Tải bản đầy đủ

Nghiên cứu nhân giống cây vú bò (ficus simplicissima lour ) bằng phương pháp nuôi cấy mô thực vật

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY VÚ BÒ
(FICUS SIMPLICISSIMA LOUR.) BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2014
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn/


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC


NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY VÚ BÒ
(FICUS SIMPLICISSIMA LOUR.) BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. NGUYỄN THỊ TÂM

Thái Nguyên - 2014

ố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn/


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành, sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm
đã tận tnh hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá
trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Trong quá trình nghiên cứu, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của kĩ thuật
viên Trần Thị Hồng (Phòng Công nghệ tế bào - Khoa Sinh - Kỹ thuật nông
nghiệp - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên). Tôi xin chân
thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô Bộ môn Di truyền và Sinh học
hiện đại - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi để tôi thực hiện quá trình nghiên cứu.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban chủ nhiệm khoa, các thầy
cô giáo, cán bộ khoa Khoa học sự sống - Trường Đại học Khoa học - Đại học
Thái Nguyên, đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn.

Tác giả

Nguyễn Thị Bích Ngọc

i



LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng
dẫn của PGS.TS Nguyễn Thị Tâm. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận
văn là trung thực và chưa được ai công bố.

Tác giả

Nguyễn Thị Bích Ngọc

ii


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. ii
MỤC LỤC ........................................................................................................ iii
NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT............................................................................... vi
DANH MỤC CÁC BẢNG.............................................................................. vii
DANH MỤC CÁC HÌNH .............................................................................. viii
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề......................................................................................................
1
2. Mục tiêu nghiên cứu......................................................................................
2
3. Nội dung nghiên cứu .....................................................................................
2
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3
1.1. Giới thiệu chung về cây Vú bò .................................................................. 3
1.1.1. Đặc điểm phân loại và sinh học của cây Vú bò ...................................... 3
1.1.2. Một số thành phần có hoạt tnh dược học của cây Vú bò .......................
4
1.1.3. Ứng dụng của cây Vú bò trong y học ..................................................... 5
1.2. Kỹ thuật nhân giống cây trồng trong công nghệ sinh học thực vật .......... 6
1.2.1. Ưu thế và các phương thức nhân giống in vitro...................................... 6
1.2.2. Các giai đoạn trong quy trình nhân giống vô tnh in vitro.................... 10
1.3. Chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin sử dụng trong
nuôi cấy mô thực vật .......................................................................................
11
1.3.1. Auxin ..................................................................................................... 11
3


1.3.2. Cytokinin ............................................................................................... 13
1.4. Tình hình nhân giống cây dược liệu bằng phương pháp nuôi cấy mô tế
bào thực vật ở trong nước ...............................................................................
14

4


Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 18
2.1. Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu .............................................. 18
2.1.1. Vật liệu thực vật ....................................................................................
18
2.1.2. Hoá chất, thiết bị ...................................................................................
18
2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu .........................................................
18
2.2. Phương pháp nghiên cứu..........................................................................
18
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy in vitro .............................................................. 19
2.2.2. Đưa cây ra môi trường tự nhiên ............................................................ 21
2.2.3. Phương pháp xử lí và tnh toán số liệu ................................................. 22
2.2.4. Điều kiện thí nghiệm .............................................................................
22
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 23
3.1. Kết quả nghiên cứu khử trùng hạt ............................................................
23
3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của các chất kích thích sinh
trưởng đến hiệu quả nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi Vú bò trong ống
nghiệm

.............................................................................................................

25
3.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả nhân chồi và sự
sinh trưởng của chồi Vú bò ............................................................................. 26
3.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin đến hiệu quả nhân chồi và
sự sinh trưởng của chồi Vú bò ........................................................................ 28
3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp giữa BAP (kinetin) và NAA đến
hiệu quả nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi Vú bò .................................... 29
3.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và NAA đến hiệu quả
nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi Vú bò................................................... 29
5


3.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp giữa kinetin và NAA đến hiệu
quả nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi Vú bò ............................................ 31
3.3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp giữa BAP, kinetin và NAA đến
hiệu quả nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi Vú bò .................................... 32

