Tải bản đầy đủ

Cải thiện điều kiện nuôi cấy serratia mercescens SH1 và phương pháp thu hồi sắc tố prodigiosin từ canh trường

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Đề tài “CẢI THIỆN ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY SERRATIA
MARCESCENS SH1 VÀ PHƯƠNG PHÁP THU HỒI SẮC
TỐ PRODIGIOSIN TỪ CANH TRƯỜNG”.

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Hoài Hương
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1151100246

: Hồ Thị Bích Phương
Lớp: 11DSH04


TP. Hồ Chí Minh, 2015


Đồ án tốt
nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi được thực hiện tại phòng
thí nghiệm khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường đại học Công
nghệ TP.Hồ Chí Minh. Các số liệu và kết quả là trung thực, chưa ai công bố.
Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về lời cam đoan của mình trước quý thầy cô
và nhà trường.
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 8, năm 2015
Sinh viên thực hiện

Hồ Thị Bích Phương


Đồ án tốt
nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Tận đáy lòng con xin gửi vạn lời cảm ơn đến cha mẹ, cha mẹ đã gian lao nuôi
dạy con thành người và là người thầy đầu đời của con. Cha mẹ luôn là chỗ dựa vững
chắc nhất của con, là người giúp con đứng vững sau mỗi lần vấp ngã, là nguồn động
viên, động lực để con tiếp tục phấn đấu trong cuộc sống.
Với lòng biết ơn sâu sắc. Em xin chân thành cảm ơn toàn thể quý Thầy Cô Khoa
Công nghệ sinh học – Môi trường – Thực phẩm, cùng toàn thể Thầy Cô Trường Đại
học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt cho em những
kiến thức quý báu về cơ sở ngành cũng như chuyên ngành từ ngày em bước chân vào
giảng đường đại học.
Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Hoài Hương người đã luôn tận
tình chỉ dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành phần thực nghiệm của
đồ án.
Em xin chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành và thầy Nguyễn Trung Dũng
đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đồ án tại phòng thí nghiệm Khoa Công
nghệ sinh học - Môi trường – Thực phẩm, Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí
Minh.
Cảm ơn tất cả các bạn lớp 11DSH04 và các bạn làm đồ án tại phòng thí nghiệm


Khoa Công nghệ sinh học - Môi trường – Thực phẩm đã luôn khích lệ, động viên và
giúp đỡ mình trong suốt quá trình học tập tại trường và trong quá trình làm đồ án tốt
nghiệp.
Xin chân thành cảm ơn!
TP. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2015
SVTH: Hồ Thị Bích Phương


Đồ án tốt
nghiệp

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................. v
DANH MỤC HÌNH ẢNH ...................................................................................... vi
MỤC LỤC BẢNG ................................................................................................ viii
LỜI MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 9
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 12
1.1 Tổng quan hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật ...........................................................12
1.1.1. Hợp chất thứ cấp ..........................................................................................12
1.1.2. Triển vọng và tiềm năng sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật ..............12
1.2

Tổng quan prodigiosin ......................................................................................15

1.2.1. Khái niệm về prodigiosin .............................................................................15
1.2.2. Cấu trúc và đặc điểm của prodigiosin ..........................................................16
1.2.3. Hoạt tính sinh học của prodigiosin ..............................................................18
1.3. Tổng quan về Serratia marcescens ....................................................................24
1.3.1. Phân loại Serratia marcescens .....................................................................24
1.3.2. Đặc điểm của Serratia marcescens .............................................................25
1.3.4 Một số hợp chất được tổng hợp bởi Serratia marcescens ............................29
1.3.5 Tổng quan về quorum sensing trong S. marcescens .....................................31
1.4. Cơ chế sinh tổng hợp prodigiosin .......................................................................32
1.4.1. Cơ chế tổng hợp prodigiosin ........................................................................32
1.4.2. Yếu tố ảnh hưởng đến tổng hợp prodigiosin................................................34

i


Đồ án tốt
nghiệp

1.4.3. Điều kiện tổng hợp prodigiosin....................................................................38
1.4.4. Thu nhận, tinh sạch và định lượng prodigiosin............................................39
1.5 Tiềm năng sản xuất prodigiosin của Serratia marcescens...................................42

