Tải bản đầy đủ

Đánh giá tác dụng của cao chiết tô mộc (caesalpinia sappan l ) đối với vi khuẩn escherichia coli gây bệnh trên gà lương phượng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN TUẤN ĐẠT

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CỦA CAO CHIẾT TÔ MỘC
(CAESALPINIA SAPPAN L.) ĐỐI VỚI VI KHUẨN ESCHERICHIA
COLI GÂY BỆNH TRÊN GÀ LƯƠNG PHƯỢNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI, 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT


HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN TUẤN ĐẠT

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CỦA CAO CHIẾT TÔ MỘC
(CAESALPINIA SAPPAN L.) ĐỐI VỚI VI KHUẨN ESCHERICHIA
COLI GÂY BỆNH TRÊN GÀ LƯƠNG PHƯỢNG

CHUYÊN NGÀNH: THÚ Y
MÃ SỐ: 60640101

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. NGUYỄN BÁ TIẾP

HÀ NỘI, 2015


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu và
kết quả được nêu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ
một công trình nào khác.
Người cam đoan

Nguyễn Tuấn Đạt

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông
nghiệp

Page i


LỜI CẢM ƠN
Khi hoàn thành luận văn này, tôi xin chân thành cảm ơn:
Gia đình và quý thầy cô đã dành nhiều thời gian động viên và giúp đỡ tôi
hoàn thành ước mơ được học hỏi của tôi.
Thầy TS. Nguyễn Bá Tiếp đã dành nhiều thời gian, tận tình hướng dẫn tôi
trong suốt thời gian thực tập nghiên cứu để hoàn thành luận văn này.
Cô PGS. TS. Lâm Thị Thu Hương đã truyền đạt nhưng kiến thức, kinh
nghiệm quí báu tạo cơ sở giúp tôi tiến hành phát triển nghiên cứu và hoàn thiện luận
văn này.


Quý thầy cô giáo Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam, Khoa Thú Y, Phòng
Đào tạo Sau đại học, ban giám hiệu học viện đã tận tình giảng dạy và tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Các thầy cô giáo trong Khoa Thú Y, Khoa Chăn Nuôi và Nuôi Trồng Thủy
Sản của học viện, các bạn sinh viên K54 đã tham gia và chia sẽ giúp tôi hoàn thành
luận văn này.
Các anh chị em Bác sĩ thú y Trần Thế Sơn, Bác sĩ thú y Nguyễn Hữu Phú
trong công ty TNHH Thương Mại Sản Xuất Nu Pha đã giúp đỡ tôi thực hiện đề tài
này.
Các anh chị em trong lớp Cao học thú y khóa 21 đã đoàn kết giúp đỡ, chia sẻ
và động viên tôi trong suốt hơn hai năm học cao học.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn sâu sắc những người thân trong gia đình: Mẹ và
bố mẹ vợ tôi, người vợ yêu quý của tôi đã là chỗ dựa vững chắc cho tôi về tình cảm
cũng như vật chất cần thiết giúp tôi có nghị lực học tập, công tác, và phấn đấu trong
cuộc sống.
Người viết luận văn

