Tải bản đầy đủ

Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất thứ cấp từ cây Tơ Hồng họ Bìm Bìm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LÊ THỊ THANH HUỆ

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC
MỘT SỐ HỢP CHẤT THỨ CẤP TỪ CÂY TƠ HỒNG
(Cuscuta sinensis Lamk) HỌ BÌM BÌM (Convolvulaceae)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành: Sư phạm Hóa học

Phú Thọ, 2017


TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LÊ THỊ THANH HUỆ

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC

MỘT SỐ HỢP CHẤT THỨ CẤP TỪ CÂY TƠ HỒNG
(Cuscuta sinensis Lamk) HỌ BÌM BÌM (Convolvulaceae)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành: Sư phạm Hóa học

NGƯỜI HƯỚNG DẪN: ThS.Nguyễn Thị Bình Yên
Trường Đại học Hùng Vương

Phú Thọ, 2017


LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn Cô hướng dẫn khoa
học: ThS. Nguyễn Thị Bình Yên – Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại
học Hùng Vương đã theo sát, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, cung cấp kiến thức
và động viên em trong suốt thời gian thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp.
Được cô hướng dẫn là một may mắn của em trong năm cuối tại trường Đại
học sư phạm. Em xin chân thành cảm ơn Cô!
Em xin chân thành cảm ơn Thầy Triệu Qúy Hùng-Trường Đại học Hùng
Vương đã giảng dạy cho em những kiến thức quý báu để em hoàn thành đề tài
của mình.
Nhân dịp này em xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đến Ban Lãnh đạo Trường
Đại học Hùng Vương, Khoa Khoa học Tự nhiên - Trường Đại học Hùng
Vương đã tận tình dạy dỗ em suốt bốn năm học qua để em có kiến thức hoàn
thành khóa luận tốt nghiệp của mình.
Cảm ơn các bạn Phạm Thị Thanh Huyền, Tô Thị Thúy Nguyên, Nguyễn
Bá Hiển, Trần Thị Thu Hà, Hoàng Thị Nhung, Đào Thị Hải Yến, Phan Thúy
Hằng đã giúp đỡ, chia sẻ cùng em những khó khăn, vui buồn trong suốt quá
trình thực hiện đề tài.
Cảm ơn bố mẹ và gia đình thân yêu luôn sát cánh là chỗ dựa tinh thần
vững vàng nhất giúp em vượt qua mọi khó khăn và tạo mọi điều kiện tốt nhất
cho em hoàn thành đề tài khóa luận tốt nghiệp này.
Phú Thọ, ngày 12 tháng 5 năm 2017
Sinh viên

Lê Thị Thanh Huệ


- i-



MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT .......................................... iii
DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................. iv
DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................. v
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
1. Lý do lựa chọn đề tài .................................................................................. 1
2. Mục tiêu của đề tài ..................................................................................... 2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .................................................... 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................... 3
1.1 Giới thiệu về chi Cuscuta ......................................................................... 3
1.2 Đặc điểm thực vật loài Tơ hồng................................................................ 5
1.3 Các nghiên cứu về hóa thực vật chi Cuscuta ............................................. 5
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU............................................................................................................... 6
2.1 Đối tượng nghiên cứu ............................................................................... 6
2.2 Nguyên vật liệu và thiết bị ........................................................................ 6
2.2.1 Xử lý Nguyên vật liệu ....................................................................... 6
2.2.2. Hóa chất ............................................................................................ 7
2.2.3 Thiết bị nghiên cứu ............................................................................ 7
2.3 Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 9
2.3.1 Phương pháp ngâm chiết .................................................................... 9
2.3.2 Phương pháp sắc ký ......................................................................... 10
2.3.3. Phương pháp kết tinh ...................................................................... 19
2.3.4. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) .......................... 19
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ....................... 22
3.1 Quá trình điều chế cặn dịch chiết CH 2Cl2 cây Tơ hồng........................... 22
3.2 Quá trình phân lập các chất từ dịch chiết CH2Cl2 cây Tơ hồng ............... 23
3.2.1 Khảo sát thành phần định tính và lựa chọn dung môi ....................... 23


- ii-

3.2.2 Quá trình phân lập các chất .............................................................. 26
3.3 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập được .............................................. 36
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 41


- iii-

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
 Các phương pháp sắc ký
TLC

Thin Layer Chromatography: Sắc ký lớp mỏng

CC

Column Chromatography: Sắc ký cột
 Các phương pháp phổ

1

H-NMR

Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy:
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

s: singlet
d: doublet
m: multiplet
 Tên của các hợp chất được viết theo nguyên bản Tiếng Anh


