011, Bộ Y Tế đã triển khai xây dựng đề án: “Chương
trình quốc gia bảo tồn, phát triển nguồn dược liệu trong nước và các
sản phẩm từ dược liệu giai đoạn từ nay đến năm 2020 và tầm nhìn đến
2030. Xây dựng hồ sơ 40 dược liệu có tiềm năng khai thác và phát
triển thị trường”, trong đó cây Sâm Việt Nam được chọn đứng vị trí
đầu tiên trong danh sách. Sâm Việt Nam được thế giới biết đến như là
một loài Sâm mới và có giá trị cao. Hiện nay, Sâm Việt Nam được
trồng tại một số vùng đặc hữu như Kon Tum và Quảng Nam. Trên thị
trường Sâm Việt Nam thường bị giả mạo bởi những dược liệu khác, vì
vậy việc kiểm nghiệm đánh giá chất lượng Sâm Việt Nam là cần thiết.
Về mặt dược lý của Sâm Việt Nam mọc hoang có tác dụng tăng
lực, chống stress, bảo vệ gan, cải thiện trí nhớ, tăng cường miễn
dịch...Tuy nhiên, hiện nay nguồn Sâm sử dụng trên thị trường chủ yếu
là từ nguồn trồng trọt. Vì các lý do cần thiết trên tiến hành thực hiện đề
tài: “Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa và đánh giá một số tác dụng sinh học
của Sâm Việt Nam”. Đề tài được thực hiện với các mục tiêu nghiên
cứu:
1. Xây dựng và đánh giá quy trình định lượng đồng thời một số
saponin chính trong Sâm Việt Nam trồng bằng phương pháp
sắc ký lỏng ghép phổ khối (HPLC-MS) và phương pháp sắc ký
lỏng với detector dãy diod quang (HPLC–DAD).
2. Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn Sâm Việt Nam trồng.
3. Đánh giá một số tác dụng sinh học của Sâm Việt Nam trồng 6
tuổi
- Tác dụng tăng lực của Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi
- Tác dụng bảo vệ gan của Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi


2
- Tác dụng chống stress tâm lý của Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi
- Tác dụng chống stress tâm lý của saponin thuộc nhóm ocotillol:
Majonosid-R1, majonosid-R2, vinaginsenosid-R2.
2. Tính cấp thiết của đề tài
Theo Quyết định số 787/QĐ/TTg ngày 05/6/2017 của Thủ tướng chính
phủ, Sâm Việt Nam là sản phẩm thuộc chương trình phát triển sản
phẩm quốc gia đến năm 2020. Cho thấy vai trò cũng như hướng phát
triển của Sâm Việt Nam trong nước đang được quan tâm rất nhiều. Tuy
nhiên, gần đây sự phát hiện một thứ của cây Sâm này là Panax
vietnamensis var. Fuscidiscus mọc hoang tại Vân Nam thuộc Trung
Quốc, có hình thái giống Sâm Việt Nam. Loài Sâm này đã được đánh
giá bước đầu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao cho thấy
trong thành phần saponin có nhóm ocotillol như Sâm Việt Nam. Do
đó, vấn đề nghiên cứu tiêu chuẩn hóa và đánh giá một số tác dụng sinh
học của Sâm Việt Nam trồng (Sâm VN) là vấn đề cấp thiết, nhằm góp
phần xây dựng thương hiệu quốc gia về Sâm Việt Nam.
3. Những đóng góp mới của luận án
Luận án đã đạt được một số kết quả mới, đóng góp vào công
trình nghiên cứu cho Sâm VN :
- Có nhiều nghiên cứu đã công bố phương pháp định lượng đồng thời
nhiều ginsenosid trong Nhân Sâm, Sâm Tam thất, Sâm Mỹ. Nhưng chủ
yếu saponin thuộc nhóm protopanaxadiol, protopanaxatriol.
Đề tài lần đầu tiên công bố xây dựng phương pháp định lượng đồng
thời 5 saponin là Ginsenosid-Rg1, Ginsenosid-Rb1, Ginsenosid-Rd,
Majonosid-R2 (M-R2) và Vinaginsenosid-R2 (V-R2) bằng phương
pháp HPLC-Q-TOF-MS, trong đó có 02 saponin thuộc nhóm ocotillol
là M-R2 và V-R2 chỉ có trong Sâm VN mà không có trong Nhân Sâm.
- Đề tài đã xây dựng tiêu chuẩn Sâm VN với các chỉ tiêu yêu cầu theo
tiêu chuẩn Dược điển và có xây dựng thêm chỉ tiêu đánh giá như: Kim
loại nặng, xác định chất chiết được trong methanol 70%, xây dựng
quy trình định lượng đồng thời 05 saponin bằng phương pháp HPLC-


3
Q-TOF-MS là phương pháp hiện đại, nhanh, chính xác với độ tin cậy
cao và được sử dụng phổ biến trên thế giới.
- Đề tài lần đầu tiên công bố các kết quả đánh giá một số tác dụng sinh
học của Sâm VN 6 tuổi có so sánh đối chiếu với Nhân Sâm trồng 6
tuổi:
+ Các kết quả nghiên cứu cho thấy rằng Sâm VN 6 tuổi có tác dụng
tăng lực trên thử nghiệm chuột bơi kiệt sức Brekhman, tại liều 50
mg/kg Sâm VN có tác dụng tăng lực điển hình hơn Nhân Sâm (NS).
Tác dụng tăng lực của Sâm VN tương đương NS trên thử nghiệm bơi
điều chỉnh tốc độ dòng.
+ Sâm VN có tác dụng bảo gan khỏi tác nhân gây tổn thương gan bởi
CCl4, cyclophosphamid, ethanol.
+ Sâm VN có tác dụng chống stress tâm lý (tác dụng giải lo âu, chống
trầm cảm, chống stress oxy hóa não trên in vivo) tương đương NS.
- Đề tài lần đầu tiên đã công bố kết quả và so sánh tác dụng giải lo âu,
chống trầm cảm, chống stress oxy hóa tế bào não trên in vivo của MR1, M-R2 và V-R2; các saponin này giống nhau khung genin chỉ khác
nhau giữa các gốc đường và nhóm chức acetyl. Các saponin trên thuộc
nhóm ocotillol chỉ có trong Sâm VN với hàm lượng tương đối cao mà
không tìm thấy trong NS. Các thực nghiệm trước đây trên Sâm VN để
đánh giá tác dụng chống trầm cảm bởi stress tâm lý chỉ dựa trên thực
nghiệm bơi bắt buộc (FST). Bởi vì, thực nghiệm FST bị ảnh hưởng bởi
yếu tố hạ thân nhiệt do thực hiện trong môi trường nước, để có kết quả
tin cậy đề tài thực hiện trên cả hai thử nghiệm FST và treo đuôi chuột
(TST). Kết quả M-R1, M-R2 và V-R2 có tác dụng giải lo âu và chống
trầm cảm, chống stress oxy hóa trên não.
4. Bố cục luận luận án
Luận án gồm 2 quyển: 1 quyển luận án và 1 quyển phụ lục.
Quyển luận án: gồm có 1 trang Bìa, 1 trang Lời cam đoan và 11 trang
tài liệu tham khảo không đánh số, 8 trang đánh số La Mã bao gồm các
trang: Mục lục, Danh mục hình ảnh, bảng biểu và Ký hiệu viết tắt. Nội
dung luận án gồm 137 trang được đánh số tự nhiên (Ả Rập), mở đầu 2
trang, chương 1 tổng quan tài liệu 29 trang, chương 2 đối tượng và
phương pháp nghiên cứu 25 trang, chương 3 kết quả nghiên cứu 55


