Tải bản đầy đủ

Nghiên cứu sự lưu hành và đặc điểm dịch tễ học phân tử của porcine circovirus type 2 (PCV2) ở lợn nuôi tại việt nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

PHẠM HỒNG QUÂN

NGHIÊN CỨU SỰ LƯU HÀNH VÀ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ
HỌC PHÂN TỬ CỦA PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2
(PCV2) Ở LỢN NUÔI TẠI VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2019


HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

PHẠM HỒNG QUÂN

NGHIÊN CỨU SỰ LƯU HÀNH VÀ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ
HỌC PHÂN TỬ CỦA PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2
(PCV2) Ở LỢN NUÔI TẠI VIỆT NAM


Chuyên ngành: Dịch tễ học thú y
Mã số: 9 64 01 08
Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Huỳnh Thị Mỹ Lệ
PGS. TS. Phạm Công Hoạt

HÀ NỘI - 2019


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả
nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng
dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được
cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2019

Tác giả luận án

Phạm Hồng Quân

i


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận
được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên
của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.
Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và
biết ơn sâu sắc PGS.TS. Huỳnh Thị Mỹ Lệ, PGS.TS. Phạm Công Hoạt đã tận
tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong
suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo,
Bộ môn Vi sinh vật truyền nhiễm, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam
đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo, cán bộ Cục Thú y, Trung tâm Chẩn đoán
Thú y Trung Ương và Ban quản lý dự án CDC đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi


trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi
điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn
thành luận án./.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2019

Nghiên cứu sinh

Phạm Hồng Quân

ii


MỤC LỤC
Lời cam đoan ..................................................................................................................... i
Lời cảm ơn ........................................................................................................................ ii
Mục lục ........................................................................................................................... iii
Danh mục chữ viết tắt ...................................................................................................... vi
Danh mục bảng ............................................................................................................... vii
Danh mục hình ............................................................................................................... viii
Trích yếu luận án .............................................................................................................. x
Thesis abstract................................................................................................................. xii
Phần 1. Mở đầu ............................................................................................................... 1
1.1.

Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................................... 1

1.2.

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài ........................................................................... 2

1.3.

Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................ 2

1.4.

Những đóng góp mới của đề tài ......................................................................... 3

1.5.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ............................................................ 3

1.5.1.

Ý nghĩa khoa học ................................................................................................ 3

1.5.2.

Ý nghĩa thực tiễn ................................................................................................ 3

Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 4
2.1.

Tình hình chăn nuôi lợn tại Việt Nam ................................................................ 4

2.2.

Giới thiệu về PCV2 và bệnh do PCV2 gây ra ở lợn nuôi ................................... 5

2.2.1.

Giới thiệu về PCV2 ............................................................................................ 5

2.2.2.

Dịch tễ học của bệnh do PCV2 ........................................................................... 8

2.2.3.

Cơ chế sinh bệnh ................................................................................................ 9

2.2.4.

Triệu chứng và bệnh tích ở lợn mắc PCV2 ...................................................... 11

2.2.5.

Một số hội chứng ở lợn có liên quan đến sự nhiễm PCV2 ............................... 14

2.2.6.

Chẩn đoán ......................................................................................................... 16

2.2.7.

Phòng bệnh ....................................................................................................... 18

2.2.8.

Điều trị .............................................................................................................. 22

2.3.

Hiện tượng đồng nhiễm do PCV2 gây ra ......................................................... 22

2.4.

Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về PCV2 ....................................... 23

2.4.1.

Tình hình nghiên cứu trên thế giới ................................................................... 23

iii


2.4.2.

Tình hình nghiên cứu trong nước ..................................................................... 29

Phần 3. Nội dung – Vật liệu - Phương pháp nghiên cứu ........................................... 33
3.1.

Địa điểm nghiên cứu......................................................................................... 33

3.2.

Thời gian nghiên cứu ........................................................................................ 33

3.3.

Vật liệu nghiên cứu........................................................................................... 33

3.4.

Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 35

3.5.

Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 35

3.5.1.

Phương pháp tính toán dung lượng mẫu........................................................... 35

3.5.2.

Phương pháp điều tra hồi cứu ........................................................................... 38

3.5.3.

Phương pháp thu thập mẫu ............................................................................... 38

3.5.4.

Phương pháp chiết tách ADN/ARN ................................................................. 38

3.5.5.

Phương pháp Realtime PCR ............................................................................. 39

3.5.6.

Phương pháp PCR ............................................................................................ 40

3.5.7.

Phương pháp giải trình tự và hoàn thiện trình tự gen ....................................... 41

3.5.8.

Phương pháp phân tích trình tự gen.................................................................. 42

3.5.9.

Xây dựng cây phát sinh chủng loại .................................................................. 42

3.5.10. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử theo không gian thời gian ............................................................................................................ 42
3.5.11. Phương pháp đo lường tính đa dạng về di truyền............................................. 45
3.5.12. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................................ 45
Phần 4. Kết quả nghiên cứu và thảo luận ................................................................... 46
4.1.

Sự lưu hành PCV2 ở lợn nuôi tại Việt Nam ..................................................... 46

4.1.1.

Kết quả nghiên cứu sự lưu hành PCV2 theo địa phương ................................. 46

4.1.2.

Kết quả xác định sự lưu hành PCV2 theo quy mô chăn nuôi ........................... 52

4.1.3.

Kết quả xác định tỷ lệ lưu hành PCV2 ở đàn lợn thuộc các lứa tuổi................ 53

4.1.4.

Kết quả nghiên cứu sự lưu hành của bệnh do PCV2 gây ra ............................. 56

4.2.

Đặc điểm dịch tễ học phân tử của PCV2 .......................................................... 59

4.2.1.

Kết quả giải trình tự bộ gen của PCV2 ............................................................. 59

4.2.2.

Phân loại genotype PCV2 lưu hành ở Việt Nam .............................................. 60

4.2.3.