6


3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của
chồi Vú bò ....................................................................................................... 34
3.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống và sự sinh
trưởng của cây con trong vườn ươm ............................................................... 36
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................. 38
1. Kết luận ....................................................................................................... 38
2. Đề nghị ........................................................................................................ 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 39
PHỤ LỤC ........................................................................................................ 44

7


NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT
BA:

6-Benzyladenine BAP:

6-Benzylaminopurine CS:
Cộng sự
CT:

Công thức

DNA:

Deoxyribonucleic acid

ĐC:

Đối chứng

IAA:

Indole-3-acetic acid IBA:

Indole-3-butyric acid Kinetin: 6furfurylaminopurine LV:
Litvay, 1985
MS:

Murashige và Skoog, 1962

NAA:

Naphthalene acetic acid

2,4-D:

2,4-Dichlorophenoxy acetic acid

8


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1. Kết quả khử trùng hạt Vú bò

24

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả nhân chồi và sự
26

sinh trưởng của chồi Vú bò
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của kinetin đến hiệu quả nhân chồi và

28

sự sinh trưởng của chồi Vú bò
Bảng 3.4. Ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và NAA đến hiệu quả

30

nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi Vú bò
Bảng 3.5. Ảnh hưởng kết hợp giữa kinetin và NAA đến hiệu

31

quả nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi Vú bò
Bảng 3.6. Ảnh hưởng kết hợp giữa BAP, kinetin và NAA đến

33

hiệu quả nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi Vú bò
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ
của chồi Vú bò

35

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống và sự sinh
trưởng của cây Vú bò in vitro trong vườn ươm

vii

37


DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Cây và quả Vú bò

4

Hình 3.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỉ lệ nảy mầm
và sự phát triển của chồi mầm Vú bò

25

Hình 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến hệ số nhân chồi và
27

sự sinh trưởng của chồi Vú bò
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ kinetin đến hệ số nhân chồi

29

và sự sinh trưởng của chồi Vú bò
Hình 3.4. Ảnh hưởng của của tổ hợp BAP và NAA đến hệ số
nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi Vú bò

31

Hình 3.5. Ảnh hưởng của tổ hợp kinetin và NAA đến hệ số
nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi Vú bò

32

Hình 3.6. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP, kinetin và NAA đến hệ
số nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi Vú bò

34

Hình 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của
36

chồi Vú bò
Hình 3.8. Ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây Vú

37

bò in vitro trong vườn ươm

viii


MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Nước ta may mắn sở hữu nguồn tài nguyên cây thuốc khá dồi dào. Hiện
nay, có hàng ngàn loài cây thuốc gắn với những bài thuốc cổ truyền bản địa
đang được nhân dân khai thác phục vụ cho chữa trị các bệnh. Việc khai thác
quá mức và thiếu quan tâm đến bảo tồn là nguyên nhân chính khiến
tài nguyên cây thuốc ngày càng cạn kiệt, nhiều loài đứng trước nguy cơ
tuyệt chủng [16].
Theo kết quả điều tra của Viện Dược liệu, cả nước ghi nhận gần bốn
nghìn loài cây thuốc, trong đó chỉ 10% là cây thuốc trồng, còn lại là cây thuốc
trong tự nhiên. Trước tnh hình suy giảm nhanh chóng nguồn cây thuốc, vấn
đề bảo tồn cây thuốc trở nên bức thiết. Để thực hiện được phương châm
lấy dược liệu làm nền tảng trong chiến lược phát triển của ngành Y - Dược,
một trong những trọng điểm của định hướng là đẩy mạnh công tác trồng
trọt cây thuốc trên quy mô lớn, phát triển nguồn dược liệu hàng hoá phục vụ
cho việc điều trị trong nước và xuất khẩu, mở ra cơ hội lớn cho việc giao
thương, tham gia thị trường quốc tế về dược liệu và dược phẩm có nguồn gốc
tự nhiên [4].
Trong dân gian, một trong những cây thuốc được sử dụng chữa nhiều
bệnh ở người đó là cây Vú bò. Cây Vú bò được phân bố ở Trung Quốc, Ấn
Độ và Việt Nam, rải rác khắp các vùng núi thấp (dưới 600m) đến trung du và
đồng bằng. Ở nước ta, Vú bò là cây mọc hoang ở các vùng đồi núi [16].
Trong cây Vú bò có nhiều axit hữu cơ, axit amin, các chất triterpen,
alkaloid và coumarin. Bộ phận dùng làm thuốc ở cây Vú bò là rễ và vỏ rễ,
được dùng thay thế Hoàng kỳ nên có tên là Thổ hoàng kỳ. Theo Đông y, Vú
bò vị cay, ngọt, hơi ấm, có tác dụng kiện tỳ, bổ phế, hành khí lợi thấp, tráng
1