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU45
2.1. Thời gian và địa điểm..........................................................................................45
2.1.1. Thời gian ......................................................................................................45
2.1.2. Địa điểm .......................................................................................................45
2.2. Vật liệu ................................................................................................................45
2.2.1. Nguồn vi sinh vật .........................................................................................45
2.2.2. Môi trường nuôi cấy và hóa chất sử dụng....................................................45
2.3. Phương pháp nghiên cứu.....................................................................................46
2.4 Bố trí thí nghiệm ..................................................................................................47
2.5.1 Khảo sát chủng nuôi cấy ...................................................................................49
2.5.1 Kiểm tra độ thuần khiết.................................................................................49
2.5.2 Kháng sinh đồ ...............................................................................................49
2.6 Xác định điều kiện lên men..................................................................................49
2.7.1 Khảo sát vận tốc lắc trong nuôi cấy ..............................................................52
2.7.2 Xác định pH tối ưu cho môi trường lên men ................................................53
2.7.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl ..........................................53
2.7.4 Khảo sát sự ảnh hưởng của phương pháp đồng nuôi cấy ............................54
2.7.5 Khảo sát sự ảnh hưởng của sản phẩm Quorum sensing................................55
2.8 Thu hồi sản phẩm thô ...........................................................................................56

ii


Đồ án tốt
nghiệp

2.8.1 Xác định tỷ lệ trích ly dung môi đồng thời khảo sát thể tích lên men ..........56
2.8.2 Cải thiện quá trình trích ly nhờ gia tăng nhiệt độ .........................................56
2.9 Các phương pháp phân tích..................................................................................56
2.9.1 Xác định protein có trong mẫu......................................................................57
2.9.2 Xác định lipid có trong mẫu..........................................................................57
2.10 Sắc ký bản mỏng TLC........................................................................................57
2.11 Phương pháp phân tích.......................................................................................59
2.11.1. Phương pháp định lượng hợp chất prodigiosin ..........................................59
2.11.2. Phương pháp xử lý số liệu thống kê...........................................................59

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 60
3.1 Kết quả kiểm tra độ thuần khiết ...........................................................................60
3.2 Xác định điều kiện lên men thu prodigiosin ........................................................65
3.2.1 Ảnh hưởng của thể tích lên men lên hàm lượng prodigiosin tổng hợp ........65
3.2.2 Xác định vận tốc lắc ......................................................................................67
3.2.3 Kết quả xác định pH tối ưu cho môi trường MT3 ........................................69
3.2.4 Ảnh hưởng của nồng độ muối lên hàm lượng prodigiosin tổng hợp ............71
3.2.5 Kết quả thí nghiệm đồng nuôi cấy ................................................................73
3.2.6 Sử dụng dịch trong nuôi cấy .........................................................................76
3.3 Thu hồi sản phẩm lên men từ canh trường...........................................................77
3.3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ canh trường: dung môi trích ly lên hàm lượng
prodigiosin thu hồi .................................................................................................77
3.3.2 Cải thiện quá trình trích ly nhờ gia nhiệt canh trường ..................................78

3


Đồ án tốt
nghiệp

3.4 Xác định thành phần hóa học trong mẫu..............................................................84
3.4.1. Phản ứng Biuret’s test ..................................................................................84
3.4.2 Xác định lipid có trong mẫu..........................................................................86
3.5 Sắc ký bản mỏng TLC..........................................................................................88

Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................... 91
4.1

Kết luận.............................................................................................................91

4.2

Kiến nghị ..........................................................................................................92

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 93
PHỤ LỤC ................................................................................................................. 1

4


Đồ án tốt
nghiệp

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
EPN: Entomopathogenic nematodes
OD: mật độ quang (Optical Density)
λmax : bước sóng hấp thụ cực đại
TLC: Thin Layer Chromatogarphy

5


Đồ án tốt
nghiệp

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) .............................................. 19
Hình 1.2 Cấu trúc hóa học prodigiosin (Krishna,2008) ............................................... 20
Hình 1.3. Cơ chế kháng tế bào ung thư của prodigiosin (Chia-Che và cộng sự,2011) 23
Hình 1.4. Serratia marcescens dưới kính hiển vi (Gillen and Gibbs, 2011) ................. 29
0

Hình 1.5. Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên môi trường nutrient agar ở 25 C sau
48 giờ (David, 2012) ..................................................................................................... 28
Hình 1.6. So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) tử Serratia ATCC
39.600, Sma 274 và các cụm sunh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) tử
Streptomyces coelicolor A3(2) (Cerdeno và cộng sự, 2001) ........................................ 35
Hình 1.7. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp prodigiosin bởi
Serratia marcescens (Sundaramoorthy và cộng sự, 2009) ........................................... 37
Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm................................................................................... 51
Hình 2.2 Sơ đồ trích ly .................................................................................................. 54
Hình 2.3 Cách chuẩn bị giấy chạy sắc ký ..................................................................... 61
Hình 3.1 Khuẩn lạc chủng SH1 nuôi cấy trên môi trường NA ..................................... 63
Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc soi thằng và soi nghiêng dưới kính hiển vi vật kính 10X
...................................................................................................................................... .64
Hình 3.3 Kết quả nhuộm Gram chủng SH1 .................................................................. 65
Hình 3.4 Kết quả kháng kháng sinh của chủng SH1 .................................................... 65

