Tải bản đầy đủ

Thực tập CNSH DCQ2014

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA DƯỢC

Bộ môn Vi sinh – Ký sinh

LỚP DCQ2014

BÁO CÁO THỰC TẬP
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
DƯỢC

Nhóm 3 (sáng thứ 5)- Tiểu nhóm 2
Nguyễn Thị Thu Hiền
Võ Minh Hiếu
Nguyễn Minh Hiếu
Hồ Nguyễn Nguyên Hồ


Bài 1. Chọn lọc giống vi sinh vật
1.1. Tóm tắt lý thuyết
- Vi sinh vật được sử dụng rộng rãi trong các quá trình công nghệ để tạo ra các sản phẩm

hoặc cung cấp các chất trung gian tạo sản phẩm. Ngày nay, để thu nhận được chủng vi sinh
vật sản xuất, có thể mua từ ngân hàng chủng hoặc sàng lọc chủng từ môi trường. Chủng có
được từ ngân hàng chủng tuy nhanh, ít tốn kém song lại không có tính cạnh tranh. Cách
phân lập từ tự nhiên với hai chiến lược “săn lùng” (shotgun) và có định hướng ( objective)
tạo ưu thế độc quyền về chủng sản xuất và đóng góp cho sự phong phú, đa dạng về giống vi
sinh vật.
- Chọn lọc giống vi sinh vật là phương pháp phân lập và phát hiện chủng vi sinh vật có
đặc tính mong muốn từ các mẫu vi sinh vật hỗn hợp, sau đó cải tạo chủng vi sinh đó và bảo
quản chúng trong môi trường thích hợp.
Công việc này bao gồm các bước: phân lập từ tự nhiên, gây đột biến, phát hiện chủng vi
sinh vật có đặc tính mong muốn và bảo quản giống
- Để phát hiện dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn có thể dựa vào:
• Chất chuyển hóa tạo ra như: kháng sinh, sắc tố,…
• Enzym ngoại bào tác động lên cơ chất trong môi trường như: amylase- tinh bột,
protease- gelatin.
• Sự thay đổi đặc tính sinh trưởng của vi sinh vật.
• Sự thay đổi hình thái của vi sinh vật.
- Bảo quản giống có nhiều cách: giữ giống trên thạch, giữ giống dưới lớp dầu khoáng, giữ
giống trong cát, đông lạnh và đông khô. Việc lựa chọn cách bảo quản đối với mỗi vi sinh
vật thường dựa vào kinh nghiệm.
- Trong bài thực hành này, ta tiến hành:
• Phân lập và phát hiện chủng vi sinh vật trong mẫu đất, có khả năng tiết amylase ngoại
bào.
Môi trường phân lập: thạch tinh bột.
Thuốc thử: Lugol.
Vi sinh vật có khả năng tiết amylase sẽ tạo vòng sáng quanh chỗ mọc (do tinh bột bị phân
giải thành glucose nên không có phản ứng màu với iod).
• Phân lập và phát hiện chủng vi sinh vật trong mẫu đất có khả năng tiết protease ngoại
bào.
Môi trường phân lập: thạch gelatin.
Thuốc thử: TCA (acid tricloroacetic).
Vi sinh vật có khả năng tiết protease sẽ tạo vòng sán quanh chỗ mọc (do gelatin bị phân
giải nên không tạo kết tủa với TCA).
• Phát hiện vi sinh vật có khả năng tiết kháng sinh dựa vào khả năng ức chế sự sinh trưởng
của nó với vi sinh vật khác.