gân cốt, chữa phong thấp tê bại, ho do phế lao, ra mồ hôi trộm, chân tay mệt
mỏi vô lực, ăn ít bụng trướng, thủy thũng, viêm gan, bạch đới, phụ nữ sau
sinh không có sữa [20].
Hiện nay, cây Vú bò chưa được trồng chính thức mà chỉ được sử dụng
làm thuốc bằng cách thu hái trong tự nhiên. Vú bò có thể trồng bằng
hạt nhưng tỉ lệ nảy mầm thấp.
Kĩ thuật nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào đã
được áp dụng trên nhiều đối tượng cây trồng như Sa nhân tm [6], Thanh hao
hoa vàng [11], Hoắc hương [18], Lô hội [22], Lan Kim tuyến [24], Ba kích
[27] …và thu được thành công lớn trong thực tiễn sản xuất.
Xuất phát từ giá trị to lớn của cây Vú bò, việc ứng dụng kĩ thuật nuôi
cấy mô tế bào thực vật nhằm bảo vệ nguồn gen và tạo ra được một số
lượng lớn giống cây Vú bò sạch bệnh, cung cấp cho nuôi trồng là hết sức cần
thiết, do vậy chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu nhân giống
cây Vú bò (Ficus simplicissima Lour.) bằng phương pháp nuôi cấy mô thực
vật”.
2. Mục têu nghiên cứu
Xác định được quy trình nhân giống cây Vú bò trong ống nghiệm và
giá thể đưa cây ra môi trường tự nhiên nhằm bảo tồn nguồn gen và tạo ra số
lượng nhất định cây con đồng đều cung cấp cho sản xuất.
3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu khử trùng hạt để có mẫu sạch ban đầu trong ống nghiệm.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến khả
năng nhân nhanh và sự sinh trưởng của chồi Vú bò trong ống nghiệm.
- Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh thông qua thăm dò ảnh hưởng
của nồng độ NAA.
- Nghiên cứu giá thể đưa cây ra môi trường tự nhiên.
2


Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu chung về cây Vú bò
1.1.1. Đặc điểm phân loại và sinh học của cây Vú bò
Cây Vú bò có tên khoa học là Ficus simplicissima Lour., tên thường
gọi: Vú bò sẻ, Vú chó, Vú lợn, Ngải phún, Sung ba thùy [1], [16].
Vú bò thuộc chi Đa đề (Ficus).
Họ Dâu tằm (Moraceae).
Bộ Hoa hồng (Rosales).
Lớp Hai lá mầm (Magnoliopsida).
Ngành Hạt kín (Magnoliophyta).
Giới Thực vật (Plantae) [34].
Vú bò thuộc dạng cây nhỏ, cao 1 - 2m. Thân Vú bò ít phân cành, phần
ngọn non có lông. Lá Vú bò mọc so le, thường tập trung ở ngọn thân, hình
bầu dục, gốc tròn hoặc hơi hình tim, đầu thuôn nhọn, có 3 thùy, rộng 4 - 18
cm, mặt trên nháp, mặt dưới có lông nhỏ, mép khía răng, gân gốc 3, cuống lá
có lông dày cứng, lá kèm hình ngọn giáo [2], [16].
Vú bò có cụm hoa mọc ở kẽ lá gồm hoa đực và hoa cái, hoa đực không
cuống, lá đài 4, hình dải, dính nhau ở gốc, nhị 2, hoa cái có cuống, lá đài 4,
thuôn tù, bầu hình trái xoan. Cành, lá, cuống lá, hoa đều có lông mịn màu
vàng mốc [16].
Quả Vú bò thuộc loại quả phức không cuống, có ít lông, có vị chát,
giòn, màu lục, khi chín thì mềm màu tím, có vị ngọt nhẹ, bên trong có nhiều
hạt (quả thực). Tháng 5 đến tháng 12 là mùa ra hoa kết quả của Vú bò. Toàn
cây Vú bò có nhựa mủ. Rễ Vú bò hình trụ, màu vàng, tương đối thẳng [16].