Nguyễn Tuấn Đạt

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông
nghiệp

Page ii


M

Ci

Lời
cam
Lời

ii

cảm
Mục
lục
Danh

iii

sách
Danh
mục
Danh

vi
vii

mục
Danh
mục
LỜI

vii
1i

MỞ
1
Đặt
2

1

Mục
2.1
Mục
2.2

1

Yêu
CHƯ
ƠNG
1.1 Giới

2

1.1
.1
1.1

thiệu

tả
Phân

2

.2
1.1
.3
1.1

bố,

tả
Thàn

3

.4
1.1
.5
1.1

hTác
dụng
Công

5

.6
1.1
.7
1.2

dụng
Một
số
Các

7

v

1
1
2
3
3
6

8
phươ
1.3 Một
9
1.3 số
Phươ 9
.1
1.3 ng
Phươ 12
.2
1.4 ng

13
lược
Đại 13
cươn
Đặc 13
.2
1.4 điểm
Cấu 15
.3
1.4 trúc
Truy 17
1.4
.1
1.4

.4

ền

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông
nghiệp

Page 3


1.4 C 1
.5
1.4 ơ
T 8
1
.6
1.4 ri
C 29
.7
h 0
1.4 P
2
.8 h 0
CHƯƠNG
2NỘI
2.1 Đ 2
2.1
.1
2.1

ối
Đ
ối
N

1
2
1
2

.2
2.2 ội
Đ 1
2
ịa
2.3 N 1
2
2.4 gP
2.4 hQ

2
2
4
2

.1
2.4
.2
2.4

ui
K
iể
Đ

4
2
6
2

3.1
.1
3.1

ết
K
ết
K

0
3
0
3

.3 á 7
CHƯƠNG
33.1KẾT
K 3

.2
3.2 ết
K 1
3
ết
3.2 T 2
3
.1
3.2
.2
3.3

ín
T
ín
T

2
3
5
3

3.3
.1
3.3

áT 8
3
ỷl
T 8

.2

á 4
E
. 2

KẾT
LUẬN
1 K 4
2 ết
Đ 7
4

ề 7
TÀI LIỆU
THAM

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông
nghiệp

Page 4


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

E. coli

: Escherichia coli

IB

: Infectious Bronchitis

MHA

: Mueller – Hinton Agar

EMB

: Eosin Methylen Blue

MCK

: MacConkey

KIA

: Kligler Iron Agar

BGA

: Brilliant green agar

BHI

: Bran Heart Infusion Broth

NB

: Nutrient Broth

NA

: Nutrient Aga

ATCC

: American Type Culture Collection

MIC

: Minimum Inhibitory Concentration

MeOH

: Methanol

EtOH

: Ethanol

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông
nghiệp

Page 5


DANH MỤC BẢNG
S
TRAN
T
G
T
T h

4
2.1 Qu
23
y
2.2 Bả
25
ng
2.3 Cô
25
ng
2.4 Sơ
27
đồ
2.5 Đ
27
ườ
2.6 Bố
28
trí
3.1 Kế
30
t
3.2 Đường
kính

3
khuẩn
4
3.3 Đường
kính
khuẩn
3
của
6
3.4 Đường
kính
trung
3
bình
7
3.5 Tỷ lệ
3

9
3.6 Tỷ lệ
4

1
3.7 Tỷ lệ
4
gà chết 3
3.8 Tỷ lệ
4

5

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông
nghiệp

Page 6


DANH MỤC ẢNH
STT

TÊN ẢNH

TRANG

1.1

Quả của cây Tô mộc

2

1.2

Dược liệu Tô Mộc

3

1.3

Cấu trúc của Brasilin

4

1.4

Trực khuẩn E.coli bắt màu Gram (-) với độ phóng đại 1000 lần

14

3.1

Mẫu cao tô mộc

31

3.2

Mẫu chai bảo quản sản phẩm

32

3.3

Đường kính vòng vô khuẩn của cao chiết Tô mộc trên vi khuẩn E. coli
chuẩn (ATCC 25922)

35

3.4

Màng bao tim dày đục ở gà bệnh lô đối chứng dương

40

3.5

Xoang bao tim tích dịch vàng và viêm màng bao tim (lô gây bệnh thực
nghiệm sau khi sử dụng chế phẩm)

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông
nghiệp

44

Page vii


DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH

đồ

đồ

nh

nh

nh

nh

Q
ui
M
ô
T

T

T

T


2
3
2
4
4
0
4
2
4
4
4
6

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông
nghiệp

Page viii


LỜI MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Vi khuẩn được liệt kê ở vị trí đầu tiên trong số các vi sinh vật gây bệnh cơ
hội. Đa số các kháng sinh hiện nay được sử dụng trong việc điều trị nhiễm trùng do
vi khuẩn. Tuy nhiên, việc sử dụng rộng rãi và không đúng cách các loại kháng sinh
đã tạo ra rất nhiều loại vi khuẩn đề kháng kháng sinh. Không những thế việc sử
dụng nhiều kháng sinh sẽ gây ra các tác dụng không mong muốn như: độc tính, quá
mẫn, suy giảm miễn dịch vật nuôi và tồn dư trong sản phẩm động vật gây ảnh
hưởng đến sức khỏe cộng đồng.
Hơn nữa, các loại kháng sinh mới, kháng sinh phổ rộng có chi phí cao. Từ
những nhược điểm trên cho thấy phải cần thiết tìm kiếm các biện pháp khác để điều
trị các bệnh do nhiễm khuẩn gây ra.
Với xu hướng chủ động nguồn nguyên liệu trong nước, giảm nhập siêu cùng
xu hướng thế giới hiện nay là sử dụng các loại thuốc từ cây dược liệu truyền thống,
các loại thuốc này có thể khắc phục được nhược điểm của kháng sinh có nguồn gốc
nguyên sinh vật và các hóa dược gây ra. Để đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của thảo
dược, được sự đồng ý của Bộ Môn Giải Phẩu – Tổ chức, Ban Chủ Nhiệm Khoa Thú
Y, Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam với sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Bá Tiếp
chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu: “ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CỦA
CAO CHIẾT TÔ MỘC (CAESALPINIA SAPPAN L.) ĐỐI VỚI VI KHUẨN
ESCHERICHIA COLI GÂY BỆNH TRÊN GÀ LƯƠNG PHƯỢNG ".
2. Mục tiêu và yêu vầu
2.1. Mục tiêu
Đánh giá hiệu lực kháng khuẩn của cao chiết xuất từ dược liệu Tô mộc trên
vi khuẩn E. coli trong phòng thí nghiệm và trên giống gà Lương Phương được gây
bệnh với vi khuẩn E. coli.
2.2. Yêu cầu
Hoàn thành chế phẩm chứa 10% cao chiết từ gổ lỏi của dược liệu tô mộc.
Bố trí thí nghiệm thử kháng sinh đồ trong phòng thí nghiệm.
Bố trí thí nghiệm phòng và trị bệnh doE. coli trên gà.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông
nghiệp