Tính đa dạng di truyền của PCV2 lưu hành ở Việt Nam.................................. 64

4.2.4.

Sự lưu hành của các genotype PCV2 theo không gian và thời gian ................. 66

4.2.5.

Đặc điểm dịch tễ học phân tử của genotype PCV2b lưu hành ở Việt Nam ............ 68

iv


4.2.6.

Đặc điểm dịch tễ học phân tử của genotype PCV2d lưu hành ở Việt Nam ............ 73

4.3.

Hiện tượng đồng nhiễm PCV2 với một số virus .............................................. 76

4.3.1.

Kết quả xác định sự có mặt của một số virus đồng nhiễm ............................... 77

4.3.2.

Kết quả nghiên cứu hiện tượng đồng nhiễm PCV2 với một số virus ............... 83

4.3.3.

Đặc điểm sinh học phân tử của loài virus mới đồng nhiễm với PCV2 ............ 87

Phần 5. Kết luận và đề nghị ......................................................................................... 92
5.1.

Kết luận............................................................................................................. 92

5.2.

Đề nghị ............................................................................................................. 92

Những công trình của tác giả công bố có liên quan đến luận án .................................... 93
Tài liệu tham khảo .......................................................................................................... 94
Phụ lục ........................................................................................................................ 112

v


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Tên đầy đủ

Từ viết tắt
ADN

Axit Deoxyribonucleic

ARN

Axit ribonucleic

CI

Confidence Interval

CS

Cộng sự

CSFV

Classical Swine Fever Virus

ELISA

Enzyme Linked Immunosorbent Assay

IPMA

Immunoperoxidase monolayer assay

NaCl

Natri clorua

ORF

Open Reading Frame

PBS

Phosphate – Buffered - Saline

PCR

Polymerase chain reaction

PCV

Porcine circovirus

PCV1

Porcine circovirus type 1

PCV2

Porcine circovirus type 2

PCV3

Porcine circovirus type 3

PCVAD

Porcine circovirus type 2-associated disease

PDNS

Porcine dermatitis and nephropathy syndrome

PK15

Pig Kidney 15

PMWS

Postweaning multisystemic wasting syndrome

PPV

Porcine parvovirus

PRRS

Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome

TTV

Torque teno virus

vi


DANH MỤC BẢNG
Số bảng
2.1.

Tên bảng

Trang

Một số loại vắc xin phòng bệnh do PCV2 gây ra được phép nhập khẩu,
lưu hành tại Việt Nam hiện nay ........................................................................... 20

3.1.

Mồi sử dụng để phát hiện các virus nghiên cứu .................................................. 34

3.2.

Trình tự mồi dùng chẩn đoán và giải trình tự gen PCV2 ..................................... 35

3.3.

Trình tự mồi dùng giải trình tự gen PCV3 ........................................................... 35

3.4.

Tổng hợp tình hình lấy mẫu nghiên cứu .............................................................. 37

3.5.

Tóm tắt thông tin trình tự gen ORF2 của các chủng PCV2d dùng phân
tích đặc điểm dịch tễ học theo không gian - thời gian ......................................... 43

3.6.

Tóm tắt thông tin trình tự gen ORF2 của các chủng PCV2b dùng phân
tích đặc điểm dịch tễ học theo không gian - thời gian ......................................... 44

4.1.

Kết quả xác định sự có mặt của PCV2 từ các địa phương ................................... 47

4.2.

Tỷ lệ lưu hành PCV2 ở đàn lợn theo các quy mô khác nhau trên địa bàn
nghiên cứu ............................................................................................................ 52

4.3.

Kết quả xác định tỷ lệ lưu hành PCV2 ở các lứa tuổi lợn.................................... 53

4.4.

Trình tự gen được đưa trên Genbank ................................................................... 60

4.5.

Motif đặc trưng genotype của PCV2 lưu hành ở Việt Nam ................................ 64

4.6.

Kết quả xác định sự có mặt của virus đồng nhiễm .............................................. 78

4.7.

Kết quả xác định sự đồng nhiễm virus trong mẫu bệnh phẩm............................. 83

vii


DANH MỤC HÌNH
Số hình

Tên hình

Trang

2.1.

Phân bố tổng số lợn nuôi theo địa phương năm 2017 .......................................... 4

2.2.

Cây phát sinh loài của PCV2 ................................................................................ 5

2.3.

Cấu trúc PCV2 ...................................................................................................... 6

2.4.

Khả năng bài tiết PCV2 ở lợn bị nhiễm ............................................................... 8

2.5.

Phát triển của nhiễm PCV2 biểu hiện thành PCVAD ........................................ 10

2.6.

Một số triệu chứng lâm sàng điển hình ở lợn nghi mắc PMWS ........................ 12

2.7.

Một số triệu chứng bệnh tích điển hình ở lợn nghi mắc PMWS ........................ 13

2.8.

Sự phân bố PCV2 trên thế giới ........................................................................... 24

2.9.

Phân loại genotype của PCV2 ở Việt Nam ........................................................ 31

4.1.

Kết quả so sánh về phạm vi lấy mẫu phát hiện PCV2........................................ 46

4.2.

Tỷ lệ dương tính với PCV2 tại các địa phương thu mẫu .................................... 49

4.3.

Một số triệu chứng điển hình ở lợn mắc PMWS ................................................ 57

4.4.

Một số bệnh tích điển hình ở lợn mắc PMWS ................................................... 58

4.5.

Sơ đồ đính kèm đánh dấu 20 tỉnh có trình tự được phân tích............................. 61

4.6.

Cây phát sinh chủng loại của các chủng PCV2 phân lập ở Việt Nam ...................... 62

4.7.

Hệ tọa độ 2 chiều biểu diễn mối quan hệ gen giữa các chủng PCV2 phân
lập ở Việt Nam ................................................................................................... 65

4.8.

Phân bố các nhóm di truyền của PCV2 ở Việt Nam theo không gian và
thời gian .............................................................................................................. 67

4.9.