- iv-

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Dây tơ hồng .................................................................................... 3
Hình 2.1. Cây Tơ hồng (tại Lâm Thao) .......................................................... 6
Hình 2.2 Làm sạch cây tơ hồng ...................................................................... 6
Hình 2.3. Máy cất quay chân không ............................................................... 7
Hình 2.4. Cột sắc ký với kích thước khác nhau............................................... 8
Hình 2.5 Bộ chưng cất dung môi ................................................................... 8
Hình 2.6 Máy soi UV ..................................................................................... 9
Hình 2.7. Sơ đồ chung của phương pháp ngâm chiết .................................... 10
Hình 2.8. Minh họa sắc ký lớp mỏng ............................................................ 10
Hình 2.9. Minh họa sắc ký cột ...................................................................... 18
Hình 2.10. Độ chuyển dịch hóa học của proton ............................................ 20
Hình 2.11. Sự tách vạch phổ......................................................................... 20
Hình 3.1. Quá trình ngâm dung dịch............................................................. 22
Hình 3.2. Sơ đồ điều chế cặn chiết CH2Cl2 và MeOH cây tơ hồng ............... 23
Hình 3.3. Cặn CH 2Cl2 cây Tơ hồng .............................................................. 23
Hình 3.4. Kết quả khảo sát TLC cặn chiết CH2Cl2 cây Tơ hồng ................... 25
Hình 3.5. TLC cặn CH2Cl2 Tơ hồng với hệ dung môi (III) ........................... 26
Hình 3.6. Cột tổng silicagel cặn CH2Cl2 ....................................................... 27
Hình 3.7. Hình ảnh TLC các phân đoạn F1÷F7 ............................................ 29
Hình 3.8. Cột phân đoạn F4.......................................................................... 30
Hình 3.9. Hình ảnh TLC các phân đoạn F4.1-F4.10 ..................................... 32
Hình 3.10. Khảo sat đoạt F4.8 ...................................................................... 34
Hình 3.11. Sơ đồ phân lập dịch chiết CH2Cl2 cây Tơ hồng ........................... 35
Hình 3.12. Hình ảnh chất CSDC3 và sắc ký đồ TLC .................................... 35
Hình 3.13. Cấu trúc của hợp chất CSDC3 .................................................... 36


- v-

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Một số giá trị vật lý của các dung môi thường gặp ....................... 13
Bảng 3.1. Giá trị Rf và màu sắc các vệt chất trên bản mỏng.......................... 26
Bảng 3.2. Kết quả các phân đoạn thu được từ cột tổng CH 2Cl2 .................... 28
Bảng 3.3. Kết quả các phân đoạn thu được từ phân đoạn F4 ........................ 31
Bảng 3.4. Kết quả các phân đoạn thu được từ phân đoạn F4.8...................... 33


-1-

MỞ ĐẦU
1. Lý do lựa chọn đề tài
Sức khỏe là tài sản quý giá nhất của con người, là sức sống, là niềm tin
và là sức mạnh mà không gì có thể so sánh bằng. Con người ai cũng có nhiều
mơ ước nhưng khi ốm đau, bệnh tật thì chỉ còn một điều ước duy nhất đó là
có sức khỏe. Nhận thức được tầm quan trọng của sức khỏe, ngay từ xa xưa cổ
đại, ông cha ta đã nghĩ đến việc chăm lo và bảo vệ sức khỏe, sử dụng các loại
cây có sẵn trong tự nhiên để bồi bổ cũng như chữa trị bệnh, làm mỹ phẩm,
hoặc sử dụng trong sản xuất nông nghiệp,…
Ngày nay, việc dùng các loài thuốc có nguồn gốc tự nhiên ngày càng
được ưa chuộng và các công trình nghiên cứu về chúng cũng ngày càng phát
triển để có thể khám phá, tiếp cận và tìm ra nhiều hơn nữa công dụng của các
loại cây trong y học một cách nghiêm túc, chi tiết và rõ ràng. Cùng với sự
phát triển của công nghệ tổng hợp hóa dược tạo ra các biệt dược, các nhà
khoa học vẫn đang cố gắng tìm hiểu, khám phá các hoạt tính sinh học khác
nhau của các hợp chất có nguồn gốc từ nhiều loài thực vật khác nhau.
Việt Nam là đường giao lưu hai chiều giữa thực vật chúng phong phú
của miền Nam Trung Quốc, của Malaysia, của Inđônêxia. Nước ta nằm trong
vùng nhiệt đới, không có sa mạc, không bao giờ chìm ngập dưới biển và
không bị giá băng phủ xua đuổi các loài nên rất thuận lợi cho sự sinh sôi, nảy
nở của cây cỏ [2]. Với những đặc thù về khí hậu thiên nhiên như vậy, Việt
Nam có một hệ thực vật phong phú và đa dạng với trên 12.000 loài, trong đó
có trên 3.200 loài thực vật được sử dụng làm thuốc trong Y học dân gian; mở
ra tiềm năng nghiên cứu về các hợp chất tự nhiên từ các loài thực vật của Việt
Nam [3].
Chi Cuscuta ở Việt Nam có 3 loài và các loài này đã được sử dụng trong
y học cổ truyền [1] mở ra tiềm năng nghiên cứu hóa thực vật về các loài này.
Dựa trên các tài liệu tham khảo cho thấy cho đến nay vẫn chưa có công
trình khoa học nào công bố về thành phần hóa học cây Tơ hồng trên địa bàn


