Tải bản đầy đủ

Nghiên cứu tách chiết độc tố conopeptide từ ốc nón conus bandanus và đánh giá sơ bộ thành phần của độc tố

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nghiên cứu tách chiết độc tố conopeptide từ ốc nón
Conus bandanus và đánh giá sơ bộ thành phần của độc tố

Giảng viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Bảo
Sinh viên thực hiện:

Trần Thị Thu Thỏa

Mã số sinh viên:

56131848

Khánh Hòa – 2018



TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nghiên cứu tách chiết độc tố conopeptide từ ốc nón
Conus bandanus và đánh giá sơ bộ thành phần của độc tố

GVHD: TS. Nguyễn Bảo
SVTH: Trần Thị Thu Thỏa
MSSV: 56131848

Khánh Hòa, tháng 07/2018


LỜI CẢM ƠN
Qua một thời gian được nghiên cứu và thực tập tại phòng thí nghiệm Trường Đại
Học Nha Trang, em đã hoàn thành đồ án tốt nghiệp. Để hoàn thành đồ án này, ngoài
sự nổ lực của bản thân em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến sự giúp đỡ tận tình của
quý Thầy cô cùng bạn bè.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường đại học Nha Trang, Khoa
Công Nghệ Thực Phẩm, Phòng thực hành công nghệ chế biến, Phòng thí nghiệm công
nghệ cao đã tạo điều kiện thuận lợi và hỗ trợ cho em trong quá trình học tập và thực
hiện nghiên cứu của mình.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới giảng viên TS. Nguyễn Bảo đã tận tình hướng
dẫn, tạo điều kiện tốt và động viên em trong suốt quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu.
Trong quá trình thực hiện đề tài không tránh khỏi những sai sót, em rất mong
nhận được sự đóng góp từ quý Thầy Cô. Em xin chân thành cảm ơn!
Khánh Hòa, tháng 07 năm 2018
Sinh viên thực hiện

Trần Thị Thu Thỏa

i


MỤC LỤC


LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................i
MỤC LỤC ..................................................................................................................... ii
DANH MỤC HÌNH ......................................................................................................iv
DANH MỤC BẢNG .....................................................................................................vi
KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................ vii
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .........................................................................................3
1.1

Tổng quan về ốc nón ........................................................................................3

1.1.1

Đặc điểm hình thái và cấu tạo của ốc nón...................................................3

1.1.2

Đặc điểm sinh thái và phân bố. ...................................................................5

1.1.3

Chế độ ăn và phương thức săn mồi .............................................................5

1.2

Tổng quan về tuyến nọc độc và độc tố ...........................................................8

1.2.1

Tuyến nọc độc .............................................................................................8

1.2.2

Độc tố của ốc nón ......................................................................................10

1.2.3

Phân loại độc tố .........................................................................................11

1.3

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) .......................................16

1.4

Phương pháp phổ khối MALDI-TOF MS ...................................................18

1.5

Tình hình nghiên cứu về độc tố. ...................................................................19

1.5.1

Nghiên cứu trên thế giới............................................................................19

1.5.2

Nghiên cứu trong nước..............................................................................20

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................22
2.1 Đối tượng nghiên cứu và phương pháp thu mẫu ............................................22
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................22
2.1.2 Hóa chất .........................................................................................................22
2.1.3 Dụng cụ và thiết bị .........................................................................................22
2.1.4 Thu mẫu .........................................................................................................23
2.2 Phương pháp nghiên cứu...................................................................................23
ii


2.2.1 Sơ đồ tổng quát của nghiên cứu.....................................................................23
2.2.2 Bố trí thí nghiệm tách chiết độc tố thô ..........................................................24
2.2.3 Khảo sát và phân vùng sơ bộ nọc độc thô bằng RP-HPLC ...........................28
2.2.4 Phân tích khối phổ các phân vùng độc tố bằng MALDI-TOF MS ...............28
2.2.5 Phương pháp khử peptide. .............................................................................29
2.3 Xác định hàm lượng protein của độc tố thô theo phương pháp Bradford ...29
2.4 Xử lý số liệu. ........................................................................................................31
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ..................................32
3.1 Kết quả khảo sát thông số ly tâm ở công đoạn tách độc tố ............................ 32
3.2 Kết quả khảo sát thông số lực ly tâm cho công đoạn siêu lọc ........................32
3.3 Kết quả sắc ký đồ pha đảo của nọc độc thô C. bandanus. .............................. 33
3.4 Kết quả phân tích phổ khối của nọc độc thô và các phân vùng.....................34
3.4.1 Kết quả phân tích MALDI-TOF MS của phân vùng Z1 ở dạng tự nhiên và
dạng khử .................................................................................................................34
3.4.2 Kết quả phân tích MALDI-TOF MS của phân vùng Z2 ở dạng tự nhiên và
dạng khử .................................................................................................................36
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN..........................................................................40
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................42