1.2. Kết quả và bàn luận
1.2.1. Phát hiện vi sinh vật sinh enzym amylase và protease
a. Hình ảnh của đĩa phân lập và phát hiện khả năng sinh enzyme


Báo cáo TT CNSH Dược

Page 1


b. Kết quả phân lập và phát hiện khả năng sinh enzym ngoại bào
Bảng 1. Kết quả phân lập và phát hiện khả năng sinh enzym ngoại bào
Chủng
Mô tả khuẩn lạc* Amylase** Protease** Kháng sinh**
1
Khóm tròn nhỏ,
9 mm
4 mm
trắng đục, có chỏm
2
Khóm tròn, trắng
15mm
6 mm
đục, bìa răng cưa

Báo cáo TT CNSH Dược

Page 2


1.2.2. Phát hiện khả năng sinh kháng sinh
Bảng 2. Kết quả phát hiện khả năng sinh kháng sinh
Chủng
Bacillus 1
Bacillus 2
Bacillus 3
Bacillus 4

E. coli**
0 mm
0 mm
0 mm
0 mm

S. aureus**
28 mm
10 mm
30 mm
28 mm

1.2.3. Bàn luận
- Đối với việc phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng tiết amylase ngoại bào:
chủng vi sinh vật trong mẫu đất sau khi phân lập trên môi trường thạch tinh bột và ủ ở
37 oC trong 24h có khả năng tiết amylase ngoại bào.
- Đối với việc phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng tiết protease ngoại bào:
chủng vi sinh vật trong mẫu đất sau khi phân lập trên môi trường thạch gelatin và ủ ở 37
o
C trong 24h có khả năng tiết protease ngoại bào.
- Đối với phương pháp phát hiện khả năng sinh kháng sinh thì kháng sinh của E.coli
tiết ra không có khả năng ức chế các chủng Bacillus nhưng kháng sinh của S. aureus tiết
ra có khả năng ức chế các chủng Bacillus với các mức độ khác nhau.

Báo cáo TT CNSH Dược

Page 3


Bài 2. Đánh giá một số đặc điểm có lợi của vi khuẩn probiotic
2.1. Tóm tắt lý thuyết
- Probiotic là vi khuẩn sống khi đưa vào cơ thể với số lượng đầy đủ sẽ có lợi cho sức
khỏe vật chủ.
- Ngày nay, các chế phẩm sinh học từ vi sinh vật probiotic được sử dụng rất rộng rãi đặc
biệt là các chế phẩm từ vi khuẩn Bacillus subtilis (trị chứng viêm đại tràng viêm đường
ruột….)
- Một số tiêu chuẩn lựa chọn vi sinh vật làm probiotic bao gồm:
 Tính an toàn: không gây bệnh, gây độc.
 Chức năng: có chức năng cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột, chống rối loạn tiêu hóa.
 Các yêu cầu về công nghệ: được sản xuất với quy mô lớn, ổn định trong lúc bảo
quản.
 Khả năng sống sót khi đến đường tiêu hóa: chịu được dịch vị muối mật.
 Tính đề kháng kháng sinh: có mang gen đề kháng hay không, nếu có thì có khả năng
lây nhiễm sang vi sinh vật khác không.
- Ở bài thực hành này ta khảo sát tỉ lệ sống sót của vi sinh vật probiotic (tế bào sinh
dưỡng và bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis PY79) trong dịch vị nhân tạo ( ở các pH
1 và 3) và dịch mật nhân tạo ( ở nông độ muối mật 0.3 và 0.5%).

2.2. Kết quả và bàn luận
2.2.1. Đánh giá đặc điểm có lợi của vi khuẩn probiotic
a. Hình ảnh của thử nghiệm khả năng chịu acid dịch vị và dịch mật nhân tạo
- Acid dịch vị
Pha loãng cấp 2 (1/100)
Pha loãng cấp 3 (1/1000)
* Tế bào sinh dưỡng:
- Đối chứng:

Báo cáo TT CNSH Dược

Page 4


- pH 2:
+ 60 phút:

+ 90 phút:

- pH 3:
+ 60 phút:

+ 90 phút:

Báo cáo TT CNSH Dược

Page 5


* Bào tử
- Đối chứng

- pH 2:
- 60 phút:

- 90 phút:

-pH 3:
+ 60 phút:

Báo cáo TT CNSH Dược

Page 6


+ 90 phút

- Dịch mật nhân tạo:

Báo cáo TT CNSH Dược

Page 7


b. Kết quả khả năng chịu acid dịch vị và dịch mật nhân tạo
Bảng 1. Kết quả đánh giá khả năng chịu dịch vị nhân tạo*
Thời
(phút)

gian

pH
MT pH
2

Đối ch ng
TBSD
70.10

0

3

Bào tử
215.10

MT pH 3
Bào tử

TBSD

Bào tử

TBSD

4

60

13.10

90

10

3

4

138.10

3

4

42.10

Bảng 2. Kết quả ph n trăm tế bào sống sót
Thời gian

6.10

3

4

88.10


0

pH dịch vị khác nhau ( )**

pH 2

pH 3

TBSD

Bào tử

TBSD

Bào tử

60

18,57

64,18

8,57

40,93

90

1,43

19,53

0

≈ 100

0

** Tỉ lệ sống sót = Số tế bào ở thời điểm và pH khảo sát/ Số tế bào ở mật đối chứng
tương ứng x100.
Bảng 3. Kết quả đánh giá khả năng chịu dịch mật nhân tạo*
Nồng độ muối mật (%)

Thời gian
(giờ)

Đối ch ng
TBSD

0

156.103

Bào tử

0,3
TBSD

0,5

Bào tử

TBSD

Bào tử

138.104

1

81.103

66.104

2.103

57.104

2

103

52.104

0

48.104

Báo cáo TT CNSH Dược

Page 8


Bảng 4. Kết quả ph n trăm tế bào sống sót
Thời gian

nồng độ muối mật khác nhau ( )**

0,3

0,5

TBSD

Bào tử

TBSD

Bào tử

60

51,92

47,83

1,28

41,30

90

6,41

37,68

0

34,78

0

** Tỉ lệ sống sót = Số tế bào ở thời điểm và pH khảo sát/ Số tế bào ở mật đối
chứng tương ứng x100.
c. So sánh khả năng chịu acid dịch vị và muối mật của dịch mật ở các nồng độ khác
nhau
- Acid dịch vị:
• Khả năng sống sót của vi sinh vật (VSV) ở dạng bào tử cao hơn rất nhiều so với
tế bào sinh dưỡng ở các pH dịch vị đã khảo sát.
• Thời gian tiếp xúc với dịch vị nhân tạo càng lâu, số lượng tế bào sinh dưỡng và
bào tử càng giảm đi.
- Muối mật:
• Khả năng sống sót của vi sinh vật (VSV) ở dạng bào tử cao hơn rất nhiều so với
tế bào sinh dưỡng ở các nồng độ muối mật đã khảo sát.
• Thời gian tiếp xúc với dịch vị nhân tạo càng lâu, số lượng tế bào sinh dưỡng và
bào tử càng giảm đi.
2.2.2. Bàn luận
9

-3

7

Số lượng vi khuẩn ban đầu được sử dụng là: 0.4x10 x50x10 = 2.10 con
A. Muối mật
- Ở nồng độ muối mật 0,5%, tỷ lệ sống sót của tế bào sinh dưỡng thấp hơn nhiều so
với nồng độ 0,3% còn bào tử thì thấp hơn không đáng kể.
- Bào tử có khả năng chịu được dịch mật tốt hơn tế bào sinh dưỡng sau một khoảng
thời gian tiếp xúc với muối mật.
B. Dịch vị nhân tạo
- Khả năng sống sót của dạng bào tử cao hơn rất nhiều so với tế bào sinh dưỡng ở các
pH dịch vị đã khảo sát.
- Thời gian tiếp xúc với dịch vị nhân tạo càng lâu, số lượng tế bào sinh dưỡng và bào
tử càng giảm đi.
- Dạng bào tử sống sót tốt trong acid dịch vị, bào tử mọc nhanh hơn và giảm ít hơn so
với tế bào sinh dưỡng. Bởi vì bào tử vi khuẩn có cấu trúc vỏ dày, chịu được những
điều kiện khắc nghiệt của môi trường.
* Các khó khăn trong quá trình thực tập
- Số lượng tế bào sinh dưỡng và bào tử cần phải điều chỉnh sao cho OD600=0.5.
- Các yếu tố ngoại nhiễm đặc biệt vi khuẩn từ không khí xâm nhập trong quá trình trải
thạch dẫn đến đếm nhầm yếu tố ngoại lai.
Báo cáo TT CNSH Dược

Page 9


- Các yếu tố khác ảnh hưởng đến khả năng tồn tại và phát triển của Bacillus subtilis
ngoài môi trường dịch vị nhân tạo và dịch mật nhân tạo.