-2-

tỉnh Phú Thọ. Nên chúng tôi lựa chọn đề tài “Nghiên cứu phân lập và xác
định cấu trúc một số hợp chất thứ cấp từ cây Tơ hồng ( Cuscuta sinensis
Lamk) họ Bìm bìm (Convolvulaceae)” nhằm mục đích góp một phần nhỏ
vào việc tìm hiểu thành phần hóa học trong cây Tơ hồng thu hái ở huyện Lâm
Thao tỉnh Phú Thọ.
2. Mục tiêu của đề tài
- Điều chế cặn dịch chiết CH2Cl2 của cây Tơ hồng.
- Phân lập chất sạch từ các phân đoạn của dịch chiết CH2Cl2 của cây Tơ
hồng.
- Xác định cấu trúc chất phân lập được bằng phương pháp phổ cộng
hưởng từ hạt nhân.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
- Ý nghĩa khoa học:
+ Kết quả của đề tài đóng góp thông tin cho lĩnh vực nghiên cứu hóa học
hữu cơ về thành phần hóa học của cây Tơ hồng.
+ Cung cấp dữ liệu về phổ cộng hưởng từ hạt nhân của một số hợp chất
thiên nhiên từ cây Tơ hồng.
- Ý nghĩa thực tiễn:
+ Bước đầu định hướng cơ sở hóa học trong việc sử dụng cây Tơ hồng
trong thực tiễn cuộc sống.
+ Góp phần nâng cao kiến thức về kỹ thuật chiết tách, phân lập hợp chất
thiên nhiên, về phổ cộng hưởng từ hạt nhân cho sinh viên.
+ Đề tài còn là tài liệu tham khảo cho sinh viên ngành hóa học và cán bộ
nghiên cứu hóa học hữu cơ.


-3-

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu về chi Cuscuta
CUSCUTA L., họ Tơ hồng - Cuscutaceae (từ chữ kouchoat hay
kouchota: tên Ả Rập của cây này)
Tơ hồng cây mọc leo cuốn, tạo thành những sợi trắng vàng hay hồng,
không có lá, hút nhựa mủ của các phần khí sinh của nhiều loại cây khác
(Hình 1.1).

Hình 1.1. Dây tơ hồng
Hoa nhỏ thường hợp thành xim đơn. Qủa nang mở bằng khe ngang hoặc
mở không đều.
Gồm đến 170 loài phân bố khắp thế giới, ở những vùng nhiệt đới, cận
nhiệt đới và ôn đới. Ở Việt Nam có 3 loài [1], [2], [4].
C. australis R. Br - Tơ hồng nam.
Toàn ký sinh không có diệp luc, thân bóng nhẵn, lóng dài, màu vàng hay
da cam, có vòi hút nhựa cây chủ. Lá teo thành vẩy nhỏ. Hoa nhỏ; tràng màu
lục; nhị đính ở miệng tràng; bầu có 2 vòi nhụy. Qủa nang chứa 4-2 hạt.
Loài của châu Âu, Nhật Bản, Trung Quốc, được truyền bá vào nước ta,
nay gặp thông thường ở miền Nam.
Cây ký sinh toàn bộ. Mọc leo lên các bờ bụi, hàng rào.
Hạt được dùng trị lưng gối yếu mỏi, liệt dương, di tính, đái đục, đầu
váng mắt hoa, tầm nhìn suy giảm, thai động không yên.


-4-

C. chinensis Lam - Tơ hồng, Dây tơ hồng. Dây leo quấn qua trái, không
có diệp lục, toàn cây dạng sợi to 1-2mm, màu vàng, bóng nhẵn có vòi hút,
thường ký sinh trên một số cây bụi. Lá tiêu dảm thành vẩy nhỏ. Hoa nhỏ, màu
trắng, thường tụ họp thành nhóm 10-12 cái; đài hoa gồm 5 lá đài dính; tràng
hoa do 5 cánh hoa dính hình lục lạc, cao 1,2cm; nhị 5; bầu có 2 vòi nhụy. Qủa
nhỏ, hình cầu; hạt 2-4.
Loài cây Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, được lan truyền ở nhiều nơi
thuộc miền Bắc nước ta.
Thường gặp ký sinh trên cây cúc tần và các loại cây bụi khác.
Ra hoa tháng 10-12.
Hạt được sử dụng làm thuốc gói là Thỏ ty tử. Thường dùng trị lưng gối
yếu mỏi, liệt dương, di tính, đái đục, đầu váng mắt hoa, sức nhìn giảm sút,
thai động không yên.
Dây tơ hồng cũng được dùng trị bệnh về phổi như ho, hen, viêm phổi,
táo bón do mất trường lực hoặc do thiếu mật, trướng bụng. Dùng ngoài rửa
mụn nhọt, sạm da mặt.
Liều dùng 12-16g dạng thuốc sắc. Có thể dùng dưới dạng cao lỏng (cao
tơ hồng 2g, nước cất 1000g), hàng ngày uống 2-4 thìa cà phê trước các bữa
ăn.
C. japonica Choisy - Tơ hồng Nhật, Tơ hồng lớn.
Dây leo mọc hằng năm, toàn ký sinh không có diệp lục, màu vàng hay
màu tía hồng, thân to 2mm, không lá, có vòi hút nhựa của cây chủ. Hoa màu
trắng hay hồng nhạt hợp thành chùm ngắn trên cuống rất ngắn; đài có 4 tai
tròn, không lông, tràng cao 3-4,5mm, thùy hình tam giác, nhị 5, đỉnh ở miệng
ống tràng; bầu 1 vòi nhụy. Qủa nang cao 4-5mm, hạt 1-2.
Loài của Nhật Bản, Triều Tiên, Trung Quốc và Việt Nam. Ở nước ta có
gặp tại Hà Nội.
Cây thường mọc leo lên các cây bụi.