4
trang, chương 4 bàn luận 23 trang, kết luận 2 trang, kiến nghị 1 trang.
Luận án có 67 bảng, 20 hình, 146 tài liệu tham khảo, 18 tài liệu tham
khảo tiếng việt và 127 tài liệu tham khảo tiếng nước ngoài và 1 trang
web.
Quyển phụ lục: gồm có 9 phụ lục với 123 trang và 1 trang bìa phụ lục
không đánh số.

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan về chi Panax
Phân loại thực vật chi Panax: Hiện nay theo The Plant list có 13 loài
thuộc chi Panax được chấp nhận .
Thành phần hóa học các loài thuộc chi Panax: Gồm có đường, acid
béo, acid amin, nguyên tố đa và vi lượng, saponin phân 4 nhóm chính
là Protopanaxadiol (PPD), Protopanaxatriol (PPT), Ocotillol (OCT).
Ngoài ra còn có saponin cấu trúc acid oleanolic (OA), saponin có mạch
nhánh C-17, các saponin có khung không phổ biến khác.
Phương pháp xác định saponin trong loài thuộc chi Panax
Saponin được định lượng bằng phương pháp HPLC kết hợp với
detector là UV hay đầu dò tán xạ bay hơi (ELSD), DAD, detector phổ
khối tứ cực thời gian bay (HPLC- Q-TOF- MS).
Sự liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính chống oxy hóa của ginsenosid:
Chủ yếu liên quan đến phần đường trên khung genin.
Kiểm nghiệm Sâm thuộc chi panax theo chuyên luận Dược điển
Các chỉ tiêu phân tích kiểm nghiệm Sâm theo một số Dược điển như:
Châu âu (EP 8.0), Mỹ (USP 4.0, NF35), Nhật Bản (JP 17), Trung Quốc
(CP 2015), Hàn Quốc (KP X) và Dược điển Việt Nam V.
1.2. SÂM VIỆT NAM
Thực vật học
Sâm Việt Nam là cây thảo, sống lâu năm, cao 40-80 cm có khi tới 1 m.
Thân rễ nạc, mọc bò ngang, có nhiều đốt, không phân nhánh, dài 30-40
cm hay có thể dài hơn, có nhiều vết sẹo do thân khí sinh lụi hàng năm


5
để lại, mặt ngoài màu nâu nhạt, ruột trắng ngà, phần cuối là rễ củ hình
con quay.
Thành phần hóa học:
Cho đến nay từ phần trên mặt đất và phần dưới mặt đất đã phân lập
được 61 saponin. Ngoài ra nhiều thành phần khác trong Sâm VN đã
được nghiên cứu và xác định như thành phần acid amin, acid béo,
thành phần nguyên tố đa vi lượng và 7 polyacetylen.
Một số tác dụng sinh học của Sâm Việt Nam
Tác dụng chủ yếu của Sâm Việt Nam là tác dụng tăng lực, bảo vệ gan,
chống stress tâm lý, kích thích miễn dịch, giảm đường huyết, giảm
cholesterol….
Phương pháp định tính, định lượng saponin trong Sâm Việt Nam
Định tính bằng sắc ký lớp mỏng
Phương pháp định lượng saponin trong Sâm Việt Nam
Hiện nay, thường dùng phương pháp HPLC-DAD, HPLC-ELSD.


6
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1 . Đối tƣợng nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu
Bộ phận dưới mặt đất của Sâm Việt Nam trồng từ 2- 6 tuổi, thu hái vào
tháng 11/2012 tại Trạm Dược liệu Trà Linh thuộc Công ty Cổ phần
Dược phẩm Quảng Nam. Sau khi thu hái được rửa sạch và sấy khô;
mẫu Sâm VN 6 tuổi được dùng để xây dựng quy trình định lượng, tiêu
chuẩn hóa và chiết cao toàn phần thử tác dụng dược lý. Mẫu Sâm 2 - 5
năm tuổi dùng xác định hàm lượng một số saponin.
2.1.2. Chất đối chiếu
Các chất đối chiếu: Ginenosid-Rg1 số lô: GRg1. Ref .012011,
ginenosid-Rd số lô: GRd-001-0913, ginenosid-Rb1 số lô: GRb1. Ref.
012011. Majonosid-R2 số lô: Majo.Ref. 012012, vinaginsenosid-R2 số
lô: VR2. Ref. 012015. Các chất đối chiếu được cung cấp bởi Viện
Kiểm Nghiệm thuốc Tp.HCM.
2.1.3. Hóa chất dùng trong nghiên cứu
Các thuốc thử, dung môi, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu
chuẩn phân tích. Hóa chất dùng trong thử nghiệm dược lý: Carbon
tetrachlorid, cyclophosphamid monohydrat, ethanol. Thuốc thử ellman
[5,5′-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid)], thiobarbituric acid (TBA), natri
pentobarbital. Hóa chất định lượng: AST, ALT. Thuốc đối chiếu:
Diazepam 5 mg, fluoxetin, silymarin.
2.1.4. Động vật thử nghiệm
Chuột nhắt trắng đực khỏe mạnh chủng Swiss albino trọng lượng 20 ±
2 g được cung cấp bởi Viện Vaccin và Sinh phẩm Y Tế Nha Trang.
2.1.5. Thiết bị dùng trong nghiên cứu
Hệ thống HPLC 1290 của Agilent (USA), cột phân tích cột Zorbax
Eclipse Plus (150 x 4,6 mm, 3,5µm). Bộ tiêm tự động cho HPLC của
Agilent. Tất cả các dữ liệu được ghi và xử lý bằng phần mềm
masshunter. Hệ thống phổ khối phân giải cao 6500 series Q-TOF-MS
(Agilent). Hệ thống HPLC 1200 của agilent (USA) bao gồm: cột phân
tích Phenomenex gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 μm) và detector DAD.
Tất cả các dữ liệu được ghi và xử lý trên phần mềm chemstation.