iii


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hình dạng bên ngoài của ốc nón Conus bandanus ...................................3
Hình 1.2. Các bộ phận của ốc nón ............................................................................4
Hình 1.3. Cách săn mồi dạng móc câu của ốc nón Conus ........................................6
Hình 1.4. Cách săn mồi dạng lưới ............................................................................6
Hình 1.5. Ốc nón ăn nhuyễn thể ...............................................................................7
Hình 1.6. Ốc nón ăn giun biển ..................................................................................7
Hình 1.7. Cấu tạo răng kitin của loài ăn cá ............................................................... 9
Hình 1.8. Cấu tạo răng kirtin của loài ăn nhuyễn thể .............................................10
Hình 1.9. Cấu tọ răng kitin của loài ăn giun biển ...................................................10
Hình 1.11. Các phương pháp tách trong tinh sạch sắc ký. (1) Tương tác kỵ nước;
(2) Pha đảo; (3) Trao đổi ion; (4) Lọc gel; (5) Ái lực ...................................................18
Hình 1. 12. Sơ đồ minh họa hoạt động của hệ MALDI-TOF .................................19
Hình 2.1. Vỏ của ốc nón C. bandanus ....................................................................22
Hình 2.2. Tuyến nọc độc của ốc nón C. bandanus .................................................22
Hình 2.3. Sơ đồ tổng quát của nghiên cứu phân tích thành phần conopeptide từ nọc
độc ốc nón C. bandanus ................................................................................................ 23
Hình 2.4. Sơ đồ tách chiết .......................................................................................24
Hình 2.5. Khảo sát lực ly tâm ở công đoạn tách chiết độc tố .................................25
Hình 2.6. Khảo sát thời gian ly tâm ở công đoạn tách chiết độc tố ........................26
Hình 2.7. Công đoạn cut-off bằng ống Amicon 0.5 ml. .........................................27
Hình 2.8. Khảo sát lực ly tâm ở công đoạn siêu lọc ...............................................27
Hình 2.9. Hệ thống sắc ký lỏng cao áp Shimadzu LC-class 10 .............................. 28
Hình 2.10. Hình bên trái của thiết bị phân tích MALDI-TOF/TOF MS và hình bên
phải là sơ đồ hóa cơ chế hoạt động của máy. ................................................................ 29
Hình 2.11. Đồ thị đường chuẩn của phương pháp Bradford ..................................30
Hình 3.1. Sắc ký đồ pha đảo (RP-HPLC) của nọc độc thô ốc nón C. bandanus qua
cột Vydac C18 (300 Å, 5µm, 4.6 mm, 250mm) với tốc độ dòng 1 ml.phút-1 ................33
Hình 3.2. Phổ khối [M+H]+của nọc độc thô ốc nón C. bandanus ..........................34

iv


Hình 3.3. Phổ khối [M+H]+ của phân vùng Z1 từ 25-33 phút trên sắc ký đồ với (A)
dạng tự nhiên, (B) dạng khử ..........................................................................................35
Hình 3.4. Phổ khối [M+H]+ của phân vùng Z2 từ 33-39 phút trên sắc ký đồ với (A)
dạng tự nhiên, (B) dạng khử ..........................................................................................36
Hình 3.5. Phổ khối [M+H]+ của phân vùng Z3 từ 39-44 phút trên sắc ký đồ với (A)
dạng tự nhiên, (B) dạng khử ..........................................................................................37
Hình 3.6. Phổ khối [M+H]+ của phân vùng Z4 từ 44-53 phút trên sắc ký đồ với (A)
dạng tự nhiên, (B) dạng khử ..........................................................................................38

v


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Bộ khung cysteine trong Conoserver ........................................................... 13
Bảng 1.2. Các đại diện conopeptide trong các giai đoạn thử nghiệm lâm sàng ........... 15
Bảng 2.1. Nồng độ abumin khác nhau để dụng đường chuẩn ...................................... 30
Bảng 3.1. Bảng mô tả trạng thái dịch ly tâm ở công đoạn tách độc tố với lực ly tâm
khác nhau trong thời gian 10 phút ............................................................................... 32
Bảng 3.2. Bảng mô tả trạng thái dịch ly tâm ở công đoạn tách độc tố trong khoảng thời
gian khác nhau ở 3500 xg ......... .................................................................................. 32
Bảng 3.3. Bảng mô tả lượng dịch thu hồi ở công đoạn cut-off với lực ly tâm khác nhau
trong 10 phút ............................. .................................................................................. 32
Bảng 3.4. Khối lượng phân tử giữa các phân vùng của độc tố ốc nón C. bandanus ... 39

vi


KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
S-S: disulfide
LC: Phương pháp sắc ký lỏng (Liquid chromatography)
RP-HPLC: Phương pháp sắc ký lỏng pha đảo (Reversed Phase - HighPerformance Liquid Chromatography)
MALDI: Matrix assisted laser desorption/-ionization
TOF: Thời gian bay (Time of flight)
MS: Khối phổ (Mass spectrometry)
KLPT: Khối lượng phân tử