6


Đồ án tốt
nghiệp

Hình 3.5. Ảnh hưởng của thể tích lên men lên hàm lượng prodigiosin tổng hợp ........ 69
Hình 3.6 Hàm lượng prodigiosin khi thay đổi vận tốc lắc ............................................ 71
Hình 3.7 Ảnh hưởng của pH lên sự tổng hợp prodigiosin của S. marcescens SH1. .... 73
Hình 3.8 Kết quả hàm lượng prodigiosin khi bổ sung NaCl. ....................................... 75
Hình 3.9 Đồng nuôi cấy Serratia marcescens SH1 và Bacillus sp............................... 77
Hình 3.10 Kết quả đồng nuôi cấy E. coli ...................................................................... 78
Hình 3.11. Hàm lượng prodigiosin thu hồi sau trích ly nhờ tỷ lệ canh trường: dung môi
khác nhau....................................................................................................................... 81
Hình 3.12 Canh trường sau khi ly tâm .......................................................................... 82
Hình 3.13. Sắc tố đỏ sau khi trích ly với dung môi Etanol:HCl (95:5) ........................ 83
Hình 3.14. Vi khuẩn S. marcescens được cấy trên môi trường NA.............................. 84
Hình 3.15. Hàm lượng prodigiosin so với đối chứng. .................................................. 85
0

Hình 3.16. Kết quả quét quang phổ của sắc tố canh trường không đun và đun 100 C 86
Hình 3.17 Biuret’s test đối với dịch trong sau ly tâm và dịch trích ly prodigiosin thô 87
Hình 3.18 Ninhydrin test đối với dịch trong sau ly tâm và dịch trích ly prodigiosin thô
ở thí nghiệm đun và không đun canh trường. ............................................................... 88
Hình 3.19. Kết quả mẫu phản ứng Coomassie brilliant blue trước và sau khi phun thuốc
thử.................................................................................................................................. 90
Hình 3.20. Kết quả sắc ký bản mỏng sử dụng hệ dung môi Petrolium ether: Ether :
Acetic acid (70 : 40 : 2, v : v :v).................................................................................... 92
Hình 3.21 Sơ đồ quy trình S. marcescens SH1 tổng hợp prodigiosin...........................93

vii


Đồ án tốt
nghiệp

MỤC LỤC BẢNG

Bảng 1.1. Danh sách một số hợp chất thứ cấp được sản xuất bởi vi sinh vật............... 15
Bảng 1.2. Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) .. 19
Bảng 1.3. Các sản phẩm prodigiosin thương mại hóa (Santa Cruz Biotechnology,
Merck Millipore, Biovision incorporated).....................................................................25
Bảng 1.4. Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens (Tariq và Jonh, 2010) 29
Bảng 1.5. So sánh quá trình tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens trong các
môi trường và các nhiệt độ khác nhau ( Chidambaram và Perumalsamy, 2009). ....... 40
Bảng 2.1. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của máy lắc và chế độ lắc. ........................ 55
Bảng 3.1 Kết quả kháng kháng sinh ............................................................................. 66
Bảng 3.2 % Hàm lượng prodigiosin tổng hợp so với đối chứng (thí nghiệm A) ........ 69
Bảng 3.3. Hàm lượng prodigiosin khi thay đổi vận tốc lắc. ......................................... 70
Bảng 3.4 Kết quả hàm lượng prodigiosin trong mẫu .................................................... 73
Bảng 3.5 Kết quả hàm lượng prodigiosin khi bổ sung muối NaCl............................... 75
Bảng 3.6. % prodigiosin tổng hợp so với đối chứng..................................................... 77
Bảng 3.7. Hàm lượng prodigiosin tổng hợp khi bổ sung dịch nuôi cấy. ...................... 79
Bảng 3.8. % Ảnh hưởng của tỷ lệ canh trường : dung môi trích ly .............................. 80
Bảng 3.9. Kết quả hàm lượng prodigiosin trong thí nghiệm ........................................ 84
Bảng 3.10. Kết quả xác định protein và lipid ............................................................... 91