7
Ngoài ra còn có thêm một số thiết bị nghiên cứu khác.
2.1.6. Nơi thực hiện đề tài
Khoa Dược, Đại học Y Dược Tp.HCM: Ban Nghiên cứu Khoa học –
Thư viện. Thử nghiệm dược lý được tiến hành tại Trung tâm Sâm và
Dược liệu Tp. HCM. Phòng phân tích thí nghiệm hóa phân tích, bộ
môn di truyền – Đại học Khoa học tự nhiên.
2.2 . Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Xây dựng và đánh giá quy trình định lượng đồng thời một số
saponin trong Sâm Việt Nam trồng
- Xây dựng và đánh giá quy trình định lượng đồng thời một số saponin
bằng hai phương pháp HPLC-MS và HPLC-DAD: Khảo sát điều kiện
thông số HPLC-MS và HPLC-DAD, khảo sát điều kiện chiết xuất
mẫu.
2.2.2. Xây dựng tiêu chuẩn Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi
- Nghiên cứu thực vật. Mô tả bằng cảm quan mô tả chi tiết bộ phận
dùng (hình dạng, màu sắc, đặc điểm riêng biệt). Nghiên cứu đặc điểm
vi học: Cắt và làm tiêu bản vi phẫu, soi bột thân rễ và rễ, mô tả và chụp
ảnh.
- Định tính: Phương pháp sắc ký lớp mỏng
- Định lượng: Định lượng đồng thời 05 saponin (G-Rg1, G-Rb1, G-Rd,
M-R2 và V-R2) bằng phương pháp HPLC-Q-TOF-MS.
- Thử tinh khiết: Các chỉ tiêu thử tinh khiết được tiến hành theo DĐVN
V: Độ ẩm (Phụ lục 9.6), tro toàn phần (phụ lục 9.8), t lệ vụn nát (phụ
lục 12.12), tạp chất (phụ lục 12.11), giới hạn kim loại nặng.
2.2.4. Đánh giá tác dụng sinh học của Sâm Việt Nam trồng
2.2.4.1. Chiết xuất cao toàn phần, saponin toàn phần từ Sâm Việt Nam
trồng 6 tuổi
Chiết xuất cao toàn phần bằng phương pháp ngấm kiệt với cồn 45%,
cô thu hồi dung môi, phần dịch chiết còn lại đem đông khô. Kiểm
nghiệm cao toàn phần gồm một số chỉ tiêu: Cảm quan, định tính, định
lượng.
Chiết xuất saponin toàn phần từ Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi bằng
phương pháp Diaion HP-20. Rửa giải lần lượt với nước, methanol,


8
cloroform. Thu phân đoạn methanol cô thu hồi dung môi, dịch chiết
còn lại đem đông khô thu được saponin toàn phần.
2.2.4.2. Khảo sát độc tính cấp
Dựa vào thể tích tối đa có thể cho uống trên chuột nhắt trắng uống với
thể tích 20 ml/kg thể trọng bằng kim đầu tù chuyên dụng.
2.2.4.3. Tác dụng tăng lực
- Tiến hành trên 02 thử nghiệm: Thử nghiệm chuột bơi kiệt sức
Brekhman và thử nghiệm bơi trong bể bơi có thể điều chỉnh tốc độ
dòng. Liều thử nghiệm của mẫu là 10 mg/kg, 50 mg/kg, 100 mg/kg.
2.2.4.4. Tác dụng bảo vệ gan của Sâm Việt Nam trồng trên in vitro
Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao toàn phần, saponin toàn
phần và một số saponin nhóm ocotillol từ Sâm VN 6 tuổi trên tế bào
Hep G2. Thử nghiệm khả năng kháng oxy hóa nội bào được xác định
dựa vào nguyên tắc hoạt động của 2’,7’- dichlorodihydrofluorescein
diacetate (DCFH-DA).
2.2.4.5. Tác dụng bảo vệ gan của Sâm Việt Nam trồng trên in vivo
Tác dụng của Sâm VN trên thực nghiệm gây tổn thương gan bằng
carbon tetraclorid, cyclophosphamid, ethanol.
Các chỉ tiêu đánh giá: AST, ALT trong huyết thanh, hàm lượng MDA,
GSH trong gan.
2.2.4.6. Tác dụng chống stress tâm lý của Sâm Việt Nam trồng
- Thực nghiệm gây stress cô lập: Tiến hành nuôi cô lập mỗi chuồng 1
con riêng biệt không tiếp xúc với nhau, kích thước chuồng 22 x 34 x
25 cm. Mỗi chuồng sẽ được ngăn cách nhau bằng tấm carton để chặn
sự nhìn thấy nhau giữa các chuột. Mục tiêu của thử nghiệm để đánh giá
thời gian chuột bị stress do cô lập, chỉ tiêu đánh giá dựa vào mức độ
hồi phục giấc ngủ pentobarbital bị rút ngắn do stress.
- Khảo sát tác dụng của Sâm VN trên sự rút ngắn giấc ngủ
pentobarbital gây bởi stress cô lập
- Tác dụng giải lo âu và chống trầm cảm của Sâm VN
+ Thực nghiệm hộp sáng tối (Light-dark box test) để đánh giá tác dụng
giải lo âu.
+ Thực nghiệm FST để đánh giá tác dụng chống trầm cảm .
2.2.4.7.Tác dụng của M-R1, MR2, V-R2 trên sự giảm lo âu, chống


9
trầm cảm và stress oxy hóa tế bào não gây ra bởi stress cô lập trên
chuột nhắt trắng
- Thực nghiệm hộp sáng tối đánh giá tác dụng giải lo âu
- Thực nghiệm FST và TST đánh giá tác dụng chống trầm cảm
- Xác định hàm lượng MDA và GSH trong não chuột

Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1 Xây dựng và đánh giá quy trình định lƣợng đồng thời một số
saponin trong Sâm Việt Nam trồng
3.1.1. Xây dựng và đánh giá quy trình định lượng saponin bằng
phương pháp HPLC-MS
3.1.1.1. Xây dựng quy trình định lượng
Khảo sát điều kiện HPLC
Điều kiện tối ưu sau quá trình khảo sát được lựa chọn:
Hệ thống sắc ký: Agilent HPLC 1290 kết hợp hệ thống phổ khối phân
giải cao 6500 series Q-TOF.
Pha tĩnh: Cột Zorbax Eclipse Plus (150 x 4,6 mm, 3,5µm).
Pha động: Kênh A là H2O chứa 0,1 % acid formic, kênh B là
acetonitril chứa 0,1 % acid formic theo chương trình sau:
0 - 15 phút (80 % A : 20% B), 15 -17 phút (20% A : 80% B), 17- 19
phút (5% A : 95% B), 19,1 - 25 phút (80% A : 20% B).
Thể tích mẫu tiêm: 10 µl. Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút.
Nhiệt độ cột: 40 oC.


