Tải bản đầy đủ

Nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein bề mặt của virut h5n1 vào cây đậu tương phục vụ sản xuất vaccine thực vật

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
––––––––––––––––––

NGUYỄN THU HIỀN

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA
PROTEIN BỀ MẶT CỦA VIRUS H5N1 VÀO CÂY
ĐẬU TƯƠNG PHỤC VỤ SẢN XUẤT VACCINE
THỰC VẬT

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
––––––––––––––––––

NGUYỄN THU HIỀN


NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA PROTEIN
BỀ MẶT CỦA VIRUT H5N1 VÀO CÂY ĐẬU
TƯƠNG PHỤC VỤ SẢN XUẤT VACCINE THỰC
VẬT
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62 42 01 21

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. CHU HOÀNG HÀ
2. GS. TS. CHU HOÀNG MẬU

THÁI NGUYÊN - 2014


i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết
quả cùng cộng tác với các cộng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày
trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các Tạp chí khoa
học chuyên ngành và trong Kỷ yếu Hội nghị Khoa học-Công nghệ với sự
đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Phần còn lại chưa được ai công bố
trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả

Nguyễn Thu Hiền


ii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS Chu Hoàng Mậu, PGS.TS Chu
Hoàng Hà đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi
trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án.


Tôi xin cảm ơn Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, xin chân
thành cảm ơn TS. Lê Văn Sơn cùng toàn thể cán bộ phòng Công nghệ tế bào
thực vật, Viện Công nghệ Sinh học đã tận tình giúp đỡ, truyền đạt những kinh
nghiệm quý báu cho tôi trong quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài luận án.
Xin cảm ơn sự giúp đỡ của nhóm nghiên cứu và các đồng nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm cùng tập thể cán
bộ Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận
lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu đề tài luận án.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô khoa Sinh-Kỹ thuật Nông nghiệp và Phòng
Quản lý sau đại học, trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên, xin
cảm ơn lãnh đạo trường Đại học Sư phạm và lãnh đạo Đại học Thái Nguyên.
Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện của Ban chủ nhiệm khoa
Khoa học cơ bản, Ban giám hiệu Trường Đại học Y Dược – Đại học Thái
Nguyên.
Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình học tập và thực hiện thành công luận án này.

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thu Hiền


3

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ...................................................................................................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề .............................................................................................................................................................................. 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................................................................................. 2
4. Những đóng góp mới của luận án ................................................................................................................ 3
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ......................................................................................................................... 4
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................................................... 5
1.1. BỆNH CÚM GIA CẦM VÀ VIRUS CÚM A/H5N1 ....................................................... 5
1.1.1. Bệnh cúm gia cầm và dịch bệnh cúm A/H5N1 ................................................................... 5
1.1.2. Virus cúm A/H5N1............................................................................................................................................ 6
1.2. VACCINE PHÒNG CHỐNG BỆNH CÚM A/H5N1............................................................
19
1.2.1. Các loại vaccine phòng chống bệnh cúm A/H5N1 ..................................................... 19
1.2.2. Nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống bệnh cúm A/H5N1 ................... 22
1.3. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN TRONG NGHIÊN CỨU
SẢN XUẤT VACCINE THỰC
VẬT ............................................................................................................................ 27
1.3.1. Nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu tương .............................................................................. 27
1.3.2. Thành tựu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong chọn giống đậu
tương.................38
1.3.3. Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong nghiên cứu sản xuất vaccine thực
vật ...................................................................................................................................................................................................... 43
Chương 2: VẬT LIỆ

H ƠN

H

N HI N C

..............................

48

2.1. VẬT LIỆU ................................................................................................................................................................... 48
.1.1. Nguyên liệu thực vật .................................................................................................................................... 48
.1. . Chủng vi khu n và các loại vector ................................................................................................ 48
2.1.3. Hóa chất ..................................................................................................................................................................... 48
2.1.4. Thiết bị ........................................................................................................................................................................ 48