viii


Đồ án tốt
nghiệp

LỜI MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Các nguồn tài nguyên thiên nhiên, chẳng hạn như thực vật, vi sinh vật, động vật
có xương sống và không xương sống là những nguồn có giá trị của các hợp chất hoạt
tính sinh học. Một số lượng lớn các loại thuốc đã được phát triển trong ngành y từ
các sản phẩm tự nhiên. Kể từ khi phát hiện và thành công trong việc điều trị của
peniciline, các vi sinh vật đã được sử dụng như một nguồn đặc biệt của các tác nhân
hoạt tính sinh học có cấu trúc đa dạng. Các ứng dụng điều trị của các chất chuyển
hóa của vi sinh vật cung cấp cơ hội cho việc phát hiện ra kháng sinh (ví dụ
peniciline, erythromycin…), ức chế miễn dịch trong cấy ghép, các tác nhân giảm
cholesterol (ví dụ lovastain và mevastatin) và tác nhân chống ung thư (ví dụ
doxorubicin, daunorubicin, bleomycin và pentostatin).
Từ khi nền khoa học hiện đại bắt đầu, các hợp chất thứ cấp tự nhiên được
chiết xuất từ trái cây, rau, hạt, rễ,… đã được sử dụng trong việc làm thuốc đông y,
mỹ phẩm, thực phẩm,... Nhưng sau đó, các hợp chất thứ cấp tự nhiên đã được nghiên
cứu sâu hơn về cấu trúc hóa học cũng như cách tổng hợp bằng phương pháp hóa học,
bởi người ta cho rằng chúng bền hơn, có thể sản xuất trên quy mô lớn và chi phí sản
xuất thấp. Tuy nhiên, các vấn đề ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng xấu đến sức
khỏe gây ra bởi các hợp chất tổng hợp hóa học đã bắt đầu được chú ý đến. Chính vì
thế so với các hợp chất thứ cấp từ thực vật và động vật thì các hợp chất từ vi sinh
vật ngày càng được quan tâm và phát triển, vì vi sinh vật cũng là một yếu tố tự nhiên
và an toàn dễ sử dụng, sản xuất được quanh năm trong các điều kiện địa lý khác
nhau và do sự tăng trưởng nhanh chóng của vi sinh vật nên sẽ làm giảm thời gian sản
xuất xuống còn chỉ một vài ngày. So với các nguồn khác từ thực vật hoặc động vật
thì hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật có thể dễ dàng được kiểm soát và dự đoán sản

9


Đồ án tốt
nghiệp

lượng (Francis, 1987; Taylor, 1984). Trong những sắc tố từ vi sinh vật thì hợp chất
prodigiosin được biết đến với ý nghĩa quan trọng.
Một số loài Serratia, đặc biệt loài Serratia marcenscens có khả năng tổng hợp
sắc tố đỏ (red pigment) prodigiosin (2-methyl-3-amyl-6-methoxyprodigiosene)
(C20H25N30 = 323,44) (Williams và Qadri, 1980, Kobayashi và El-Barrad, 1996;
Press và cộng sự, 1997; Someya và cộng sự, 2000; Roberts và cộng sự, 2005).
Prodigiosin là sắc tố màu đỏ, và có hoạt tính kháng vi sinh vật đã được bắt đầu
nghiên cứu từ những năm 1960, nay thu hút được nhiều quan tâm do khả năng sử
dụng làm màu tự nhiên và ứng dụng trong lãnh vực bảo vệ thực vật cũng như hoạt
chất kháng ức chế miễn dịch và chống khối u (D’Alessio và Rossi, 1996; Azuma và
cộng sự, 2000; Bennet và Bentley, 2000; Melvin và cộng sự, 2000, Tsuji và cộng sự,
1990; Kataoka và cộng sự, 1992; Tsuji, 1992; Songia và cộng sự, 1997).
Sớm nhận thấy được lợi rất quan trọng của hợp chất prodigiosin được tách từ
việc nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcenscens, Nguyễn Hoàng Anh Kha đã thu nhận sắc
tố đỏ prodigiosin từ việc nuôi cấy trong môi trường peptone glycerol đạt 10,575 mg/ml
sắc tố ( ĐATN Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2014). Sau đó ĐATN Trần Lâm Tú Quyên
(2014) đã khảo sát trong quá trình lên men thu prodigiosin, môi trường huyền phù
đậu phộng MT1 (10%) cho hàm lượng prodigiosin là 248,4% so với môi trường
peptone glycerol là 100%. Cũng trong ĐATN Trần Lâm Tú Quyên (2014) kết luận môi
trường MT3 chứa 10% huyền phù đậu phộng 5% pepton và 1% dầu hướng dương, tỉ
lệ cấy giống 3%, lắc 180 vòng phút trong 24 giờ đầu sau đó giảm còn 150 vòng/phút
là môi trường và điều kiện tối ưu nhất để tổng hợp sắc tố đỏ prodigiosin. Nhưng quá
trình lên men còn ở quy mô sản xuất nhỏ 20 ml/bình và còn nhiều yếu tố cần cải thiện.
Dựa trên cơ sở này đề tài “CẢI THIỆN ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY Serratia
mercescens SH1 VÀ PHƯƠNG PHÁP THU HỒI SẮC TỐ PRODIGIOSIN TỪ
CANH TRƯỜNG” được tiến hành nhằm tăng nồng độ prodigiosin tổng hợp.
10


