Tải bản đầy đủ

SO SÁNH ĐỘ TIÊU HÓA PROTEIN CỦA MỘT SỐ NGUYÊN LIỆU THỨC ĂN TRÊN CÁ RÔ PHI (Oreochromis) BẰNG PHƯƠNG PHÁP INVIVO VÀ INVITRO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

SO SÁNH ĐỘ TIÊU HÓA PROTEIN CỦA MỘT SỐ NGUYÊN
LIỆU THỨC ĂN TRÊN CÁ RÔ PHI (Oreochromis) BẰNG
PHƯƠNG PHÁP IN-VIVO VÀ IN-VITRO

Họ và tên sinh viên : Nguyễn Thị Bích Chi
Ngành
: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
Niên khóa
: 2008 - 2010

Tháng 07/2010


SO SÁNH ĐỘ TIÊU HÓA PROTEIN CỦA MỘT SỐ NGUYÊN LIỆU
THỨC ĂN TRÊN CÁ RÔ PHI (Oreochromis) BẰNG PHƯƠNG PHÁP
IN -VIVO VÀ IN-VITRO


Thực hiện bởi

NGUYỄN THỊ BÍCH CHI

Luận văn được đệ trình để hoàn tất yêu cầu cấp bằng Kỹ sư nuôi trồng thuỷ sản

Giáo viên hướng dẫn: LÊ THANH HÙNG
ONG MỘC QUÝ

Thành phố Hồ Chí Minh
Năm 2010

i


TÓM TẮT
Đề tài nghiên cứu “So sánh độ tiêu hóa protein của một số nguyên liệu thức ăn
trên cá rô phi (Oreochromis) bằng phương pháp In-vivo và In-vitro” được tiến hành từ
ngày 01/04/2010 đến ngày 02/07/2010, tại trại thực nghiệm và phòng thí nghiệm khoa
Thủy Sản, Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
Thí nghiệm 1: Với phương pháp invivo xác định độ tiêu hóa protein của 03
nguyên liệu: Bột cá, bánh dầu đậu nành và cám gạo trên cá rô phi bằng cách nuôi cá
trong bình thu phân, cho cá ăn thức ăn thí nghiệm có bổ sung chất đánh dấu Cr2O3 vào
trong thức ăn để xác định độ tiêu hóa protein của từng nguyên liệu trên cá rô phi. Kết
quả thí nghiệm cho thấy độ tiêu hóa protein của bột cá và bánh dầu đậu nành (87,96%;
94,82%) có độ tiêu hóa cao và khi bổ sung bột cá hoặc bánh dầu đậu nành vào khẩu
phần thức ăn làm tăng độ tiêu hóa của thức ăn (bổ sung 30% bột cá hoặc bánh dầu đậu
nành vào thức ăn cơ bản thì độ tiêu hóa của thức ăn tăng từ 65,65% lên 68,52% và
65,65% lên 71,52%). Đối với cám gạo có độ tiêu hóa protein thấp 69,74%, khi bổ sung
vào khẩu phần thức ăn với tỉ lệ cao 30% sẽ làm giảm độ tiêu hóa của thức ăn từ
65,65% xuống 56,30%.
Thí nghiệm 2: Xác định độ tiêu hóa protein của 03 nguyên liệu: Bột cá, bánh
dầu đậu nành và cám gạo với phương pháp invitro dựa trên nguyên tắc thủy phân
protein bởi enzyme pepsin. Kết quả thí nghiệm cho thấy bột cá có độ tiêu hóa protein
cao nhất (88,61%), kế đến là bánh dầu đậu nành (82,93%) và thấp nhất là cám gạo
(61,54%).
Từ kết quả độ tiêu hóa protein của 03 nguyên liệu với phương pháp In-vivo và
In-vitro trên hai thí nghiệm cho thấy phương pháp invitro sử dụng enzyme pepsin thủy
phân protein cho kết quả độ tiêu hóa protein của nguyên liệu bột cá không có sự khác
biệt so với độ tiêu hóa protein được xác định trên phương pháp invivo. Đối với nguyên
liệu bánh dầu đậu nành và cám gạo thì độ tiêu hóa protein thấp hơn so với độ tiêu hóa
protein được xác định trên cá rô phi (In-vivo) vì hoạt tính của enzyme pepsin bị hạn
chế bởi hàm lượng carbohydrat và một số yếu tố ức chế có trong nguyên liệu protein
thực vật bánh dầu đậu nành và cám gạo.

ii


LỜI CẢM TẠ
Chúng tôi xin chân thành cảm tạ:
Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
Ban Chủ Nhiệm Khoa Thủy Sản, cùng toàn thể quý Thầy Cô trong khoa đã tận
tình giảng dạy, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho chúng tôi trong suốt thời gian học tập
tại trường.
Xin chân thành cảm ơn Thầy Lê Thanh Hùng, Thầy Ong Mộc Quý đã tận tình
hướng dẫn, giúp đỡ cho tôi hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp.
Đồng thời, xin gởi lòng biết ơn đến các cán bộ, kỹ thuật viên của Trại Thực
Nghiệm Thủy Sản, Trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện và
giúp đỡ tôi thực hiện đề tài này.
Các bạn sinh viên trong và ngoài lớp đã động viên, giúp đỡ trong suốt thời gian
học tập và thực hiện đề tài.
Do hạn chế về thời gian, kinh phí và kiến thức nên đề tài chắc chắn sẽ không
tránh khỏi những sai sót. Kính mong nhận được sự đóng góp ý kiến từ quý thầy cô và
các bạn sinh viên.