vii


ĐẶT VẤN ĐỀ
1. Tính cấp thiết của đề tài
Vùng biển Việt Nam có khoảng trên 11000 loài sinh vật biển, trong đó có 692
loài thực vật phù du, 657 loài động vật phù du, 94 loài thực vật ngập mặn, 653 loài
rong biển, 6377 loài động vật đáy lớn (trong đó có 2523 loài thân mềm, 1647 loài giáp
xác, 714 loài ruột khoang, 734 loài giun đốt, 384 loài da gai và nhiều nhóm sinh vật
khác), khoảng 2109 loài cá biển, trong đó có 779 loài cá rạn san hô. Với số liệu trên,
các nhà chuyên môn trong và ngoài nước đánh giá biển Việt Nam là một trong các
trung tâm đa dạng sinh vật biển trên thế giới.
Trong đó, ốc nón là một trong những nguồn lợi hải sản có mức độ phong phú về
thành phần loài theo báo cáo của Hylleberg và Kilburn (2003), vùng biển Việt Nam có
khoảng 76 loài ốc nón. Chúng phân bổ chủ yếu ở các vùng ven biển, quanh các đảo
thuộc vùng biển miền Trung: Lý Sơn (Quảng Ngãi), Cù Lao Chàm (Quảng Nam),
Sông Cầu (Phú Yên), Hòn Lớn (Vân Phong-Khánh Hòa), và vịnh Nha Trang (Khánh
Hòa). Vỏ ốc nón có màu sắc sặc sỡ với hoa văn đẹp mắt nên rất được ưa chuộng để
làm đồ mỹ nghệ, đồ trang sức, đồ lưu niệm và thịt ốc là một nguồn cung cấp dinh
dưỡng dồi dào. Chính vì vậy dẫn đến tình trạng khai thác quá mức làm cạn kiệt nguồn
tài nguyên này [1].
Ngoài giá trị về mặt thẩm mỹ và dinh dưỡng, ốc nón còn mang lại lợi ích vô cùng
to lớn trong lĩnh vực y dược. Bởi vì loài này sử dụng nọc độc để tự vệ hoặc săn mồi.
Tùy vào loại thức ăn của chúng là động vật thân mềm, cá, sâu biển hay một số loài ốc
nón khác mà tạo ra hàng nghìn peptide độc có hoạt tính sinh học khác nhau. Tuy
nhiên, theo thống kê của Lewis và cộng sự (2012), thì hiện nay chỉ mới có khoảng
0,1% conopeptide đã được biết rõ về dược tính và tiềm năng trong điều trị bệnh nan y
từ nguồn dược này[2]. Trong đó có ω-conotoxin MVIIA đã được thương mại hóa với
cái tên là Ziconotide (SNX-111; Prialt) sản phẩm này được tổng hợp từ độc tố của ốc
nón Conus magus. Ziconotide có tác dụng giảm đau cho các cơn đau dữ dội và mãn
tính, sản phẩm được sử dụng bằng cách tiêm trực tiếp vào não tủy để giảm đau ngay
(được FDA phê duyệt vào tháng 12/2004).
Vì ứng dụng cần thiết đó nên cần tập trung nghiên cứu conopeptide của các loài
ốc nón tiềm năng để khai thác những hoạt tính về y học từ nguồn độc dược này. Đây
1


cũng là một hướng đi chiến lược để tìm ra các dược phẩm điều trị các bệnh nan y
(giảm đau cho bênh nhân ung thư và các bệnh liên quan đến thần kinh). Từ sự tài trợ
kinh phí của Quỹ phát triển khoa học và công nghệ quốc gia cho đề tài “Nghiên cứu
các peptides hoạt tính sinh học thần kinh của ốc nón săn nhuyễn thể ở vùng biển
Khánh Hòa”, chúng tôi thực hiên một nội dung “Nghiên cứu tách chiết độc tố
conopeptide từ ốc nón Conus bandanus và đánh giá sơ bộ thành phần của độc tố”

2. Mục tiêu đề tài
Đánh giá sơ bộ thành phần của độc tố

3. Nội dung nghiên cứu


Khảo sát điều kiện chiết độc tố thô của ốc nón C. bandanus.



Phân đoạn peptide bằng kỹ thuật sắc ký lỏng pha đảo.

 Phân tích sơ bộ các phân đoạn peptide bằng phương pháp khối phổ.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1

Tổng quan về ốc nón

1.1.1 Đặc điểm hình thái và cấu tạo của ốc nón
Phân loại: Họ ốc nón Conidae thuộc liên họ Conoidea, bộ Sorbeoconcha, là một
trong những họ có số lượng loài lớn trong ngành động vật thân mềm. Cho đến nay trên
thế giới đã xác định được hơn 700 loài, chủ yếu thuộc giống Conus.
Hệ thống phân loại ốc nón như sau:
Giới: Animalia
Ngành: Mollusca
Lớp: Gastropoda
Liên họ: Conoidea
Họ: Conidae
Phân họ: Coninae
Giống: Conus
Hình thái: Hiện nay các nhà khoa học đã xác định được khoảng 500-700 loài ốc
nón Conus. Những loài ốc này đều có đặc điểm chung là có màu sắc sặc sỡ với những
loại hoa văn đẹp mắt. Vỏ thuôn dài, dày, bằng đá vôi, chắc nặng, xoắn theo chiều kim
đồng hồ như hình 1.1 [3].

Hình 1.1. Hình dạng bên ngoài của ốc nón Conus bandanus

Cấu tạo vỏ của ốc nón
- Vỏ hình chóp thuôn dài, cấu tạo bằng đá vôi, chắc nặng xoắn theo chiều kim
đồng hồ. Lỗ miệng kéo dài và thu hẹp, nắp miệng bằng chất sừng, rất nhỏ. Vỏ có màu
3


sắc sặc sỡ, hoa văn rất đa dạng. Vỏ còn được phủ bên ngoài một lớp sừng trong suốt
màu vàng rất nhạt. Vỏ của ốc nón có ba dạng hình thái điển hình là hình nón, hình nón
rộng và hình nón bẹp, đây là một trong những chỉ tiêu quan trọng để phân loại ốc nón.
- Kích thước của các loài ốc nón rất khác nhau tùy theo loài. Có loài lớn đến 23
cm, đa số trong khoảng 5-7 cm. Đầu có một súc tu (râu), toàn thân liền trong vỏ bao
bọc một lớp nhầy. Do cấu tạo vỏ của chúng có khe hở rộng nên chúng có thể thò vòi
tiếp xúc con mồi ở phạm vi khá rộng, dễ gây nguy hiểm cho con mồi.
Các bộ phận của ốc nón: gồm 4 bộ phận như ở hình 1.2 và chân