Báo cáo TT CNSH Dược

Page 10


Bài 3. Tinh chế enzyme amylase bằng alginat
3.1. Tóm tắt lý thuyết
- Enzym amylase là enzym thủy phân tinh bột có thể tìm thấy ở rất nhiều nguồn khác
nhau như động vật, thực vật và vi sinh vật. Amylase có ý nghĩa về mặt sinh lý, thương
mại, công nghiệp, thực phẩm, dược phẩm.
- Trong ngành dược, amylase được sử dụng để sản xuất glucose là dịch tiêm truyền
chuyển hóa tinh bột thành dextrin, tinh bột tan là tá dược của một số thuốc.
- Tinh chế enzym là một bước quan trọng trong quá trình sản xuất enzym. Có nhiều
phương pháp tinh chế enzym amylase trong đó có phương pháp cố định lên aginate.
- Khi cho CaCl2 vào hỗn hợp enzym và sodium alginat thì sẽ tạo thành những hạt có
cấu trúc bền vững (khoảng 0.54 mm) chứa enzym bên trong. Enzym được bao bọc
trong một màng không thẩm thấu đối với enzym và những chất có trọng lượng phân tử
cao, nhưng lại cho cơ chất và sản phẩm thẩm thấu qua một cách dễ dàng. Điều này cho
phép giữ enzym trong dung dịch gần giống như trong tự nhiên và có thể tái sử dụng
nhiều lần.
- Gel alginate có khả năng nhốt một lượng lớn enzyme, hiệu suất nhốt enzym cao, thao
tác và kỹ thuật tiến hành đơn giản. Hạt gel có cấu trúc bền vững. Để ổn định hạt gel có
thể cho nó vào trong dung dịch glutaraldehyd hoặc các khâu mạch khác. Tuy nhiên gel
này lại không bền trong môi trường có phosphate.

3.2. Kết quả và bàn luận
3.2.1. Hàm lượng protein
Bảng 3. Hàm lượng protein của enzym thô và tinh chế
Mẫu

Thể tích (ml)

OD280

Hàm lượng protein (mg)

Enzym thô

0.9807

Vthô =10

196.14

Enzym tinh chế

0.5284

Vtinh chế = 22

11.6248

3.2.2. Hoạt tính enzym
a. Đường chuẩn hoạt tính enzym và OD560
Bảng 2. Thông số đường chuẩn tinh bột
Ống
U/ml
OD

Báo cáo TT CNSH Dược

1

2

3

4

5

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0.1432

0.2922

0.4030

0.5398

0.6192

Page 11


Đường chuẩn:

b. Hoạt tính enzym
Bảng 3. Hoạt tính enzym thô và tinh chế
Mẫu

OD560
chứng

Enzym thô

0,63385 0,21115

100

7707,6

39,2964

tinh 0,61595 0,5467

50

543,73

46,7732

Enzym
chế

OD560
thử

Độ
loãng

pha Hoạt tính
enzym (U)

tổng Hoạt tính riêng
(U/protein)

Tính: Hiệu suất tinh chế và Mức tinh chế.
Hiệu suất tinh chế:

M c tinh chế:

c. Nhận xét về hiệu suất tinh chế và mức tinh chế
-Hiệu suất tinh chế là 7,054% là quá thấp.
-Mức tinh chế có kết quả là 1,19 lần. Tuy đạt yêu cầu song còn quá thấp.
3.2.3. Bàn luận
- Sau khi tinh chế, hoạt tính riêng của enzym tăng lên.
- Hiệu suất tinh chế còn thấp, lượng amylase bị thất thoát trong quá trình thao
tác còn lớn. Có thể là do thao tác chưa chính xác hoặc không cẩn thận trong quá
Báo cáo TT CNSH Dược