.

iii


MỤC LỤC
Đề Mục
Trang
Trang tựa..........................................................................................................................i
Tóm tắt .......................................................................................................................... ii
Lời cảm tạ ..................................................................................................................... iii
Mục lục ..........................................................................................................................iv
Danh sách các chữ viết tắt .............................................................................................vi
Danh sách các hình ...................................................................................................... vii
Danh sách các bảng và biểu đồ................................................................................... viii
I. GIỚI THIỆU .............................................................................................................1
1.1 Đặt Vấn Đề ...............................................................................................................1
1.2 Mục Tiêu Đề Tài ......................................................................................................2
II.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU...............................................................................3
2.1
Một Số Đặc Điểm Của Cá Rô Phi ....................................................................3
2.1.1 Giới thiệu chung về cá rô phi ...........................................................................3
2.1.2 Đặc điểm sinh học ............................................................................................4
2.1.2.1 Phân loại ...........................................................................................................4
2.1.2.2 Hình thái ...........................................................................................................4
2.1.2.3 Đặc điểm môi trường sống ...............................................................................5
2.1.2.4 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển ..................................................................6
2.1.2.5 Đặc điểm sinh sản.............................................................................................6
2.1.2.6 Đặc điểm dinh dưỡng .......................................................................................6
2.1.2.7 Nhu cầu về protein và acid amin ......................................................................7
2.1.2.8 Một số nguồn nguyên liệu cung cấp protein.....................................................9
2.1.2.9 Độ tiêu hóa protein trên cá rô phi ...................................................................10
2.2
Tổng Quan Về Enzyme ..................................................................................11
2.2.1 Khái niệm enzyme ..........................................................................................11
2.2.2 Enzyme tiêu hóa protein .................................................................................11
2.2.2.1 Pepsin..............................................................................................................12
2.2.2.2 Cơ chế thủy phân protein của pepsin..............................................................14
2.2.2.3 Điều kiện hoạt động của enzyme....................................................................15
2.2.2.4 Một số nghiên cứu xác định độ tiêu hóa protein trong thành phần thức ăn
bằng phương pháp In-vitro .............................................................................16
III.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................18
3.1
Thời Gian Và Địa Điểm Nghiên Cứu.............................................................18
3.2
Vật Liệu Thí Nghiệm......................................................................................18
3.2.1 Đối tượng nghiên cứu .....................................................................................18
3.2.2 Hệ thống thí nghiệm .......................................................................................18
3.2.3 Dụng cụ và nguyên liệu thí nghiệm................................................................19
3.2.4 Nguyên liệu thức ăn........................................................................................20
3.3
Phương Pháp Bố Trí Thí Nghiệm...................................................................20
3.3.1 Thí nghiệm 1: Xác định độ tiêu hóa protein của 03 loại nguyên liệu thức ăn
bột cá, bánh dầu đậu nành, cám gạo bằng phương pháp In-vivo...................20
iv


3.3.1.1
3.3.1.2
3.3.1.3
3.3.2

Bố trí thí nghiệm.............................................................................................20
Các chỉ tiêu theo dõi .......................................................................................22
Phương pháp đo độ tiêu hóa protein...............................................................22
Thí nghiệm 2: Xác định độ tiêu hóa protein của 03 loại nguyên liệu thức ăn
bột cá, bánh dầu đậu nành, cám gạo bằng phương pháp In-vitro..................23
3.3.2.1 Bố trí thí nghiệm.............................................................................................23
3.3.2.2 Các chỉ tiêu theo dõi .......................................................................................25
3.3.2.3 Đo độ tiêu hóa protein ....................................................................................25
3.4
Phương Pháp Phân Tích Các Chỉ Tiêu Và Số Liệu........................................26
IV.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................................27
4.1
Độ Tiêu Hoá Protein Của 03 Loại Nguyên Liệu Thức Ăn: Bột Cá, Bánh Dầu
Đậu Nành, Cám Gạo Bằng Phương Pháp In-vivo .......................................................27
4.1.1 Các thông số môi trường ..................................................................................27
4.1.2 Thành phần sinh hoá của thức ăn và phân cá ở các nghiệm thức thức ăn.........28
4.1.3 Độ tiêu hóa của nguyên liệu trong các nghiệm thức thí nghiệm......................28
4.2
Độ Tiêu Hóa Protein Của 03 Loại Nguyên Liệu Thức Ăn: Bột Cá, Bánh Dầu
Đậu Nành, Cám Gạo Bằng Phương Pháp In-vitro ............................................32
4.3
So Sánh độ tiêu hóa protein của các nguyên liệu thức ăn bằng phương pháp
In-vivo và In-vitro..............................................................................................33
V.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................................35
5.1
Kết Luận .........................................................................................................35
5.2
Đề Nghị...........................................................................................................35
TÀI LIỆU THAM KHẢO..........................................................................................36
Tài Liệu Tiếng Việt ......................................................................................................36
Tài Liệu Nước Ngoài....................................................................................................37
PHỤ LỤC ....................................................................................................................39

v


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADC : Apparent Digestibility Coefficient
AD : Apparent Digestibility
AOAC
: Association of Official Analytical Chemists
LVTN : Luận Văn Tốt Nghiệp
NRC : National Research Council
NT : Nghiệm Thức

vi


DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ
Bảng 2.1 Nhu cầu protein điển hình của cá rô phi ........................................................8
Bảng 2.2 Độ tiêu hoá protein của một số nguyên liệu thức ăn trên cá rô phi ..............11
Bảng 3.1 Hàm lượng protein của 03 loại nguyên liệu thức ăn.....................................20
Bảng 3.2 Thành phần nguyên liệu của nghiệm thức thức ăn cơ bản (T0) ....................21
Bảng 4.1 Các thông số môi trường...............................................................................27
Bảng 4.2 Thành phần sinh hoá trong thức ăn và trong phân cá của các nghiệm thức
thức ăn .........................................................................................................................28
Bảng 4.3 Độ tiêu hóa thức ăn của các nghiệm thức thí nghiệm...................................29
Bảng 4.4 Độ tiêu hóa protein của nguyên liệu thức ăn ................................................30
Bảng 4.5 Độ tiêu hóa nguyên liệu và protein của nguyên liệu thức ăn........................32
Bảng 4.6 So sánh độ tiêu hóa protein của các nguyên liệu bằng phương pháp In-vivo
và In-vitro.......................................................................................................................33
Biểu đồ 4.1 So sánh độ tiêu hóa protein của các nguyên liệu bằng phương pháp In-vivo
và In-vitro.......................................................................................................................34

vii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Hình dạng ngoài của cá rô phi.........................................................................5
Hình 2.2 Cấu trúc của enzyme pepsin ..........................................................................13
Hình 3.1 Hệ thống bình thu phân .................................................................................19
Hình 3.2 Máy ép viên thức ăn ......................................................................................19
Hình 3.3 Tủ sấy thức ăn và phân cá .............................................................................19