Page 1


CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1 Giới thiệu cây Tô mộc
Cây Caesalpinia sappan (Cs) được gọi là Tô mộc có nhiều ở một số tỉnh
miền núi nước ta, gỗ thân cây có tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm, tiêu viêm, và
sử dụng để điều trị một số bệnh như bệnh thấp khớp, viêm v.v… và cũng ñược dùng
làm chất chỉ thị màu.
Cây Tô mộc còn có tên là cây Gỗ vang, cây Vang nhuộm, cây Tô phượng
(do cây này mọc ở nước Tô Phượng, một nước cổ ở vùng hải đảo Trung Quốc).
Tên khoa học Caesalpinia sappan L.
Thuộc họ Vang Caesalpiniaceae.
Tô mộc (Lignum Caesalpinia sappan) là gỗ phơi khô của cây Gỗ vang hay
cây Tô mộc. Vì vị thuốc sản xuất ở Tô Phượng nên có tên (Tô là Tô Phượng, mộc là
gỗ) (Đỗ Tất Lợi, 2005).
1.1.1. Mô tả cây
Cây Tô mộc cao 7 – 10 m. Thân có gai. Lá kép lông chim, gồm 12 đôi, hay
hơn
12 đôi lá chét, hơi dẹp ở phía dưới, tròn ở đầu, mặt trên nhẵn, mặt dưới có lông. Hoa
của cây Tô mộc có 5 cánh màu vàng mọc thành chùm, nhị hơi lồi ra, nửa dưới chỉ nhị
hơi có lông, bầu hoa phủ lông xám. Quả là một giáp dẹt hình trứng ngược dày, dai,
cứng, dài từ
7 – 10 cm, rộng từ 3,5 – 4 cm, trong có 3 – 4 hạt màu nâu (Đỗ Tất Lợi,
2005).


Ảnh 1.1: Quả của cây Tô mộc


1.1.2. Phân bố, thu hái và chế biến
Cây mọc hoang và được trồng nhiều nơi ở nước ta vì gỗ được dùng làm
thuốc nhuộm gỗ và làm thuốc với tên Tô mộc. Gỗ được chẻ mỏng phơi khô (Đỗ Tất
Lợi, 2005).
Sau khi thu hoạch (những cây già), phần gỗ giác trắng được gọt bỏ, lấy phần
gỗ đỏ bên trong, cưa thành khúc và chẻ ra thành mảnh nhỏ, phơi hoặc sấy khô
(Dược Điển Việt Nam IV, 2009).
1.1.3. Mô tả dược liệu
Dược liệu có hình trụ hay nửa trụ tròn, đường kính từ 3cm đến 12cm, hay
những thanh nhỏ, dài 10cm hay hơn. Mặt ngoài các miếng lớn có màu đỏ vàng đến
đỏ nâu, có vết dao đẻo và vết cành, thường có khe nứt dọc.Mặt cắt ngang hơi bóng,
vòng tuổi thấy rõ rệt (màu da cam), có thể thấy màu nâu tối, có các lỗ nhỏ (mạch
gỗ). Dễ tách thành từng mảnh theo thớ gỗ, tủy có lỗ rõ. Các thanh được chẽ nhỏ có
màu hồng đỏ, có thể có những chỗ có màu nhạt hay đậm hơn.Chất gỗ cứng, nặng,
không mùi, vị hơi se (Dược Điển Việt Nam IV, 2009).

Ảnh1.2: Dược liệu Tô Mộc
1.1.4. Thành phần hóa học
Theo một số tài liệu các hợp chất trong cây Tô mộc có thể là: brazilin,
brazilein, hematein, hematoxylin, brazilide A, protosapponin A, protosapponin A,
tinh dầu chứa D(-) phelladren, ocimen, tanic acid, gallic acid và saponin. Trong đó


hàm lượng chính là các hợp chất màu tự nhiên: hematein, hematoxylin, brazilin,
brazilein. Các hợp chất màu này chỉ thu được từ tự nhiên, như từ cây gỗ Tô mộc
hay Huyết mộc chứ hầu như không thể tổng hợp được trong công nghiệp. Chúng
được chiết từ cây gỗ vang bằng các dung môi phân cực như CH3OH, C2H5OH,
C4H9OH và H2O.
Brasilin là một chất dạng tinh thể màu vàng, có màu đỏ trong môi trường
kiềm, khi oxy hóa sẽ cho braselein với công thức cấu tạo C16H12O5. Cấu tạo của
chất brasilin và braselein gần giống chất hematoxylin và hematein (do oxy hóa
hematoxylin) là chất màu lấy ở gỗ cây Hematoxylon campechianum L. cùng họ.

