Tải bản đầy đủ

PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT

PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT
I. Phương pháp truyền thống
1. Phương pháp đếm trực tiếp
- Áo dụng cho những vi sinh vật có kích thước lớn nấm men, tảo...
- Mục đích: xác định nhanh chóng mật độ vi sinh vật trong mẫu.
- Nhược điểm: không phân biệt được tế bào sống và chết , dễ nhầm lẫn với các hạt
vật thể khác, độ chính xác không cao, không thích hợp cho huyền phù có mật độ
thấp.
1.1. Đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu
- Lựa chọn khu vực đếm hồng cầu trên buồng đếm. Có nhiều loại buồng đếm khác

nhau như Goriaep, Thoma, Neubauer và Smic., nhưng có đặc điểm chung khi đếm
hồng cầu là đều đếm 5 khu vực (5 ô vuông lớn), trong đó 4 khu vực ở bốn góc và
một khu vực ở giữa buồng đếm. Mỗi khu vực đếm gồm 16 ô vuông nhỏ. Bằng vật
kính x 40, đếm tất cả hồng cầu nằm gon trong khu vực ô vuông lớn và các hồng
cầu nằm trên 2 cạnh của mỗi ô vuông lớn.
- Khi thực hiện quan sát và đếm vi sinh vật, cho thêm vài giọt formalin vào trong
mẫu, trộn đều. Pha loãng mẫu bằng dung dịch pha loãng 0,1% peptone và 0,1%
laurylsulphate và 0,01% methyl blue sao cho mỗi ô nhỏ của buồng đếm chứa từ 5 10 tế bào.
- Mật độ tế bào của huyền phù mẫu là: N/ml = 0,25a × 106 tế bào/ml. Trong đó a là
số tế bào bình quân trong một ô vuông lớn.

1.2. Đếm trực tiếp bằng buồng đếm Breed
- Rất hữu ích trong việc đếm tổng số vi sinh vật vật bằng phương pháp đếm trực
tiếp. Buồng đếm Breed có một vùng diện tích 1cm2 được đánh dấu.
- Dùng bơm tiêm hay que cấy vòng cho khoảng 0,01ml mẫu cần đếm vào trong
vùng này , sấy khô bằng ngọn lửa sau đó nhuộm với methyl blue.
- Khi đếm cho dầu nhúng lên diện tích vùng cần đếm . Mật độ của vi sinh vật là:
N/ml = 4a × 104/ π d2. Trong đó a là số tế bào trong một vùng đếm, d là đường kính
của vùng đếm


1.3 Đếm trực tiếp bằng kính hiển vi huỳnh quang
- Ưu điểm: ước đoán được số lượng thật sự của các loài vi sinh vật khác nhau hiện
diện trong mẫu ; phản ánh đúng sinh khối của vi sinh vật.
- Mục đích: xác định trực tiếp vi sinh vật dưới kính hiển vi huỳnh quang bằng
cách nhuộm phát huỳnh quang khác nhau như acridin cam (AODC), 4',6dianidino-2-phenyl-indol (DAPI), fluorescein isothiocyanate (FITC).
2. Phương pháp đếm khuẩn lạc
- Mục đích: Xác định số lượng tế bào vi sinh vật, còn sống hiện diện trong mẫu.
Tế bào sống là tế bào có khả năng phân chia tạo thành khuẩn lạc trên môi trường
chọn lọc.
- Nhược điểm: dễ cho sai số lớn nên cần thực hiện lặp lại trên ít nhất hai đĩa. Do
khả năng nhiều tế bào hình thành chung một khuẩn lạc nên số đếm khuẩn lạc
không nhất thiết trùng lặp với số tế bào ban đầu được đưa lên môi trường nên kết
quả đếm và mật độ tế bào thường được trình bày bằng số đơn vị hình thành khuẩn
lạc CFU/ml thay vì số tế bào/ml. Đây là phương pháp tốt nhất để xác định tế bào
sống
Pha loãng mẫu theo dãy thập phân
Mẫu được pha loãng tuần tự thành dãy các nồng độ thập phân 1/10, 1/100,
1/1000...Mỗi bậc pha loãng 1/10 được thực hiện bằng cách dùng 1ml mẫu ( hoặc
dung dịch có độ pha loãng trước đó) thêm vào 9 ml nước hoặc môi trường trong
một ống nghiệm. Sau khi lắc kĩ sẽ được độ pha loãng 1/10. Có thể tiến hành. Có
thể tiến hành bằng các thể tích khác, ví dụ 0,5 ml + 4,5 ml trong ống nghiệm hoặc
0,1 ml + 0,9 ml trong ống Eppendorf.