viii


Chương 1
GIỚI THIỆU
1.1

Đặt Vấn Đề
Ở nước ta, nghề nuôi trồng thủy sản đã phát triển từ rất lâu đời với nhiều đối

tượng, hình thức nuôi phong phú, đa dạng như: Nuôi thủy sản nước ngọt, nước lợ, nuôi
các loài nhuyễn thể, … với các mô hình như quảng canh, bán thâm canh và thâm canh.
Trong nhiều đối tượng nuôi thì cá rô phi là một trong những nhóm cá được nghiên cứu
nhiều nhất vì chúng có nhiều ưu điểm: dễ nuôi, ít dịch bệnh, thức ăn không đòi hỏi
chất lượng cao, có khả năng thích nghi với những điều kiện khắc nghiệt của môi
trường sống (nhiệt độ cao, hàm lượng oxy thấp, nước nông, độ mặn cao) và đồng thời
được sự chấp nhận rộng rãi của người tiêu dùng.
Với mô hình nuôi thâm canh chi phí thức ăn chiếm tỉ lệ rất lớn trong tổng chi
phí đầu tư. Do đó, để đạt được hiệu quả cao trong sản xuất thì việc sử dụng những
nguồn nguyên liệu làm thức ăn giữ vai trò rất quan trọng: Thức ăn phải có chất lượng,
đảm bảo nhu cầu dinh dưỡng, dễ tiêu hoá, hấp thu tốt nhằm nâng cao năng suất, sản
lượng nhưng đồng thời giảm giá thành sản xuất.
Trong các thành phần hóa học của nguyên liệu thức ăn protein là một trong
những yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến sự tăng trưởng và sức đề kháng của cá. Thêm vào
đó giá trị dinh dưỡng của thức ăn phụ thuộc vào giá trị dinh dưỡng của từng thành
phần nguyên liệu có trong thức ăn và khả năng tiêu hoá, hấp thu các dưỡng chất đó
vào trong cơ thể vật nuôi. Vì vậy, xác định độ tiêu hóa là một trong những khâu quan
trọng trong quá trình đánh giá một thành phần nguyên liệu được sử dụng trong khẩu
phần thức ăn cho cá. Phương pháp xác định độ tiêu hóa thức ăn trực tiếp In-vivo đã
được áp dụng trên nhiều đối tượng vật nuôi như trên gia súc, gia cầm, các loài động
vật thủy sản (tôm, cua, cá tra, cá rô phi, cá hồi) bằng cách trộn chất đánh dấu vào trong
thức ăn để xác định độ tiêu hóa. Trong khi đó có rất ít nghiên cứu xác định độ tiêu hóa
1


bằng phương pháp In-vitro với enzyme pepsin trên đối tượng cá rô phi. Phương pháp
này được xem là một phương pháp mới với nhiều ưu điểm, cho phép đánh giá nhanh
một số lượng lớn mẫu thức ăn với sự giảm chi phí thời gian, tiền bạc và có độ chính
xác tương đối cao.
Do đó, đề tài nghiên cứu: “So sánh độ tiêu hóa protein của một số nguyên liệu
thức ăn trên cá rô phi (Oreochromis) bằng phương pháp In-vivo và In-vitro” được
chúng tôi thực hiện tại Khoa Thủy Sản trường Đại Học Nông Lâm, Tp. Hồ Chí Minh.
1.2

Mục Tiêu Đề Tài
Xác định độ tiêu hóa protein của 03 loại nguyên liệu thức ăn: bột cá, bánh dầu

đậu nành, cám gạo trên cá rô phi bằng phương pháp In-vivo.
Xác định độ tiêu hóa protein của 03 loại nguyên liệu thức ăn: bột cá, bánh dầu
đậu nành, cám gạo trên cá rô phi bằng phương pháp In-vitro với sự xúc tác thủy phân
của enzyme pepsin.

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1

Một Số Đặc Điểm Của Cá Rô phi

2.1.1

Giới thiệu chung về cá rô phi
Hiện nay, cá rô phi thuộc giống (Oreochromis) có nguồn gốc từ Châu Phi

được nuôi phát tán rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới, đặc biệt là các nước nhiệt đới
và cận nhiệt đới. Châu Á là nơi nuôi cá rô phi nhiều nhất. Cá rô phi có khoảng 100
loài, những loài được nuôi phổ biến là rô phi vằn, rô phi đen, rô phi xanh và rô phi đỏ
trong đó loài nuôi phổ biến nhất là rô phi vằn.
- Rô phi đen (O. mossambicus) loài cá này chậm lớn, chu kỳ sinh sản ngắn,
hiện nay không được quan tâm.
- Rô phi vằn (O. niloticus) được nhập từ Đài Loan vào nước ta từ năm 1973.
Loài cá này lớn nhanh, chu kỳ sinh sản kéo dài. Tuy nhiên, do sự tạp giao giữa cá rô
phi đen và cá rô phi vằn đã làm suy thoái chất lượng con giống.
- Rô phi vằn dòng GIFT, rô phi vằn dòng Thái Lan là những dòng cá thuần
chủng có sức lớn nhanh, chất lượng thịt thơm ngon được nhập vào nước ta năm 1994.
- Rô phi đỏ (con lai giữa O. mossambicus và O. hornorum) được nhập từ
Malaysia vào nước ta năm 1975, loài cá này có sức lớn nhanh, màu sắc đẹp, thịt ngon.
Hiện nay loài cá rô phi vằn và rô phi đỏ được phát triển nuôi rộng rãi và còn
được xem là loài cá nuôi xóa đói giảm nghèo ở nước ta nhờ vào các ưu điểm của
chúng như: tính ăn đơn giản, sinh trưởng nhanh, kháng bệnh và được chấp nhận cao ở
người tiêu dùng.

