Tải bản đầy đủ

PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ (Hybridization)

Bộ công thương
Trường đại học công nghiệp thực phẩm
tp. HCM

PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ
(Hybridization)
Nhóm 15
GVHD: Hoàng Xuân Thế


NHÓM 15
Tên
1. Phạm Ngọc Ý Vy
2. Nguyễn Thị Hoài Yến
3. Phạm Thị Hoài Xinh
4. Trần Thị Thúy Vy
5. Phạm Thị Hồng Nguyên

MSSV
2022150235
2022150242

2022150117
2022150175
2022150150


Nhược điểm của phương pháp phân tích vi sinh
vật truyền thống
- Tốn nhiều thời gian nuôi cấy và phân tích, chậm thu
kết quả.
- Mất nhiều công sức, tốn kém.
- Không đáp ứng yêu cầu phân tích thực tế hiện nay.
Nhiều nghiên cứu được tiến hành nhằm áp
dụng các thành tựu của kỹ thuật di truyền,
sinh học phân tử vào lĩnh vực thực phẩm.
Trong đó, phương pháp lai phân tử được thiết
lập dựa trên DNA để định lượng vi sinh vật và
được thương mại hóa dưới dạng bộ kit để phát
hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm.


1. Khái niệm
- Mục đích: Phương pháp lai phân tử (hay còn gọi là
phương pháp mẫu dò) dùng để phát hiện vi sinh vật gây
bệnh trong thực phẩm dựa trên sự phát hiện một đoạn
gen đặc trưng của vi sinh vật.
- Cơ sở của lai phân tử: sự biến tính và hồi tính DNA
Khi 1 phân tử DNA mạch đôi được đun lên 1 nhiệt độ
quá "nhiệt độ nóng chảy Tm" thì 2 mạch đôi sẽ tách rời
nhau do sự phá vỡ các liên kết Hydro nối liền mạch. Sau
khi tách mạch, nếu nhiệt độ phản ứng được làm giảm từ
từ cộng với điều kiện thích hợp, chúng sẽ bắt cặp trở lại.
Hiện tượng này được gọi là lai phân tử.


1. Khái niệm
- Đặc điểm của lai phân tử: sự tái bắt cặp xảy ra giữa

2 trình tự có trình tự hoàn toàn bổ sung. Các trình tự
bổ sung có thể là DNA hoặc RNA dẫn đến hình thành
các phân tử lai DNA-DNA, RNA-RNA hay DNARNA




* Quá trình lai phân tử giữa hai mạch DNARNA


2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lai
phân tử
* Nồng độ DNA: nghĩa là số lượng các trình tự bổ

sung, càng cao thì xác suất tiếp xúc với nhau càng tăng
dẫn tới làm tăng tốc độ phản ứng lai phân tử.
* Thời gian phản ứng: Thời gian phản ứng càng dài thì
xác suất tiếp xúc càng lớn hơn và số lượng phân tử lai
tăng dần cho đến khi toàn bộ các trình tự bổ sung đều
tái bắt cặp.
* Nhiệt độ: Tốc độ phản ứng lai phụ thuộc vào nhiệt độ.
Thông thường phản ứng lai cực đại ở nhiệt độ thấp hơn
Tm của chính nucleic acid đó độ 25%.


2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lai
phân tử
* Độ dài của các trình tự: Tốc độ lai tăng tỉ lệ thuận

với căn bậc hai của tốc độ dài các trình tự bổ sung.
* Lực ion: Nồng độ NaCl 1M làm tăng tốc độ phản
ứng lên từ 5-10 lần. Nồng độ NaCl >1,2 M lại hoàn
toàn không còn tác dụng.


3. Phân loại:
- Lai trên pha lỏng
- Lai trên pha rắn
+ Southern blot
+ Nouthern blot
+ Western blot
+ Dot (slot) blot
- Lai tại chỗ


3. Phân loại
- Lai trên pha lỏng
Nguyên tắc
+ Các mạch đơn nằm trong môi trường lỏng là một
dung dịch đệm.
+ Sự lai phân tử xảy ra khi các trình tự này gặp nhau
do sự chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường
thấp hơn Tm ít hơn vài độ.


- Lai trên pha lỏng: 3 phương pháp thường sử dụng

+ Phương pháp dùng quang phổ kế
+ Phương pháp sử dụng nuclease S1
+ Phương pháp sắc kí trên hydroxylapatite


+ Phương pháp dùng quang phổ kế
• DNA mạch đôi hấp thu ánh sáng yếu hơn DNA
mạch đơn.
• Sự chuyển từ mạch đôi sang dạng mạch đơn
được xác định dễ dàng thông qua việc đo biến
động giá trị của mật độ quang (OD) ở bước sóng
260 nm.
• Giá trị mật độ quang tăng lên khi phân tử mạch
đôi chuyển thành mạch đơn, hiện tượng này có
tên gọi là hiệu ứng siêu sắc (hyperchromic effect).