-5-

Hạt cũng dùng như Thỏ ty tử để chữa can thận hư, lưng gối đau mỏi, di
tính, mắt mờ, đái đục, tiểu tiện đau buốt, phụ nữ có thai đẻ non, thai động
không yên.
CUSCUTACEAE Dumort., 1829 (Magno-liopsida - Lamiidae Convolvulales) - Họ tơ hông.
Cây leo bằng thân quấn, ký sinh không có diệp lục, thường hut nhựa của
cây chủ nhờ những giác mút. Thân hình sợi màu vàng, màu lục nhạt hay màu
đỏ. Không có lá hoặc có lá biến đổi thành vẩy.
Hoa nhỏ, tụ họp thành nhiều kiểu cụm hoa. Đài chẻ 4 hay 5. Tràng hình
cầu, hình nhạc, hình ống, có mép chia thành 4-5 thùy xếp lợp. Nhị 4-5, đính
trên họng của ống tràng. Ở gốc tràng có những có những vẩy nằm trong nhị
và xen kẽ với nhị. Bầu 2 ô, chứa 4 noãn, 2 vòi nhụy có khi dính liền làm một,
đầu nhụy hình chùy hay hình đầu
Quả nang 2 ô, rách không đều hoặc nứt ngang. Hạt 2-4, có phôi nhũ thịt;
phôi hình sợi chỉ cuộn vòng hay cuộn xoắn ốc trong phôi nhũ; lá mầm rất thô
sơ hoặc không có. Gồm 1 chi Cuscuta.
1.2 Đặc điểm thực vật loài Tơ hồng
Cây tơ hồng (Cuscuta sinensis Lamk) là một loại dây kí sinh cuốn trên
các cây khác, thân thành sợi màu vàng hay đỏ nâu nhạt, không có lá. Lá biến
thành vẩy, cây có dễ mút để hút các thức ăn từ cây chủ. Hoa ít thấy, hình cầu
màu trắng nhạt, gần như không có cuống, tụ thành 10-20 hoa một. Qủa hình
cầu, chiều ngang rộng hơn chiều cao, rộng độ 3mm, nút từ dưới lên. Hạt 2-4,
hình trứng, đỉnh dẹt, dài chừng 2mm.
1.3 Các nghiên cứu về hóa thực vật chi Cuscuta
Dựa trên các tài liệu tham khảo cho thấy đến nay vẫn chưa có công trình
khoa học nào công bố chi tiết về thành phần hóa học của cây Tơ hồng.
Theo Từ điển thực vật thông dụng của tác giả Võ Văn Chi chỉ ra cho
thấy cây Tơ hồng có chứa chất nhựa, tính chất glucozit gọi là cuscutin [1].


-6-

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu
Cây Tơ hồng được thu hái tại Thị trấn Lâm Thao – Huyện Lâm Thao –
Tỉnh Phú Thọ vào tháng 6/2016. Tên cây được xác định bởi nhà thực vật học
Đỗ Văn Hài. Mẫu tiêu bản kí hiệu QHT-04 được lưu giữ tại Viện Sinh thái và
Tài nguyên Sinh vật-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Hình 2.1. Cây Tơ hồng (tại Lâm Thao)
2.2 Nguyên vật liệu và thiết bị
2.2.1 Xử lý Nguyên vật liệu
Tơ hồng thu hái về loại bỏ tạp rác, thái nhỏ rồi phơi khô (Hình 2.2)

Hình 2.2 Làm sạch cây tơ hồng


-7-

2.2.2. Hóa chất
+ Dung môi được sử dụng như n-hexane, CH2Cl2, EtOAc, MeOH,
acetone đều là các hóa chất kỹ thuật của Việt Nam, Hàn Quốc được chưng cất
lại trước khi sử dụng.
+ Silica gel: Silica gel 60, 0.04 – 0.063 mm, Merck; Silica gel 250 – 400
mesh, dùng cho sắc ký cột.
+ Sắc ký bảng mỏng loại 25DC – Alufolien 20 x 20, Merck.
+ Thuốc thử hiện hình sắc ký bảng mỏng: Ce(SO4)2.
2.2.3 Thiết bị nghiên cứu
Quá trình ngâm chiết được thực hiện trong các bình thủy tinh có dung
tích 5 lít. Sau quá trình ngâm chiết, dung môi được thu hồi bằng máy cất quay
chân không IKA®RV 10 của Anh.