Kết quả phân tích sự phát tán theo không gian và thời gian của genotype
PCV2b giữa các nước ......................................................................................... 69

4.10.

Sự phát tán theo không gian và thời gian của chủng PCV2b nhánh 1 xâm
nhập vào Việt Nam ............................................................................................ 71

4.11.

Sự phát tán theo không gian và thời gian của chủng PCV2b nhánh 2 xâm
nhập vào Việt Nam ............................................................................................ 72

4.12.

Sự phát tán theo không gian và thời gian của genotype PCV2d ........................ 74

4.13.

Nguồn gốc, sự phát tán theo không gian và thời gian của genotype
PCV2d lưu hành ở Việt Nam.............................................................................. 75

viii


4.14.

Kết quả PCR xác định sự có mặt của virus đồng nhiễm .................................... 77

4.15.

Các tỉnh có mẫu dương tính với các virus đồng nhiễm ...................................... 80

4.16.

Sự phân bố theo không gian của virus đồng nhiễm PCV2 ................................. 86

4.17.

Trình tự gen ORF2 của 5 chủng PCV3 phân lập tại Việt Nam .......................... 88

4.18.

Khoảng cách di truyền giữa các chủng PCV3 của Việt Nam và thế giới ........... 89

4.19.

Cây phát sinh chủng loại của PCV3 lưu hành ở Việt Nam ................................ 90

4.20.

Quan hệ di truyền giữa PCV2 và PCV3 lưu hành ở Việt Nam .......................... 91

ix


TRÍCH YẾU LUẬN ÁN
Tên tác giả: Phạm Hồng Quân
Tên luận án: Nghiên cứu sự lưu hành và đặc điểm dịch tễ học phân tử của porcine
circovirus type 2 (PCV2) ở lợn nuôi tại Việt Nam
Chuyên ngành: Dịch tễ học thú y

Mã số: 9 64 01 08

Cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Mục đích nghiên cứu:
Xác định tỷ lệ lưu hành, đặc điểm dịch tễ học phân tử của PCV2 ở lợn nuôi tại
Việt Nam và xác định sự đồng nhiễm của PCV2 với một số ADN/ARN virus ở lợn
nuôi tại Việt Nam.
Phương pháp nghiên cứu:
Sử dụng phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên đơn giản nhiều giai đoạn và dựa
vào thuật toán thống kê. Phân tích mẫu bằng phương pháp realtime PCR/PCR để xác
định mẫu nhiễm PCV2.
Sử dụng chương trình tin sinh học Bioedit v7.1.3.0 (Hall, 1999) để phân tích
trình tự nucleotide. Sử dụng chương trình MEGA 7 (Tamura et al., 2013) để xây
dựng cây phát sinh chủng loại. Sử dụng phương pháp Principal Coordinate Analysis
(PCoA) để phân tích sự đa dạng về trình tự nucleotide gen ORF2 của 64 chủng
PCV2 phân lập ở Việt Nam từ 2004 đến 2017.
Sử dụng phần mềm Quantum GIS để mô tả mức độ và sự phân bố của PCV2 ở
lợn nuôi tại Việt Nam. Sử dụng phần mềm BEAST (Drummond et al., 2012) để xây
dựng lại quá trình phát tán (dispersal pathway) của các chủng PCV2d theo không
gian và thời gian (spatio-temporal dynamics), với các tham số của mô hình dựa theo
kết quả nghiên cứu trước đây (Lemey et al., 2009). Sử dụng chương trình SpreaD3
(Bielejec et al., 2016) để tính toán giá trị Bayes factor (cho biết mức tin cậy của dự
đoán các con đường phát tán). Giá trị BF trong khoảng BF > 150, 3 < BF < 150 và 1
< BF < 3 lần lượt ứng với mức dự đoán có độ tin cậy cao, có căn cứ và chưa đủ căn
cứ về con đường phát tán (Kass and Raftery, 1995).
Số liệu được xử lý bằng phần mềm MS Excel 2010; so sánh sự sai khác giữa

các yếu tố bằng phép thử χ2 (phần mềm Minitab 14.0) và phép thử Fisher Exact
Test (phần mềm SAS 9.1).

x


Kết quả chính và kết luận
* Tỷ lệ lưu hành porcine circovirus type 2 (PCV2) ở Việt Nam:
(i) Tỷ lệ lưu hành PCV2 ở Việt Nam là 41,14%. Tỷ lệ lưu hành PCV2 tại 14

tỉnh dao động từ 16% đến 88%; (ii) Ở các đàn lợn nuôi có quy mô khác nhau thì tỷ
lệ dương tính với PCV2 khác nhau, cụ thể tỷ lệ lưu hành PCV2 cao nhất ở những
trại có mức quy mô đàn >500 con (47,5%), thấp nhất là trại có quy mô đàn từ 100
– 300 con (27,42%). (iii) Ở các nhóm tuổi lợn đều phát hiện được mẫu dương tính
với PCV2, tỷ lệ lưu hành PCV2 ở lợn thịt là cao nhất (45,16%), lợn con theo mẹ và
lợn nái tương ứng là 39,58% và 32,35%.
* Kết quả nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử của porcine circovirus
type 2 (PCV2) lưu hành ở lợn nuôi tại Việt Nam:
Ở Việt Nam, chỉ có sự lưu hành genotype PCV2b bao gồm nhánh 1A/1B,
nhóm tái tổ hợp và genotype PCV2d. Ở cả 3 miền Bắc - Trung - Nam, đều thấy sự
hiện diện đồng thời nhiều nhóm di truyền của PCV2 ở một tỉnh, trong cùng một
khoảng thời gian. Các chủng phân lập ở Việt Nam thuộc genotype PCV2b có nguồn
gốc từ Trung Quốc và Hàn Quốc, các chủng thuộc genotype PCV2d từ 2004 - 2017
đều có nguồn gốc đầu tiên từ Trung Quốc, nhưng nằm ở các nhánh khác nhau của
cây phát sinh chủng loại.
* Kết quả xác định sự đồng nhiễm porcine circovirus type 2 (PCV2) với một
số virus:

PCV2 đồng nhiễm với 04 virus (PPV, TTV, PCV3, PRRS), cụ thể đồng
nhiễm PCV2/PPV là cao nhất (35,42%), PCV2/TTV (13,19%), PCV2/PRRS
(7,64%) và phát hiện được sự lưu hành của PCV3 với tỷ lệ 4,17% và các chủng
PCV3 đều thuộc về nhóm di truyền PCV3a.
Kết quả góp phần làm đầy đủ thêm bức tranh dịch tễ về virus PCV2 đang lưu
hành tại Việt Nam. Đồng thời, đã xác định thêm được sự lưu hành của loài virus mới
PCV3 ở lợn nuôi tại Việt Nam. Đây là cơ sở khoa học quan trọng để nâng cao các
biện pháp phòng chống nhằm giảm nguy cơ lợn mắc PMWS, nâng cao hiệu quả của
ngành chăn nuôi lợn.

xi


THESIS ABSTRACT
PhD candidate: Pham Hong Quan
Thesis title: Investigating the prevalence and the molecular epidemiology of porcine
circovirus type 2 (PCV2) circulating in pig’s population in Vietnam.
Major: Veterinary Epidemiology

Code: 9 64 01 08

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)
Research objective
Determining the prevalence and molecular epidemiological characteristics of
PCV2 and the co-infection of PCV2 with other DNA/RNA viruses in pigs in
Vietnam.
Materials and Methods
In this thesis, a simple multiple-stage random sampling design and statistical
algorithms were used. The collected samples were tested using rRT/PCR to detect
PCV2.
Nucleotide sequences was analyzed using Bioedit v7.1.3.0 (Hall, 1999).
Phylogenetic trees of PCV2 was generated using MEGA 7 (Tamura et al., 2013).
The diversity of the ORF2 genomic sequences of the 64 PCV2 viruses collected in
Vietnam between 2004 and 2017 was analyzed using Principal Coordinate Analysis
(PCoA) method.
The extent and distribution of PCV2 viruses circulated in Vietnam were
described using Quantum GIS software. The dispersal pathway of spatio-temporal
dynamics (PCV2d) with the parameters of the model based on the previous study
(Lemey et al., 2009) was reconstructed using BEAST software (Drummond et al.,
2012). The Bayes factor (BF) values (indicating the reliability of predicted pathways)
were calculated using the SpreaD3 program (Bielejec et al., 2016). BF values of 150,
3 and reliability, evidence and insufficient grounds for spread (Kass and Raftery, 1995).
The data is processed by MS Excel 2010 software; The difference between
factors were compared by the χ2 test (Minitab 14.0 software) and the Fisher Exact
Test (SAS 9.1 software).
Main findings and conclutions
* The prevalence of PCV2 in Vietnam:
(i) The prevalence of PCV2 in Vietnam was 41,14%. The prevalence of PCV2
in the 14 selected provinces ranged from 16% to 88%. (ii) In different herd sizes,

the prevalence of PCV2 was different. The prevalence of PCV2 was highest in

xii


pigs farms with herd size > 500 (47,5%), the lowest prevalence of PCV2 was
detected in herd sizes with the scale of 100 - 300 (27,42%). (iii) The PCV2
viruses were detected in all different age groups. The highest prevalence of
PCV2 was in the fattening pigs (45,16%), followed by piglets and sow groups
with 39,58% and 32,35%.
* Results of molecular epidemiological characteristics of porcine circovirus
type 2 (PCV2) circulating in pigs in Vietnam, 2004 - 2017:
In Vietnam, only the genotype PCV2b circulated including the 1A / 1B arm,
the recombinant and the PCV2d genotype. In all three regions of North - Central South, there was a simultaneous presence of several genetic groups of PCV2 in one
province at the same time. The PCV2 strains isolated in Vietnam of gennotype
PCV2b are originally belong to Chinese and Korean PCV2 viruses, the PCV2 strains
of genotype PCV2d from 2004 to 2017 are originally belong to Chinese PCV2
viruses, but they were in different branches of the PCV2 phylogenetic tree.
* Results of PCV2 co-infection with others viruses in pigs:
Results of PCV2 co-infection with others viruses (PPV, TTV, PCV3, PRRS),
co-infection PCV2/PPV was highest at 35,42%, PCV2/TTV at 13,19%,
PCV2/PRRS at 7,64% and identification of new PCV3 virus in Vietnam with a
detection rate of 4,17% and five PCV3 strains in Vietnam were belong to the PCV3a
genetic group.
This result contributes to the overall epidemiological picture of PCV2 virus in
Vietnam. At the same time, the prevalence of new PCV3 virus in pigs in Vietnam
was further identified. This is a very important scientific basis to improve the
prevention and control measures of the disease to reduce the risk of PMWS and to
improve the efficiency of the pig industry.
Key words: PCV2 genotype 2d, molecular epidemiology, spatio-temporal
dynamics.