3. Phương pháp MPN (Most Probable Number)
- Phương pháp MPN ( phương pháp có số xác suất cao nhất, số tối khả) còn được
gọi là phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ. Đây là một
phương pháp dùng để xác định số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có
xác suất lớn nhất hiện diện trong một đơn vị thể tích mẫu. Đây là phương pháp
định lượng dựa trên kết quả định tính của hàng loạt thí nghiệm được lặp lại ở một
độ pha loãng khác nhau.
- Quy trình định lượng: Cho vào ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho sự
tăng trưởng của đối tượng vi sinh vật cần định lượng cho thể tích dung dịch mẫu
chính xác ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp. Ủ ở nhiệt độ và thời gian thích
hợp. Dựa vào biểu hiện trong từng ống nghiệm như sinh hơi, đổi màu, đục,... Ghi
nhận số lượng ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng. Sử dụng số liệu này
tra bảng Mac Crady suy ra mật độ của vi sinh vật được trình bày dưới dạng số
MPN/100ml hay số MPN/1g mẫu.

II. Phương pháp miễn dịch và sinh học phân tử
1. Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)
- Mục đích: để xác định sự có mặt của kháng nguyên mục tiêu hoặc kháng thể mục
tiêu có mặt trong mẫu phân tích
- Nguyên tắc kỹ thuật: sử dụng kháng thể đơn dòng (kháng thể sơ cấy) phủ bên
ngoài những đĩa giếng nhằm mục đích thu giữ những kháng nguyên mục tiêu. Các
kháng nguyên thu giữ này được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể thứ cấp có


gắn enzyme phát tín hiệu như horseradish peroxidase hay alkaline phosphatase.
Khi bổ sung một cơ chất đặc hiệu của enzyme vào giếng thì enzyme xúc tác phản
ứng thủy phân cơ chất để tạo ra các sản phẩm có màu hay phát sáng. Bằng cách
theo dõi sự đổi màu, có thể phát hiện và định lượng kháng nguyên.
- Mô hình ELISA sandwich

2. Phương pháp lai phân tử (Hibridization) - Phương pháp sử dụng mẫu dò
- Mục đích: phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm dựa trên sự phát hiện một đoạn
gen đặc trưng của vi sinh vật.
- Cở sở của phương pháp sử dụng mẫu dò là quá trình lai phân tử.
- Quá trinh này bao gồm sự tách rời hai mạch đôi của chuỗi xoắn kép DNA khi
nhiệt độ vượt quá nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử DNA và sự tái bắt cặp giữa
các đoạn DNA có trình tự nucleotide bổ sung khi nhiệt độ bình thường trở lại. Một
trong hai mạch DNA bổ sung (gọi là DNA mục tiêu - DNA của tế bào vi sinh vật)
được cố định trên một giá thể rắn hoặc nằm ngay trên tế bào hay mô). Sự lai phân
tử có thể xảy ra giữa DNA và RNA. Quá trình lai phân tử chịu ảnh hưởng bởi
nhiều yếu tố: nồng độ DNA trong môi trường, nhiệt độ và thời gian phản ứng, kích
thước các trình tự lai và lực ion của môi trường.
3. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) - phương pháp in vitro
- Mục đích: nhận biết và phát hiện một đoạn gen cụ thể trong đoạn gen.
- Ứng dụng: để phát hiện, tạo ra các đột biến gen, chẩn đoán bệnh, phát hiện các
mầm bệnh vi sinh vật có trong thực phẩm.


- Phương pháp PCR là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một
trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này
thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi
đặc hiệu cho đoạn DNA này. Tất cả các enzyme polymerase đều cần những mồi
chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn.
+ Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gen ( gọi là trình tự DNA mục
tiêu) đặc trưng cho loài vi sinh vật mục tiêu.
+ Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của
mạch khuôn và nhờ hoạt động của enzyme polymerase thì đoạn này sẽ được nối
dài và hình thành mạch mới.
+ Đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ khuếch đại thành một số lượng bản sao đến
mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận
được đoạn DNA này cho các mục đích tái thao tác trên gen.
- Phản ứng PCR gồm nhiều chu kì lặp lại khác nhau. Mỗi chu kỳ gồm có 3 bước.




Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×

×