Hình 1.2. Các bộ phận của ốc nón

- Vòi hút: Vòi hút là vũ khí săn mồi của ốc nón. Độc tố được tiêm vào con mồi
bằng các răng chứa trong túi răng kitin. Vòi hút có thể duỗi ra dài gấp 2 lần cơ thể ốc
nón.
- Súc tua: Súc tua của ốc có chức năng như mũi. Đó là một túi có thể duỗi ra dài
ra và phát hiện con mồi trong môi trường nước xung quanh. Nó cũng góp phần đưa
nước đến mang giúp cho quá trình hô hấp.
- Mắt: Ốc nón có 2 mắt, nằm ở 2 bên miệng. Hiện tại vẫn chưa rõ khả năng nhìn
của ốc nón.
- Miệng: Miệng có thể mở rộng ra phía trước để nuốt con mồi. Hệ thống cơ để co
duỗi để và đưa miệng vào trong vỏ.
- Chân: Chân có cấu tạo bằng cơ, giúp ốc nón di chuyển trên bề mặt.
4


1.1.2 Đặc điểm sinh thái và phân bố.
Ốc nón Conus thường phân bố ở vùng vĩ độ giữa 40o Bắc và 40o Nam, thuộc các
vùng biển: Ấn Độ - Thái Bình Dương, Panamic, Caribean, Peruvian, Patagonic, Tây
và Nam Phi, Địa Trung Hải. Nhìn chung ốc nón xuất hiện hầu hết ở vùng biển nhiệt
đới và cận nhiệt đới, nhưng đa dạng nhất ở khu vực Ấn Độ - Thái Bình Dương. Mật độ
phân bố lớn nhất của chúng đạt 40 cá thể/m2, nhưng thường có số loài ít đa dạng [4].
Ở Việt Nam, ốc nón phân bố chủ yếu tại các vùng ven biển thuộc khu vực Nam
Trung Bộ từ Đà Nẵng (Khánh Hòa, Bình Thuận,…) đến Vũng Tàu, Kiên Giang và
quanh các hải đảo ( như Lý Sơn, Cù Lao Chàm, Trường Sa, Hoàng Sa, Phú Quý, Côn
Đảo) với khoảng 76 loài [1].
1.1.3 Chế độ ăn và phương thức săn mồi
Ốc nón là loài ăn thịt có tính chuyên hóa cao. Thức ăn chính của chúng là giun
biển (70%), nhuyễn thể (15%), cá (15%) và cả các ốc nón khác. Chúng có một cơ quan
bắt mồi chuyên biệt là răng kitin. Răng kitin của ốc nón hõm sâu và có gai, giống như
cây lao thu nhỏ. Chiều dài của răng thông thường khoảng vài mm, nhưng đôi khi có
thể lên đến 10 mm. Dải răng kitin này có thể kéo dài hoặc mở rộng như những ống
vòi. Khi ốc nón nhận ra con mồi, vòi của chúng sẽ kéo dài ra, nhờ một lực co cơ những
chiếc răng kitin trong ống vòi phóng ra rất nhanh kèm theo một lượng lớn độc tố được
phóng thích và làm tê liệt con mồi nhanh chóng. Sự tấn công chỉ xảy ra trong một
phần nghìn giây. Chất độc sẽ gây tê liệt con mồi và gây tử vong cho đối tượng trong
thời gian rất ngắn [5].
- Loài ăn cá
Ốc nón ăn cá có 2 phương thức săn mồi là dạng móc câu và dạng lưới. Nọc độc
của các loài này gây ra hai trạng thái tê liệt cho con mồi là tê liệt cứng và tê liệt mềm.
Tê liệt cứng khi tất cả các cơ cùng co thắt lại cùng một lúc khiến con mồi trở nên cứng
đờ trong khi tê liệt mềm các cơ không bị co thắt lại con mồi trở nên mềm nhũng.
Săn mồi dạng móc câu: Ốc nón săn mồi bằng móc gai (phóng răng kitin có móc
gai) giống như cần câu cá. Đầu tiên chúng sẽ sử dụng súc tua để tìm kiếm con mồi
xung quanh vùng nước, nếu phát hiện ra con mồi, chúng sẽ mở rộng vòi (vòi có thể
5


mở rộng gấp đôi chiều dài cơ thể), trong vòi có các răng kitin chứa độc tố sẽ bắn vào
cơ thể chính con mồi. Độc tố là hỗn hợp các conotoxin có khả năng làm tê liệt con
mồi, ban đầu con mồi sẽ co giật mạnh sau đó bất động và cứng đờ. Răng kitin có các
móc gai sẽ buộc chặt con mồi vào vòi, con mồi được nhanh chóng đưa vào miệng. Các
loài ốc nón săn mồi kiểu móc câu khiến con mồi trở nên cứng đơ để chúng có thể dễ
dàng nuốt, cách săn mồi này được mô tả ở hình 1.3.

Hình 1.3. Cách săn mồi dạng móc câu của ốc nón Conus

Săn mồi dạng lưới: Một hay nhiều con mồi bị bắt giữ thông qua phần miệng mở
rộng ra trông giống như một cái bát san hô hoặc nơi trú ẩn trên rạn san hô (hình 1.4)
sau đó chất độc được tiêm vào chúng thông qua các gai móc để làm tê liệt con mồi.
Một số loài có vòi hút ở ngoài giống như ngón tay làm con mồi nhầm tưởng là hải quỳ.