xiii


PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Trong những năm gần đây, ngành chăn nuôi nói chung và chăn nuôi lợn nói
riêng đang ngày càng phát triển và chiếm vị trí quan trọng trong nền nông nghiệp
nước ta. Tổng đàn lợn trên cả nước tại thời điểm 01/10/2017 đạt trên 27,4 triệu
con (Cục Chăn nuôi, 2017). Cùng với các tiến bộ kỹ thuật về giống, thức ăn,
quản lý, thú y kết hợp với các biện pháp khuyến khích chăn nuôi của nhà nước
làm cho ngành chăn nuôi lợn ở nước ta phát triển với tốc độ tương đối cao, mang
lại hiệu quả kinh tế cho người dân đồng thời góp phần vào nền kinh tế quốc gia.
Tuy nhiên, bên cạnh với sự phát triển đó, ngành chăn nuôi lợn cũng có
nhiều thách thức đó là sự gia tăng và diễn biến ngày càng phức tạp của dịch bệnh,
trong đó Hội chứng bệnh do PCV2 được coi là nguyên nhân gây thiệt hại kinh tế
nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi lợn. Một số nghiên cứu cho thấy thiệt hại
hằng năm do PCV2 gây ra đối với ngành chăn nuôi lợn là rất lớn: tại Anh là
khoảng 35 triệu bảng anh và đối với các nước thuộc liên minh châu Âu vào
khoảng 562 - 900 triệu euro (Armstrong and Bishop, 2004). Tại Mỹ, PCVAD gây
thiệt hại kinh tế trung bình 3 - 4 đô la/lợn, thậm chí có đàn lên đến 20 đô la/lợn
(Gillespie et al., 2009) và PCV2 được coi là virus gây bệnh quan trọng nhất trong
ngành chăn nuôi (Opriessnig et al., 2007).
Tại Việt Nam, Hội chứng còi cọc ở lợn con sau cai sữa đã được chứng minh
xuất hiện lần đầu tiên vào năm 2000, gây ra những ảnh hưởng đáng kể cho ngành
chăn nuôi lợn (Nguyễn Thị Thu Hồng và cs., 2006). Tuy nhiên các nghiên cứu về
sự lưu hành, đặc điểm dịch tễ học và sự đồng nhiễm của PCV2 với một số mầm
bệnh khác đến nay còn hạn chế và mới chỉ tập trung theo vùng, miền như các
nghiên cứu về sự lưu hành và đặc điểm dịch tễ học tại miền Nam: (Nguyễn Thị
Thu Hồng và cs., 2006; Lâm Thị Thu Hương và cs., 2005) xác định có sự lưu
hành của PCV2 ở Thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận; Nguyễn Ngọc Hải
và cs. (2013) ghi nhận các chủng PCV2 thu nhận tại tỉnh Đồng Nai và TP. Hồ
Chí Minh chủ yếu là 2 kiểu gen PCV2b và PCV2d; nghiên cứu của Lê Thị Thu
Phương và cs. (2018) khẳng định PCV2 lưu hành ở 13 tỉnh phía Nam thuộc các
genotype 2b, 2d và nhóm tái tổ hợp; tại miền Trung: Phạm Hoàng Sơn Hưng và
cs. (2018) ghi nhận sự lưu hành PCV2 ở Nghệ An và tại miền Bắc: (Huỳnh Thị
Mỹ Lệ và cs., 2012; Nguyễn Viết Không và cs., 2013; Trương Anh Đức và cs.,
1


2015; Bùi Trần Anh Đào và cs., 2015) đều khẳng định sự hiện diện và nguy cơ
ngày càng lan rộng của PCV2 ở mọi quy mô chăn nuôi lợn. Huỳnh Thị Mỹ Lệ và
cs. (2015) giải trình tự và phân tích trình tự gen của 10 chủng PCV2 phân lập
được tại một số tỉnh miền Bắc trong năm 2013-2014 cho thấy có sự hiện diện của
nhánh 1A/1B thuộc genotype PCV2b, nhóm tái tổ hợp (CRF), và genotype
PCV2d mới được công nhận trên thế giới. Các nghiên cứu về sự đồng nhiễm của
PCV2 với một số mầm bệnh khác, đến nay mới có Hoàng Văn Năm (2012) đánh
giá về tỷ lệ đồng nhiễm PRRRV và PCV2 ở lợn mắc PRRS, Lâm Thị Thu
Hương (2012) nghiên cứu một số vi khuẩn cộng nhiễm trên heo mắc hội chứng
gầy còm sau cai sữa. Trong thực tế có rất nhiều virus (ví dụ như PRRS, PPV,
TTV,...) được phát hiện nhiễm ghép với PCV2 từ các ca mắc hội chứng còi cọc
ở lợn con sau cai sữa. Thử nghiệm lâm sàng đã chứng minh trong điều kiện
thực nghiệm một mình PCV2 không gây bệnh mà kết hợp với một số virus như
PRRS (Changhoon et al., 2014), PPV (Krakowka et al., 2000), TTV (Lee et al.,
2010) mới gây bệnh thể lâm sàng.
Xuất phát từ các vấn đề nêu trên, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu
nhằm làm rõ về sự lưu hành, hoàn thiện bức tranh về đặc điểm dịch tễ học phân
tử và sự đồng nhiễm của PCV2 với một số virus trong điều kiện sản xuất thực tế
của các cơ sở chăn nuôi lợn xuyên suốt ở cả ba miền Bắc – Trung – Nam trên cả
nước. Kết quả của đề tài là cơ sở khoa học quan trọng mở ra hướng nghiên cứu
mới và đề ra các biện pháp phòng chống bệnh do PCV2 có hiệu quả, nhất là công
tác lựa chọn chủng virus phù hợp trong sản xuất vacxin phòng bệnh cho đàn lợn
trong nước.
1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI
- Xác định sự lưu hành và một số đặc điểm dịch tễ học phân tử của PCV2 ở
lợn nuôi tại Việt Nam.
- Xác định sự đồng nhiễm của PCV2 với một số ADN, ARN virus ở lợn
nuôi tại Việt Nam.
1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Mẫu được thu thập từ các trại nuôi lợn thuộc 14 tỉnh nghiên cứu đại diện
cho ba miền Bắc – Trung – Nam ở Việt Nam bao gồm: Thái Nguyên, Hà Nội,
Hòa Bình, Bắc Ninh, Hưng Yên, Hải Phòng, Hải Dương, Hà Tĩnh, Quảng Trị,