10
Thông số đầu dò phổ khối
Đề tài dùng chế độ Scan với phần mềm Data Acquisition, dữ liệu MS
được ghi với chế độ ion dương và khoảng m/z từ 400-1700 Dalton.
Bảng 3.7. Thông số của detector phổ khối định lượng saponin
Buồng ion hóa

Thông

Bộ cô lập khối

Thông số

số
Gas temp (oC)

300

Fragmentor

140

Gas flow (l/min)

10

Skimmer 1

65

Nebulizer (psig)

35

OctopoleRFPeak

650

SheathGastemp

300

SheathGasFlow

12

Vcap

3500

Nozzle voltage (V)

400

Nhận diện saponin trong mẫu thử và chuẩn bằng MS
Bảng 3.8. Kết quả HPLC-MS nhận dạng ion của 5 saponin đối chiếu
Saponin

Công thức

Rt (phút)

Ion phân tử (m/z) (Da)

G-Rg1

C42H72O14

13,681

823,4722

M-R2

C41H70O14

13,834

809,4562

V-R2

C43H72O15

15,205

851,4677

G-Rb1

C54H92O23

17,365

1131,5931

G-Rd
C48H82O18
18,534
969,5391
Khảo sát điều kiện chiết mẫu
Kết quả lựa chọn điều kiện chiết xuất để thu được 05 saponin với hàm
lượng cao: Phương pháp siêu âm, dung môi MeOH 70%, thời gian
chiết 30 phút, nhiệt độ 25 oC.


11
3.1.1.2.Đánh giá quy trình định lượng saponin bằng phương pháp
HPLC-MS
Tính tương thích hệ thống: Độ lệch chuẩn tương đối của t lệ tín hiệu
diện tích pic trên nồng độ chất chuẩn qua sáu lần tiêm liên tiếp có giá
trị RSD < 2 %. Do đó qui trình đạt tính tương thích hệ thống.
Tính đặc hiệu: Dữ liệu phổ MS xác định tất cả 05 saponin cần định
lượng có chỉ số IP > 4, phương pháp định lượng có tính đặc hiệu.
Tính tuyến tính: có sự tương quan giữa nồng độ và diện tích pic trong
khoảng tuyến tính (0,05-50 μg/ml), riêng G-Rb1 có khoảng tuyến tính
(0,1-50 μg/ml), các hệ số tương quan R2 ≥ 0,9995.
Độ lặp lại: Kết quả độ lặp lại trong ngày có % RSD < 5%
Độ đúng: Các giá trị hiệu suất thu hồi và hiệu suất thu hồi trung bình
đều nằm trong tiêu chuẩn chấp nhận 80 - 110 % , qui trình đạt yêu cầu
về độ đúng.
Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của saponin
Bảng 3.24. Giới hạn phát hiện và định lượng bằng HPLC-MS
Saponin (ng/ml)
Giới hạn
G-Rg1
M-R2
V-R2
G-Rb1
G-Rd
LOD
0,582
3,209
3,307
0,306
0,234
LOQ
1,940
10,697
11,023
1,018
0,778
Ứng dụng phƣơng pháp LC- MS để định lƣợng saponin trong mẫu
Sâm Việt Nam trồng 2 -6 năm tuổi.
Hàm lượng G-Rg1, M-R2, V-R2, G-Rb1 và G-Rd tăng dần theo độ
tuổi. Ginsenosid–Rb1, M-R2 đạt hàm lượng cao vào năm thứ 6. Tổng
hàm lượng saponin tăng dần theo độ tuổi với hàm lượng cao nhất ở
năm thứ 6.
3.1.2. Xây dựng và đánh giá quy trình định lượng saponin trong Sâm
Việt Nam trồng bằng phương háp HPLC-DAD
3.1.2.1. Xây dựng quy trình định lượng saponin bằng phương háp
HPLC- DAD
Khảo sát một số thông số HPLC
Máy: Agilent HPLC 1200
Detector: Bước sóng 196 nm, nhiệt độ cột: 40 °C
Cột: Phenomenex Gemini 5u C18 110A (250 × 4,6 nm, 5 µm)


12
Thể tích tiêm mẫu: 10 µl, tốc độ dòng: 1 ml/phút.
Đề tài thăm dò một số điều kiện sắc ký tìm điều kiện tối ưu:
Điều kiện 3: 0 –1 phút (80 % A : 20 % B), 1 - 3 phút (68 % A : 32 %
B), 3 - 12 phút (68 % A : 32 % B), 12 - 17 phút (55 % A : 45 % B), 17
- 20 phút (50 % A: 50% B), 20 - 24 phút (10 % A: 90% B), 24-24,1
phút (0 % A: 100 % B), 24,1-28 phút (0% A : 100 % B), 28-28,1 phút (
80 % A : 20 % B), 28,1 - 35 phút (80 % A : 20 % B).
Thăm dò điều kiện chiết mẫu
Kết quả lựa chọn điều kiện chiết xuất để thu được 05 saponin với hàm
lượng cao: Chiết bằng phương pháp siêu âm, dung môi MeOH 70%,
thời gian chiết 30 phút, nhiệt độ 25 oC.
3.1.2.2. Đánh giá quy trình định lượng saponin bằng phương pháp
HPLC-DAD
Tính tương thích hệ thống
Các thông số thời gian gian lưu (Rt) và diện tích đỉnh (S) đều có %
RSD < 2 %, hệ số kéo đuôi nằm trong khoảng 0,8 - 1,5, các pic có độ
phân giải Rs ≥ 1,5. Như vậy quy trình định lượng đạt tính tương thích
hệ thống.
Tính đặc hiệu
Sắc ký đồ thể hiện đạt độ tinh khiết pic, thời gian lưu của các pic trong
mẫu chuẩn và mẫu thử tương đương nhau. Mẫu trắng không có tín hiệu
trùng với thời gian lưu của các pic quan tâm. Khi thêm chuẩn vào dung
dịch thử, diện tích đỉnh của mẫu thử tăng lên. Quy trình đáp ứng các
yêu cầu về tính đặc hiệu của quy trình định lượng.
Tính tuyến tính
Kết quả có sự tương quan giữa nồng độ và diện tích pic trong khoảng
tuyến tính, giá trị của hệ số tương quan 0,9995 ≤ R2 ≤ 0,9999.
Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
LOD của G-Rd thấp nhất 2,9 µg/ml, M-R2 cao nhất là 63 µg/ml.
LOQ của G-Rd là 8,6 µg/ml, M-R2 cao nhất là 190 µg/ml.