Brasilin

Hình 1.3: Cấu trúc của Brasilin
Bảng 1.1 Thành phần hoá học của dịch chiết với dung môi C2H5OH
S
T
T
1

2
3
4
5
6

T
Công
h
thức
ờ Công
i 6. C 7
9 16
1
( 4
1 M c
6
9. C B
2
1 16
( rh
5
1 M
M yC
0
= B
h
1 M
3
1 =
M rC
3
h
C H
1 =
1 16 e
.1 H
M m
C

2
4
1
4
1
0
1
0
8
,1
,
9
2

7
4
= P
h
,3
8
1 M
5 = Cường
r
. – Giang Thị Kim Liên, 2008)
(Đào Hùng


Nghiên cứu về thành phần chất chiết được từ Tô mộc bằng dung môi ethanol
(C2H5OH) được thực hiện bởi Đào Hùng Cường và Giang Thị Kim Liên (2008) đã
xác định một số thành phần cao chiết qua bảng 1.1
1.1.5. Tác dụng dược lý
Phòng đông y thực nghiệm Viện vi trùng Việt Nam (1961) đã nghiên cứu
thấy nước sắc Tô mộc có tác dụng kháng sinh mạnh đối với vi trùng Staphylococcus
209P (vòng vô khuẩn 1,2cm), Salmonella typhi (0,4cm), Shiga flexneri (0,7cm),
Shigella sonnei (0,2cm), Shigella dysenteria shiga (1cm), và Bacillus subtilis (1cm).
Tác dụng kháng sinh này không mất đi dưới tác dụng của dịch vị và dịch tụy.
Theo Gabor (1951) (trích dẫn bởi Đỗ Tất Lợi, 2005), brasilein có tác dụng
kháng histamin. Nếu tiêm trước brasilein vào xoang phúc mạc chuột bạch có thể đề
phòng hiện tượng thay đổi ở mắt chuột bạch do tiêm dung dịch 1,5% histamin
chlohydrat.
Theo Gabor và cs (1952) (trích dẫn bởi Đỗ Tất Lợi, 2005), brasilin và
brasilein đều có tác dụng làm mạnh và kéo dài tác dụng của hormon thượng thận
đối với mẫu ruột cô lập của chuột bạch hoặc tử cung cô lập của thỏ và đối với huyết
áp của thỏ.
Năm 1952, Gabor và cs nghiên cứu cho thấy brasilin và brasilein có tác dụng
ức chế men histidin decarboxylase(trích dẫn bởi Đỗ Tất Lợi,
2005).
Tù Tá Hạ và Diêm Ứng Bổng (Trung Hoa y học tạp chí, 1994 – 1996 trích
dẫn bởi Đỗ Tất Lợi, 2005) nghiên cứu toàn diện áp dụng dược lý của Tô mộc đã đi
đến kết luận sau:
Với liều lượng thích hợp, Tô mộc có tác dụng làm tăng co bóp tim ếch cô
lập. Áp lực tim ban đầu càng yếu, tác dụng càng rõ.
Nước Tô mộc làm giản mạch máu ếch (phương pháp Treudenberg). Nếu bắt
đầu dùng nước Tô mộc trước rồi mới dùng muối nitrit thì tác dụng giãn mạch của
muối nitrit sẽ không xuất hiện nữa.
Nước Tô mộc không ảnh hưởng đến hô hấp và huyết áp của chó bị gây mê.
Nếu phối hợp với histamin hoặc hormon thượng thận, Tô mộc không thấy có tác
dụng hiệp đồng.


Đối với mẫu ruột thỏ cô lập, nước Tô mộc không có tác dụng, nhưng có thể
làm tăng mạnh tác dụng của hormon thượng thận.
Hơi nước Tô mộc có tác dụng ức chế co bóp cơ tử cung chuột nhắt, nếu phối
hợp Tô mộc với hormon thượng thận, tác dụng ức chế này càng được thể hiện rõ.
Nước Tô mộc không có tác dụng giảm nhẹ tính chất kích thích của dầu thông
trên da bụng thỏ.
Thí nghiệm trên phế quản của chuột bạch, nước Tô mộc không có tác dụng
làm giảm mất tác dụng gây co thắt của histamin.
Tiêm nước Tô mộc vào tĩnh mạch của chó đã gây mê, không ảnh hưởng đến
tác dụng lọc và bài thải nước tiểu của thận.
Sau khi tiêm 0,1ml vaccine thương hàn vào tĩnh mạch của thỏ để gây sốt, sau
đó tiêm vào phúc mạc 5ml dung dịch Tô mộc 20%, thân nhiệt của không giảm.
Tiêm vào xoang phúc chuột nhắt 1ml dung dịch Tô mộc (1mg/10g thể
trọng) hầu như không làm mất tác dụng của morphin. Đối với thỏ hầu như có tác
dụng đối kháng với tác dụng trấn tĩnh do tiêm dung dịch morphine vào dưới da
(5 mg/kg thể trọng).
Với 0,2ml dung dịch Tô mộc 20% có thể khôi phục sự hoạt động của tim ếch
cô lập (phương pháp Straub) đã bị đình lại do tiêm nước sắc 20% vị thuốc chỉ xác.
Cho uống, tiêm tĩnh mạch hay tiêm dưới da dịch chiết Tô mộc cho thỏ, chuột
nhắt, chuột bạch với một liều lớn có thể gây mê và chết. Nước tô mộc có tác dụng
đối kháng với tác dụng hưng phấn trung khu thần kinh do strychnine hoặc cocain.
Nước Tô mộc có khả năng khôi phục sự hoạt động của tim ếch cô lập
(phương pháp Straub) đã bị cloralhytdrat hoặc quinin clohydrat, pilocacpin, eserin
salixylat làm cho chưa hoàn toàn đình chỉ.
Tiêm nước sắt Tô mộc dưới da hoặc vào bụng con chó có thể gây nôn mửa
và đi tả (Đỗ Tất Lợi, 2005).
1.1.6. Công dụng
Tính vị theo đông y: vị ngọt, bình, không độc, vào 3 kinh tâm, can và tì. Có
tác dụng hoạt huyết, thông kinh hoạt lạc, khứ ứ, chỉ thống, tán phong hòa huyết.
Tô mộc còn được dùng làm thuốc săn da và cầm máu dùng trong các trường
hợp xuất huyết tử cung, đẻ mà mất máu sau sinh, choáng váng, hoa mắt.