3


(A)

(B)

Hình 1.1. Cây (A) và quả (B) Vú bò
1.1.2. Một số thành phần có hoạt tính dược học của cây Vú bò
Trong rễ cây Vú bò có chứa các axit hữu cơ, axit amin, các chất
triterpen, alkaloid và coumarin…[20]. Trong đó alkaloid và coumarin là hai
trong số các thành phần đóng vai trò quan trọng trong dược liệu.
Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng,
có phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đôi khi có trong động vật,
thường có dược lực tính rất mạnh và cho những phản ứng hóa học với một số
thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alkaloid [25], [33].
Về tầm quan trọng trong dược liệu, alkaloid nói chung là những chất có
hoạt tnh sinh học. Nhiều alkaloid có tác dụng trên hệ thần kinh trung ương
gây ức chế hoặc gây kích thích. Trong số alkaioid có chất gây tê tại chỗ, có
chất làm giãn cơ trơn, chống co thắt. Có alkaloid làm tăng huyết áp, có chất
làm hạ huyết áp, một số ít alkaloid có thể tác dụng trên tim được dùng
làm thuốc chữa loạn nhịp tim. Có alkaloid diệt ký sinh trùng dùng để chữa lỵ,
trị sán [8], [26].
Coumarin là những dẫn chất α- pyron có cấu trúc C6 - C3. Người ta có
thể coi α-pyron là một lacton (este nội) của axit hydroxycinnamic vì khi cho
4


tác dụng axit vô cơ lên axit hydroxycinnamic, ví dụ HCl thì sẽ đóng vòng
lacton. Ngược lại, vòng lacton sẽ bị mở vòng khi tác dụng bởi kiềm. Sự mở
vòng và đóng vòng có tnh thuận nghịch [35].
Về tác dụng của coumarin, đáng chú ý là tác dụng của các dẫn chất
coumarin chống co thắt, làm giãn nở động mạch vành. Một số coumarin có
tác dụng chống đông máu, tác dụng như vitamin P (làm bền và bảo vệ thành
mạch), chữa bệnh bạch biến hay bệnh lang trắng và bệnh vẩy nến, tác dụng
kháng khuẩn. Một số có tác dụng chống viêm [8].
1.1.3. Ứng dụng của cây Vú bò trong y học
Theo Đông y, bộ phận dùng của Vú bò chủ yếu là rễ và vỏ rễ. Thường
rễ đào về thái mỏng, phơi hay sấy khô. Có khi sao vàng hay tẩm mật sao cho
thơm. Có khi nấu thành cao đặc mà dùng [14].
Vị thuốc Vú bò được sử dụng trong một số đơn thuốc sau:
(1) Chữa phong thấp: Ngày dùng 15 - 20g dưới dạng thuốc sắc hay
ngâm rượu. Mỗi lít rượu ngâm 100 - 200g rễ sao vàng, mỗi ngày uống 15 20ml rượu này.
(2) Chữa đau phong thấp: Rễ Vú bò 60g, móng giò lợn 250g, rượu 60g.
Thêm ít nước, sắc còn nửa bát, chia làm 2 lần uống trong ngày cách nhau 4 - 6
giờ.
(3) Chữa ngã bị ứ huyết, ngực bụng đau nhức, hòn cục: Toàn cây Vú bò
giã nát, thêm rượu và ít muối, sao nóng đắp lên nơi đau.
(4) Chữa đau dạ dày, viêm tinh hoàn, lòi dom, sa tử cung: Vú bò 30g,
Tô mộc, Hồi đầu thảo, Ngưu tất, Mộc thông mỗi vị 12 g. Sắc uống
(5) Chữa bế kinh, sau khi đẻ ứ huyết đau bụng: Rễ Vú bò 30 - 60g. Sắc
nước rồi thêm ít rượu uống.
(6) Chữa thấp khớp mạn tnh: Vú bò (sao vàng) 20g, Dây đau xương
(sao vàng) 16g, rễ Sung (sao) 12g, củ Ráy ta (sao) 12g, rễ Gối hạc (sao vàng)