13
Độ lặp lại của phương pháp HPLC-DAD
Độ lặp lại trong ngày: Kết quả định lượng 6 mẫu thử độc lập cho hàm
lượng G-Rg1, G-Rb1, G-Rd, M-R2 có % RSD < 2%. Do đó quy trình
định lượng đạt yêu cầu về độ lặp lại.
Độ lặp lại liên ngày: Kết quả định lượng 3 mẫu thử độc lập, lặp lại 3
ngày khác nhau, hàm lượng G-Rg1, G-Rb1, G-Rd, M-R2 có % RSD <
5%. Do đó, quy trình định lượng đạt yêu cầu về độ lặp lại.
Độ đúng của phương pháp định lượng saponin bằng HPLC-DAD
Kết quả có t lệ phục hồi của các ginsenosid trong thực nghiệm trong
giới hạn cho phép của t lệ phục hồi lý thuyết của các chất phân tích
(90-107 %).
3.2. Xây dựng tiêu chuẩn Sâm Việt Nam trồng
Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở Sâm Việt Nam trồng gồm có một số chỉ
tiêu: Vi phẫu, soi bột, thử tinh khiết (độ ẩm, tro toàn phần, giới hạn
kim loại nặng), định tính, định lượng bằng phương pháp HPLC-QTOF-MS.
3.3. Đánh giá một số tác dụng sinh học của Sâm Việt Nam trồng 6
tuổi
4.3.1. Chiết xuất cao toàn phần, saponin toàn phần
Chiết xuất cao toàn phần: Kết quả từ 300 g nguyên liệu có độ ẩm 7,56
% bằng phương pháp chiết ngấm kiệt thu được 150,6 g cao, hiệu suất
(54,32 %).Hàm lượng một số saponin trong cao toàn phần SÂM VNT:
G-Rg1 (102,2 mg/g), G-Rb1 (35,1 mg/g), G-Rd (36,4 mg/g), M-R2
(73,9 mg/g), V-R2 (0,5 mg/g).
Chiết xuất saponin toàn phần
Kết quả từ 50 g cao toàn phần có độ ẩm 4,45% thu được 14,86 g
saponin toàn phần với độ ẩm 3,48%, hiệu suất (30,02%).
3.3.2. Kết quả khảo sát độc tính cấp
Không ghi nhận phân suất tử vong ở liều cao tối đa có thể cho chuột
uống Dmax là 48,5 g/kg, thể tích uống 20 ml/kg trọng lượng chuột.
3.3.3. Khảo sát tác dụng tăng lực của Sâm Việt Nam trồng
3.3.3.1. Ảnh hưởng của cao Sâm Việt Nam trồng trong thực nghiệm
chuột bơi kiệt sức Brekhman


14
Kết quả cho thấy tại thời điểm T60, T7, T14: Các lô chuột uống cao Sâm
VN hay cao NS liều 10 mg/kg, 50 mg/kg và 100 mg/kg làm tăng phần
trăm thời bơi có ý nghĩa thống kê so với lô chứng nước cất (p<0,05).
Lô chuột uống cao Sâm VN liều 50 mg/kg sau 7 ngày lặp lại có thời
gian bơi tăng 63% đạt ý nghĩa thống kê so với lô uống cao NS liều 50
mg/kg (p<0,05).
3.3.3.2. Ảnh hưởng của cao Sâm Việt Nam trồng trong thực nghiệm
chuột bơi trong bể bơi có thể điều chỉnh tốc độ dòng
Kết quả cho thấy, tại thời điểm T60, T7, T14: Các lô chuột uống cao Sâm
VN hay cao NS liều 10 mg/kg, 50 mg/kg và 100 mg/kg làm tăng phần
trăm thời bơi có ý nghĩa thống kê so với lô chứng nước cất (p<0,01).
Tác dụng của Sâm VN tương đương NS.
3.3.4. Tác dụng bảo vệ gan của Sâm Việt Nam trồng
3.3.4.1.Tác dụng chống oxy hóa của SâmVN trên in vitro
Kết quả cho thấy cao Sâm VN, cao NS cũng như thành phần saponin
thuộc nhóm ocotillol (M-R1,M-R2,V-R2) thể hiện hoạt tính chống oxy
hóa thấp. Do đó chưa đủ dữ liệu để tính được nồng độ kháng oxy hóa
50% (EC50). Saponin toàn phần thể hiện phần trăm giảm ROS của Sâm
VN là 79,91% và NS là 50,58%; tính toán trên phần mềm Graphpad
prism 7.00, xác định EC50 của saponin Sâm VN là 2,381 ± 0,39
(mg/ml) và của saponin NS là 5,031 ± 1,81 (mg/ml).
3.3.4.2. Tác dụng của Sâm Việt Nam trồng trên thực nghiệm gây tổn
thương gan bằng carbon tetraclorid
Tác dụng cao Sâm Việt Nam trồng trên chỉ số AST, ALT trong
huyết tƣơng
Kết quả trên nhóm CCl4 (-): Lô chuột uống cao Sâm VN, cao NS liều
100 mg/kg, 200 mg/kg, saponin Sâm VN hay saponin NST liều 50
mg/kg, cũng như silymarin liều 100 mg/kg có AST, ALT không thay
đổi có nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý.
Nhóm CCl4 (+): Lô chứng bệnh lý có hoạt độ AST tăng 115% (p<0,05)
và ALT tăng 136,7% (p<0,001) đạt ý nghĩa thống kê so với nhóm
chứng sinh lý. Điều này chứng tỏ chuột bị tổn thương gan khi tiêm
CCl4 liều 1 ml/kg. Lô chuột uống cao Sâm VN, cao NS liều 100
mg/kg, 200 mg/kg, saponin Sâm VN hay saponin NS liều 50 mg/kg,


15
cũng như silymarin liều 100 mg/kg có hoạt độ enzym AST, ALT giảm
có nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý.
Ảnh hƣởng cao Sâm VN trên hàm lƣợng MDA và GSH
Kết quả cho thấy nhóm chuột không tiêm CCl4: Hàm lượng MDA,
GSH trong gan chuột của lô uống silymarin và các lô uống cao toàn
phần, không thay đổi đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý.
Nhóm CCl4 (+): hàm lượng MDA trong gan của lô chứng tiêm CCl4
tăng 96% đạt ý nghĩa thống kê (p<0,001) so với lô chứng không tiêm
CCl4 (p< 0,001), chứng tỏ CCl4 liều 1 ml/kg gây tổn thương oxy hóa
trên gan chuột. Hàm lượng MDA trong gan của lô uống cao Sâm VN
liều 200 mg/kg giảm 43% (p<0,05), cao NST giảm 36% và lô uống
silymarin liều 100 mg/kg giảm 32% (p<0,05) so với lô chứng bệnh lý.
Lô uống cao Sâm VN, cao NS liều 100 mg/kg và saponin Sâm VN
hay saponin NS liều 50 mg/kg, có hàm lượng MDA thay đổi không đạt
ý nghĩa thống kê.
Hàm lượng GSH trong gan chuột của lô chứng bệnh lý giảm 22% đạt ý
nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý (p < 0,001), chứng tỏ CCl4 liều
1 ml/kg gây tổn thương oxy hóa trên gan chuột. Hàm lượng GSH trong
gan của lô uống cao Sâm VN liều 200 mg/kg tăng 44,8% (p<0,05) so
với lô chứng. Lô uống cao NS liều 200mg/ kg tăng 37% (p<0,05),
saponin Sâm VN hoặc NS liều 100 mg/kg có hàm lượng GSH tăng
24,7% (p<0,05), 23% (p<0,05) tương ứng so với lô chứng. Cao Sâm
VN liều 100 mg/kg hay silymrarin 100 mg/kg làm tăng hàm lượng
GSH đạt ý nghĩa thống kê 23% (p<0,05), 38% (p<0,05) tương ứng so
với lô chứng bệnh lý. Lô uống cao NS liều 100 mg/kg chưa có sự thay
đổi đạt ý nghĩa thống kê. Tác dụng bảo vệ gan theo hướng chống oxy
hóa của cao toàn phần liều 100 mg/kg trên cao Sâm VN điển hình hơn
cao NS.
3.3.4.3. Khảo sát tác dụng của Sâm Việt Nam trồng trên thực nghiệm
gây tổn thương gan cấp bằng cyclophosphamid
Kết quả xác định hàm lượng MDA và GSH trong gan chuột trên thực
nghiệm cyclophosphamid:
Kết quả cho thấy nhóm chuột không tiêm cyclophosphamid có hàm
lượng MDA và GSH của lô uống cao Sâm VN liều 100 mg/kg, 200