Hình 2.3. Máy cất quay chân không
Việc tinh chế các hỗn hợp sản phẩm được thực hiện bằng sắc ký cột siica
gel và sắc ký lớp mỏng. Với sắc ký cột silica gel thì tùy vào lượng mẫu chất ta
sử dụng các cột sắc ký có kích cỡ khác nhau: 1; 2; 2,5; 4; 10. Chất nhồi
cột sắc ký là silica gel 60 (0,063 – 0,200 mm) (70 – 230 mesh astm) đều là
của Merck còn sắc ký lớp mỏng sử dụng bình sắc ký lớp mỏng Camag của


-8-

Đức và bản mỏng sắc ký tráng silicagel 60 F254 trên tấm nhôm 20 × 20 cm của
Đức.

Hình 2.4. Cột sắc ký với kích thước khác nhau
Dung môi được chưng cất trước khi sử dụng bằng bộ chưng cất dung
môi của hãng IKA.

Hình 2.5 Bộ chưng cất dung môi


-9-

Hiện màu dưới bước sóng UV 254, 366 nm được thực hiện trên hệ thống
đèn UV CAMAG.

Hình 2.6 Máy soi UV
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp ngâm chiết
Do cấu tạo của cây cỏ hoặc sinh khối thường là những chất liệu đại phân
tử tương đối trơ, không hòa tan trong dung môi hữu cơ nên việc khảo sát hợp
chất tự nhiên chính là việc chiết lấy và khảo sát các chất thứ cấp có trọng
lượng phân tử nhỏ. Nguyên tắc tổng quát là lựa chọn dung môi và quy trình
phù hợp để chiết tách hợp chất ra khỏi mẫu cây, điều này tùy thuộc vào đặc
tính của chất thứ cấp có trong cây mà người khảo sát mong muốn tách cô lập:
cấu trúc hóa học đa dạng, tính chất phân cực khác biệt, … Muốn chiết hợp
chất ra khỏi cây cỏ cần chọn dung môi phù hợp có độ phân cực tăng dần (nhexane, CH2Cl2, EtOAc, MeOH, …), sử dụng kỹ thuật chiết tách phù hợp
bằng cách ngâm dầm rồi lọc. Sau khi lọc, phần bã cây hoặc sinh khối còn lại
được lọc bỏ. Dung môi qua lọc được thu hồi bằng máy cô quay chân không ở
nhiệt độ thấp khoảng 30-45 oC vì thực hiện ở nhiệt độ cao có thể làm hư hại
một vài hợp chất kém bền nhiệt [5].


-10-

Hình 2.7. Sơ đồ chung của phương pháp ngâm chiết
2.3.2 Phương pháp sắc ký
2.3.2.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng
Đặc điểm chung:

K: Hỗn hợp chất ban đầu
A: Các vệt chất được phân tách
Hình 2.8. Minh họa sắc ký lớp mỏng


-11-

Về bản chất, đây là hệ sắc kí lỏng – rắn mà pha tĩnh rắn được trải thành
lớp mỏng trên bản kính, nhựa hay kim loại. Giọt dung dịch mẫu nghiên cứu
được nhỏ trên đường xuất phát cách rìa bản 2-3 cm, còn rìa bản được nhúng
vào một dung môi thích hợp. Dung môi này đóng vai trò như pha động trong
sắc kí hấp phụ lỏng – rắn. Dưới tác dụng của lực mao quản, dung môi sẽ
chuyển động dọc theo lớp hấp thụ và chuyển vận các cấu tử của hỗn hợp với
các vận tốc khác nhau đưa đến việc tách các cấu tử. Sự khuyếch tán các cấu tử
trong lớp hấp phụ vừa theo chiều dọc vừa theo chiều ngang vì vậy có thể xem
quá trình sắc kí thực hiện theo hai chiều. Vì các đặc điểm kĩ thuật trên đây mà
phương pháp sắc kí bản mỏng còn có các tên gọi khác: phương pháp giọt,
phương pháp sắc kí dài, phương pháp sắc kí bề mặt, phương pháp sắc kí cột
mở…
Phương pháp sắc kí bản mỏng được ứng dụng để phân tích định tính,
định lượng các hợp chất vô cơ cũng như hữu cơ. Ưu điểm cơ bản của phương
pháp sắc kí bản mỏng là thiết bị đơn giản, thời gian phân tích không kéo dài,
việc tách các cấu tử có thể thực hiện khá dễ dàng.
Sắc ký lớp mỏng dùng để khảo sát thành phần và sắc ký lớp mỏng điều
chế đều được thực hiện trên bản mỏng đế nhôm tráng sẵn Silica gel 60 F254
của hãng Merck có độ dày 0,25 mm. Dung môi triển khai là 1 hoặc hỗn hợp
một số dung môi thông dụng như n-hexane, CH2Cl2, EtOAc, acetone, MeOH.
Thuốc thử hiện màu được sử dụng là ceri sulfate.
Cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc ký silica gel nói chung là dựa trên
khả năng hấp phụ khác nhaucủa các chất trên silica gel (pha tĩnh) sẽ được
dung môi rửa giải (pha động) khi đi lên theo lực mao quản sẽ phân tách (giải
hấp) ở các vị trí khác nhau trên đường đi của dung môi. Chất có độ phân cực
kém hơn sẽ đi lên nhanh hơn chất có độ phân cực cao hơn [8].
Tính chất hấp thụ của hệ sắc kí bản mỏng đặc trưng bằng độ linh động
Rf : Rf được xác định bằng:


-12-

Rf =
Trong trường hợp minh họa ở hình vẽ trên: Rf(A) =

.