Hình 1.4. Cách săn mồi dạng lưới

6


- Loài ăn nhuyễn thể
Chúng ăn vô số các động vật thân mềm biển khác bao gồm các loài ốc biển và
một số loài ốc cối khác. Sau khi phóng răng kitin vào mục tiêu, con mồi được đưa cẩn
thận vào miệng (miệng có thể đưa vào trong vỏ qua khe hở của vỏ) để bắt đầu tiêu hóa
con mồi. Những loài ốc nón có thể giết và nuốt những con mồi lớn hơn chúng [6].
Loài ăn nhuyễn thể điển hình là C. bandanus (hình 1.5).

Hình 1.5. Ốc nón ăn nhuyễn thể

- Loài ăn giun biển
Ốc nón ăn các loài giun biển là nhóm lớn nhất trong giống Conus, săn chủ yếu
giun biển (giun nhiều tơ) như hình 1.6, chúng dùng hệ thống phân phối độc tố tương tự
như ốc nón ăn cá và nhuyễn thể. Khi con mồi bị tiêm nọc độc và tê liệt, ốc nón sẽ
nhanh chóng tiêu hóa chúng. Hầu hết các loài ăn giun biển thường không gây độc cho
con người do tính chất vốn có của nguồn thức ăn. Răng kitin của các loài này thường
dài 0.5-4 mm (trong khi loài ăn cá là 5-12mm) [7].

Hình 1.6. Ốc nón ăn giun biển

7


1.2

Tổng quan về tuyến nọc độc và độc tố

1.2.1 Tuyến nọc độc
Tuyến nọc độc của ốc nón gồm các bộ phận: túi nọc độc, ống dẫn độc, vòi hút,
túi răng kitin vị trí của chúng được mô tả trong hình 1.7.

Hình 1.7. Tuyến nọc độc của ốc nón Conus

- Túi nọc độc: Hình lưỡi liềm, màu trắng sữa, nằm vuông góc với trục của cơ thể,
lõm về phía đỉnh vỏ, lồi ra về phía ngược lại. Túi nọc độc là cơ quan lớn nhất trong
tuyến nọc độc, có chức năng tiết ra độc tố và tạo ra áp lực khi bơm độc tố vào con mồi.
- Ống dẫn độc: Là cơ quan chính của bộ máy nọc độc, nằm ở phía sau hầu về
phía bên phải ngay sau vòng cơ. Khi cắt dọc ống này có thấy một vùng sáng rõ rất lớn
được lấp đầy chất độc trong cấu trúc dạng dây của các hạt màu, được bao quanh bởi
một lớp biểu mô mỏng của các tế bào tiết hình khối nằm ở phần gốc sợi cơ. Thành ống
bao gồm một lớp cơ vòng nhẵn trung gian và một lớp cơ theo chiều dọc bên ngoài [8].
- Vòi hút: Là phần cuối cùng của tuyến nọc độc, rỗng phía trong, hình chóp cụt,
lớn hơn ở phần nối với hầu, nhỏ hơn đối với phần còn lại, có khả năng thay đổi kích
thước và độ đàn hồi rất tốt. Khi tấn công con mồi, vòi hút sẽ phình to hút con mồi vào
bên trong đưa đến nhánh ngắn của túi răng kitin và răng kitin được phóng ra, tiếp đến
chất độc sẽ được bơm đầy làm tê liệt con mồi.
- Túi răng kitin (dải răng kitin): chứa các răng kitin. Túi răng kitin bao gồm hai
nhánh. Nhánh dài có màu đỏ ở phần nối với ống dẫn và vàng nhạt ở phần còn lại,
nhánh còn lại trong suốt. Phía cuối túi răng kitin này có tế bào tạo răng với vai trò tạo
8


ra các răng kitin mới. Các răng kitin ban đầu mềm sau đó trở nên cứng khi chúng di
chuyển từ nhánh dài đến nhánh ngắn, quá trình đi tới nhánh ngắn răng kitin đi song
song dọc theo túi [9].
Răng kitin của ốc nón giống như kim tiêm trong suốt, khi tiêm vào cơ thể con
mồi răng kitin sẽ được giữ lại trong cơ thể, răng này có vai trò đưa chất độc vào cơ thể
con mồi. Trên răng có các ngạnh để giữ răng kitin lại trong con mồi. Tùy từng loài sẽ
có kích thước răng kitin khác nhau. Các ngạnh của răng giống như các ngạnh của lưỡi
câu. Tất cả răng kitin các loài ốc nón có ngạnh đầu, một số có ngạnh thứ hai, ngoài ra
còn tìm thấy một số rất ít loài có ngạnh thứ ba. Lưỡi răng kitin có vai trò cắt và mở
rộng diện tích tiếp xúc khi phóng kim tiêm vào con mồi. Đường răng cưa là một dãy
răng nhỏ chạy dọc phía trong thân răng kitin từ ngạnh đầu xuống gần giữa răng kitin.
Các răng nhỏ này có kích thước lớn dần từ đỉnh đến giữa thân răng kitin. Răng kitin
chỉ được sử dụng một lần để tiêm vào con mồi sau đó chúng sẽ bị loại, các loài ốc nón
sẽ tiếp tục tạo ra các răng kitin mới [10].
Cùng với hình thái, màu sắc, vân trên vỏ, răng kitin là một cơ sở để định danh
loài và phân biệt các loài cận giống. Hình dạng và cấu trúc dải răng kitin của ốc nón
đặc trưng cho loài hoặc giống. Cấu trúc này thường được sử dụng rộng rãi trong phân
loại ốc nón [5]. Franklin và cộng sự (2007) nghiên cứu hình thái răng kitin của 22 loài
ốc nón ở vùng ven biển Ấn Độ, trong đó có 8 loài lần đầu tiên được mô tả. Kết quả có
sự khác biệt trong cấu trúc răng kitin ở các loài này và phân chúng làm ba nhóm:
- Nhóm A gồm các loài ăn cá. Răng kitin có 3 ngạnh với các đầu gai uốn cong,
không có đường răng cưa, eo, lưỡi kim, cựa đáy như hình 1.8.