16
mg/kg, silymarin liều 100 mg/kg trong 8 ngày chưa có thay đổi đạt ý
nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý. Lô uống cao Sâm VN liều
100mg/kg, 200 mg/kg Sâm hay silymarin liều 100 mg/kg chưa có ảnh
hưởng lên hàm lượng MDA, GSH trong gan.
Nhóm CY (+): Hàm lượng MDA của lô chứng bệnh lý tăng đạt ý nghĩa
thống kê (p<0,001) so với lô chứng sinh lý, hàm lượng GSH của lô
chứng bệnh lý giảm đạt ý nghĩa thống kê (p<0,001) so với lô chứng
sinh lý. Chứng tỏ cyclophosphamid liều duy nhất 150 mg/kg gây tổn
thương oxy hóa trên gan.
Hàm lượng MDA của lô uống cao Sâm VN hay cao NS liều 100 mg/kg
trong 8 ngày giảm nhưng không đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng
bệnh lý (p=0,073). Hàm lượng MDA của lô uống cao Sâm VN hay cao
NS liều 200 mg/kg, silymarin liều 100 mg/kg trong 8 ngày giảm hàm
lượng MDA, đồng thời làm tăng hàm lượng GSH đạt ý nghĩa thống kê
so với lô chứng bệnh lý (p<0,001). Cho thấy Sâm VN và NS (liều 200
mg/kg), silymarin liều 100 mg/kg thể hiện tác dụng ức chế quá trình
peroxy hóa lipid tế bào gan, có tác dụng bảo vệ gan.
3.3.4.4 Tác dụng của Sâm Việt Nam trên thực nghiệm gây tổn
thương gan mạn bằng ethanol
Kết quả khảo sát hàm lượng AST, ALT trong huyết tương vào tuần 8
Kết quả từ cho thấy trên nhóm chuột không uống ethanol: Lô chuột
uống cao Sâm VN, cao NS liều 100 mg/kg, 200 mg/kg, silymarin liều
100 mg/kg có hoạt độ enzym AST, ALT không khác biệt có nghĩa
thống kê so với lô chứng sinh lý.
Nhóm EtOH (+): Nhóm chứng bệnh lý có hoạt độ AST tăng 56,6%
(p<0,01) đạt ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng sinh lý. Chỉ số ALT
của nhóm chứng bệnh lý không khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô
chứng sinh lý.
Điều trị với cao Sâm VN hoặc cao NS liều 200 mg/kg thì hoạt độ AST
giảm 32,5%, 33,9% đạt ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với lô chứng
bệnh lý. Lô uống cao Sâm VN, cao NS cũng như silymarin liều 100
mg/kg có hoạt độ AST giảm 34,5%,31,7%, 32,9% tương ứng
(p<0,050) so với lô chứng bệnh lý.


17
Hoạt độ ALT của các lô điều trị không có sự khác biệt có ý nghĩa
thống kê so với lô chứng bệnh lý.
Kết quả hàm lƣợng MDA, GSH trong gan chuột sau 8 tuần
Kết quả cho thấy nhóm EtOH(-): Các lô chuột uống mẫu thử có hàm
lượng MDA và GSH không có sự khác biệt đạt nghĩa thống kê so với
lô chứng sinh lý.
Nhóm EtOH (+): Lô chứng bệnh lý có hàm lượng MDA tăng 38,6% và
hàm lượng GSH giảm 19% đạt ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nhóm
chứng sinh lý.
Lô uống cao Sâm VN hoặc cao NS liều 200 mg/kg có hàm lượng
MDA giảm 35,1%, 33,6% đạt ý nghĩa thống kê (p<0,01) so với lô
chứng uống nước cất. Lô uống cao Sâm VN, cao NS cũng như
silymarin liều 100 mg/kg có hàm lượng MDA giảm 44%, 44,3%, 46%
đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý.
Lô uống cao Sâm VN hoặc cao NS liều 200 mg/kg có hàm lượng GSH
tăng 51,8%, 24,4% (p<0,01) so với lô chứng uống nước cất. Lô uống
cao Sâm VN, cao NS cũng như silymarin liều 100 mg/kg có hàm lượng
GSH tăng 40%, 26,8%, 27,1% tương ứng đạt ý nghĩa thống kê so với
lô chứng bệnh lý.
Lô điều trị với cao Sâm VN hay cao NS liều 100 mg/kg, 200 mg/kg
cũng như silymarin liều 100 mg/kg, hàm lượng MDA và GSH không
có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê giữa các nhóm với nhau.
3.3.5. Tác dụng chống stress tâm lý
3.3.5.1. Mô hình gây stress cô lập
Kết quả từ cho thấy trên nhóm chuột nuôi chung: Thời gian ngủ giữa
các tuần so với nhau và so sánh với ngày đầu thì không có khác biệt có
ý nghĩa thống kê (p> 0,05).
Nhóm nuôi cô lập: Sau 4 tuần nuôi cô lập thì giấc ngủ gây bởi
pentobarbitral rút ngắn nhiều nhất (p< 0,05); chứng tỏ sau 4 tuần nuôi
cô lập chuột có dấu hiệu bị stress.