Kĩ thuật sắc kí bản mỏng
i. Chuẩn bị bản mỏng:
Đế để trải bản mỏng thường là các bản thủy tinh, lá nhôm hoặc màng
poliete. Các loại màng trong suốt với tia tử ngoại có ưu điểm là có thể dùng
đo quang trực tiếp nhiều hợp chất trong bản mỏng.
Chất hấp phụ để trải bản mỏng thường là bột silica gel, alumin (Al2O 3),
kizengua, bột xenlulozo… Chất hấp phụ có thể được trải dưới dạng nhão có
chất kết dính, hoặc dạng bột mịn (không có chất kết dính).
Thông thường trên thị trường có sẵn bản mỏng nhôm/silica gel đã được
tráng rồi với kích thước 20 x 20 cm.
ii. Lựa chọn dung môi giải ly:
Chọn dung môi triển khai tùy thuộc vào mẫu cần tách. Với mẫu chưa
biết thành phần, chưa có tài liệu tham khảo, cần thử nghiệm với nhiều loại
dung môi khác nhau, từ loại không phân cực đến loại phân cực.
Cách xác định nhanh loại dung môi phù hợp với mẫu:
- Chấm dung dịch mẫu thành nhiều chấm bằng, đều nhau lên trên cùng
một bản mỏng, các vết chấm cách nhau 1cm. Dùng những vi quản để đưa các
dung môi có độ phân cực khác nhau, thấm nhẹ lên vết chấm mẫu, mỗi vết
mẫu một giọt dung môi loại khác nhau. Sau khi chấm, dung môi sẽ lan tỏa tạo
thành vòng tròn. Dùng viết chì khoanh tròn vết lan xa nhất của dung môi.
Quan sát các vòng tròn đồng tâm: dung môi nào làm mẫu lan ra ngoài cùng
lúc với tiền tuyến dung môi thì dung môi đó quá phân cực, dung môi nào mà
mẫu vẫn nằm tại chỗ là không đủ phân cực.
- Để dễ quan sát hơn nên thiết lập một loạt thử nghiệm với những bình
triển khai sắc kí bản mỏng trong đó mỗi bình chứa một trong các dung môi
với độ phân cực tăng dần: hexan, benzene, chloroform, eter dietil, acetat etil,
aceton, metanol. Chuẩn bị các tấm bản mỏng có chấm các mẫu chất như nhau


-13-

rồi nhúng mỗi tấm vào một bình như đã chuẩn bị. Ghi nhận độ di động của
các cấu tử trong mẫu:
+ Nếu dung môi nào khiến cho tất cả các cấu tử nằm tại chỗ mức xuất
phát thì dung môi đó chưa đủ phân cực (dung môi không phù hợp).
+ Nếu dung môi nào khiến cho tất cả các cấu tử di chuyển hết lên mức
tiền tuyến dung môi thì dung môi quá phân cực (dung môi không phù hợp).
+ Nếu dung môi nào có thể làm cho chất mẫu ban đầu tách thành nhiều
vết khác nhau một cách gọn, rõ, sắc nét và vị trí của các vết nằm khoảng từ
1/3 đến 2/3 chiều dài bản sắc kí thì dung môi đó phù hợp.
+ Nếu qua quá trình triển khai mà nhận thấy hệ thống đơn dung môi
không cho những vết gọn, rõ, sắc nét thì cần thử triển khai với hệ thống hỗn
hợp dung môi, thí dụ toluene: methanol hoặc hexan: acetate etil …
Bảng 2.1: Một số giá trị vật lý của các dung môi thường gặp
Dung môi

Nhiệt độ

Hằng số điện

Momen lưỡng cực

sôi (oC)

môi (ở 250C)

(Debye)