5


16g, Thiên niên kiện 12g, rễ Bạch hoa xà 8g. Sắc nước, cho thêm ít rượu để
uống.
(7) Chữa ứ máu tm bầm do ngã hay bị thương: Lá hay quả giã nát,
chưng với rượu, đắp hay chườm.
(8) Sưng đau tinh hoàn: Rễ Vú bò tươi 60 - 120g. Sắc uống.
(9) Bạch đới: Rễ Vú bò khô 60g. Sắc uống
(10) Ăn không ngon miệng, tiêu hoá kém, hay đầy bụng, hay bị phân
sống: Vú bò 20g, Mộc hương 4g, Thảo quả 6g, Đậu khấu 6g. Sắc uống.
(11) Các chứng viêm gan mạn, xơ gan, phù do suy dinh dưỡng: Vú bò
20g, Diệp hạ châu 16g, Nhân trần 12g, Rau má 16g. Sắc uống.
(12) Khử đờm giảm ho (viêm phế quản, ho có đờm): Vú bò 20g, Mạch
môn 12g, Diếp cá 20g, lá Táo 16g. Sắc uống.
(13) Lợi sữa: Vú bò 20g, Trạch tả 20g, Mộc thông 20g, Xuyên sơn giáp
10g. Sắc uống
(14) Bổ khí, bổ huyết, bổ tỳ, bổ thận: Vú bò 20g, Đương quy 10g, Bạch
truật 10g, Thục địa 10g. Sắc uống, ngày 1 thang. Có thể dùng đơn này với
liều cao hơn để ngâm rượu, ngâm 10 - 15 ngày. Uống 30ml mỗi ngày.
(15) Chữa bụng trướng đầy, đại tiện táo kết: Nhựa mủ trắng lấy từ cây
Vú bò, trộn với bột Nghệ vàng, làm thành viên. Mỗi lần uống 10 - 15g, ngày
uống 2 lần chiêu với nước trắng [16], [19].
1.2. Kỹ thuật nhân giống cây trồng trong công nghệ sinh học thực vật
1.2.1. Ưu thế và các phương thức nhân giống in vitro
1.2.1.1. Ưu thế của nhân giống in vitro
Kĩ thuật nhân giống in vitro phát triển và mở rộng trong những năm
gần đây do nhu cầu về lượng giống cây trồng tăng cao. Các giống cây trồng
cần lượng lớn nhằm phục vụ dự án trồng lại rừng, sản xuất lương thực, thực

6


phẩm, dược liệu, thức ăn gia súc và bảo vệ môi trường. Nhân giống in vitro có
những ưu điểm nổi bật mà các loại hình nhân giống khác không có được, đó là:
(1) Đưa ra sản phẩm nhanh hơn: Từ một cây ưu việt bất kì đều có thể
tạo ra một quần thể có độ đồng đều cao với số lượng không hạn chế, phục
vụ sản xuất thương mại, dù cây đó là dị hợp về mặt di truyền.
(2) Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết các trường
hợp, công nghệ vi nhân giống đáp ứng tốc độ nhân nhanh cao, từ một
cây trong vòng 1 - 2 năm có thể tạo thành hàng triệu cây.
(3) Sản phẩm cây giống đồng nhất: Vi nhân giống về cơ bản là công
nghệ nhân dòng. Nó tạo ra quần thể có độ đồng đều cao dù xuất phát từ
cây mẹ có kiểu gen dị hợp hay đồng hợp.
(4) Tiết kiệm không gian: Vì hệ thống sản xuất hoàn toàn trong phòng
thí nghiệm, không phụ thuộc vào thời tiết và các vật liệu khởi đầu có kích
thước nhỏ. Mật độ cây tạo ra trên một đơn vị diện tch lớn hơn rất nhiều
so với sản xuất trên đồng ruộng và trong nhà kính theo phương pháp
truyền
thống.
(5) Nâng cao chất lượng cây giống: Nuôi cấy mô là một phương pháp
hữu hiệu để loại trừ virut, nấm khuẩn khỏi các cây giống đã nhiễm bệnh. Cây
giống sạch bệnh tạo ra bằng cấy mô thường tăng năng suất 15 - 30% so với
giống gốc.
(6) Khả năng tiếp thị sản phẩm tốt hơn và nhanh hơn: Các dạng sản
phẩm khác nhau có thể tạo ra từ hệ thống vi nhân giống như cây con in vitro
(trong ống nghiệm) hoặc trong bầu đất. Các cây giống có thể được bán ở dạng
cây, củ bi hay thân củ.
(7) Lợi thế về vận chuyển: Các cây con kích thước nhỏ có thể vận
chuyển đi xa dễ dàng và thuận lợi, đồng thời cây con tạo ra trong điều kiện vô
trùng được xác nhận là sạch bệnh. Do vậy, bảo đảm an toàn, đáp ứng các quy
định về vệ sinh thực vật quốc tế.
7