Đồ án tốt
nghiệp

2. Mục tiêu đề tài
Cải tiến điều kiện lên men Serratia marcescens tổng hợp prodigiosin, cũng như
phương pháp thu hồi sắc tố thô.
3. Nội dung đề tài
Khảo sát chủng Serratia marcescens xem xét độ thuần khiết, khảo sát kháng
sinh đồ.
Cải tiến điều kiện nuôi cấy Serratia marcescens tổng hợp prodigiosin: tăng thể
tích lên men, ảnh hưởng của vận tốc lắc, pH nuôi cấy, nồng độ muối % NaCl, thử áp
dụng phương pháp đồng nuôi cấy tăng hợp chất thứ cấp, thử áp dụng bổ sung dịch nuôi
cấy vi khuẩn Gram âm chứa phân tử tín hiệu Quorum sensing.
Thiết lập quy trình trích ly sắc tố thô từ canh trường nuôi cấy.
4. Ý nghĩa khoa học
Áp dụng các kiến thức về công nghệ lên men sản xuất hợp chất thứ cấp vào tổng
hợp prodigiosin.
Xem xét khá năng sử dụng chủng Serratia marcescens SH1 phân lập từ tuyến
trùng EPN vào sản xuất prodigiosin qua kháng sinh đồ khác biệt với chủng phân lập từ
bệnh phẩm.
Góp phần vào việc tăng quy mô và nồng độ sản phẩm prodigiosin tổng hợp
bằng phương pháp lên men.
5. Ý nghĩa thực tiễn
Cung cấp sản phẩm prodigiosin thô cho nghiên cứu tinh sạch và khảo sát hoạt
tính sinh học.

11


Đồ án tốt
nghiệp

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật
1.1.1. Hợp chất thứ cấp
Hợp chất thứ cấp là chất được tạo ra từ hợp chất sơ cấp, có trọng lượng phân
tử nhỏ, thường được gọi là chất có hoạt tính sinh học đóng vai trò điều hòa quan hệ
sinh thái của chủ thể với các tác động lên chủ thể của môi trường xung quanh.
Hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật là những hợp chất được vi sinh vật tạo ra từ quá
trình chuyển hóa hợp chất sơ cấp.
1.1.2. Triển vọng và tiềm năng sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật
Vi sinh vật đã được sử dụng trong một thời gian dài cho sản xuất các phân tử
sinh học như thuốc kháng sinh, enzyme, vitamine và các tác nhân chỉ thị. Có sự
quan tâm ngày càng tăng trong ngành công nghiệp thực phẩm trong việc sử dụng các
thành phần tự nhiên. Các thành phần, chẳng hạn như hợp chất thứ cấp, được xem là
tự nhiên khi xuất phát từ nguồn gốc sinh học như động vật, thực vật hoặc vi sinh
vật. Hợp chất thứ cấp của vi sinh vật được sử dụng trong ngành công nghiệp chế biến
cá, ví dụ như để tăng màu hồng của cá hồi nuôi. Hơn nữa, một số hợp chất tự nhiên
có tiềm năng thương mại để sử dụng như chất chống oxy hóa. Ngành công nghiệp
hiện nay đã sản xuất một số hợp chất từ vi sinh vật ứng dụng trong thực phẩm, mỹ
phẩm hoặc vật liệu dệt. Trong tự nhiên phong phú về hợp chất và vi sinh vật sản
xuất hợp chất (nấm, nấm men và vi khuẩn). Trong các sắc tố tự nhiên thì vi sinh

12


Đồ án tốt
nghiệp

vật cung cấp một số lượng hợp chất rất lớn như: carotenoid, melanin, flavin,
quinone, prodigiosin và cụ thể hơn là monascin, violacein hoặc indigo (Dufosse,
2009). Các loại hợp chất này có tiềm năng khai thác cao, vì quá trình sản xuất đơn
giản, sự đa dạng di truyền ở vi sinh vật, cũng như có thể dễ dàng tối ưu hóa quy trình
công nghệ (Juailova và cộng sự, 1997).
Bên cạnh đó, một số vi sinh vật có khả năng sản xuất hợp chất với hiệu suất
cao, bao gồm các chi Monascus (Hajjaj và cộng sự, 2000) và Serratia (Williams và
cộng sự, 1971a). Các chi vi sinh vật khác như: Rhodotorula, Bacillus, Achrombacter,
Yarrowia và Phaffia cũng có khả năng sản xuất số lượng lớn hợp chất thứ cấp
(Krishna, 2008), trong đó kháng sinh, nhóm hoạt chất có khả năng gây chết hoặc kìm
hãm vi sinh vật phát triển, được một số vi sinh vật như nấm mốc, xạ khuẩn và vi
khuẩn tạo ra, là một trong những thành tựu quan trọng của việc sản xuất hợp chất thứ
cấp từ vi sinh vật. Mỗi kháng sinh có phổ tác động riêng của mình. Bảng 1.1 tóm tắt
về một số hợp chất thứ cấp được sản xuất bởi vi sinh vật.
Bảng 1.1. Danh sách một số hợp chất thứ cấp được sản xuất bởi vi sinh vật
Vi sinh vật
Penicillium
notatum,
Penicillium

Hợp chất thứ cấp
Penicillin

Ứng dụng

Kiểu tác động ức chế

Ức chế tụ cầu khuẩn, Ức chế tạo polymer
nhiễm trùng kỵ khí, vách tế bào vi khuẩn,
giang mai, hen suyễn.