Pentan

36,0

1,8

0,0

n-Hexan

68,8

1,9

0,0

Xiclohexan

80,8

2,0

0,0

Tetraclorua cacbon

76,7

2,2

0,0

1,4- dioxan

101,4

2,2

0,4

Tretylamin

89,0

2,4

0,8

Bezen

80,1

2,3

0,0

Toluen

110,6

2,4

0,4

Sulfua cacbon

46,2

2,6

0,0

Dietyl eter

34,6

4,2

0,0

Dimetylsulfoxid

189,0

4,7

3,9

Cloroform

61,2

4,7

1,1

Clorobenzen

132,0

5,6

1,5


-14-

Piperidin

106,0

5,8

1,1

Axetat etyl

77,1

6,0

1,8

Axit axetic

118,5

6,2

1,5

Anilin

184,4

7,0

1,5

Tetrahirofuran

65,4

7,4

1,7

Diclorometan

39,8

8,9

1,5

Tert-butanol

82,5

12,2

1,7

Piridin

115,5

12,3

2,2

Axeton

56,2

20,7

2,7

Etanol

78,3

24,3

1,7

Benzonitrin

190,7

25,2

3.9

Metanol

65,0

32,6

1,6

Dimetylformamid

153,0

36,7

3,8

Axetonitrin

190,7

25,2

3,9

Nước

100,0

78,5

1,8

Nitrometan

101,1

38,6

3,1

iii. Chấm bản
Trước khi chấm mẫu lên bản phải vạch lằn “mức xuất phát” cách đáy
bản 1cm và lằn “mức tiền tuyến dung môi” cách đầu bảng 0,5 cm. Với bản
tráng sẵn thì gạch nhẹ bằng bút chì vót nhọn; với bản do sinh viên tự tráng rất
dễ tróc thì gạch cẩn thận và thật nhẹ nhàng phần đầu nhọn của vi quản.
Mẫu là chất lỏng thì sử dụng trực tiếp. Nếu mẫu là chất rắn, lấy 1mg mẫu
đặt lên mặt kiếng đồng hồ hoặc đựng trong một ống nghiệm nhỏ, hòa tan mẫu
với vài giọt dung môi dễ bay hơi như acetone. Dùng vi quản vừa điều chế như
trên, nhúng nhẹ phần đầu nhọn vào dung dịch mẫu, lực mao dẫn sẽ hút dung
dịch mẫu vào vi quản, chấm nhẹ phần đầu nhọn có chứa mẫu lên trên bản
mỏng tại một điểm cách đáy bản 1cm (điểm này phải ở vị trí sao cho khi
nhúng bản mỏng vào bình triển khai thì điểm chấm này vẫn nằm trên cao khỏi
mặt thoáng của dung dịch giải ly chứa trong bình).


-15-

Cẩn thận nhẹ nhàng để đầu nhọn của vi quản chạm nhẹ vào bề mặt bản
mỏng để không nhìn thấy lỗ bề mặt. Chạm vào và lấy vi quản ra khỏi bề mặt
thật nhanh để dung dịch mẫu thấm vào bản tạo thành một điểm tròn nhỏ vì
nếu chạm lâu, điểm này sẽ lan to. Thổi nhẹ lên vết chấm để dung môi bay hơi
mau không lan thành vết chấm to. Có thể chấm thêm lên ngay vết chấm cũ vài
lần nữa để có vết đậm, rõ, đường kính không quá 2 mm. Nên chấm nhiều lần,
mỗi lần một lượng nhỏ dung dịch mẫu hơn là chấm một lần với lượng lớn
mẫu.
Nếu cần chấm cùng lúc nhiều vết chấm lên một bản thì các vết chấm
phải cách đáy bản 1cm và cách đều nhau 1cm và cách hai cạnh bên 1cm.
iv. Chuẩn bị bình triển khai
Bình hình khối trụ hoặc khối chữ nhật, có đường kính lớn hơn bề ngang
bản mỏng một ít. Đặt một tờ giấy lọc bao phủ mặt trong của bình nhưng vẫn
chừa một khoảng để có thể quan sát bên trong. Tính toán lượng dung môi giải
ly sao cho khi vào bình, lớp dung môi sẽ dày khoảng 0,5 – 0,7 cm.
Cho dung môi giải ly vào bình, để yên 5-10 phút để bảo hòa hơi dung
môi trong bình (nhờ tờ giấy lọc).
Bản mỏng được cầm thẳng đứng và được nhúng vào dung môi trong
bình, khi nhúng vào phải cẩn thận để 2 cạnh bên của bản không chạm vào
thành bình; lúc đó, vị trí của các vết chấm mẫu nằm trên cao cách mặt thoáng
của dung môi khoảng 0,5cm.
Đậy nắp bình, dung môi sẽ được hút lên bản bởi lực hút mao dẫn. Theo
dõi khi mực dung môi lên đến vạch tiền tuyến dung môi đã được vạch sẵn
trước đó (cách đầu bản 0,5cm) thì lấy bản ra khỏi bình. Sấy nhẹ bản bằng máy
sấy. Quan sát bằng mắt và dùng viết chì khoanh nhẹ các vết thấy được. Còn
nếu không thấy gì trên bản, có thể nhìn dưới đèn tử ngoại (UV), bằng hơi iod
hoặc phun bản với các thuốc hiện hình thích hợp.
v. Cách hiện hình vết sắc ký để xác định R f
Sau khi kết thúc quá trình sắc ký người ta phải tiến hành việc làm hiện
hình vết sắc ký bằng phương pháp hóa học hoặc vật lý.