Còn dùng chữa lỵ ra máu, chảy máu trong ruột.
Tô mộc còn được dùng như chất giải khát (Đỗ Tất Lợi, 2005).
1.1.7. Một số nghiên cứu về hoạt tính của chất chiết Tô mộc
Phòng đông y thực nghiệm Viện vi trùng Việt Nam (1961) đã nghiên cứu
thấy nước sắc Tô mộc có tác dụng kháng sinh mạnh đối với Staphylococcus 209P
(vòng vô khuẩn 1,2 cm), Salmonella typhi (0,4 cm), Shiga flexneri (0,7 cm),
Shigella sonnei (0,2cm), Shigella dysenteria shiga (1,0 cm), Bacillus subtilis (1,0
cm) (Đỗ Tất Lợi, 2005).
Nguyễn Minh Thắng (2009) thăm dò khả năng kháng khuẩn của mẫu gỗ lên
hai loài vi khuẩn S. aureus và P. aeruginosa, kết quả cho thấy dịch chiết mẫu vỏ hạt
chín có khả năng kháng mạnh hai loài này. Các dịch chiết mẫu gỗ ở nồng độ cao
cũng kháng cả hai loài.
Phạm Tất Thắng và Lã Văn Kính (2004) xác định 100% E. colivà 100%
Salmonella gây bệnh tiêu chảy trên heo nhạy cảm với chất chiết từ Tô mộc khi kết
hợp với berberin và palmatin (chất chiết từ một số cây dược liệu khác).
Nguyễn Quang Tính (2011) bào chế thành công sản phẩm PTLC từ cao chiết
của Tô Mộc và Mộc hương và xác định hiệu phòng trị bệnh tiêu chảy do E. colivà
Salmonella gây bênh trên heo.
Đào Hùng Cường và Giang Thị Kim Liên (2008) đã thành công trong việc
Nghiên cứu xác định thành phần hóa học của dịch chiết từ Tô mộc (gỗ Vang) ở
Quảng Nam.
Chất chiết của cây Caesalpinia sappan L có khả năng ức chế cao vi khuẩn S.
aureus ATCC 25913, S. aureus và B. subtilic với vòng vô khuẩn là 2,10 (2,23 ±
0,15) và (1,3 ± 0.17) (Kongcharoensuntorn, 2005).
Năm 2004, nghiên cứu tại Hàn Quốc cho thấy dịch chiết Tô mộc trong các
dung môi n-butanol, methanol, nước, chloroform có khả năng ức chế sự phát triển
của nhiều chủng Staphylococcus aureus kháng kháng sinh (Kim và cs, 2003 trích
dẫn bởi Nguyễn Minh Thắng, 2009).
Theo Saraya và cs (2009) nồng độ ức chế vi khuẩn của dịch chiết từ cây Tô
mộc trên vi khuẩn E. coli, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium và


Candida albicans tương ứng là 250, 125, 500 và 16000 µg/ml.
Saravanakumar và Helan Chandra (2013) đã xác định tính kháng khuẩn E.
colivà một số vi khuân gây bệnh khác bằng chất chiết tư ethanol tư lá của cây Tô
mộc, đồng thời xác định vòng kháng khuẩn trên vi khuẩn E. coliđạt 12 millimeter tư
dịch chiết có nồng độ 5mg/ml. Nghiên cứu cũng cho thấy dịch chiết bằng dung môi
ethanol có tính kháng khuẩn cao hơn các dung môi khác.
Theo nghiên cứu đánh giá của Chang và Choi (2007), thì chất chiết Tô mộc
có khả năng chống lại vi khuẩn E. coli ở nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 1.4~8
mg/ml khi chiết bằng dung môi Methanol (MeOH) và đạt mức MIC 1.2~12 mg/ml
khi chiết bằng dung môi Ethanol (EtOH).
Temrangsee và cộng sự (2011), khảo sát thấy hỗn hợp chất chiết Tô mộc và
Curcuma longa Linn, Rhinacanthus nasutus Linn, Garcinia mangostana Linn,
Caesalpinia sappan Linn và Centellia asiatica Linn bằng dung môi Ethanol 95% có
khả năng kháng khuẩn Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus kháng
Methicillin