-

Hình 1.7. Cấu tạo răng kitin của loài ăn cá

9


- Nhóm B: gồm các loài ăn động vật thân mềm. Răng kitin có 1 ngạnh và 1 lưỡi
thay bằng ngạnh thứ 2, đường răng cưa dài kết thúc ở chỗ lồi lên của lưỡi kim, có hoặc
không có eo, không có cựa đáy.

-

Hình 1.8. Cấu tạo răng kitin của loài ăn nhuyễn thể

- Nhóm C: gồm các loài ăn giun biển. Răng kitin gồm 1 ngạnh và 1 lưỡi, có
đường răng cưa, có cựa đáy, có eo răng.

Hình 1.9. Cấu tạo răng kitin của loài ăn giun biển

1.2.2 Độc tố của ốc nón
Nọc độc của các loài ốc nón là hỗn hợp của các conotoxin, nó là những độc tố
thần kinh có phân tử lượng thấp. Nọc độc của ốc nón rất phức tạp và đa dạng. Nó có
tính phức tạp bởi vì trong nọc độc có hàng trăm phân tử có hoạt tính (conopeptides) và
mỗi hợp chất sở hữu một hoạt tính sinh học đặc biệt. Tính đa dạng có thành phần nọc
độc khác nhau theo loài, cùng một loài thành phần nọc độc thay đổi khác nhau theo độ
tuổi sinh trưởng, mùa và môi trường sống và một đặc điểm nữa là có khoảng 700 loài
ốc nón khác nhau nhưng chỉ có khoảng một trăm loài được nghiên cứu.

10


Độc tố có tác dụng nhanh chóng bởi vì ốc nón di chuyển rất chậm nên sẽ khó
khăn trong việc bắt mồi, độc tố mạnh sẽ ngay lập tức làm tê liệt con mồi. Khi xác định
được con mồi, ngay lập tức ốc nón sẽ phóng răng kitin. Răng kitin khi bám vào con
mồi ngay lập tức sẽ có tác dụng, cố định con mồi bằng các chuỗi acid amin, các
peptide làm ức chế, bất hoạt kênh natri và chặn các kênh kali. Sự kết hợp này dẫn đến
kết quả là ngay lập tức xảy ra một quá trình khử cực lớn ở bất kì sợi thần kinh nào ở
vùng lân cận của vùng bị tiêm nọc độc, gây ra một hiệu ứng như điện giật. Tác động
thứ hai liên quan đến sự ức chế tổng truyền thần kinh cơ qua các conopeptide hoạt
động tại các điểm xa vị trí tiêm nọc độc chẳng hạn như các mối nối thần kinh cơ.
Trong nọc độc của các loài ốc nón ăn cá được nghiên cứu cho đến nay đều phát hiện
các peptide ức chế kênh canxi trước khớp thần kinh, làm cho các chất dẫn truyền thần
kinh bị cắt dòng, thụ thể nicotinic sau khớp thần kinh và các kênh natri làm nền tảng
cho hoạt động của các cơ [11].
Độc tố của những loài ốc nón là hỗn hợp của nhiều peptide ngắn giàu liên kết
disulfide (S-S) và gốc cystein có hoạt tính gây độc thần kinh còn gọi là conotoxin. Mỗi
loại độc tố ốc nón là một dãy duy nhất chứa trên 100 loại peptide khác nhau. Các
peptide này có kích thước nhỏ, dễ tổng hợp, cấu trúc ổn định, tác dụng vào các mục
tiêu chuyên biệt làm cho chúng trở thành các đầu dò lý tưởng trong dược học [12].
Mỗi loài ốc chứa một loại độc tố riêng, mỗi loại độc tố lại là một hỗn hợp các
peptide độc rất phức tạp, có cấu trúc và tính dược lý đặc trưng. Tập tính ăn của các loài
ốc sẽ dẫn đến sự khác nhau trong thành phần của conotoxin, điều này giải thích cho sự
đa dạng của các peptide độc tố. Hầu hết conotoxin ở các loài ốc nón ăn cá có sự đa
dạng hơn các loài ăn giun và nhuyễn thể [13].
Conopeptide thường có khối lượng nhỏ, phần lớn conotoxin giàu liên kết S-S có
chiều dài khoảng 12-30 amino acid. Ngược lại, chiều dài của đoạn polypeptide từ các
độc tố khác thường khoảng 40-80 amino acid. Mặc dù kích thước nhỏ nhưng trình tự
amino acid giữa các loài là rất phức tạp [14].
1.2.3 Phân loại độc tố
Các peptide phân lập từ nọc độc ốc nón được gọi là các conopeptide vào những
năm gần đây số lượng các conopeptide đã được pháp hiện tăng lên đáng kể. Hiện tại
11