(8) Sản xuất quanh năm: Quá trình sản xuất có thể tiến hành vào bất kì
thời gian nào, không phụ thuộc mùa vụ [31].
1.2.1.2. Các phương thức nhân giống in vitro
* Nuôi cấy mô phân sinh (đỉnh sinh trưởng)
Khái niệm mô phân sinh chỉ đúng khi mẫu vật nuôi cấy được tách từ
đỉnh sinh trưởng có kích thước trong vòng 0,1mm tính từ chóp của tháp sinh
trưởng. Trong thực tế thường gặp khó khăn lớn trong việc nuôi thành công
các đỉnh sinh trưởng riêng rẽ như vậy nên người ta chỉ áp dụng hình thức nuôi
cấy mô phân sinh với mục đích làm sạch virut cho cây trồng [3], [10].
Độ lớn của chồi (mô) nuôi cấy có mối tương quan chặt chẽ với tỉ lệ
sống, khả năng cảm ứng và mức độ ổn định về mặt di truyền. Nếu độ lớn chồi
tăng thì tỉ lệ sống và tnh ổn định tăng, nhưng có thể làm giảm khả năng cảm
ứng của chồi/mô nuôi cấy và ngược lại. Tuy nhiên, nếu xét về hiệu quả kinh
tế (thể tch bình nuôi, lượng dung dịch môi trường dinh dưỡng…): nếu độ lớn
tăng thì hiệu quả kinh tế giảm, nếu độ lớn giảm thì hiệu quả kinh tế tăng. Do
đó, phải có sự kết hợp hài hòa giữa các yếu tố trên để tm ra kích thước
mẫu tối ưu [10].
Một đỉnh sinh trưởng nuôi cấy ở điều kiện thích hợp sẽ tạo ra một hay
nhiều chồi và mỗi chồi sẽ phát triển thành một cây hoàn chỉnh. Xét về nguồn
gốc của các cây đó có ba khả năng: cây phát triển từ chồi đỉnh (chồi ngọn),
cây phát triển từ chồi nách phá ngủ, cây phát triển từ chồi mới phát sinh. Tuy
nhiên trong thực tế rất khó phân biệt được chồi phá ngủ và chồi mới phát
sinh
[30].
Có hai phương thức phát triển cây hoàn chỉnh từ nuôi cấy đỉnh sinh
trưởng đó là: (1) Phát triển cây trực tiếp, thường gặp chủ yếu ở các đối tượng
cây hai lá mầm như: hoa cúc, cẩm chướng, khoai tây, thuốc lá…(2) Phát triển
cây thông qua giai đoạn protocorm, thường gặp chủ yếu ở các đối tượng cây
một lá mầm như phong lan, dứa, huệ…Từ một đỉnh sinh trưởng ban đầu cùng
8