2


Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Bình Dương, Tiền Giang và Vĩnh Long.
Thời gian thực hiện từ tháng 6 năm 2015 đến tháng 3 năm 2019.
1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI
- Xác định được tỷ lệ lưu hành và bổ sung đầy đủ thêm bức tranh dịch tễ về
virus PCV2 đang lưu hành tại Việt Nam.
- Đánh giá được sự đồng nhiễm của PCV2 với một số virus (PPV, TTV,
PRRS, PCV3) ở lợn nuôi tại Việt Nam.
- Trong quá trình thực hiện đề tài đã xác định thêm được sự lưu hành của
loài virus mới PCV3 ở lợn nuôi tại Việt Nam.
1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
1.5.1. Ý nghĩa khoa học
- Đây là một trong những nghiên cứu có hệ thống về sự lưu hành, đặc điểm
dịch tễ học phân tử của PCV2 và sự đồng nhiễm của PCV2 với một số virus ở
lợn nuôi tại Việt Nam.
- Đây là nghiên cứu mới về Porcine circovirus 3 (PCV3), một loài virus mới
lưu hành của ở đàn lợn nuôi tại Việt Nam.
- Kết quả nghiên cứu của đề tài là tài liệu tham khảo tốt phục vụ cho những
nghiên cứu tiếp theo về PCV.
1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Khuyến cáo cho việc sử dụng vắc xin phòng bệnh phù hợp với nhánh
virus mới lưu hành trong thực tế ở mỗi khu vực nghiên cứu.
- Kết quả nghiên cứu của đề tài giúp chủ động đề xuất được biện pháp
phòng PCVAD có hiệu quả, hạn chế thiệt hại do dịch bệnh gây ra bởi PCV2 cho
đàn lợn nuôi tại Việt Nam.
- Trên cơ sở phát hiện của đề tài về một loài virus mới PCV3, mở ra hướng
nghiên cứu sâu hơn về đánh giá sự lưu hành, cũng như vai trò gây bệnh và tác
động của PCV3 tới sức sản xuất của đàn lợn để đưa ra các giải pháp phòng,
chống có hiệu quả.

3


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. TÌNH HÌNH CHĂN NUÔI LỢN TẠI VIỆT NAM
Ngành chăn nuôi lợn đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển nông
nghiệp của nước ta. Hiện nước ta có đàn lợn khoảng 27,4 triệu con, tốc độ tăng
trưởng đàn lợn, giai đoạn 2007 – 2017 đạt 0,91%/năm (Cục Chăn nuôi, 2017).
Ngành chăn nuôi lợn của Việt Nam chủ yếu là chăn nuôi nhỏ lẻ ở qui mô hộ gia
đình, môi trường chăn nuôi không đảm bảo vệ sinh thú y, phong tục tập quán của
người Việt Nam mang nhiều yếu tố nguy cơ làm phát sinh và lây lan dịch bệnh ở
lợn như: sử dụng thịt lợn tươi sống là chủ yếu, giết mổ nhỏ lẻ tại hộ gia đình, sử
dụng cả thịt lợn mắc bệnh, buôn bán lợn nhỏ lẻ không qua kiểm dịch thú y, chăn
nuôi lợn tận dụng nguồn thức ăn thừa từ các nhà hàng,... nên nhiều loại dịch bệnh
ở lợn, trong đó có Hội chứng bệnh do PCV2 có thể tồn tại, lưu hành trong thời
gian dài.

Hình 2.1. Phân bố tổng số lợn nuôi theo địa phương năm 2017
Nguồn: Cục Chăn nuôi (2017)

4


2.2. GIỚI THIỆU VỀ PCV2 VÀ BỆNH DO PCV2 GÂY RA Ở LỢN NUÔI
2.2.1. Giới thiệu về PCV2
2.2.1.1. Phân loại
PCV2 thuộc giống Circovirus, họ Circoviridae (Lukert et al., 1995). Họ
circoviridae gồm hai giống, được xác định là nguyên nhân gây một số bệnh ở gia
súc và gia cầm:
- Giống Anellovirus: gồm một số circovirus của người như Transfusion
Transmitted Virus hay Torque teno virus (TTV). Virus này được phát hiện lần
đầu tiên vào năm 1997 tại Nhật Bản và thường phân lập được từ bệnh nhân mắc
bệnh gan; tuy nhiên chúng không được coi là nguyên nhân gây bệnh. Một số
nghiên cứu gần đây cho thấy TTV cũng có thể gây bệnh cho một số loài vật nuôi
khác như lợn, và có thể phân lập được từ huyết thanh của lợn mắc PMWS tại Tây
Ban Nha (Francisco de Grau, 2012).
- Giống Circovirus: gồm các virus đã phát hiện được từ động vật như
porcine circovirus type 1 và 2 (circovirus ở lợn), circovirus ở chim hoàng yến
(Phenix et al., 2001), circovirus ở chim bồ câu (Woods et al., 1993),
circovirus ở chim sẻ (Shivaprasad et al., 2004), circovirus ở mòng biển
(Smyth et al., 2006), circovirus ở thiên nga (Halami et al., 2008), circovirus ở
ngỗng (Soike et al., 1999), circovirus ở vịt (Hattermann et al., 2003),
circovirus ở quạ (Stewart et al., 2006).

Hình 2.2. Cây phát sinh loài của PCV2
Nguồn: Franzo et al. (2015)

5


Về phân loại virus, cho tới năm 2015, PCV2 có 4 genotype (PCV2a, PCV2b,
PCV2c và PCV2d) và 8 nhánh di truyền (cluster) 2A-2E và 1A-1C. Dữ liệu hiện
có cho thấy PCV2a và PCV2b đang chiếm ưu thế trên toàn thế giới. PCV2b chủ
yếu được phát hiện kể từ năm 2003. PCV2c được báo cáo đầu tiên ở Đan Mạch
(Dupont et al., 2008) và gần đây được phát hiện từ lợn rừng hoang dã ở Brazin
(Franzo et al., 2015b) và các mẫu thực địa thu từ lợn bệnh tại Trung Quốc (Liu et
al., 2016). PCV2d được báo cáo từ Trung Quốc (Gou et al., 2010), gần đây nó
được khẳng định chiếm ưu thế trong các ca bệnh nhiễm PCV2 ở Hoa Kỳ (Xiao et
al., 2015), ở Hàn Quốc (Kwon et al., 2017) và toàn cầu (Xiao et al., 2015).
2.2.1.2. Hình thái, cấu trúc
PCV mang bộ gen là ADN virus sợi đơn vòng chứa khoảng 1759 nucleotide
(PCV1) và khoảng 1767 - 1768 nucleotide (PCV2) (Gou et al., 2010; Olvera et
al., 2007).