có hơn 2000 chuỗi conopeptide đã được công bố [15]. Cruz và cộng sự vào năm 1985
đã công bố bản danh pháp các conopeptide [16] và sau đó được nhiều lần cập nhật.
Phân loại các conopeptide thành các liên họ dựa trên trình tự và khung tín hiệu tương
đồng và sau đó các họ conopeptide có dược lý dựa trên các mục tiêu tương tác. Các
peptide độc của ốc nón được chia thành hai nhóm là nhóm ít liên kết S-S và nhóm
nhiều liên kết S-S như trong hình 1.11. Các peptide có ít liên kết S-S là có chứa một
hoặc không có liên kết S-S nào. Các peptide không có chứa liên kết S-S nào được chia
thành các nhóm nhỏ: các contulakin (nhắm vào thụ thể neurotensin), các conantokin
(nhắm vào các thụ thể acid N-methyl-D-aspartic), các conoramit (nhắm vào thụ thể
Rfamide), các conolysins (nhắm vào màng tế bào), conopeptide Y (nhắm vào kênh K+)
và các nhóm conopham, conoporin, conomarphin, conomap chưa xác định rõ. Các
peptide chứa một liên kết S-S được phân vào các contryphans (nhóm mục tiêu không
xác định) hoặc là các conopressin (homologs vasopressin). Các peptide nhiều liên kết
S-S được gọi là conotoxin và là nhóm được quan tâm nhiều vì nhiều dược tính. Những
peptide có thể dao động từ 11-71 acid amin nhưng khoảng 80% trong số đó có chiều
dài từ 12-33 acid amin [17].
Các conotoxin đã được phân thành liên họ dựa trên bộ khung trình tự của các
peptide tiền chất dựa vào bảng 1.1 để phân loại bộ khung. Đối với liên họ thì có hai
hay nhiều hơn các khung cysteine, một là chiếm ưu thế và chỉ được tìm thấy trong một
vài trường hợp. Có một số tín hiệu được duy trì sử dụng để xác định các conopeptide
thuộc về một liên họ nào đó. Tuy nhiên đối với các conopeptide mới được phát hiện
thì được nhóm lại một bộ khung và được phân loại dựa trên mục đích mà chúng tương
tác [17].
Ở hình 1.11, nhóm ít liên kết S-S nằm ở phần phía trên của đường nét đứt và
nhóm nhiều liên kết S-S nằm phía dưới đường nét đứt. Nhóm nhiều liên kết S-S các
conotoxin được phân loại thành các liên họ dựa trên bộ khung cysteine. Các conotoxin
đặc trưng dựa trên liên kết S-S của chúng trong bộ khung và mục tiêu. B, I và O là các
liên họ được chi định họ gen riêng biệt: B1, B2, B3, I1, I2,O1, O2 và O3 trong hình là
kết quả của mỗi tín hiệu duy nhất và các mục tiêu cũng khác nhau.
12