Page 12


trình thôi enzyme (do thôi enzyme chưa hết hay enzyme còn sót trong tủa gel,..)
hay sai sót trong quá trình đo quang.
- Để đánh giá hiệu quả của quá trình tinh chế ta có thể dựa vào mức tinh chế
amylase. Theo lý thuyết, mức tinh chế này nên lớn hơn 1 (tốt nhất là hơn 4).
Kết quả trên là 1,19 lần, tuy đạt yêu cầu song còn quá thấp. Có thể là do thao
tác chưa cẩn thận nên đã làm giảm hoạt tính của amylase.
 Quy trình tinh chế enzyme:

Báo cáo TT CNSH Dược

Page 13


Bài 4. Cố định CGTase lên alginat
4.1. Tóm tắt lý thuyết
- Cyclodextrin glucanotransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) đây là một enzym của vi
khuẩn có vai trò chuyển hóa tinh bột và các chất tương tự khác như amylopectin,
glycogen,.. để tạo thành hỗn hợp cyclodextrin (CD) là những chất có mạch ngắn hơn
với 6, 7 và 8 đơn vị glucose tương ứng là α-CD, β-CD, γ-CD.
- Việc cố định enzym sẽ giúp thu hồi, bảo quản và tái sử dụng những enzym CGTase
đắt tiền trước sự thay đổi của môi trường như pH, nhiệt độ,… mà hoạt tính của enzym
ổn định hơn so với enzym tự do
- Sự cố định enzym là sự gắn enzym hòa tan lên một chất mang bằng nhiều kỹ thuật
khác nhau, do đó enzym sẽ từ trạng thái hòa tan chuyển sang trạng thái không hòa tan.
Hiện nay có các phương pháp:
• Phương pháp vật lý: hấp phụ, liên kết ion, liên kết hydro, tương tác kỵ nước, lực
Vander Waals,…
• Phương pháp liên kết cộng hóa trị: cố định enzyme bằng liên kết cộng hóa trị với
các chất mang được hoạt hóa để tạo phức giữa enzym – chất mang.
• Phương pháp bắt giữ enzym vào khuôn gel: enzym được nhốt trong các cấu trúc
mạng gel có màng không thẩm thấu, cơ chất và sản phẩm không bị giữ lại sẽ đi qua
được, phương pháp này đơn giản enzym ít bị biến đổi trong quá trình cố định
• Phương pháp tạo vi nang: enzym được giữ trong các bao vi thể có màng bán
thấm dày 200Å (cellulose, polysaccharid), vì hoạt động trong môi trường dung
dịch do đó khả năng tiếp xúc của enzym với cơ chất sẽ lớn hơn so với phương pháp
giữ enzym vào khuôn gel.
- Trong bài thực tập này tiến hành cố định enzym bằng hai phương pháp: hấp phụ và
bắt giữ.
• Phương pháp bắt giữ dựa trên nguyên tắc enzym bị giữ trong mạng lưới gel Caalginat.
• Phương pháp hấp phụ dựa trên nguyên tắc enzym bị giữ ở bề mặt của hạt gel.

4.2. Kết quả và bàn luận
4.2.1. Hàm lượng protein
a. Đường chuẩn BSA
Bảng 1. Thông số đường chuẩn BSA
Ống nghiệm
0
1
2
3
4
5
Nồng độ BSA (mg/ml)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
OD595 nm
0,0952 0,1495 0,2343 0,3040 0,3493 0,4185

Báo cáo TT CNSH Dược

Page 14


Đường chuẩn BSA theo nồng độ protein chuẩn

b. Hàm lượng protein
Bảng 4. Hàm lượng protein của enzym thô và tinh chế
Mẫu

OD595

Thể tích (ml)