(MRSA),

Pseudomonas

aeruginosa,

Acinetobacter

baumanii,

Escherichia coli và Klebsiella pneumoniae tốt hơn dung môi nước.
Srinivasan và cộng sự (2012), nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của
chất chiết Tô mộc bằng Ethanol và dầu khoáng (Petrolium), đã xác định chất
chiết Tô mộc bằng Ethanol có vòng kháng khuẩn là

34,0±2,7 mm đối với

Pseudomonas aeruginosa và vòng kháng khuẩn là 6,0±0,3 mm trên E. coli khi
chiết bằng dầu khoáng.
1.2 Các phương pháp chiết xuất dược liệu
¾ Căn cứ vào nhiệt độ, có các phương pháp chiết:
+ Chiết nóng.
+ Chiết nguội (ở nhiệt độ thường).
¾ Căn cứa vào chế độ làm việc có các phương pháp chiết:
+ Gián đoạn.
+ Bán liên tục.
+ Liên tục.
¾ Dựa vào chiều chuyển động tương hỗ giữa hai pha, có các phương
pháp chiết:


+ Ngược dòng.
+ Xuôi dòng.
+ Chéo dòng.
¾ Dựa vào áp suất làm việc, có các phương pháp chiết:
+ Áp suất thường (áp suất khí quyển).
+ Áp suất giảm (áp suất chân không).
+ Áp suất cao (làm việc có áp lực).
¾ Dựa vào trạng thái làm việc của hai pha, có các phương pháp chiết:
+ Ngâm.
+ Ngấm kiệt.
¾ Dựa vào những biện pháp kỹ thuật đặc biệt:
+ Phương pháp siêu âm.
+ Phương pháp tạo dòng xoáy.
+ Phương pháp mạch nhịp…
(Kỹ thuật sản xuất dược phẩm, 2007).
1.3 Một số phương pháp đánh giá kháng sinh của thảo dược
1.3.1 Phương pháp thử vi sinh vật
Hoạt lực kháng sinh được thể hiện bằng khả năng ức chế một hay một số
chủng chỉ thị ở điều kiện thích hợp. Sự giảm hoạt tính sinh học của kháng sinh được
thể hiện trên chất chỉ thị nên rất khó phát hiện bằng phương pháp phân tích hóa học.
Vì vậy, phương pháp vi sinh vật thường giữ một vai trò quan trọng trong việc đánh
giá hoạt tính kháng sinh, nhất là những loại kháng sinh có cấu trúc phức tạp hoặc
thành phần gồm một hỗn hợp kháng sinh cùng họ mà mức độ hoạt lực chênh lệch
nhau không nhiều.
Phương pháp vi sinh vật xác định hoạt lực của một kháng sinh bằng cách so
sánh khả năng ức chế sự phát triển của một loại vi sinh vật (được gọi là chủng chỉ
thị) bởi kháng sinh ở các nồng độ pha loãng khác nhau với khả năng ức chế của
kháng sinh đối chiếu (kháng sinh chuẩn đã biết rõ hoạt lực) (Dược Điển Việt Nam
IV, 2009).
Hai phương pháp thường được sử dụng trong kiểm nghiệm là phương pháp
khuếch tán dùng môi trường thạch và phương pháp đo độ đục dùng môi trường lỏng.


1.3.1.1 Phương pháp khuếch tán dùng môi trường thạch
Phương pháp khuếch tán dùng môi trường thạch dựa vào sự khuếch tán của
kháng sinh từ chỗ chứa qua lớp thạch đặc ở hộp petri hoặc khay vào khoảng phát
triển của vi sinh vật tạo ra một vòng ức chế hoàn toàn xung quanh nơi chứa (ống
trụ, lỗ thạch) dung dịch kháng sinh.
Môi trường Mueller-Hinton Agar (MHA) để thử kháng sinh đồ được đổ vào
đĩa petri vô trùng, đường kính 9 cm, độ dày thạch khoảng 4 mm (25 ml/đĩa). Sau
o

o

khi đổ môi trường được bảo quản ở nhiệt độ từ 4 C đến 8 C. Trước khi làm kháng
sinh đồ, môi trường phải được lấy ra và để ở nhiệt độ phòng 15 phút và làm khô bề
mặt trong tủ ấm.
Từ dung dịch giữ gốc, vi khuẩn được cấy chuyển sang môi trường thạch đĩa
o

NA. Sau khi cấy, ủ ở nhiệt độ 37 C trong 16 – 20 giờ, chọn 3 khuẩn lạc có kích
thước đồng đều trên đĩa NA cho vào ống nghiệm vô trùng có chứa 3 ml nước sinh
lý vô trùng, lắc đều bằng vortex. Sau đó đo độ đục với ống Mc Farland 0,5 trên nền
tờ giấy trắng có vạch đen và điều chỉnh với nước muối sinh lý (nếu cần). Với độ đục
8

này, nồng độ vi khuẩn tương đương 1 – 3x10 tế bào/ml.
Dàn đều huyễn dịch vi khuẩn trên đĩa môi trường bằng cách dùng que tăm
bông vô trùng nhúng vào ống huyễn dịch vừa chuẩn bị. Sau đó rút tăm bông lên và
ép nhẹ tăm bông vào thành ống nghiệm để tăm bông không quá ướt, phết đều vi
o