Hình 2.3. Cấu trúc PCV2
Nguồn: Gillespie et al. (2009)

Dựa trên các nghiên cứu phát sinh loài và PCR-RFLP trước đó, PCV2 có 4
genotype (PCV2a, PCV2b, PCV2c và PCV2d) và 8 nhóm di truyền: PCV2b (1A1C) và PCV2a (2A-2E) (Saha et al., 2012; Franzo et al., 2015; Guo et al., 2010;
Segalés et al., 2008; Olvera et al., 2007) được công nhận.
Theo Hamel et al. (1998) PCV là một virus trần không có vỏ bọc bên ngoài.
Bộ gen gồm 11 khung đọc mở ORFs (open reading frame) mã hóa cho các phân tử
protein của virus, trong đó hai khung đọc mở chính (ORF1 và ORF2) theo hướng
ngược nhau.
6


Hiện nay trên thế giới các nghiên cứu về PCV thường tập trung vào ba ORF
là ORF1, ORF2 và ORF3.
ORF1 (vị trí 51 đến 995) mã hóa cho các protein liên quan đến sự nhân lên
của virus (viral replication protein – Rep), có khối lượng phân tử 35,8 kDa
(Mankertz et al., 1998). Sự tương đồng amino acid của phân tử protein quy định
bởi ORF1 giữa PCV1 và PCV2 khoảng là 85%.
ORF2 (vị trí 1734/1735 đến 1030/1033/1034) mã hóa cho các protein liên
quan đến sự hình thành vỏ capsid của virus (capsid protein – Cap), có khối lượng
phân tử 27,8 kDa (Mankertz et al., 1998; Nawagitgul et al., 2000). Sự tương đồng
amino acid của phân tử protein do ORF2 mã hóa giữa PCV1 và PCV2 là 66%.
Sản phẩm ORF2 chứa các điểm quyết định kháng nguyên, kích thích sinh kháng
thể chống lại virus, vì vậy người ta sử dụng kháng thể nguồn gốc ORF2 như một
công cụ để chẩn đoán phân biệt PCV.
ORF3 (vị trí 671 đến 357) mã hóa protein có khối lượng phân tử 11,9
kDa, được cho là có liên quan đến hiện tượng apoptosis ở tế bào nhiễm virus
(Liu et al., 2006); sự tương đồng amino acid của protein này giữa PCV1 và
PCV2 là 62%.
2.2.1.3. Sức đề kháng
PCV2 có khả năng sống được 15 phút ở nhiệt độ 70oC, bị bất hoạt ở pH= 3.
Ở nhiệt độ phòng, khi bị tác động trong 10 phút bởi một số chất sát trùng như
chlorhexidine, formaldehyde, iodine, vikon và cồn thì hiệu giá của virus sẽ giảm.
Nghiên cứu in vitro cho thấy PCV2 có khả năng đề kháng tốt với nhiệt độ.
Nhiệt độ > 75oC trong 1 giờ mới làm giảm hiệu giá virus. Do đó, PCV2 có khả
năng tồn tại một thời gian dài trong điều kiện tại các trang trại. Có thể phân lập
được PCV2 trong bệnh phẩm của lợn bảo quản ở -70oC (Ellis et al., 1998).
Khả năng đề kháng với chất sát trùng cũng được nhiều tác giả quan tâm
nghiên cứu trong điều kiện in vitro. Potassium peroxymonosulfate (KHSO5),
sodium hydroxide (NaOH) khiến cho PCV2 bị bất hoạt trong thời gian ngắn thì
hỗn dịch NH4/glutaraldehyde cần phải thời gian dài hơn mới bất hoạt được virus
này (Kim et al., 2010). Formaldehyde có hiệu quả kém hơn so với các chế phẩm
trong thành phần có iodine và phenol, mà không ảnh hưởng đến hiệu giá của
virus (Martin et al., 2010). Nhìn chung, việc giảm hiệu giá của PCV2 trong điều
kiện in vitro khi sử dụng sản phẩm có chứa chất oxy hóa, halogen hoặc NaOH là
7


rõ rệt hơn so với các chế phẩm có iodine, alcohol, phenol hoặc formaldehyde
(Royer et al., 2001). Việc bất hoạt hoàn toàn PCV2 trong điều kiện in vitro rất
khó khăn và đòi hỏi thời gian dài (Yilmaz and Kaleta, 2004).
2.2.2. Dịch tễ học của bệnh do PCV2
2.2.2.1. Loài cảm thụ
PCV2 phân bố rộng rãi ở loài lợn, các loài vật khác không mẫn cảm với
PCV2. Gần đây, nghiên cứu của (Potter et al., 2012) đã khẳng định bản chất di
truyền của từng giống lợn có ảnh hưởng đến mức độ mẫn cảm với PCVAD.
Chen et al. (2007) cho biết trong các loài được kiểm tra huyết thanh học
gồm lợn, gà, vịt, dê và trâu, bò thì chỉ xác định được kháng thể kháng PCV2
trong huyết thanh của lợn.
2.2.2.2. Chất chứa mầm bệnh
Mầm bệnh có trong dịch bài xuất và bài tiết của lợn mắc hoặc không mắc
PMWS, trong huyết thanh lợn có triệu chứng lâm sàng cũng như lợn khỏe mạnh,
không có triệu chứng (Segalés et al., 2005).