Enzym ban đầu

0,2691

Vban đầu = 1

5,326

Vgộp = 44

1,675

Enzym không CĐ 0,3065
theo bắt giữ

Hàm lượng protein (mg)

Enzym CĐ theo bắt
giữ

3,651

Enzym không CĐ 0,4585
theo hấp phụ
Enzym CĐ
hấp phụ

Vgộp = 40

2,618

theo

2,708

4.2.2. Hoạt tính enzym
a. Đường chuẩn CD
Bảng 3. Thông số đường chuẩn CD
Số thứ tự

1

2

3

4

5

6

Nồng độ CD (mg)

0

2

4

6

8

10

OD550
OD550

Báo cáo TT CNSH Dược

0,9104 0,7522 0,6005 0,4974 0,3825 0,2981
0

0,1582 0,3099 0,4130 0,5279 0,6123

Page 15


Đường chuẩn β-CD
ΔOD
0,7
0,6
0,5

0,4
0,3

y = 0,0611x + 0,0316
R² = 0,9873

0,2
0,1

Nồng độ mg/ml
0

0

2

4

6

8

10

12

b. Hoạt tính enzym
Bảng 4. Hoạt tính enzym
Mẫu

OD550
chứng

OD550 thử Hoạt tính chung Hoạt tính riêng (U/mg
(U)
protein)

Enzym ban đầu

0,8533

0,6032

63,015

11,8316

Enzym CĐ theo bắt giữ

0,7187

0,2395

4,7810

1,3095

Enzym CĐ theo hấp phụ 0,7311

0,6047

1,5189

0,5609

- Hiệu suất cố định:
• Phương pháp hấp phụ

• Phương pháp bắt giữ

- Tỉ lệ hoạt tính:
• Phương pháp hấp phụ

• Phương pháp bắt giữ

c. Nhận xét về hiệu suất cố định và và tỉ lệ hoạt tính riêng của enzym.
Báo cáo TT CNSH Dược

Page 16


- Hiệu suất cố định enzym bằng phương pháp bắt giữ cao hơn 1,35 lần phương pháp
hấp phụ. Vì ở phương pháp bắt giữ enzym bị giữ bên trong hạt gel không thoát ra
được, đây là quá trình cố định không thuận nghịch. Còn ở phương pháp hấp phụ là quá
trình cố định thuận nghịch, enzym chỉ bị hấp phụ lên bề mặt của hạt gel.
- Hoạt tính của enzym bị cố định theo bắt giữ cao hơn 2,34 lần so với hấp phụ
- Hoạt tính của enzyme bị cố định thấp hơn nhiều so với enzyme tự do, do lúc này
enzyme đã bị gắn với chất mang nên sự tiếp xúc của enzym với cơ chất bị cản trở về
mặt không gian cũng như cấu trúc của enzym bị thay đổi, vì vậy khả năng gắn với cơ
chất sẽ bị giảm.
4.2.3. Bàn luận
- Các phương pháp cố định CGTase lên alginate hấp phụ và bắt giữ có các ưu – nhược
điểm khác nhau và hiệu suất cố định cũng khác nhau:
+ Với phương pháp hấp phụ:
 Ưu điểm: đây là phương pháp dễ thực hiện, thường ít ảnh hưởng đến hoạt tính
của enzym.
Nhược điểm:
• Enzyme dễ bị hòa tan trở lại trong quá trình sử dụng lặp lại nhiều lần, do đây là
phương pháp hấp phụ vật lý, liên kết enzym với chất mang lỏng lẻo, độ bền liên
kết của enzym phụ thuộc vào pH và lực ion.
• Ngoài ra trong quá trình làm, do thao tác thí nghiệm như nhỏ dung dịch alginate
và CaCl2 nhanh và không đều làm cho gel tạo ra có kích thước không đồng nhất,
việc lọc và rửa gel không cẩn thận sẽ làm enzym đã bị hấp phụ tan trở lại môi
trường,… dẫn đến hiệu suất cố định thấp.
+ Với phương pháp bắt giữ:
Ưu điểm: enzym bị giữ chặt hơn, enzym không liên kết trực tiếp với chất mang,
mà chỉ bị nhốt bên trong chất mang nên cấu trúc enzym hầu như không thay
đổi.
Nhược điểm:
• Không thể áp dụng phương pháp này để cố định các enzym mà cơ chất có phân
tử lớn, do cơ chất phân tử lớn không thể qua màng gel.
• Kích thước của các mắt lưới trong gel không đồng nhất nên enzym vẫn có thể
thoát ra ngoài được. Và kích thước của các mắt lưới phải đủ lớn để cơ chất và
sản phẩm thoát ra và phải đủ nhỏ để giữ enzym ở lại.
• Một số gốc tự do tạo ra do quá trình trùng hợp tạo gel có thể làm kìm hãm enzym
do đó phải chú ý đến nhiệt độ, pH và các điều kiện khác để tránh sự tạo gel ảnh
hưởng đến enzym.
• Ngoài ra trong quá trình làm, do thao tác thí nghiệm như thêm enzym vào
alginate không lắc kỹ, việc tạo gel quá nhanh và không đều nên enzym bị giữ
lại không đồng nhất ở các hạt gel, viêc hấp phụ enzym lên bề mặt hạt gel vẫn
xảy ra nên việc xác định các thông số vẫn có sai số.
- Nhìn chung, phương pháp bắt giữ ưu việt hơn so với phương pháp hấp phụ, bên
cạnh các phương pháp này còn có nhiều phương pháp có ưu điểm hơn mà có thể
đưa vào sản xuất với quy mô lớn như phương pháp cố định enzym bằng liên kết
cộng hóa trị, phương pháp tạo vi nang có nhiều ưu điểm vượt trội như có thể giữ
Báo cáo TT CNSH Dược