18
3.3.5.2. Khảo sát tác dụng của cao Sâm Việt Nam trồng trên sự rút
ngắn giấc ngủ pentobarbital gây bởi stress cô lập
Nhóm nuôi chung: Lô chứng sinh lý và mẫu thử có thời gian ngủ gây
bởi pentobarbital không khác biệt có ý nghĩa thống kê.
Nhóm nuôi cô lập: Lô chứng bệnh lý có giấc ngủ gây ra bởi
pentobarbital rút ngắn (29,9 %, p<0,05) so với nhóm chứng sinh lý .
Điều trị với cao Sâm VN ở các liều 50, 100, 200 mg/kg kéo dài thời
gian ngủ gây bởi pentobarbital tương ứng 60,6 % (p<0, 01), 114,8 %
(p<0,05) và 32 % (p<0,05) đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh
lý. Điều trị với cao NS liều 100, 200 mg/kg chưa thể hiện tác dụng hồi
phục giấc ngủ pentobarbital đạt ý nghĩa thống kê (p>0,05) so với lô
chứng bệnh lý. Chỉ có cao NS liều 50 mg/kg kéo dài thời gian ngủ
pentobarbital 61,7% đạt ý nghĩa thống kê với p<0,05 so với lô chứng
bệnh lý.
3.3.5.3. Khảo sát tác dụng giải lo âu và chống trầm cảm của cao
toàn phần Sâm Việt Nam trồng
Tác dụng giải lo âu của cao Sâm Việt Nam trồng liều duy nhất
Số liệu cho thấy trên nhóm chuột nuôi chung: Chuột uống mẫu thử liều
duy nhất có số lần ra sáng cũng như thời gian ra sáng chưa có sự khác
biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý.
Nhóm chuột nuôi cô lập: Lô uống nước cất, mẫu thử có số lần ra sáng
chưa có khác biệt đạt nghĩa thống kê so với lô chứng nuôi chứng bệnh
lý.
Nhóm chuột cô lập : Lô chứng bệnh lý có thời gian ở ngăn sáng giảm
đạt ý nghĩa thống kê 63,5% (p < 0,05) so với lô chứng sinh lý. Cho
thấy chuột nuôi cô lập sau 4 tuần có biểu hiện lo âu. Lô uống cao Sâm
VN liều duy nhất 200 mg/kg, 500 mg/kg làm tăng thời gian ở ngăn
sáng 100,8% (p < 0,05), 197,6% (p < 0,001) so với lô chứng stress cô
lập đạt ý nghĩa thống kê. Lô uống cao NS liều duy nhất 200 mg/kg làm
tăng thời gian ở ngăn sáng 122% (p < 0,05) đạt ý nghĩa thống kê so với
lô chứng bệnh lý; Lô uống cao NS liều duy nhất 500 mg/kg chưa làm
tăng thời gian ra sáng đạt ý nghĩa thống kê. Diazepam liều 0,5 mg/kg
làm tăng thời gian ra sáng 102,4% (p < 0,05) so với lô chứng bệnh lý.
Tác dụng giải lo âu của cao Sâm VN sau 7 ngày điều trị lặp lại


19
Kết quả nhóm nuôi chung: Các lô uống mẫu thử lặp lại trong 7 ngày
liên tục chưa ảnh hưởng đến số lần ra sáng và thời gian ở ngăn sáng có
ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý.
Nhóm nuôi cô lập: Lô chứng bệnh lý có thời gian ở ngăn sáng giảm
75,5% đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý. Cho thấy chuột
nuôi cô lập sau 4 tuần có biểu hiện lo âu. Điều trị với cao Sâm VN liều
50, 100 mg/kg hay cao NS liều 50 mg/kg, 100 mg/kg, 200 mg/kg lặp
lại 7 ngày làm tăng số lần di chuyển giữa hai ngăn sáng tối (p < 0,05)
so với lô chứng bệnh lý. Cao Sâm VN liều 200 mg/kg có số lần di
chuyển chưa có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) so với lô
chứng bệnh lý.
Lô uống cao Sâm VN liều 50 mg/kg, 100 mg/kg, 200 mg/kg lặp lại 7
ngày liên tục làm tăng thời gian ở ngăn sáng 655%, 619% , 545% đạt ý
nghĩa thống tương ứng với p < 0,001 so với lô chứng bệnh lý. Cao NS
liều 50 mg/kg, 100 mg/kg, 200 mg/kg làm tăng số lần ra sáng 431%,
485%, 607% đạt ý nghĩa tương ứng với p < 0,001 so với lô chứng bệnh
lý. Diazepam 0,5 mg/kg liều duy nhất làm tăng thời gian ra sáng
102,4% (p < 0,05) so với lô chứng bệnh lý trong cùng thời điểm thí
nghiệm.
Tác dụng chống trầm cảm của cao Sâm VN dùng liều duy nhất
Nhóm nuôi chung: Các lô uống mẫu thử một liều duy nhất không thay
đổi thời gian bất động trên chuột có ý nghĩa thống kê so với lô chứng
sinh lý.
Nhóm nuôi cô lập: Lô chứng bệnh lý có thời gian bất động tăng 64%
(p<0,01) so với lô chứng sinh lý. Cho thấy chuột bị nuôi cô lập sau 4
tuần có biểu hiện bị trầm cảm. Điều trị với cao Sâm VN liều duy nhất
200 mg/kg, 500 mg/kg làm giảm thời gian bất động 42,6%, 55%
(p<0,01) tương ứng so với lô chứng bệnh lý. Cao NS liều duy nhất 200
mg/kg, 500 mg/kg làm giảm thời gian bất động 50,6%, 44% tương ứng
(p<0,01) so với nhóm chứng bệnh lý. Fuoxetin 20 mg/kg liều duy nhất
chưa làm giảm thời bất động trên chuột có ý nghĩa thống kê (p>0,05)
so với lô chứng bệnh lý.


20
Tác dụng chống trầm cảm của cao Sâm VN dùng liều lặp lại 7 ngày
và 14 ngày
Kết quả cho thấy nhóm chuột nuôi chung: Các lô uống mẫu thử lặp lại
trong 7 hoặc 14 ngày đều không làm thay đổi thời gian bất động có ý
nghĩa thống kê so với nhóm chứng sinh lý.
Nhóm nuôi cô lập: Lô chứng bệnh lý sau 7 ngày và 14 ngày đều làm
tăng thời gian bất động 89,8%, 74% có ý nghĩa thống kê (p<0,01,
p<0,001 tương ứng) so với lô chứng sinh lý. Cho thấy chuột bị nuôi cô
lập sau 4 tuần có biểu hiện bị trầm cảm.
Sau 7 ngày, điều trị với cao Sâm VN liều 50 mg/kg, 100 mg/kg, 200
mg/kg làm giảm thời gian bất động đạt ý nghĩa thống kê 58,5% (p <
0,001), 40,4% (p < 0,01), 48,9% (p < 0,01) tương ứng so với lô chứng
bệnh lý. Trong khi đó, điều trị với cao NS liều 200 mg/kg chưa giảm
thời gian gian bất động trên chuột (p > 0,05). Cao NS liều 50, 100
mg/kg và fluoxetin (20 mg/kg) làm giảm thời gian bất động 30,6% (p <
0,05), 46,6% (p < 0,01) và 45% (p < 0,01) với lô bệnh lý.
Sau 14 ngày điều trị, cao Sâm VN liều 50, 100 mg/kg làm giảm thời
gian bất động trên chuột 48,5%, 40,6% tương ứng đạt ý nghĩa thống kê
với. Điều trị với cao Sâm VN liều 200 mg/kg, fluoxetin liều 20 mg/kg
làm giảm thời gian bất động trên chuột 53,5% , 39,8% (p < 0,001) so
với lô chứng bệnh lý. Cao Sâm VN liều 50, 100 mg/kg làm giảm thời
gian bất động trên chuột 48,5%, 40,6% tương ứng với p < 0,001. Điều
trị với cao NS liều (50, 100, 200 mg/kg) làm giảm thời gian bất động
trên chuột 45,6%, 42,5%, 42,9% tương ứng với p< 0,001 so với lô
chứng bệnh lý.
3.3.5.4. Khảo sát ảnh hƣởng của majonosid R1 và vinaginsenosid
R2 trên sự giảm lo âu, trầm cảm và stress oxy hóa trong não gây
ra bởi stress cô lập trên chuột nhắt trắng
Tác dụng giải lo âu của majonosid-R1, vinaginsenosid-R2
Nhóm chuột nuôi chung: Các lô chuột uống mẫu thử không thay đổi số
lần ra sáng và thời gian ra sáng so với lô chứng sinh lý.
Nhóm chuột nuôi cô lập: Lô chứng sinh lý có thời gian ra sáng và số
lần ra sáng ít hơn (đạt ý nghĩa thống kê) so với lô chứng sinh lý. Điều