khuẩn trên đĩa môi trường MHA theo 3 hướng chéo nhau 60 để dàn đều vi khuẩn.
Sau khi dàn đều vi khuẩn, để đĩa khoảng 5 phút rồi dùng kẹp vô trùng đặt đĩa
giấy tẩm cao chiết và đĩa giấy tẩm kháng sinh lên bề mặt môi trường. Ấn nhẹ đĩa
giấy vào môi trường để chúng không bị bong ra. Mỗi môi trường MHA được đặt 6
đĩa giấy, mỗi đĩa giấy cách nhau 2 – 3 cm và cách rìa đĩa petri 2 – 2,5 cm. Sau khi
o

đặt xong các đĩa giấy, đĩa môi trường được ủ ở 37 C trong 24 giờ (Sridhar, 2009).
Đọc kết quả sau 24 giờ. Dùng thước chia độ mm để đo đường kính vòng vô
khuẩn trên đĩa môi trường. Trong thời gian ủ, tinh dầu và kháng sinh khuyếch tán ra
thạch tạo nên một gradien với nồng độ giảm dần theo khoảng cách từ đĩa giấy.
Kết quả được đánh giá ở 3 mức: kháng khuẩn, trung gian và đề kháng.


1.3.1.2 Phương pháp đo độ đục dùng môi trường lỏng (phương pháp MIC)
Nguyên lý: Nồng độ kháng sinh tăng dần trong môi trường nuôi cấy, đến
nồng độ sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Tác dụng ức chế có thể được xác định
bằng mắt thường.
Ngày 1:
Tất cả các chủng cần thử MIC và các chủng chuẩn quốc tế, đều được cấy
trong canh thang thường hoặc BHI để có được canh khuẩn non. Với trực khuẩn
Gram âm, cấy 0,1 ml; với liên cầu D, tụ cầu và trực khuẩn mủ xanh, cấy 0,3 ml; với
các liên cầu khác, 0,6 ml (hoặc trên môi trường thạch thích hợp của từng loại). Đặt
o

ở 37 C/ 18 giờ để có được vi khuẩn non. Chú ý điều kiện không khí theo yêu cầu
của từng loại vi khuẩn: H. influenzae, S. pneumoniae, S. pyogenescần đảm bảo 5%
CO2(trong điều kiện không có tủ ấm CO2, tạo CO2 bằng cách cho đĩa thạch vào một
bình thủy tinh lớn, đốt nến, đậy nắp thật kín).
Ngày 2:
Pha loãng 0,1 ml (100 ml) canh khuẩn non (đậm độ tương đương 1-1,5 x
8

10 vi khuẩn ml) trong 9,9 ml canh thang MH (pha loãng 100 lần để có đậm độ
6

tương đương 1-1,5 x 10 vi khuẩn/ml), chia 1,8 ml vào các ống nghiệm đường
kính 12 mm. Nếu nuôi cấy qua đêm bằng môi trường thạch, lấy vi khuẩn thuần
khiết từ môi trường thạch thích hợp hoà vào 3 ml dung dịch đệm PBS (hoặc
nước cất) để có độ đục bằng độ đục của ống Mc Farland 0,5 – tương đương 1 – 3
8

x10 vi khuẩn/ml, sau đó lại pha loãng 1/100 trong canh thang MH và chia vào
các ống nghiệm như trên.
Thêm 0,2 ml nước cất hoặc nước muối sinh lý vô trùng vào 1 ống
nghiệm (chứng âm).
Thêm 0,2 ml kháng sinh đã pha theo bảng pha các đậm độ kháng sinh ở trên
vào mỗi ống nghiệm, phân phối từ nồng độ kháng sinh thấp nhất đến nồng độ kháng
sinh cao nhất. Lắc kỹ từng ống nghiệm.
o

Đặt vào tủ ấm 37 C/18 giờ.
Ngày 3.
Lắc kỹ từng ống nghiệm trước khi đọc kết quả.