3


2.1.2

Đặc điểm sinh học

2.1.2.1 Phân loại
Cá rô phi thuộc:
Lớp: Osteichthyes
Lớp phụ: Actinopterygii
Bộ: Perciformes
Bộ phụ: Percoidei
Họ: Cichlidae
Giống: Oreochromis
Loài: O. niloticus.
(Trewavas, 1982; trích bởi Lê Sơn Nam, 1984)
2.1.2.2 Hình thái
Loài rô phi đen (O. mossambicus): Toàn thân phủ vẩy, vẩy ở phần lưng có
màu xám tro đậm hoặc xanh đen nhạt, phần bụng có màu trắng xám hoặc màu xám
ngà. Trên thân có từ 6 – 8 vạch sắc tố màu xanh đen xen lẫn chấm sắc tố màu tím chạy
từ lưng tới bụng. Những vạch sắc tố ở vây không rõ ràng (Dương Nhật Long, 2004).
Loài rô phi vằn (O. niloticus): Toàn thân phủ vẩy, vẩy ở phần lưng có màu
sáng vàng nhạt hoặc xám nhạt, phần bụng có màu trắng ngà hoặc màu vàng nhạt. Trên
thân có từ 6 – 8 vạch sắc tố chạy từ lưng tới bụng. Các vạch sắc tố ở các vây như vây
đuôi, vây lưng rỏ ràng (Dương Nhật Long, 2004).
Rô phi đỏ (điêu hồng) là một dạng đột biến của loài O. niloticus: Vẩy trên
thân có màu vàng đậm hoặc vàng nhạt hoặc đỏ hồng, cũng có thể gặp những cá thể có
màu vàng, màu hồng xen lẫn những đám vẩy đen nhạt (Dương Nhật Long, 2004).

4


Hình 2.1: Hình dạng ngoài của cá rô phi.
2.1.2.3 Đặc điểm môi trường sống
Rô phi là loài cá nhiệt đới, thích sống ở những nơi có mực nước cạn, có khả
năng chịu đựng tốt hơn so với các loài cá nuôi nước ngọt phổ biến khác về độ mặn,
nhiệt độ cao, hàm lượng oxy hòa tan thấp và nồng độ ammonia cao.
Nhiệt độ: Cá rô phi thuộc nhóm cá rộng nhiệt, có thể chịu đựng được nhiệt độ
xuống tới 8 - 10oC trong một thời gian ngắn mặc dù sự tăng trưởng và sinh sản giảm đi
rất nhiều khi nhiệt độ xuống dưới 20oC. Cá rô phi cũng có thể chịu đựng được nhiệt độ
cao tới 35oC, cá chết ở nhiệt độ 39 - 42oC (Balarin và Haller, 1982).
Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của loài O. mossambicus là 20 - 35oC và
loài O. niloticus là 31 - 36oC (Balarin và Haller, 1982).
Oxy hòa tan (DO): Có khả năng chịu đựng sự thiếu oxy tốt, tồn tại được ở DO
= 0,3 mg/L. Cá sinh trưởng tốt với oxy trên 2 mg/L. Quá trình biến dưỡng, tăng
trưởng, khả năng kháng bệnh giảm nếu DO thấp hơn 1 mg/L. (Huỳnh Phạm Việt Huy,
2006).
pH: Cá rô phi có khả năng chịu đựng khoảng pH rộng từ 5 -10. pH cho cá
sinh trưởng tốt nhất là 6 – 9 (Huỳnh Phạm Việt Huy, 2006).
Khả năng chịu mặn: Cá rô phi có thể sinh trưởng và phát triển tốt trong môi
trường nước ngọt, lợ và mặn. Có khả năng thích ứng với độ mặn từ 0 - 32‰, khoảng
độ mặn thích hợp cho cá phát triển tốt từ 0 - 25‰. Khả năng thích ứng của cá với độ
mặn khác nhau tùy theo loài (Huỳnh Phạm Việt Huy, 2006).

5


2.1.2.4 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển
Tốc độ sinh trưởng của cá rô phi phụ thuộc vào nhiệt độ môi trường, thức ăn,
mật độ thả và kỹ thuật chăm sóc. Do tính ăn tạp và khả năng bắt mồi lớn nên cá rô phi
có tốc độ tăng trưởng nhanh chóng trong điều kiện nuôi bình thường.
Sau 1 tháng tuổi cá con có thể đạt trọng lượng từ 2 – 3 g/con và sau khoảng 2
tháng tuổi có thể đạt 10 – 12 g/con.
Cá cái sẽ lớn chậm hơn sau khi tham gia sinh sản trong khi đó cá đực vẫn lớn
bình thường. Vì vậy, trong đàn cá rô phi thì cá đực có kích thước lớn hơn cá cái. Sau 5
– 6 tháng tuổi cá rô phi vằn đực có thể đạt trọng lượng 200 – 250 g/con và cá cái có
thể đạt 150 – 200 g/con (Dương Nhật Long, 2004).
2.1.2.5 Đặc điểm sinh sản
Sau khoảng 4 – 5 tháng tuổi cá rô phi vằn tham gia sinh sản còn cá rô phi đen
chỉ cần khoảng 3 tháng tuổi. Tập tính chung của cá rô phi là làm tổ đẻ trứng ở đáy ao
và ấp trứng trong xoang miệng. Cá thường chọn những nơi có mực nước từ 0,3 – 0,6
m, đáy ao có ít bùn để làm tổ, sau khi tổ làm xong cá tự ghép đôi và tiến hành sinh sản.
Hầu hết các loài cá rô phi sinh sản nhiều lần trong năm, chu kỳ sinh sản ngắn
khoảng 20 – 30 ngày. Trung bình một cá cái có trọng lượng 200 – 250 g/con sinh sản
được 1000 – 2000 trứng.
Sau khi đẻ xong cá cái ngậm trứng và cá con mới nở trong miệng (cá con
được giữ trong miệng đến khi tiêu hết noãn hoàng). Trong thời gian ngậm trứng và
nuôi con cá cái không bắt mồi vì vậy cá không lớn, cá chỉ bắt mồi trở lại khi đã giải
phóng hết con trong miệng (Dương Nhật Long, 2004).
2.1.2.6 Đặc điểm dinh dưỡng
Hầu như tất cả các loài rô phi thuộc giống Oreochromis đều ăn tạp, có chế độ
dinh dưỡng thấp, thức ăn ưa thích của chúng là những sinh vật thủy sinh lơ lửng trong
nước: tảo, động vật phù du, động vật không xương sống nhỏ, ấu trùng cá, mùn bã hữu
cơ và một phần thực vật bậc cao.