21
trị với M-R1 liều 5 mg/kg, 10 mg/kg hay M-R2 liều 5 mg/kg không có
sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý. Nhóm uống
V-R2 liều 10 mg/kg, M-R2 liều 5 mg/ kg hay 10 mg/kg làm tăng số lần
ra sáng cũng như số lần ra sáng đạt ý nghĩa thống kê (p<0,05). Kết quả
nghiên cứu cho thấy hợp chất V-R2 liều 10 mg/kg có tác dụng giải lo
âu tương đương M-R2 (5 mg/kg, 10 mg/kg) hay fluoxetin 20 mg/kg.
Tác dụng chống trầm cảm của majonosid-R1, vinaginsenosid -R2
Kết quả thực nghiệm trên mô hình FST, TST
Kết quả trên nhóm chuột nuôi chung: Lô uống mẫu thử chưa có ảnh
hưởng đến thời gian bất động trong thực nghiệm FST và TST.
Nhóm chuột cô lập: Lô chứng bệnh lý của hai thực nghiệm FST và
TST có thời gian bất động tăng coq ý nghĩa thống kê so với lô chứng
sinh lý. Sau 7 ngày điều trị với M-R1 liều (5-10 mg/kg), V-R2 (5-10
mg/kg) và M-R2 (5-10 mg/kg) cũng như fluoxetin liều 20 mg/kg, làm
giảm thời gian bất động đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý.
Tác dụng của majonosid R1và vina-ginsenosid R2 bởi stress oxy
hóa trong não chuột bị trầm cảm do stress cô lập
Kết quả cho thấy trên nhóm chuột nuôi chung: Các lô uống mẫu thử
chưa ảnh hưởng đến hàm lượng MDA và GSH trong não chuột có ý
nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý.
Nhóm chuột cô lập: Lô uống nước cất có hàm lượng MDA tăng 72,7%
đạt ý nghĩa thống kê (p<0,01), hàm lượng GSH giảm 45,1% (p<0,001)
so với lô chứng bệnh lý. Chứng tỏ, chuột nuôi cô lập sau 4 tuần gây
stress oxy hóa tế bào não.
Điều trị với M-R2 hay V-R2 liều 10 mg/kg cũng như fluoxetin liều 20
mg/kg làm giảm hàm lượng MDA là 40,5%, 38,3%, 44,2 % tương ứng
đạt ý nghĩa thống kê. Điều trị với M-R1 liều 5 mg/kg, 10 mg/kg cũng
như V-R2, M-R2 liều 5 mg/kg chưa làm giảm hàm lượng MDA đạt ý
nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý.
Điều trị với M-R1, V-R2 cũng như M-R2 liều 5 mg/kg, 10 mg/kg làm
tăng hàm lượng GSH đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý, tác
dụng này tương đương fluoxetin liều 20 mg/kg. Chưa có sự khác biệt
có ý nghĩa thống kê (p>0,05) về hàm lượng GSH giữa các nhóm điều
trị bằng M-R1, V-R2, M-R2 cũng như fluoxetin.


22
KẾT LUẬN
Luận án đã hoàn thành các nội dung nghiên cứu với những mục tiêu đã
đề ra như sau:
1. Xây dựng và đánh giá quy trình định lƣợng đồng thời một số
saponin trong Sâm Việt Nam trồng
- Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời 5 saponin GRg1, G-Rb1, G-Rd, M-R2 và V-R2 bằng phương pháp HPLC-Q-TOFMS trong Sâm VN. Đề tài xây dựng và thẩm định quy trình định lượng
đồng thời 4 saponin G-Rg1, G-Rb1, G-Rd, M-R2 bằng phương pháp
HPLC-DAD.
Đề tài này ứng dụng phương pháp HPLC-Q-TOF-MS định lượng đồng
thời 5 saponin là G- Rg1, G-Rb1, G-Rd , M-R2 và V-R2 trong Sâm
VN từ 2 - 6 năm tuổi.
2. Xây dựng tiêu chuẩn Sâm Việt Nam trồng
Xây dựng được tiêu chuẩn của Sâm VN gồm các chỉ tiêu như: Mô tả,
vi phẫu, soi bột, định tính, định lượng bằng phương pháp HPLC-QTOF-MS, mất khối lượng do làm khô, giới hạn kim loại nặng, độ tro,
tạp chất, xác định chất chiết được.
3. Đánh giá một số tác dụng sinh học của Sâm VN
- Cao Sâm VN liều 10 mg/kg, 100 mg/kg thể hiện tác dụng tăng lực và
tác dụng này tương đương NS. Đặc biệt, cao Sâm VN liều 50 mg/kg
thể hiện tác dụng tăng lực điển hình hơn NS.
- Tác dụng bảo vệ gan của cao Sâm VN
Cao Sâm VN liều 200 mg/kg có tác dụng bảo vệ gan khỏi tổn thương
do CCl4, cyclophosphamid và tác dụng này tương đương với NS. Tuy
nhiên, cao NS liều 100 mg/kg chưa thể hiện tác dụng này. Cao Sâm
VN liều 100 mg/kg, 200 mg/kg sau 4 tuần điều trị có tác dụng bảo vệ
gan khỏi tổn thương do ethanol; tác dụng này tương đương NS.
Tác dụng chống stress tâm lý của cao Sâm VN.
- Kết quả cho thấy sau 4 tuần nuôi cô lập chuột biểu hiện bị stress, do
rút ngắn giấc ngủ gây ra do pentobarbital.


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×

×