-16-

Khi làm hiện hình bằng phương pháp hóa học người ta phun lên bản
mỏng một dung dịch thuốc thử có thể tác dụng với các cấu tử của hỗn hợp
thành hỗn hợp màu nhìn rõ bằng mắt thường.
Trong phương pháp vật lý, người ta có thể lợi dụng hiện tượng phát
quang với các tia tử ngoại. Người ta dùng một chất chỉ thị phát quang tác
dụng được với các cấu tử trong hỗn hợp. Người ta cũng có thể nhận dạng vết
sắc ký bằng phương pháp phóng xạ.
vi. Phân tích định tính
Quá trình đồng nhất các chất (định tính) sẽ khá đơn giản khi vết sắc kí có
màu đặc trưng hoặc có thể dùng các biện pháp khác nhau để hiện hình. Tuy
nhiên số loại hợp chất như vậy, nhất là với các chất hữu cơ, không nhiều lắm.
Điểm xuất phát chung nhất cho phân tích định tính là dựa vào giá trị
Rf vì đây là đặc trưng nhạy nhất của các chất. Tuy nhiên Rf lại phụ thuộc
nhiều vào điều kiện xác định nó. Người ta có thể vượt qua trở ngại này bằng
cách tuân thủ chặt chẽ các điều kiện chuẩn. Để thực hiện được việc đó người
ta khống chế kích thước của bản, độ dày của lớp hấp phụ, thể tích mẫu, độ
dày của tuyến dung môi và một số yếu tố khác. Khi tuân thủ các điều kiện
chuẩn, giá trị Rf sẽ có độ lặp lại cần thiết và có thể dùng để so sánh với các số
liệu cho trong các sổ tay, nếu chúng được đo trong cùng điều kiện và đáp ứng
được yêu cầu phân tích định tính.
Nhưng phương pháp tin cậy nhất vẫn là phương pháp làm chứng. Theo
phương pháp này, tại vạch xuất phát, bên cạnh giọt dung dịch mẫu nghiên
cứu, người ta nhỏ một giọt chất tương ứng với thành phần giả thiết có trong
mẫu. Do các yếu tố ảnh hưởng đến Rf của các chất như nhau nên sự trùng
nhau của Rf của một cấu tử trong mẫu với Rf của các chất làm chứng cho
phép kết luận chúng là Rf của cùng một chất. Nếu trong mẫu không có Rf nào
trùng với Rf của chất làm chứng thì có nghĩa là trong mẫu không có hợp chất
trùng tên với chất làm chứng.
Người ta có thể kết hợp sắc kí bản mỏng với các phương pháp khác. Thí
dụ khi kết hợp sắc kí bản mỏng với sắc kí khí, sắc kí bản mỏng có thể trở


-17-

thành một đetectơ đặc biệt. Khí thoát ra khỏi cột sắc kí, khí hướng vào vạch
xuất phát của sắc kí bản mỏng và cho tiến hành quá trình sắc kí bản mỏng
theo thủ tục chọn trước.
Kết quả phân tích sắc kí bản mỏng cho kết quả độc lập khi phân tích các
chất, điều đó làm tăng độ tin cậy của kết quả phân tích.
vii. Phân tích định lượng
Người ta tiến hành phân tích định lượng các chất theo phương pháp sắc
kí bản mỏng trực tiếp trên bản xử lý bằng các biện pháp thích hợp để lấy cấu
tử nghiên cứu ra khỏi bản.
Khi xác định trực tiếp các cấu tử theo các vết sắc kí trên bản, người ta
phải đo điện tích vết sắc kí, thí dụ đo bằng thước đo milimet và tìm lượng
chất nghiên cứu theo đồ thị chuẩn đã lập sẵn.
Người ta cũng có thể tiến hành đo trực tiếp độ đậm của các vết sắc kí
trên bản bằng phương pháp quang phổ đo quang nhờ các densitomet. Nồng độ
chất nghiên cứu cũng được xác định theo thủ tục của phương pháp đường
chuẩn.
Nhưng cách phân tích cho kết quả chính xác nhất vẫn là phương pháp
tách chất phân tích ra khỏi bản. Việc tách các chất ra khỏi bản có thể thực
hiện được bằng cơ học hay bằng cách rửa với dung môi thích hợp. Sau đó ta
tiến hành xác định nồng độ các chất trong dung dịch rửa bằng các phương
pháp thích hợp.
viii. Ứng dụng của phương pháp sắc kí bản mỏng
 Các hợp chất hữu cơ
Đây là phương pháp dùng để tách hầu hết các hợp chất hữu cơ, quá trình
tách thực hiện nhanh, có độ chọn lọc cao. Với các chất chỉ cần có sự khác
nhau rất ít về cấu trúc hay cấu hình là có thể thực hiện việc tách chúng ra khỏi
nhau bằng phương pháp sắc kí bản mỏng. Phương pháp có thể sử dụng để
tách và cô lập các hợp chất họ axit, rượu, alcaloit, amin, aminoaxit, protein và
peptit, các chất kháng sinh v.v…Vì vậy phương pháp được sử dụng rộng rãi
trong công nghệ thực phẩm, dược học, y học v.v…


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×