6


Cá rô phi thường ăn lọc thức ăn bởi vì chúng có thể sử dụng rất hiệu quả
những phiêu sinh thực vật trong nước, ở mang cá tiết ra một chất nhầy các phiêu sinh
thực vật sẽ bị dính vào chất nhầy này tạo thành cục và được cá rô phi nuốt vào bụng.
Ở giai đoạn cá con từ cá bột lên cá hương thức ăn chủ yếu là động vật và thực
vật phù du. Từ giai đoạn cá hương đến trưởng thành thức ăn chủ yếu là mùn bã hữu cơ
và thực vật phù du.
Nhìn chung, cá rô phi là loài ăn tạp thiên về thực vật, trong điều kiện nuôi
nhân tạo cá rô phi có khả năng thích nghi cao với những loại thức ăn chế biến do con
người cung cấp như cám gạo, tấm, bột bắp, các loại rong bèo và những phụ phẩm nông
nghiệp khác.
Nhu cầu dinh dưỡng của cá rô phi gần giống với nhu cầu dinh dưỡng của cá
chép về thành phần tinh bột (< 40%), canxi (1,5 – 2%), P (1 – 1,5), K, Na, . . .chỉ khác
là hàm lượng protein trong thức ăn của cá rô phi (28%) nhỏ hơn yêu cầu về hàm lượng
protein của cá chép (30%) (Trần Văn Vỹ, 2002).
2.1.2.7 Nhu cầu về protein và acid amin
Theo quan điểm hóa học protein là một hợp chất hữu cơ rất lớn, có hai đặc
điểm quan trọng:
- Trong thành phần cấu trúc luôn chứa nitrogen (N) với tỷ lệ ổn định ≈ 16%.
- Có trọng lượng phân tử cao nên gọi là đại phân tử protein (Nguyễn Phước
Nhuận và ctv., 2003).
Protein là thành phần rất quan trọng của cơ thể, nó có mặt trong nhân, nguyên
sinh chất, màng tế bào, là hợp chất bắt buộc, thường trực. Quá trình sống là sự trao đổi
chất, đổi mới liên tục của protein. Vì vậy, protein là thành phần không thể thiếu trong
khẩu phần ăn hằng ngày của cả con người và động vật.
Nhu cầu protein là lượng protein tối thiểu có trong thức ăn, nhằm thỏa mãn
yêu cầu các acid amin để đạt tăng trưởng tối đa (NRC, 1993).
Nhu cầu protein trên cơ thể cá: Protein ảnh hưởng rất lớn đến sự tăng trưởng
và phát triển của cá, nếu bị thiếu hụt làm cá chậm lớn, dễ bị nhiễm bệnh. Protein được
hấp thu, chuyển hóa thành các acid amin và được sử dụng bởi các mô, cơ quan để làm
thành những protein mới (phát triển chức năng) hay thay thế những protein đã già cõi
7


(duy trì chức năng) (SEAFDEC/AQD, 1994). Các loài cá thường có nhu cầu protein
rất cao so với gia súc và gia cầm. Trung bình nhu cầu protein của cá là 30%.
Protein trong thành phần càng cao thì càng kích thích sự tăng trưởng, nhưng
trong nhu cầu dinh dưỡng của cá nếu cung cấp vượt quá nhu cầu thì protein không tích
lũy ở dạng protid mà sẽ được ưu tiên tích lũy trong cơ thể ở dạng năng lượng so với
lipid và carbohydrate. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra khẩu phần cho cá rô phi vằn khoảng
30% trong ao nuôi cá thịt và hơn 45% trong ao nuôi cá hương lên cá giống. Ngoài ra,
trong thời kỳ sinh sản đòi hỏi một hàm lượng protein cao để tăng quá trình tái sản xuất
có hiệu quả (Santiago và ctv., 1985; Chang và ctv., 1988; trích bởi Hồ Tấn Cường,
2009).
Bảng 2.1: Nhu cầu protein điển hình của cá rô phi.
Giai đoạn

Nhu cầu

<0,02 gam

45 – 50 %

0,02 – 2,0 gam

40 %

2,0 – 35 gam

35 %

>35 gam

30 – 32 %

(Nguồn: Fitzsimmons, 2004; trích bởi Phạm Ngọc Tịnh, 2005)

Nhu cầu về protein thật sự là nhu cầu về các amino acid. Trong 20 amino acid
thì có khoảng 10 amino acid thiết yếu (arginine, histidine, isoleucine, leucine, lysine,
threonine, trytophan, valine, methionine, phenyalanine) là những amino acid không tự
tổng hợp được bởi cá hay không thể tổng hợp với số lượng đủ để cung cấp cho nhu cầu
của cá. Cá rô phi cũng có nhu cầu về 10 amino acid thiết yếu giống như những loài cá
khác.
Nhu cầu protein của cá phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: năng lượng trong
thức ăn, chất lượng và loại thức ăn sử dụng, trạng thái sinh lý cá, môi trường nuôi
dưỡng và lượng thức ăn hằng ngày của cá. Nhu cầu protein cho sự tăng trưởng lớn
nhất tùy thuộc vào chất lượng protein, kích cỡ của cá và chiếm tới 50% trong khẩu
phần ăn của cá giống nhỏ. Tuy nhiên, trong nuôi cá với mục đích thương mại thì hàm
lượng protein thô của thức ăn thường từ 26 – 30% (Popma và Masser, 1999; trích bởi
Hồ Tấn Cường, 2009).
8