4

. . PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................................................... 49
2.2.1. Nhóm phương pháp sử dụng để thiết kế vector chuyển gen..................................
50
. . . Các phương pháp sử dụng trong xây dựng mô hình tái sinh và chuyển
gen in
vitro................................................................................................................................................................................................... 56
. . . Phương pháp phân tích cây chuyển gen.................................................................................. 61
. . ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU VÀ HOÀN THÀNH LUẬN ÁN............................ 62
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN C U VÀ THẢO LUẬN ......................................... 63
3.1. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN HA VÀ ĐOẠN
GEN HA1 CỦA VIRUS H5N1 ......................................................................................................................... 63
3.1.1. Kết quả thiết kế vector chuyển gen mang gen HA ...................................................... 63
3.1.2. Kết quả thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen HA1 ................................... 77
3.2.HOÀN THIỆN QUY TRÌNH TÁI SINH VÀ CHUYỂN GEN THÔNG
QUA VI KHUẨN A.TUMEFARACIENS Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG ............................. 85
3.2.1. Phát triển hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen ở hai giống đậu tương
ĐT1 và DT84 ..................................................................................................................................................................... 86
3.2.2. Kết quả chuyển gen gus vào cây đậu tương thông qua vi khu n ................ 94
3.2.3. Kết quả chuyển cấu trúc đoạn gen HA1 vào cây đậu tương ........................... 99
3.3. KẾT QUẢ CHUYỂN ĐOẠN GEN HA1 VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG .... 101
3.3.1. Phân tích sự có mặt của đoạn gen HA1 ở các dòng cây đậu tương
chuyển gen ở thế hệ T0............................................................................................................................................. 101
. . . Phân tích các dòng cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T1 ............................. 103
KẾT LUẬN

ĐỀ NGHỊ ............................................................................................................................. 107

C C B I B O ĐÃ CÔN

BỐ LI N Q AN ĐẾN LUẬN ÁN........................ 109

TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................................................................... 110


5

DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT
AS

Acetosyrigone

A. tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens

BAP

6-benzyladenine purin

bp

Base pair

CCM

Cocultivation medium

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxynucleoside triphosphate

đtg

Đồng tác giả

EDTA

Ethylene diamine tetraacetic acid

E. coli

Escherichia coli

GA3

Gibberellic acid

GM

Môi trường nảy mầm

gus

Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase

IAA

Indoleacetic acid

IBA

Indole-3-butyric acid

kb

Kilo base

LB

Luria and Bertani

MS

Môi trường cơ bản theo Murashige và Skoog (1962)

NAA

α-Naphthaleneacetic acid

nptII

Neomycin phosphotransferase gene

OD

Optical density

PCR

Polymerase Chain Reaction

PPT

Phosphinothricin

RM

Môi trường ra rễ

SDS

Sodium dodecylsulfat


6

SIM

Môi trường tạo chồi

SEM

Môi trường kéo dài chồi

Taq

Thermus Aquaticus

T-DNA

Vùng DNA plasmid chuyển vào thực vật

Ti- plasmid

Plasmid tạo khối u

T0, T1, T2

Các thế hệ cây đậu tương chuyển gen

T0

Cây đậu tương chuyển gen tái sinh từ chồi

T1

Hạt của cây chuyển gen T0 nảy mầm thành cây T1

T2

Hạt của cây chuyển gen T1 nảy mầm thành cây T2

Vir

Virulence Region

v/p

vòng/phút

X-gluc

5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide

YEP

Yeast extract peptone


vii

DANH MỤC BẢNG

TT

Tên bảng

Trang

Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR

50

Bảng 2.2 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR

50

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng ligation

52

Bảng 2.4 Thành phần hóa chất tách plasmid

52

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng LR

54

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme hạn chế

55

Bảng 2.7 Thành phần môi trường nuôi khu n

56

Bảng 2.8 Thành phần các loại môi trường nuôi cấy in vitro

57

Bảng 3.1 Trình tự cặp mồi XhoI-HA/HindIII-HA

66

Bảng 3.2 Trình tự cặp mồi XhoI-HA1/HindIII-HA1

78

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến khả năng nảy

86

mầm hạt
Bảng 3.4

ết quả tái sinh đa chồi trên các môi trường chứa

AP

89

nồng độ khác nhau
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của GA và IAA đến khả năng kéo dài chồi

91

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của I A đến khả năng tạo rễ

92

Bảng 3.7 Kết quả chuyển gen gus vào nách lá mầm đậu tương

95

thông qua vi khu n A. tumefacines
Bảng 3.8 Khả năng tái sinh thông qua nách lá mầm của giống đậu
tương ĐT1 sau khi biến nạp cấu trúc gen HA1