Bảng 1.1. Bộ khung cysteine trong Conoserver

Tên

Khung cystien

Số cysteine

Liên kết S-S

I

CC-C-C

4

II

CCC-C-C-C

6

III

CC-C-C-CC

6

IV

CC-C-C-C-C

6

I-V, II-III,IV-VI

V

CC-CC

4

I-II, II-IV

VI/VII

C-C-CC-C-C

6

I-IV, II-V, III-VI

VIII

10

IX

C-C-C-C-C-C-C-C-C-C
C-C-C-C-C-C

6

I-IV, II-V, III-VI

X

CC-C.[PO]C

4

I-IV, II-III

XI

C-C-CC-CC-C-C

8

I-IV, II-VI, III-VII, V-VIII

XII

C-C-C-C-CC-C-C

8

XIII

C-C-C-CC-C-C-C

8

XIV

C-C-C-C

4

XV

C-C-CC-C-C-C-C

8

XVI

C-C-CC

4

XVII

C-C-CC-C-CC-C

8

XVIII

C-C-CC-CC

6

XIX

C-C-C-CCC-C-C-C-C

10

XX

C-CC-C-CC-C-C-C-C

10

XXI

CC-C-C-C-CC-C-C-C

10

XXII

C-C-C-C-C-C-C-C

8

XXIII

C-C-C-CC-C

6

XXIV

C-CC-C

4

XXV

C-C-C-C-CC

6

XXVI

C-C-C-C-CC-CC

8

XXVII

C-CC-C-C-C

6

I-III, II-IV

I-III, II-IV

13


Giá trị dược liệu của độc tố ốc nón
Một số loại độc tố ốc nón có liên quan đến sự giảm đau đớn và được dùng trong
điều trị giảm đau. Các độc tố này tác dụng lên các kênh canxi (ω-conotoxin), natri (μ-,
μO- và δ- conotoxin) và kali (κ- conotoxin), chất vận chuyển norepinephrine (χconopeptide), thụ thể (receptor) acetylcholine nicotinic (α-conotoxin), α1-adrenoceptor
(ρ-conopeptide), thụ thể NMDA (conantokins), thụ thể vasopressin (conopressin) và
thụ thể neurotensin (contulakins)[12].
Tín hiệu thần kinh từ tủy sống đưa lên não cần có sự vận chuyển các ion canxi
qua lại màng tế bào tiền synap qua các kênh canxi. Kênh canxi có nhiều loại: L, T, P,
R, Q, …Đặc biệt kênh canxi loại N có nhiều ở các mô cơ thần kinh đóng vai trò quan
trọng trong sự cảm nhận với các cơn đau. Kênh canxi này bao gồm 5 tiểu đơn vị trong
đó, tiểu đơn vị α2-δ có ái lực mạnh với các độc tố, ví dụ ω-conotoxin MVIIA.
Độc tố ω-conotoxin MVIIA đi vào cơ thể sẽ liên kết với các tiểu đơn vị α2-δ, làm
thay đổi cấu hình của tiểu đơn vị này, dẫn tới sự kìm hãm sự vận chuyển ion canxi qua
màng tế bào, sự truyền tín hiệu đau đớn không tới não được mà thần kinh vẫn làm việc
bình thường [18] [19] [20]. Do vậy, các độc tố ốc nón được sử dụng trong điều trị các
cơn đau mạn tính, các bệnh thần kinh như Parkinson, các bệnh liên quan đến hệ thần
kinh, ung thư, tim mạch và nhiều bệnh khác. Bảng 1.2 thống kê một số đại diện
conopeptide đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng.
Bảng 1.2. Các đại diện conopeptide trong các giai đoạn thử nghiệm lâm sàng

Tên
MVIIA
SIIIA
MrVIB
PVIIA
Xen2174
Vc1.1
TIA
Con-G
Cono-G
Cont-G

Cơ chế tác động
Ức chế Cav2.2
Ức chế Nav
Ức chế Nav 1.8
Ức chế Kv
Ức chế NET
Ức chế nAChR
Ức chế α1-Adrenoceptor
NMDA-R antagonist
Vasopressin-R agonist
Neurotensin-R agonist

Tiềm năng lâm sàng
Ức chế đau (tiêm ở cột sống; pha IV)
Ức chế đau (tiêm mạch máu)
Ức chế đau (tiêm ở cột sống/mạch)
Phục hồi tim mạch
Ức chế đau (tiêm ở cột sống; pha II)
Ức chế đau (tiêm mạch máu) a
Tim mạch
Đau/động kinh (tiêm ở cột sống) a
Tim mạch/cảm xúc
Ức chế đau (tiêm ở cột sống) a

15

Nguồn
[21]
[22]
[23]
[24]
[25]
[26]
[27]
[28]
[28]
[29]


1.3

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Sắc ký (Chromatography) là một phương pháp phân riêng vật lý mà trong đó các

thành phần sẽ được phân riêng nhờ sự phân bố giữa hai pha, một pha cố định gọi là
pha tĩnh và pha còn lại chuyển động theo một hướng gọi là pha động. Sắc ký cột là
một quá trình mà trong đó pha động thì liên tục di chuyển qua lớp sắc ký và mẫu được
đưa vào hệ thống bằng các lần bơm [8]. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn
hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính bị
hấp phụ, tính tan…). Trong hệ thống sắc ký chỉ có các phân tử pha động mới chuyển
động dọc theo hệ sắc ký. Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và
pha tĩnh. Trong quá trình chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp
pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ, phản hấp phụ. Hệ quả là các chất có
ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất
tương tác yếu hơn pha này. Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua
quá trình sắc ký [30].
Sắc ký lỏng pha đảo (RP-HPLC, Revered Phase – High Performance Liquid
Chromatography), là một kỹ thuật trong phân tích dung để tách, nhận biết, định lượng
từng thành phần trong hỗn hợp mẫu, qua cột sắc ký. Cột sắc ký được cấu tạo bằng vật
liệu hấp phụ rắn. Mỗi thành phần trong mẫu tương tác tương đối khác với các vật liệu
hấp phụ, nên tốc độ dòng của mỗi thành phần khác nhau là khác nhau, dẫn tới sự phân
tách các thành phần mà khi chúng chảy ra khỏi cột. RP-HPLC dựa trên hệ thống bơm
để đẩy chất lỏng đã bị nén và hỗn hợp mẫu qua một cột đổ bằng một chất hấp phụ, dẫn
tới sự phân tách của các thành phần trong mẫu. Thành phần hoạt động của cột, chất
hấp phụ, tiêu biểu là một vật liệu cấu trúc hạt làm từ những hạt rắn như silica hay
polymers, có kích thước trong khoảng 2-50 micromet. Những thành phần của hỗn hợp
mẫu được tách ra khỏi nhau bởi mức độ tương tác khác nhau với các hạt hấp phụ. RPHPLC dựa trên tương tác giữa tính kị nước trên bề mặt phân tử sinh học và bề mặt kỵ
nước của môi trương sắc ký. Để đẩy mạnh tương tác kỵ nước của bề mặt kỵ nước phải
đảo ngược bằng cách sử dụng dung môi hữu cơ không phân cực, chẳng hạn như
acetonitril hoặc metanol. Hình 1.11 thể hiện các bước thực hiện trong quá trình diễn ra
của sắc ký pha đảo. Thành phần và nhiệt độ của pha động đóng vai trò chính trong quá
trình phân tách bằng cách tác động lên nhưng tương tác xảy ra giữa những thành phần
16


trong mẫu và chất hấp phụ ở cột. Đây là những tương tác vật lý trong tự nhiên, như
hydrophobic, lưỡng cực-lưỡng cực và ion, thông thường nhất là sự kết hợp của các
tương tác. Dựa vào những tương tác tự nhiên nên người ta có các phương pháp tách
như hình 1.10:

Hình 1.10. Các giai đoạn diễn ra của sắc ký pha đảo.

17


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×