lúc tạo ra hàng loạt protocorm và các protocorm này có thể tiếp tục phân
chia thành các protocorm mới hoặc phát triển thành cây hoàn chỉnh. Bằng
phương thức này chỉ trong một thời gian ngắn người ta có thể thu được hàng
triệu cá thể [10].
* Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây
Ngoài đỉnh sinh trưởng là bộ phận nuôi cấy dễ thành công thì các bộ
phận còn lại của cơ thể thực vật (ngoại trừ các mô đã hóa gỗ) cũng đều có
thể sử dụng cho việc nhân giống in vitro, chẳng hạn như đoạn thân, mảnh lá,
các bộ phận của hoa, vảy củ,… [30].
Sự phát sinh hình thái trực tiếp từ mẫu nuôi cấy bắt đầu từ các tế bào
nhu mô nằm ở trong biểu bì hoặc ngay phía dưới bề mặt của thân. Một số
tế bào này trở thành mô phân sinh và các túi nhỏ gọi là thể phân sinh phát
triển. Khả năng cảm ứng của mô thực vật cũng tùy thuộc vào nồng độ của
các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, chủ yếu phụ thuộc vào tỉ lệ nồng độ
giữa auxin và cytokinin. Tỉ lệ này lớn hơn 1 thì thường có khuynh hướng tạo
rễ; tỉ lệ này nhỏ hơn 1 thường có khuynh hướng tạo chồi; nếu tỉ lệ này bằng 1
thì mô nuôi cấy thường phát sinh callus [10].
* Nhân giống in vitro thông qua giai đoạn mô sẹo (callus)
Nếu tái sinh cây hoàn chỉnh trực tiếp từ mẫu vật cấy ban đầu thì thu
được nhanh chóng các cây khá đồng nhất về mặt di truyền, tuy nhiên
trong nhiều trường hợp mô nuôi cấy không tái sinh cây ngay mà phát triển
thành khối mô sẹo. Tế bào mô sẹo khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn
định về mặt di truyền, để tránh tnh trạng đó cần sử dụng mô sẹo vừa phát
sinh để thu được cây tái sinh đồng nhất về di truyền. Thông thường, người
ta chỉ tiến hành nhân giống qua giai đoạn mô sẹo đối với những đối tượng
khó tái sinh cây trực tiếp [30].
* Nhân giống thông qua phát sinh phôi vô tnh - công nghệ hạt nhân
tạo
Phôi vô tnh là các cá thể nhân giống có cực tnh bắt nguồn từ các tế
9


bào soma. Chúng rất giống phôi hữu tnh ở hình thái, quá trình phát triển


10


sinh lí, nhưng do không phải là sản phẩm của quá trình thụ tinh giữa giao tử
đực và giao tử cái, vì vậy không có quá trình tái tổ hợp di truyền, do đó các
phôi vô tnh có nội dung di truyền giống hệt với các tế bào soma đã sinh ra
chúng [10].
Khả năng tạo phôi vô tnh trong nuôi cấy mô thực vật, ngoài các điều
kiện môi trường, điều kiện nuôi cấy, còn phụ thuộc rất lớn vào loài, vào các
giống, dòng trong cùng một loài. Khả năng này đã được chứng minh là do
một hoặc vài gene phụ trách. Vì vậy, bằng biện pháp lai tạo có thể chuyển khả
năng tạo phôi vô tính cao từ cây này qua cây khác [10].
Hạt nhân tạo là phôi vô tnh bọc trong một lớp vỏ polymer như agar,
agarose, alginatc… Trong cấu trúc lưới của lớp vỏ đó, nước, chất dinh dưỡng
được cung cấp thay cho nội nhũ, giúp cho phôi vô tnh có thể nảy mầm trở
thành cây hoàn chỉnh [10].
1.2.2. Các giai đoạn trong quy trình nhân giống vô tính in vitro
Theo Nguyễn Hoàng Lộc (2007), quy trình nhân giống vô tnh in vitro
được thực hiện theo ba giai đoạn
[13].
1.2.2.1. Giai đoạn I – Cấy gây
Đưa mẫu vật từ bên ngoài vào nuôi cấy vô trùng phải bảo đảm những
yêu cầu: Tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ sống cao, tốc độ sinh trưởng nhanh.
Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ cho tỉ lệ sống cao và môi trường
dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt được tốc độ sinh trưởng nhanh
[13].
1.2.2.2. Giai đoạn II – Nhân nhanh
Ở giai đoạn này, người ta kích thích tạo cơ quan phụ hoặc các cấu trúc
khác mà từ đó cây hoàn chỉnh có thể phát sinh.
Trong giai đoạn này cần nghiên cứu các tác nhân kích thích phân hóa
cơ quan, đặc biệt là chồi như: (1) Bổ sung riêng rẽ hoặc tổ hợp chất kích thích
sinh trưởng phù hợp. Tăng tỉ lệ auxin/cytokinin sẽ kích thích mô nuôi cấy tạo
11