Nhìn chung, cá rô phi có khả năng tiêu hóa protein động vật giống như cá da
trơn nhưng hiệu quả hơn trong tiêu hóa protein thực vật, đặc biệt là những protein thực
vật có chuỗi sợi dài. Năng lượng tiêu hóa đòi hỏi cho sự tăng trưởng tốt nhất của cá rô
phi thì giống những cá da trơn và ước lượng khoảng 8,2 – 9,4 kcal trên 1 gram của
khẩu phần protein.
2.1.2.8 Một số nguồn nguyên liệu cung cấp protein
a. Nguồn protein động vật
Bột cá, cá tạp, bột huyết, bột xương thịt, bột nhuyễn thể, bột phụ phẩm gia
cầm là những nguồn cung cấp protein chất lượng cao có nguồn gốc động vật thường
được sử dụng trong công nghệ chế biến thức ăn cho gia súc, gia cầm và động vật thủy
sản với hàm lượng protein từ 27 – 85% và khả năng tiêu hóa cũng tốt hơn so với
protein có nguồn gốc thực vật (Lê Thanh Hùng, 2000).
Trong các nguồn nguyên liệu cung cấp protein có nguồn gốc động vật, bột cá
được xem là nguồn nguyên liệu có giá trị dinh dưỡng cao nhất và được ưa chuộng nhất
vì hàm lượng protein trong bột cá cao (40 – 60% nhưng tùy thuộc nguồn gốc và
phương pháp chế biến), chứa đầy đủ các acid amin và acid béo thiết yếu, giàu muối
khoáng, vitamin đặc biệt là vitamin A (vitamin tan trong lipid). Ngoài ra, bột cá còn
chứa các chất dẫn dụ, ngon miệng kích thích tiêu hóa tốt (85 – 90%), giúp tăng trưởng
nhanh.
Nhưng hiện nay, nguồn nguyên liệu cung cấp bột cá có một số hạn chế do sản
lượng cá đánh bắt ngày càng giảm sút, nhu cầu sử dụng tương đối cao nên xảy ra tình
trạng khan hiếm, giá cả biến động, giá thành cao hơn nhiều so với các nguồn protein
thực vật (Lê Thanh Hùng, 2000).
b. Nguồn protein thực vật
Protein có nguồn gốc thực vật thường bắt nguồn từ những cây họ đậu và các
hạt có chứa dầu như: đậu nành, đậu phộng, lúa mì, hạt bông vải, hạt hoa hướng dương,
phần lớn hàm lượng đạm trong các nguyên liệu này từ 15 – 55%.
Bánh dầu đậu nành là một trong những nguồn protein thực vật chính cung cấp
protein trong thức ăn thủy sản, với hàm lượng protein khá cao 44 – 48%, chứa tương
9


đối đầy đủ các acid amin thiết yếu nhưng hàm lượng methionine và cystine (chứa S),
thấp so với nhu cầu của cá, hàm lượng arginine và phenylalanine rất dồi dào trong bã
dầu đậu nành, đây là nguồn cung cấp nguyên liệu ổn định, giá cả hợp lý và ngày càng
được nghiên cứu, sử dụng.
Trong hạt đậu nành sống có chứa một số yếu tố kháng dinh dưỡng gồm: hoạt
chất ức chế sự tiêu hóa protein, haemagglutinin, phytates, … đáng quan tâm nhất là
soyin. Đây là những acid amin không thiết yếu, liên kết với enzyme tiêu hóa protein,
ngăn cản hoạt động tiêu hóa của enzyme này. Tuy nhiên, những yếu tố ngăn cản này
dễ bị phân hủy ở nhiệt độ cao (>105oC) nhưng khi nhiệt độ lên quá cao thì một số acid
amin thiết yếu nhạy cảm với nhiệt độ như lysine sẽ tạo thành phức hệ với đường theo
phản ứng Millard nên giá trị dinh dưỡng của lysine sẽ bị giảm đi rất nhiều (Lê Thanh
Hùng, 2000).
Đã có rất nhiều nghiên cứu sử dụng bã đậu nành thay thế phần lớn bột cá
trong thức ăn của các loài thủy sản. Trong thực tế sản xuất, bã dầu đậu nành sẽ được
phối trộn với một tỷ lệ nhất định bột cá hay các nguồn protein động vật để bổ sung
những khiếm khuyết của bã dầu nành khi sử dụng với tỉ lệ cao trong thức ăn. Ở cá rô
phi có thể sử dụng bã dầu nành thay thế 70 – 75% bột cá trong thức ăn.
2.1.2.9 Độ tiêu hóa protein trên cá rô phi
Khi so sánh với các thành phần hoá học khác trong thức ăn thì protein có độ
tiêu hóa khá cao từ 50 – 95%. Tuy nhiên, độ tiêu hóa này phụ thuộc rất nhiều vào chất
lượng loại protein. Những loại protein có nguồn gốc động vật thường có độ tiêu hóa
tốt hơn so với protein nguồn gốc thực vật vì hàm lượng cellulose, hemicellulose tồn tại
trong thành phần hóa học của protein thực vật ngăn cản các enzyme nội sinh, đồng
thời có các yếu tố kháng dinh dưỡng ức chế sự hoạt động của một số enzyme tiêu hoá
protein.

10


Bảng 2.2: Độ tiêu hoá protein của một số nguyên liệu thức ăn trên cá rô phi.
Nguyên liệu

Độ tiêu hoá (%)

Bột cá (65%)

84,8

Bột xương thịt (50%)

77,7

Bột lông vũ thuỷ phân

_

Bột phế phẩm gia cầm

_

Bột huyết (81%)

84,8

Cám gạo (13%)

_

Cám mì (16%)

70,7

Bánh dầu nành (48%)

94,4

Bánh dầu phộng

84,8
(Poma, 1982; trích bởi Lê Thanh Hùng, 2008)

2.2

Tổng Quan Về Enzyme

2.2.1

Khái niệm enzyme
Trong cuộc sống sinh vật xảy ra rất nhiều phản ứng hóa học, với một hiệu suất

rất cao, mặc dù ở điều kiện bình thường về nhiệt độ, áp suất, pH. Sở dĩ như vậy vì nó
có sự hiện diện của chất xúc tác sinh học được gọi chung là enzyme.
Enzyme có thành phần cơ bản là protein, nó được cơ thể sinh vật tổng hợp
nên, tham gia xúc tác cho tất cả các phản ứng sinh hóa bên trong cơ thể và ngoài tế bào
(In-vitro). Trong các phản ứng này, các phân tử lúc bắt đầu của quá trình được gọi là
cơ chất (substrate), enzyme sẽ biến đổi chúng thành các phân tử khác nhau. Tất cả các
quá trình sinh hóa trong tế bào đều cần enzyme.
2.2.2