Đọc kết quả ở ống chứng âm trước để kiểm tra xem chủng vi khuẩn có phát
triển tốt hay không, nếu vi khuẩn phát triển tốt mới tiếp tục đọc kết quả, nếu không
mọc tốt phải làm lại thí nghiệm.
Đọc kết quả ở các chủng vi khuẩn đói chứng, so sánh kết quả MIC của các
chủng này với bảng mẫu, nếu những kết quả này nằm trong giới hạn, sai số cho
phép là một bậc nhỏ hơn hoặc một bậc lớn hơn, điều đó nói lên rằng các điều kiện
của thí nghiệm tiêu chuẩn về pH, nồng độ kháng sinh, nhiệt độ, dinh dưỡng của môi
trường, mật độ của vi khuẩn… Như vậy có thể tiếp tục đọc kết quả ở những chủng
cần xác định MIC. Nếu không đạt được như trên, bắt buộc phải làm lại thí nghiệm,
đồng thời phải kiểm tra lại các điều kiện của thí nghiệm sao cho đạt được điều kiện
chuẩn thức.
Xác định nồng độ MIC: đọc kết quả bắt đầu từ ống nghiệm có nồng độ
kháng sinh thấp nhất. Nồng độ MIC được tính ở ống nghiệm có nồng độ kháng sinh
thấp nhất có thể ức chế được sự phát triển của vi khuẩn (bằng mắt thường không
nhìn thấy vi khuẩn mọc - canh thang trong).
Kết quả MIC của các chủng với mỗi kháng sinh được ghi theo bảng mẫu.
Ở nồng độ thấp nhất, không thấy vi khuẩn mọc thì kết quả được ghi nhận là:
nhỏ hơn hoặc bằng nồng độ đó. Trong trường hợp đến nồng độ cao nhất mà vẫn
thấy vi khuẩn mọc thì kết quả được ghi nhận là lớn hơn nồng độ đó.
Kết quả MIC của các chủng sẽ được so sánh với nồng độ ranh giới để phân
biệt 3 mức độ nhạy cảm (Susceptible), kháng (Resistante) hay ở mức độ trung gian
(Intermediate).
1.3.2 Phương pháp thử trên động vật
Hoạt lực kháng sinh được thể hiện bằng khả năng không mắc bệnh hoặc khỏi
bệnh của động vật sau khi sử dụng kháng sinh và công cường độc bằng một hay
một số vi khuẩn có độc lực.
Các loài động vật thường sử dụng là: chuột bạch, thỏ, gà, heo…


1.4 Sơ lược về vi khuẩn E. coli
1.4.1 Đại cương
Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) thuộc:
Lớp: Schgzomycetes
Bộ: Eubacteriales
Họ: Enterobacteriaceae
Tộc: Escherichiae
Giống: Escherichia
Loài: Escherichia coli
Escherichia coli được gọi tắt là E. coli còn có tên là Bacterium coli commue
được Escherich phát hiện năm 1883.
E. coli là trực khuẩn ruột già, vi khuẩn này có mặt thường xuyên trong
ruột của động vật, ở phần cuối của ruột non hay ruột già, ít khi ở dạ dày hay
phần trước của ruột non của các loài động vật như: ngựa, bò, dê, lợn, chó, mèo,
gia cầm và người.
Ngoài tự nhiên E. coli tồn tại vài tuần đến vài tháng trong bụi phân, nước,
không khí.
Những thú non có cảm nhiễm đặc biệt với vi khuẩn E. coli(Nguyễn Vĩnh
Phước, 1977).
1.4.2 Đặc điểm sinh học
1.4.2.1 Đặc điểm hình dạng và sự nhuộm màu
E. coli là trực khuẩn hình gậy ngắn, gram âm, bắt màu hồng, kích thước 2 – 3
µm x 0,5 µm hai đầu tròn, đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn, di động,
không hình thành nha bào, có giáp mô thỉnh thoảng thấy bắt màu lưỡng cực ở hai
đầu (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977).


Ảnh 1.4: Trực khuẩn E.coli bắt màu Gram (-) với độ phóng đại 1000 lần
1.4.2.2 Đặc điểm nuôi cấy
o

E. coli là trực khuẩn hiếu khí hay kỵ khí tuỳ tiện, nhiệt độ thích hợp 37 C,
pH = 7,4. Mọc tốt trên môi trường dinh dưỡng thông thường, chịu được nhiệt độ từ
o

4 – 45 C. Trên môi trường thạch dinh dưỡng, E. coli tạo khuẩn lạc tròn ướt, màu
trắng đục hơi lồi, để lâu có dạng khô rìa hơi nhăn. Trên thạch máu, có chủng E. coli
gây dung huyết alpha hoặc bêta và có chủng không gây dung huyết, không gây tan
chảy gelatin. Môi trường canh dinh dưỡng, E. coli làm đục đều môi trường canh
khuẩn, sau lắng xuống đáy, màu tro nhạt đôi khi có màu xám, có mùi trứng thối.
Trên môi trường chuyên biệt, môi trường Eosin methylen blue (EMB), E. coli tạo
khuẩn lạc tím ánh kim; môi trường MacConkey (MCK), E. coli tạo khóm đỏ hồng;
môi trường Kligler iron agar (KIA), E. coli gây lên men đường glucose và lactose
(vàng/vàng), sinh gas, không sinh H2S;môi trường Brilliant green agar (BGA),
khuẩn lạc E. coli tạo khóm khuẩn lạc màu vàng phớt xanh.
1.4.2.3 Đặc tính sinh hoá
E. coli lên men sinh hơi: glucose, lactose, manitol, galactose…; lên men
không sinh hơi: maltose, arabinose; lên men hay không lên men: saccharose; không
lên men: dextrin, glycogen, salisin amidon, ít khi có lên men: inulin, pectin; phản
+

+

-

-

ứng IMViC: ++--(indol , methylred , vogesproskauer , citrate ).
1.4.2.4 Sức đề kháng
o

o

E. coli bị diệt ở nhiệt độ 55 C/1 giờ, 60 C/15-30 phút, 95% bị diệt ở nhiệt độ
đông lạnh trong 2 giờ.


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×