Hiệu ứng siêu sắc :
Nhuộm tím phân tử DNA
, nếu đem chúng đun
nóng lên và làm lạnh từ
từ thì kết quả là các phân
tử DNA sẽ trở nên tím
đậm hơn lúc đầu một
chút. Nếu hạ nhiệt độ
một cách đột ngột thì
chúng sẽ trở nên rất đậm.
Đó là do hiện tượng các
mạch đơn DNA hấp thu
tia UV mạnh hơn DNA
mạch đôi.


+ Phương pháp sử dụng nuclease S1
• Nuclease S1 là enzyme thủy giải các nucleic

acid mạch đơn bất kể là DNA hay RNA trong
một số điều kiện thực nghiệm.
• Dung dịch phản ứng lai được trích ra một
phần, đem xử lí với nuclease S1.
• Các mạch đơn sẽ bị thủy giải, các nucleic
acid còn lại tương ứng với các phân tử lai được
thu nhận qua phương pháp tủa rồi đem định
lượng .


+ Phương pháp sắc kí trên hydroxylapatite
• Hydroxylapatite là những tinh thể phosphat calci .
• Kỹ thuật này sử dụng các mồi đánh dấu (đoạn
nucleotide hoặc kháng thể ) để lai với ADN,ARN
hoặc với các protein ở trong các tế bào mà không cần
tách chiết.
• Sau khi các hỗn hợp bị đốt nóng, chúng được làm
lạnh để những mạch đơn va chạm ngẫu nhiên. Các
hỗn hợp được ủ khoảng 120h ở 600C trong một dung
dịch đệm Natri phosphat.


• Nhiệt độ này rất quan trọng bởi vì ở nhiệt độ
thấp, sự bắt cặp sai lệch sẽ thường xuyên hơn.
Tại 600C, DNA chỉ bắt cặp với mạch bổ sung của
nó vì đa số các base đủ cho mạch kép bền vững
ở nhiệt độ này.
• Kế tiếp, 1 mẫu của mỗi thể lai mạch đôi khác
nhau tạo thành sẽ được đặt vào cột của
hydroxylapatite đã được dìm trong chậu nước
550C. Khi mỗi thể lai tan chảy, nó được rửa sạch
cho vào lọ nhỏ và năng lực phóng xạ của mỗi lọ
được xác định. Cuối cùng, 1 đường cong tan
chảy sẽ được vẽ với những kết quả của thí
nghiệm này.


Ứng dụng:
+ Tính tỉ lệ % các trình tự giống nhau ở hai loài
• Việc lai DNA có thể đo mức độ tương đồng
về DNA của các loài khác nhau. Những DNA
lai tương đồng nhiều hơn sẽ tan chảy ở nhiệt
độ cao hơn. Kỹ thuật này cho thấy rằng người
và tinh tinh mang DNA giống nhau nhiều hơn
so với DNA của đười ươi hay khỉ đột.


Ứng dụng
+ Phân tích các trình tự lặp lại :
• Trong một trình tự DNA, một trình tự lặp
lại nhiếu lần sẽ có nhiều cơ may gặp
mạch bổ sung hơn so với một trình tự duy
nhất.
• Bộ gen của Eucaryote có trình tự lặp lại
cao hơn ở Procaryote.


3. Phân loại:
- Lai trên pha rắn
+ Lai trên pha rắn: Một trong hai trình tự cần lai được
cố định trên giá thể rắn (màng lai) phát hiện phân tử lai
thông qua mẫu dò (probe) có đánh dấu đồng vị phóng
xạ
+ Một trong hai trình tự cần lai được cố định trên giá
thể rắn (màng lai) phát hiện phân tử lai thông qua mẫu
dò (probe) có đánh dấu đồng vị phóng xạ


Ưu điểm

+ Thao tác dễ dàng.
+ Tách trực tiếp ADN hay ARN gốc ở dung dịch thuốc
thử.
+ Ngăn sự tái bắt cặp giữa 2 mạch của cùng một phân
tử.

Khuyết điểm

+ Phân tích định lượng các phân tử lai kém chính
xác.
+ Hiệu quả thấp
+ Vận tốc lai trên pha rắn <10 lần so với vận tốc lai
trên pha lỏng do một phần các nucleic acid được cố


Sơ đồ quá trình lai phân tử trên pha rắn


* Lai trên pha rắn có 4 phương pháp cơ bản:
+ Southern blot
+ Northern blot
+ Western blot
+ Dot (slot) blot
* Nổi bật lên 3 phương pháp được sử dụng rộng

rãi nhất là phương pháp Southern, Northern và
Dot blot.


* Southern blot







Trích DNA từ tế bào
Cắt DNA với enzyme giới hạn
Chạy trên gel agarose
Làm biến tính DNA với alkali
Chuyển lên màng nitrocellulose
Lai với mẫu dò DNA được đánh dấu


Chuyển DNA từ
gel lên màng lai

Lai với mẫu dò DNA được đánh dấu


* Northern blot






Trích RNA từ tế bào
Làm biến tính với formaldehyde
Chạy trên gel thường dùng agarose
Chuyển lên màng nitrocellulose
Lai với mẫu dò DNA được đánh dấu


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×