Enzyme tiêu hóa protein
Tiêu hóa là quá trình qua đó thức ăn trong ống tiêu hóa được thủy phân thành

các hợp chất đơn giản, để được hấp thu ở ruột và đi vào hệ thống mao mạch. Các
enzyme tiêu hóa thực hiện sự phân cắt khi thức ăn đi qua ống tiêu hóa (Lê Thanh
Hùng, 2008).
Người ta tìm thấy enzyme thủy phân protein thức ăn trong dạ dày, tụy tạng và
lớp tuyến ở thành ruột của các loài cá, tôm. Những enzyme này được thành lập từ các
11


tiền chất. Do đó, nguy cơ tự phân hủy các mô sản sinh ra các enzyme này không thể
xảy ra. Enzyme protease là một loại enzyme tham gia xúc tác quá trình thủy giải liên
kết peptid (-CO-NH-)n trong phân tử protein để tạo thành các peptide ngắn, cuối cùng
là tạo thành các acid amin và NH3.
R
-NH

R

R

CH - C-NH-CH- C- + H2O

R

-NH-CH-COOH + NH2-CH- C-







O

O

O

Dựa vào tính đặc hiệu với cơ chất có thể phân protease thành 2 nhóm:
- Endopeptidase (pepsin, trypsin, chymotrypsin, collagenase và elastase) thủy
phân protein và các chuỗi polypeptides dài thành các chuỗi polypeptides ngắn hơn.
- Exopeptidase (carboxypeptidae, aminopeptidase) thủy phân các polypeptide,
tạo sản phẩm cuối cùng cắt các liên kết peptid ở đầu mạch tạo thành amino acid.
Hoạt tính enzyme tiêu hóa protein trong cơ thể cá thay đổi theo nhiều yếu tố:
tuổi, trạng thái sinh lý, mùa vụ, thành phần thức ăn và các yếu tố môi trường như nhiệt
độ, pH dịch tiêu hóa. Hoạt tính của enzyme đạt mức tối đa ở nhiệt độ nhất định, khi
nhiệt độ thay đổi vượt quá mức hoạt tính tối đa của enzyme sẽ giảm đột ngột, ngoài ra
hoạt tính của enzyme còn bị ảnh hưởng bởi pH của môi trường như pepsin có hoạt tính
tối đa ở pH = 2 – 3, trypsin có hoạt tính tối đa khi pH đạt 7 – 8.
2.2.2.1 Pepsin
Enzyme thủy phân protein điển hình trong dạ dày, thủy phân các nối peptide
trong chuỗi protein.
Về thành phần hóa học: phân tử pepsin có chứa 14,7% nitrogen. Ngoài ra, còn
có chứa lưu huỳnh tạo 3 cầu disulfua và 1 gốc acid phosphoric kết hợp với nhóm
hydroxyl của một gốc serin.

12


Hình 2.1: Cấu trúc của enzyme pepsin
Hoạt tính của pepsin ở cá cao hơn pepsin các loài hữu nhũ. Ví dụ như hoạt
tính pepsin của loài cá cao gấp 150 lần hoạt tính pepsin động vật hữu nhũ. Pepsin hoạt
động trong môi trường acid và trị số pH tối ưu, ở loài O. niloticus có pH tối ưu là 1,5
(Moriarty, 1973).
Pepsin được sản sinh từ tế bào tiết trong vách dạ dày dưới dạng các tiền
enzyme pepsinogen bất hoạt và chỉ trong môi trường acid chúng mới chuyển thành
pepsin hoạt động. Ở những loài cá có dạ dày, hydrochloric acid (HCl) được tiết ra từ
các tế bào tiết HCl, làm pH dịch vị hạ thấp. Sự tiết HCl tăng lên sau khi cá ăn.
Sự tiết HCl ở cá rô phi O. niloticus thay đổi theo nhịp ngày đêm. Dịch vị có
pH giảm dần khi cá bắt đầu ăn vào buổi sáng, pH cá đạt cực trị 1,4 – 1,6 vào buổi trưa,
ở cá rô phi sự tiêu hóa và hấp thu được tảo lam là nhờ dịch dạ dày acid (Moriarty,
1973).
Pepsin dạ dày tác dụng được trên các protein nguyên trạng cũng như trên các
protein đã bị biến tính. pH tối ưu của pepsin ≈ 2, hoạt động mạnh trong vùng acid khá
rộng (2 – 4). Với những protein đã bị biến tính, pH hoạt động tối ưu của enzyme
chuyển về vùng pH cao hơn so với protein nguyên thể.
Pepsin ở trạng thái khô khá bền, ngay cả ở điều kiện nhiệt độ thường. Trong
môi trường dung dịch pepsin kém bền hơn đặc biệt là khi ở nhiệt độ thấp do xảy ra sự
tự phân của enzyme kèm theo sự tạo thành các sản phẩm phân tử thấp.

13


2.2.2.2 Cơ chế thủy phân protein của pepsin
Quá trình thủy phân protein thành các acid amin là một quá trình rất phức tạp
với sự tham gia xúc tác của enzyme pepsin.
pepsinogen
(chưa hoạt động)

HCl

pepsin
(hoạt động)

protein

pH: 1,5 - 3

pepton
polypeptide
peptide đơn giản
amonoacid

Trong quá trình xúc tác của enzym chỉ có một phần tham gia trực tiếp vào phản ứng để
kết hợp với cơ chất gọi là "trung tâm hoạt động”.
Các cơ chất kết hợp với trung tâm hoạt động tạo phức hợp enzym - cơ chất