rễ và ngược lại sẽ kích thích phát sinh chồi. (2) Đảm bảo điều kiện nhiệt độ,
ánh sáng phù hợp.
Mục tiêu quan trọng nhất của giai đoạn này là xác định được phương
thức
nhân nhanh nhất bằng môi trường dinh dưỡng và điều kiện khí hậu tối ưu [13].
1.2.2.3. Giai đoạn III – Chuẩn bị và đưa ra ngoài đất
Chuẩn bị và đưa ra ngoài đất là giai đoạn quan trọng bao gồm việc tạo
rễ, huấn luyện thích nghi với thay đổi nhiệt độ, độ ẩm, sự mất nước, sâu
bệnh và chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng hoàn toàn. Quá
trình thích nghi ở đây là quá trình thay đổi những đặc điểm sinh lí và giải
phẫu của bản thân cây non đó. Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2 - 3
tuần, trong thời gian này cây phải được chăm sóc và bảo vệ trước những
yếu tố bất lợi như mất nước nhanh làm cho cây bị héo khô, nhiễm vi khuẩn
và nấm gây nên hiện tượng thối nhũn, cháy lá do nắng [13].
1.3. Chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin sử dụng
trong nuôi cấy mô thực vật
Ngoài các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung
một hoặc nhiều chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin và gibberellin
là rất cần thiết để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hóa cơ quan.
Tuy vậy, yêu cầu đối với những chất này thay đổi tùy theo loài thực vật, loại
mô, hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh của chúng. Các chất điều
hòa sinh trưởng được sử dụng nhiều trong nuôi cấy mô thực vật thuộc
nhóm auxin và nhóm cytokinin [31].
1.3.1. Auxin
Bản chất hóa học của auxin tự nhiên trong tế bào thực vật là axit indol
axetic (IAA) và nó là dạng auxin đầu tiên, chủ yếu và quan trọng nhất trong
tất cả các loại thực vật. Trong thực vật nó không chỉ tồn tại ở dạng tự do mà
còn ở dạng liên kết không có hoạt tnh sinh học như IAA-glucose, IAA12


myoinositol, IAA-glucan, IAA-aspartate…Các dẫn xuất khác của indol cũng thể
hiện hoạt tnh của auxin là indol tryptamine, indol acetaldehyde, indol
pyruvate, indol ethanol [7].
Auxin được tổng hợp ở tất cả các thực vật bậc cao, tảo, nấm, vi khuẩn và
chủ yếu ở đỉnh chồi ngọn rồi di chuyển xuống các bộ phận non của cơ thể
thực vật như lá, rễ và các mô dự trữ…Auxin gồm có auxin tự nhiên và auxin
tổng hợp (IBA, NAA, 2,4-D…) [7].
Auxin có nhiều vai trò khác nhau trong đời sống thực vật, liên quan tới
hàng loạt các quá trình sinh lý: Kích thích phân chia và kéo dài tế bào, kích
thích sự mọc rễ ở cành giâm và kích thích sự phát sinh chồi phụ, auxin có các
ảnh hưởng khác nhau đối với sự rụng lá, quả, sự đậu quả, sự phát triển và
chín của quả, sự ra hoa…Do hoocmon thực vật tác động lên sinh trưởng
thông qua mối tương quan nồng độ giữa các loại hoocmon khác nhau, nên
các quá trình trên đây không chỉ ảnh hưởng của auxin mà còn của các
hoocmon khác. Tùy thuộc vào nồng độ tác dụng mà các mô thực vật có các
kiểu phản ứng khác nhau đối với auxin. Phản ứng chủ yếu và nhanh chóng
nhất đối với xử lý auxin là làm tăng độ kéo dài của tế bào thông qua tác
dụng trực tiếp lên sự giãn nở của vách tế bào [7], [31].
Các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin gồm một vài hợp
chất đã được sử dụng từ rất lâu trong nông nghiệp. Chỉ một thời gian ngắn
sau khi IAA được tm thấy trong tự nhiên, nó đã được tổng hợp và trở thành
một hợp chất có giá trị. Nhưng IAA không có lợi để dùng trong nông nghiệp
bởi nó dễ dàng bị phân hủy thành các hợp chất mất hoạt tnh dưới ảnh
hưởng của ánh sáng và vi sinh vật. Một trong những tác dụng của auxin là
kích thích sự hình thành rễ của những lát cắt thân. Một số hợp chất tổng hợp
nhân tạo có vai trò tương tự như IAA, trong đó có IBA. IBA là hợp chất có
hoạt tnh auxin yếu
13


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×