ức chế hấp thu amino
acid và protein, ức chế

chrysogenum

tạo enzyme

13


Đồ án tốt
nghiệp

Streptomyces

Streptomycin

griceus

Ức

chế

Gram

vi

âm

khuẩn Ức chế ghép nối một


ram số amino acid vào

dương. Trị bệnh lao, protein, tác động lên
bệnh viêm màng não, hệ
ho gà

enzyme

khuẩn

của

vi

tham

gia

chuyển pyruvate vào
chu trình Creb…
Steptomyces

Chloramphenicol

venezuelae

Ức chế đối với bệnh Ức chế đặc hiệu sinh
lỵ, sốt cao, sốt phát tổng hợp protein vi
ban

khuẩn liên quan đến
peptidyl

transferase

trong tiểu đơn vị
Ribosome 50s, ngăn
không cho tạo liên kết
peptide
Streptomyces

Tetracilin

aureomycin

Ức chế phổ rộng vi Ức
khuẩn

Gram

chế

tổng

hợp

âm, protein

Gram dương
Streptomyces
erythraeus

Erythromycin

Chữa bệnh do tụ cầu ức chế vi khuẩn Gram
khuẩn
gây ra

14

streptococcal âm và Gram dương


Đồ án tốt
nghiệp

Streptomyces

Neomycin

fradiae

Tác dụng vi khuẩn Hơi độc
Gram âm và Gram
dương

Streptomyces

Kanamycin

kanamycetius

Điều trị lao, ức chế vi Tác động giống như
khuẩn Gram âm và
Gram dương

Streptomyces

Cycloserine

Điều trị bệnh lao

lavendulae
1.2

streptomycin



neomycin

Cản trở tổng hợp vách
tế bào

Tổng quan prodigiosin

1.2.1. Khái niệm về prodigiosin
Prodigiosin là một tripyrrole được phát hiện lần đầu tiên trên khuẩn lạc đặc
trưng của vi khuẩn Serratia marcescens. Tên gọi “prodigiosin” có nguồn gốc
từ “prodigious” có nghĩa là một điều gì đó kỳ diệu. Prodigiosin được tìm thấy ở
dạng túi bên ngoài tế bào cũng như các tế bào liên kết, và dạng hạt ở bên trong tế
bào (Kobayashi và Ichikawa, 1991).
Prodigiosin là một chất chuyển hóa thứ cấp, được sản xuất bởi các vi khuẩn
như Serratia marcescens, Pseudomonas magneslorubra, Vibrio psychroerythrous,
Serratia rubidaea, Vibrio gazogenes, Alteromonas rubra, Rugamonas rubra và các
xạ khuẩn Gram dương, chẳng hạn Streptoverticillium rubrireticuli và Streptomyces
longisporus (Khanafari và cộng sự, 2006). Hình 1.1 trình bày cấu trúc hóa học của
các hợp chất đại diện của prodigiosin.

15


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.1 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003)
1.2.2. Cấu trúc và đặc điểm của prodigiosin
Mãi đến năm 1960, công thức hóa học chính xác của prodigiosin được tổng
hợp bởi Serrattia marcescens mới được biết đến (Rapoport và Holden, 1962). Do sự
tiến bộ nhanh chóng trong khoa học phân tích và quang phổ ở những năm tiếp theo,
mà cấu trúc của prodigiosin dần được nghiên cứu rõ ràng hơn (Hesse, 2000).
Prodigiosin

với

tên

gọi

(5[(3-methoxy-5-pyrrol-2-ylidene-pyrrol-2-

ylidene)methyl]-2-methyl-3-pentyl-1H-pyrrole) có công thức phân tử C20H25N30 và
trọng lượng phân tử là 323,44 Da (Harris và cộng sự, 2004; Song và cộng sự, 2006;
Williamson và cộng sự, 2006).
Prodigiosin là một alkaloid có cấu trúc hóa học đặc biệt, với ba vòng pyrrole
tạo thành bộ khung pyrrolylpyrromethane, trong đó hai vòng đầu liên kết trực tiếp
với nhau, còn vòng thứ ba được gắn vào thông qua cầu nối methene (Qadri và
Williams, 1972; Gerber, 1975). Cấu trúc của prodigiosin có bảy liên kết đôi và được
miêu tả là tạo sắc tố mạnh (Krishna, 2008).
16


Hình 1.2. Cấu trúc hóa học prodigiosin (Krishna, 2008).
Prodigiosin nhạy cảm với ánh sáng và không tan được trong nước.
Prodigiosin có thể tan tương đối trong alcohol và ether; bên cạnh đó, nó dễ tan
trong chloroform, methanol, acetonitrile và DMSO (Grimont và cộng sự, 1977;
Khanafari và cộng sự, 2006).
Bảng 1.2. Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973)
Loài