E + S → ES → E + P
(enzyme + cơ chất → phức hợp enzyme – cơ chất → sản phẩm trung gian →
sản phẩm + enzyme)
Trong đó:
E : enzyme (pepsin).
S : cơ chất (protein).
ES : hợp chất trung gian giữa enzyme và cơ chất.
P : sản phẩm
Sản phẩm chủ yếu của quá trình phân giải protein này là acid amin và các
protein cấp thấp.
Sự tạo thành và chuyển biến hợp chất ES qua 3 bước:
• Bước 1: Enzyme kết hợp với cơ chất protein tạo thành hợp chất trung gian
(enzyme – protein), bước này xảy ra khá nhanh, liên kết không bền.
• Bước 2: Xảy ra sự chuyển biến của các phân tử protein dẫn đến làm phá vỡ
các mối liên kết đồng hoá trị tham gia vào phản ứng. Khi đó phức chất ES
đồng thời xảy ra 2 quá trình là sự dịch chuyển thay đổi electron, dẫn đến sự
cực hóa của mối liên kết tham gia vào phản ứng và sự biến dạng hình học
của nối liên kết đồng hóa trị trong phân tử protein cũng như trong trung tâm
14


hoạt động của enzyme, làm cho protein hoạt động, quá trình thủy phân dễ
dàng hơn.
• Bước 3: Giai đoạn tạo thành các acid amin và peptid cấp thấp, giải phóng
enzyme trở lại trạng thái tự do có thể xúc tác phản ứng với cơ chất mới cùng
loại.
2.2.2.3 Điều kiện hoạt động của enzyme
Enzyme pepsin được dùng để chuyển hoá các cơ chất protein thành các acid
amin nhưng hoạt động của enzyme còn tuỳ thuộc vào những đặc tính riêng như yếu tố
môi trường, đặc điểm của cơ chất, …..
- pH hoạt động của enzyme: Mỗi loại enzyme hoạt động trong một khoảng pH
nhất định và có một pH tối ưu. Đối với pepsin hoạt động trong môi trường acid có pH
tối ưu từ 1 – 4, ở pH từ 1,5 – 2,0 pepsin hoạt động tối đa với hiệu suất 90%, pH = 4,5
hiệu suất hoạt động là 35% (Bohak, 1969). Khi môi trường pH trên 5,5 thì pepsin
không hoạt động vì lúc này protein enzyme đã bị biến tính.
- Nhiệt độ: Tốc độ của phản ứng enzyme chịu ảnh hưởng của nhiệt độ. Mỗi
enzyme có một nhiệt độ tối ưu (tại nhiệt độ này enzyme có hoạt tính cao nhất). Khi
chưa đạt đến nhiệt độ tối ưu của enzyme thì sự gia tăng nhiệt độ sẽ làm tăng tốc độ
phản ứng enzyme. Tuy nhiên, khi đã qua nhiệt độ tối ưu của enzyme thì sự gia tăng
nhiệt độ sẽ làm giảm tốc độ phản ứng và có thể enzyme bị mất hoàn toàn hoạt tính.
Nhiệt độ thích hợp để pepsin hoạt động tốt: 35 – 48oC, tối ưu ở 45oC.
- Nồng độ enzyme: Tốc độ phản ứng của enzyme tùy thuộc vào nồng độ
enzyme trong dung dịch. Với một lượng cơ chất xác định, nồng độ enzyme càng cao
thì tốc độ phản ứng xảy ra càng nhanh.
- Nồng độ cơ chất: Mỗi loại enzyme có tính đặc hiệu với cơ chất của nó.
Pepsin là enzyme protease chỉ tham gia xúc tác quá trình thủy phân protein. Với một
lượng enzyme xác định, nếu tăng dần lượng cơ chất trong dung dịch thì thoạt đầu hoạt
tính của enzyme tăng dần nhưng đến một lúc nào đó thì sự gia tăng về nồng độ cơ chất
cũng không làm tăng hoạt tính của enzyme. Đó là vì tất cả các trung tâm hoạt động của
enzyme đã được bão hòa bởi cơ chất.

15


Ngoài ra, hoạt tính của enzyme còn chịu sự tác động bởi các yếu tố khác như:
Chất ức chế hoặc hoạt hoá enzyme.
Một số chất hoá học, các phân tử vô cơ, hữu cơ (protein) có thể làm hoạt độ
của enzyme bị thay đổi (ức chế, kìm hãm hoặc có thể làm mất hoạt tính của enzyme).
Ngược lại, một số chất khác như các ion kim loại (Mn2+, Zn2+,…) khi kết hợp với
enzyme lại làm tăng hoạt tính của enzyme, các chất hoạt hóa thường kết hợp trực tiếp
với phân tử enzyme làm thay đổi cấu hình không gian của enzyme theo hướng có lợi
cho hoạt động xúc tác, ngoài ra còn có thể tác dụng gián tiếp thông qua loại bỏ các yếu
tố kìm hãm.
2.2.2.4 Một số nghiên cứu xác định độ tiêu hóa protein trong thành phần thức ăn
bằng phương pháp In-vitro
a. Ưu nhược điểm của phương pháp
Để đảm bảo cung cấp đầy đủ nhu cầu dưỡng chất cho các loài động vật thủy
sản. Người nuôi ngoài việc hiểu rõ đặc điểm sinh học, nhu cầu dinh dưỡng của đối
tượng nuôi đồng thời phải biết được các giá trị dinh dưỡng của nguồn nguyên liệu thức
ăn. Có thể xác định giá trị dinh dưỡng, giá trị năng lượng của một loại thức ăn nào đó
thông qua các thí nghiệm tiêu hóa trên cơ thể vật nuôi nhưng các phương pháp này tốn
nhiều thời gian, công sức và chi phí, không phù hợp cho việc đánh giá một số lượng
lớn thức ăn. Vì vậy đã có nhiều phương pháp mới như kỹ thuật In-vitro sử dụng
enzyme pepsin của AOAC (1971), phương pháp pH Stat theo Equerra (1998), phương
pháp xác định mức tiêu hoá protein thức ăn bằng TNBS theo Adler Niser (1986), …
đã được các nhà khoa học dinh dưỡng phát triển nhằm đánh giá nhanh tỷ lệ tiêu hóa
của một số lượng lớn mẫu thức ăn vì có độ chính xác tương đối cao, dễ lặp lại, ít tốn
tiền bạc và thời gian.
Kỹ thuật invitro sử dụng enzyme pepsin để xác định khả năng tiêu hóa protein
của thức ăn tuy có nhiều ưu điểm nhưng vẫn có mặt hạn chế vì là phương pháp
enzyme, nên kết quả phụ thuộc rất nhiều vào nồng độ và hoạt lực của loại enzyme sử
dụng. Vì vậy, khi tiến hành xác định khả năng tiêu hóa và năng lượng thức ăn bằng
phương pháp này, enzyme sử dụng phải có nguồn gốc tốt và sử dụng cùng một nguồn
gốc.
16


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×

×