Hình 2.4. Khả năng bài tiết PCV2 ở lợn bị nhiễm
Nguồn: Segalés et al. (2008)

Virus còn có thể bài thải qua nhiều đường khác nhau trong một thời gian
dài; trong đó bài thải qua tinh dịch, phân, nước tiểu, sữa non, sữa từ lợn nhiễm
bệnh (Chiou et al., 2011; Patterson et al., 2010; Segalés et al., 2005). Việc tăng
bài thải virus ở động vật có biểu hiện triệu chứng lâm sàng của PCVAD thường
cao hơn rõ rệt so với lợn không có biểu hiện triệu chứng bệnh.
8


2.2.2.3. Phương thức truyền lây
PCV2 có thể dễ dàng lây nhiễm và gây bệnh ở lợn khi các yếu tố ngoại
cảnh bất lợi tác động vào như: mật độ quá dày, lợn đang bị stress, chăm sóc vệ
sinh kém, hệ thống cùng vào cùng ra chưa áp dụng đúng mức yêu cầu…
Sự lây lan của PCV2 ở đàn lợn địa phương đã được báo cáo ở các phạm vi
khác nhau từ lợn sang lợn (Dupont et al., 2009; Shen et al., 2010), từ người sang
lợn (Alarcon et al., 2011), từ động vật gặm nhấm sang lợn (Lórincz et al., 2010),
từ ký sinh trùng sang lợn (Blunt et al., 2011; Yang et al., 2012), từ môi trường
chuồng trại sang lợn (Verreault et al., 2010).
Mầm bệnh xâm nhập vào cơ thể chủ yếu qua đường miệng - mũi. Bệnh có
thể lây qua tiếp xúc, qua phân, qua đường hô hấp và tinh dịch của lợn đực giống.
Bằng kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) có thể xác định được mầm bệnh
có trong dịch bài xuất và bài tiết của lợn mắc hoặc không mắc PMWS, trong
huyết thanh lợn có triệu chứng lâm sàng cũng như lợn khỏe mạnh, không có triệu
chứng (Segalés et al., 2005).
PCV2 cũng có thể truyền trực tiếp từ mẹ sang con qua nhau thai, là nguyên
nhân khiến cho mầm bệnh tồn tại lâu trong đàn, lợn con bị nhiễm virus ngay từ
khi mới sinh. Tuy nhiên, đường truyền lây này ít gặp. Ngoài ra, PCV2 còn được
tìm thấy trong sữa đầu, nhưng để khẳng định được đây có phải là đường truyền
lây bệnh hay không thì cần phải tiếp tục nghiên cứu (Gillespie et al., 2009).
2.2.3. Cơ chế sinh bệnh
Cho đến nay, ảnh hưởng của PCV2 đến hệ miễn dịch của lợn vẫn còn nhiều
tranh cãi và cần phải có các nghiên cứu để làm sáng tỏ. Nghiên cứu cần tập trung
làm rõ tác động qua lại giữa giai đoạn sau nhiễm trùng và trước khi biểu hiện
triệu chứng lâm sàng để giải thích hiện tượng nhiễm trùng cấp tính hoặc mạn tính.
Điểm đặc trưng quan trọng nhất quan sát được khi lợn bị hội chứng
PCVAD là số lượng bạch cầu giảm rất nhanh (leucopenia). PCV2 tác động làm
giảm tế bào lympho và các tế bào có thẩm quyền miễn dịch như tế bào đơn nhân,
đại thực bào và tế bào tua (dendritic cell) gây suy giảm miễn dịch dẫn tới tác
động đáng kể lên sức sản xuất ở lợn như tăng trọng trung bình hàng ngày, tỷ lệ
chuyển đổi thức ăn, khoảng thời gian mang thai, lứa đẻ, stress, đồng nhiễm
(Opriessnig et al., 2007), từ đó tạo điều kiện thuận lợi cho nhiều loại mầm bệnh
khác xâm nhập và gây bệnh.
9


Hình 2.5. Phát triển của nhiễm PCV2 biểu hiện thành PCVAD
Nguồn: Opriessnig (2007)

Nghiên cứu với những lợn mắc bệnh tự nhiên cho thấy mất các nang
lympho và sự giảm tế bào lympho có liên quan đến sự giảm các tế bào tua
(dendritic cell) và tế bào lưới cũng như sự giảm tế bào lympho B và lympho T,
CD+ gây suy giảm miễn dịch, tạo điều kiện thuận lợi cho nhiều loại mầm bệnh
khác xâm nhập và gây bệnh (Darwich et al., 2003). Ngoài ra, hiện tượng giảm
sản sinh interferon nhưng tăng lượng IL-10 ở những lợn thực nghiệm bị nhiễm
PCV2 cũng đã được chứng minh (Allan et al., 2010).
Opriessnig et al. (2007) cho biết mặc dù hầu hết lợn trong đàn có thể bị
nhiễm PCV2 nhưng chỉ có khoảng 5 – 30% lợn mẫn cảm biểu hiện triệu chứng.
Có bốn yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh PCVAD do nhiễm PCV2 là cấu trúc và
độc lực virus, giống lợn, sự đồng nhiễm, trạng thái miễn dịch của cơ thể. Ở lợn
cùng tiêm một loại vắc xin nhưng có chất bổ trợ khác nhau (đặc biệt bổ trợ dầu) sẽ
làm cho thời gian nhiễm virus cũng như số lượng PCV2 trong huyết thanh và mô
bào tăng lên, tế bào lympho bị tổn thương nặng hơn so với những lợn được tiêm
vắc xin bổ trợ là keo phèn (Vanderstichel and Hurnik, 2003; Marlin et al., 2006).
Thí nghiệm của (Krakowka et al., 2007) cũng cho thấy khi lợn được tiêm vắc xin
phòng bệnh do M. hyopneumoniae, sau đó gây nhiễm PCV2 thì thời gian PCV2 có

10


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×