Page 17


bọc đồng thời nhiều enzym trong một dãy phản ứng mà hầu như không làm ảnh
hưởng đến cấu trúc enzym,…
- Việc cố định enzym có nhiều ứng dụng quan trọng trong nhiều lĩnh vực nông
nghiệp, công nghiệp, y học,… Chẳng hạn như trong công nghiệp cố định enzym
glucoisomerase và enzym invertase để sản xuất các loại siro giàu fructose hay sản
xuất sữa không lactose bằng việc cố định enzym β-Galactosidase và lactase. Trong
y học cố định enzym penicillin amydase để sản xuất ra các penicillin bán tổng hợp
và cố định các enzym không tan là steroid 11β-oxygenase và Δ-dehydrogenase để
sản xuất prednisolone điều trị bệnh thấp khớp,…
 . Sơ đồ cố định CGTase theo phương pháp hấp phụ
Nhỏ từ từ 15ml dung dịch alginate 2% vào 20ml
dung dịch CaCl2 0,2M
1. Để yên 10 phút
2. Lọc

Hạt gel Ca-alginate

Cho hạt gel vào 20ml đệm
Tris-HCl pH 8
1. Thêm 1ml CGTase
2. Cố định 45 phút
3. Lọc

Enzym bị hấp phụ
Rửa 2 lần với đệm
Tris HCl pH 8

Dịch lọc (giữ)
Xác định V

Gộp

Enzym bị hấp
phụ trên gel

Dịch rửa
Xác định V

Dịch gộp

 Sơ đồ cố định CGTase theo phương pháp bắt giữ
Báo cáo TT CNSH Dược

Page 18


Thêm 1ml enzyme CGTase vào 10
dung dịch alginate 2%
Nhỏ từ từ

Dung dịch CaCl2 0,2M
1. Để yên 10 phút
2. Lọc

Enzym bị bắt giữ
Rửa 2 lần với đệm
Tris HCl pH 8

Dịch lọc (giữ)
Xác định V

Gộp

Enzym bị bắt
giữ trong gel

Dịch rửa
Xác định V

Báo cáo TT CNSH Dược

Dịch gộp

Page 19


Bài 5. Tinh chế protein bằng sắc ký trao đổi ion
5.1. Tóm tắt lý thuyết
- Các phương pháp tinh chế protein đều dựa trên những tinh chất hóa lý của protein
như độ tích điện, kích thước phân tử, độ hòa tan…Đối với phương pháp tinh chế
protein bằng sắc kí trao đổi ion thì dựa trên sự tích điện khác nhau trước sự thay đổi
của pH. Mỗi protein có một giá trị pH mà tại đó tổng điện tích âm và dương của nó
bằng nhau, hay nói cách khác là điện tích bằng 0, pH này được gọi là pI ( điểm đẳng
điện ). Khi pH dung dịch lớn hơn pI protein sẽ tích điện âm và ngược lại.
- Nhựa sắc ký trao đổi ion gồm một chất nền rắn không tan được gắn các nhóm
mang điện tích bằng liên kết cộng hóa trị, các nhóm mang điện tích này sẽ liên kết với