Tên sắc tố

Danh pháp prodigiosin

Trọng lượng
phân tử và
công thức

Serratia marcescens

Serratia marcescens

Prodigiosin

Norprodigiosin

2-Methyl-3-amyl-6-

323,4 Da

methoxy prodigiosene

C20H25N30

2-Methyl-3-amyl-6-

309,4 Da

hydroxy-prodigiosene

Nocardia

Nonylprodigiosin

(Actinomadura)

2-Nonly-6methoxyprodigiosene

madurae

17

C10H23N30
363,5 Da
C23H31N30


Nocardia

Cyclononylprodig

2,10-Nonano-6-

265,5 Da

(Actinomadura)

iosin

melhoxy-prodigiosene

Methylcyclodc

2,10-Nonano-6-

391,5 Da

Methoxy-prodigiosene

C25H33N30

2-Undecyl-6-

393,6 Da

Rnethoxyprodigiosene

C25H35N30

391,6 Da

C23H33N30

madurae
Nocardia(Actinomadura)
pellctieri

cyl-prodigiosin

Streptomyces

Undccylprodigios

longisporusruber và

in

Nocardia(Actinomadura)
pelletieri
Streplonlyces

Metacycloprodig

2,4-(9-Ethylnonano)-6-

longisporusruber

iosin

methoxyprodigiosene

C25H33N30

1.2.3. Hoạt tính sinh học của prodigiosin
1.2.3.1. Hoạt tính kháng khuẩn
Prodigiosin có khả năng ức chế sự tăng trưởng của một số loài vi
khuẩn (Khanafari và cộng sự, 2006). Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin là
do khả năng thấm qua màng tế bào và khả năng ức chế các enzyme như DNA
gyrase, topoisomerase IV,… dẫn đến quá trình ức chế sự tăng trưởng của tế bào vi
khuẩn (Ramina và Samira, 2009).
Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện và nhận thấy rằng prodigiosin có thể
kháng một số vi khuẩn như:

Staphylococcus

aureus,

saprophyticus, Bacillus subtilis, Enterococcus avium,
Echerichia coli, Pseudomonas

aeruginosa,
18

Aeromonas

Staphylococcus

Streptococcus pyogenes,
hydrophila,

Proteus


mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Bacillus cereus,... Tuy nhiên, hoạt động kháng
khuẩn của prodigiosin đối với các vi khuẩn Gram dương lại cao hơn so với
các vi khuẩn Gram âm (Ramina và Samira, 2009; Chandni và cộng sự, 2012).
1.2.3.2. Hoạt tính chống tế bào ung thư
Prodigiosin có khả năng gây độc tế bào và có thể chống lại một loạt các dòng
tế bào ung thư ở người, nhưng vẫn duy trì các tế bào lành tính (Pandey và cộng
sự,2009; Pérez-Tomás và Viñas, 2010). Vì khả năng gây độc chọn lọc này,
prodigiosin hứa hẹn có nhiều triển vọng trong việc sản xuất thuốc chống ung thư. Các
hoạt động chống ung thư trong cơ thể của prodigiosin được chứng minh lần đầu tiên
bằng những ác dụng

ức

chế của cycloprodigiosin trên tế bào Huh-7

hepatocarcinoma xenografted (Yamamoto và cộng sự, 1999). Một mô hình khối u ác
tính trên chuột cũng cho thấy prodigiosin có khả năng ức chế sự di căn, bằng cách
nó đã giảm sự di căn trên tế bào ung thư phổi (Zhang và cộng sự, 2005), điều này
đã cho thấy rằng prodigiosin ngăn quá trình phát triển của tế bào ung thư thông qua
nhiều cơ chế.
Các khả năng gây độc dẫn đến sự tự hủy của tế bào ác tính bởi prodigiosin
chủ yếu là do ảnh hưởng từ proapoptotic của chúng chống lại các tế bào ác tính.
Nhiều nghiên cứu đã dần làm sáng tỏ con đường prodigiosin gây sự tự hủy của các
tế bào (Chia-Che và cộng sự, 2011). Cơ chế kháng tế bào ung thư của prodigiosin
được mô tả cụ thể như sau:

19


Hình 1.3. Cơ chế kháng tế bào ung thư của prodigiosin (Chia-Che và cộng sự,2011)
Quá trình acid hóa pH trong tế bào (pHi) rõ ràng là một kích hoạt quan trọng
của quá trình tự hủy trong tế bào (Lagadic-Gossmann và cộng sự, 2004). Acid hóa
nội bào là cần thiết cho cycloprodigiosin kích thích quá trình tự hủy trong tế bào
HL-60 (Yamamoto và cộng sự, 2000), cũng tương tự như prodigiosin gây ra sự tự
hủy ở tế bào ung thư ruột (Castillo-Avila và cộng sự, 2005).
Các kết cấu của BCL-2 rất quan trọng trong việc tiến hành con đường tự hủy
của ty thể bằng cách điều hòa tính thấm của màng ty thể bên ngoài. Tăng tính thấm
của màng ty thể bên ngoài sẽ dẫn đến việc hình thành cytosolic của cytochrome c,
nhằm kích hoạt caspase-9 bắt đầu caspase để tạo ra quá trình tự hủy. Prodigiosin
được biết là tác nhân gây ra sự kích thích quá trình tự hủy của protein BCL-2 BAX
trong tế bào MCF-7 (Soto-Cerrato và cộng sự, 2004). Tương tự như vậy, các nghiên
cứu cũng đã chứng minh trước đó undecylprodigiosin giảm sự ngăn chặn tự
hủy BCL-XL nhưng nâng kích thích tự hủy BIK, BIM, MCL-1S và NOXA (Ho và
cộng sự, 2007).
Survivin và XIAP là chất ức chế nội sinh của caspase. Survivin hoặc XIAP
cao sẽ tạo ra sự đề kháng, điều này rất phổ biến trong các tế bào ung thư (Schimmer
20


và cộng sự, 2006; Altieri, 2008). Một nghiên cứu trước đó của các tác giả thấy rằng
cả survivin và XIAP đều được giảm đi bởi sự có mặt của undecylprodigiosin trong
tế bào MCF-7 (Ho và cộng sự, 2007).
Ngừng chu kỳ tế bào: bên cạnh việc gây sự tự hủy của các tế bào ung thư,
prodigiosin cũng ngăn chặn sự phát triển ung thư bằng cách gây ra quá trình ngừng
chu kỳ tế bào ở nồng độ không gây độc cho tế bào. Để làm điều này,
undecylprodigiosin làm giảm sự phát triển của tế bào lympho T bằng cách ức chế
CDK4 và CDK2 (Songia và cộng sự, 1997). Tương tự như vậy, prodigiosin gây ra
ngừng tăng trưởng của các tế bào Jurkat tại quá trình chuyển đổi G1-S, bằng cách
giảm phosphoryl hóa Rb thông qua sự ức chế hoạt động của kinase cyclin E-CDK2
và cyclin A-CDK2, cũng như bằng cách điều chỉnh p21CIP1/WAF1 và
p27KIP1 (Pérez-Tomás, và Montaner, 2003). Một nghiên cứu gần đây của
SotoCerrato và cộng sự (Soto-Cerrato và cộng sự, 2007) đã cung cấp một cái nhìn
sâu sắc vào cách prodigiosin điều chỉnh p21CIP1/WAF1.
Chống sự xâm nhập và chống sự di căn: di căn là một nguyên nhân hàng đầu
dẫn đế sự tử vong do bệnh ung thư và làm tăng nhu cầu về thuốc chống di
căn. Những lợi ích chữa bệnh của prodigiosin đã được chứng minh trong một mô
hình khối u ác tính ở chuột, bằng cách giảm sự di căn phổi (Zhang và cộng sự, 2005).
Cơ chế hoạt động chống di căn của prodigiosin có thể là do tác dụng ức chế của nó
trên các tế bào di căn và xâm nhập, có thể thông qua quá trình downregulation của RhoA và matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) (Zhang và cộng sự,
2005).
Tiềm năng gây độc tế bào của prodigiosin cũng đã nghiên cứu trong 60 dòng
tế bào tiêu chuẩn của các khối u ở người, có nguồn gốc từ phổi, ruột, thận,
buồng trứng, ung thư não, các khối u ác tính và bệnh bạch cầu. Ức chế tăng sinh tế

21


bào cũng như cảm ứng cho tế bào tự hủy đã được quan sát trong các dòng
tế bào (Chidambaram và Perumalsamy, 2009).
Ngoài ra, prodigiosin cũng được tìm thấy gây độc tế bào ung thư phổi và các
tế bào biểu mô kháng doxorubicin và biểu hiện tốt lên các protein đa kháng
thuốc (Llagostera và cộng sự, 2005).
1.2.3.3. Hoạt tính ức chế miễn dịch
Hoạt động ức chế miễn dịch của prodigiosin lần đầu tiên được mô tả
bởi Nakamura và cộng sự, họ đã cho thấy sự hiện diện của prodigiosin và
metacycloprodigiosin trong canh trường nuôi cấy vi khuẩn Serratia và quan sát sự
ức chế chọn lọc quá trình phát triên của các tế bào lympho T đa giá so với các tế bào
lympho B (Han và cộng sự, 2001). Sau đó, hoạt động ức chế miễn dịch đã được
chứng minh cho các chất tương tự prodigiosin khác như: undecylprodigiosin, cPrG,
MAMPDM, nonylprodigiosin,…

22


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×