các đối ion có điện tích trái dấu một cách thuận nghịch nhờ tương tác tĩnh điện. Có hai
loại nhựa trao đổi ion: cationit và anionit
- Sắc ký trao đổi ion dựa vào sự trao đổi thuận nghịch của các điện tích trên protein
với các điện tích trái dấu của pha tĩnh sắc ký, tùy theo cân bằng ion và pH trong dung
dịch mà protein gắn vào hay bị đẩy ra khỏi nhựa.
- Nguyên tắc bài thực tập: dựa vào sự khác biệt pI của lysozym(pI=10) so với các
protein khác trong lòng trắng trứng(pI<6), do đó tại pH 8 trên nhựa trao đổi cation
lysozym có pI>pH sẽ tích điện dương bị giữ lại trong cột còn protein pIâm không trao đổi được nên đi ra ngoài. Lysozym trong cột được thôi ra bằng cách
nâng pH lên 10 hoặc tăng nồng độ ion trong cột để cạnh tranh và đẩy lysozym ra.

5.2. Kết quả và bàn luận
Đường chuẩn được sử dụng trong bài này là đường chuẩn Bradford trong bài 4
y= 0,3265x+0,0952
5.2.1. Kết quả xác định hàm lượng protein
Bảng 1. Hàm lượng protein trong các phân đoạn
Mẫu
A280
Thể tích

A

B*

C*

D1

D2

D3

D4

D5

D6

Mẫu
gộp D**

0,1871 0,1694 0,1042 0,3876 0,2074 0.1141
1

1

0,5

0,5

0,5

0,5

3

Lượng

28,15 22,73 1,38

0,45

0,17

0,03

0,65

Hiệu
suất

HS= (Mẫu gộp D)/Mẫu A( )=0,65/28,15=2,31%

* Cộng tổng các mẫu B từ B0 đến Bn, cộng tổng các mẫu C từ C0 đến Cn
**Mẫu gộp D: là tổng lượng protein trong các ống D1 đến Dn
Nhận xét về hiệu suất tinh chế
- Dịch A chứa toàn bộ lượng protein nên có lượng protein lớn nhất, dịch B và C lần
lượt là protein không phải lysozym , dịch D là lysozym chiết được. Ta thấy
Báo cáo TT CNSH Dược

Page 20


B+C+D=24,76 µg, A= 28,15 µg nên B+C+Dlượng protein trong A.
5.2.2. Bàn luận
- Thực tế lysozyme trong lòng trắng trứng chếm tỉ lệ rất nhỏ (5%)
- Hiệu suất tinh chế chưa đạt tuyệt đối có thể do:
 Thao tác tinh chế chưa cẩn thận, còn làm tưng nhựa trao đổi.
 Thao tác bơm, hút dịch vào eppendoff chưa chính xác, ảnh hưởng đến kết quả đo
quang.
 Chưa hoạt hóa tối đa khả năng trao đổi ion của cột sắc ký.
 Các thể tích đo được chỉ ước lượng nên kết quả nồng độ protein cũng kém chính
xác

Báo cáo TT CNSH Dược

Page 21


Báo cáo TT CNSH Dược

Page 22



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×