100


8

DANH MỤC HÌNH
TT

Tên hình

Trang

Hình 1.1

Hình thái, mô hình cấu tạo, cấu trúc ribonucleoprotein

11

của virus cúm A/H5N1
Hình 1.2

Mô hình cấu trúc protein Hemagglutinin

15

Hình 1.3

18

Hình 1.4

Sơ đồ xâm nhiễm của virus cúm A/H5N1 trong tế bào
chủ
Khối u thực vật do A. tumefaciens

Hình 1.5

Cấu trúc Ti- Plasmid

32

Hình 1.6

Mô hình chuyển gen gián tiếp nhờ A. tumefaciens

34

Hình 2.1

Sơ đồ thí nghiệm tổng quát

49

Hình 2.2

Sơ đồ thí nghiệm tái sinh và chuyển gen vào cây đậu
tương
Trình tự A và cấu trúc của đoạn gen nhân tạo

59

H nh 3

30

64

(SLHEP) (B)
Hình 3.2

Trình tự gen HA đã được thay đổi mã bộ ba HAop)

65

Hình 3.3

Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả PCR nhân đoạn gen

67

HAop bằng XhoI-HA/HindIII-HA
Hình 3.4

Hình ảnh điện di kiểm tra sản ph m thôi gel

68

Hình 3.5

Sơ đồ thí nghiệm ghép nối gen HA/HA1 vào vector

69

p201-SLEHP tạo p201-SLEHP-HA/HA1
Hình 3.6

Hình ảnh khu n lạc sau khi biến nạp plasmid tái tổ hợp

70

vào E.coli
Hình 3.7

Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả chọn dòng plasmid
tái tổ hợp p201-SLHEP-HA

71


9

H nh 3

Sơ đồ thiết kế cấu trúc p

1-HA HA1vào vector

72

pPhaso-dest tạo pPhaso-dest-HA/HA1
H nh 3
H nh 3

Hình ảnh điện di kiểm tra vector tái tổ hợp pPhasoHAop
Hình ảnh điện di sản ph m PCR kiểm tra vector biến

73
75

nạp trong chủng A. tumefaciens CV58
Hình 3.11

Sơ đồ mô tả sự tái sinh và chuyển gen HA ở cây thuốc lá

76

Hình 3.12

Hình ảnh điện di sản ph m PCR kiểm tra gen chuyển

77

HA trong cây thuốc lá
Hình 3.13

Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả PCR nhân đoạn gen

78

HA1 bằng XhoI-HA1/HindIII-HA1
Hình 3.14

Trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn của

80

đoạn gen HA1
Hình 3.15

Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả chọn dòng plasmid

81

tái tổ hợp p201-SLHEP-HA1
H nh 3

Hình ảnh điện di kiểm tra vector chuyển gen mang cấu

82

trúc pPhaso-SLEHP-HA1
H nh 3

Hình ảnh điện di sản ph m PCR kiểm tra vector biến

84

nạp trong chủng CV5
H nh 3

Kết quả điện di sản ph n PCR kiểm tra cây thuốc lá

85

chuyển gen HA1
Hình 3.19

Hạt nảy mầm sau các thời gian khử trùng khác nhau

88

Hình 3.20

Cụm chồi tạo được sau 4 tuần nuôi cấy trên SIM

90

Hình 3.21

Cụm chồi trên môi trường kéo dài SEM

91

H nh 3 22

Đậu tương tái sinh đa chồi A và chọn lọc cây chuyển

95


10

gen trên môi trường chứa kháng sinh kanamycine
H nh 3 23

Hình ảnh kết quả nhuộm X-gluc để kiểm tra biểu hiện

96

gen gus trên cây đậu tương chuyển gen
Hình 3.24

Sơ đồ mô tả quy trình tái sinh phục vụ chuyển gen ở

98

cây đậu tương ĐT1
Hình 3.25

Quy trình chuyển gen ở giống đậu tương ĐT1

100

Hình 3.26

Các cây đậu tương chuyển gen thế hệ T0 được trồng

101

trong nhà lưới
Hình 3.27

Phân tích cây đậu tương chuyển gen mang đoạn gen

102

HA1 ở thế hệ T0
Hình 3.28

Phân tích sản ph m PCR bằng cặp mồi đặc hiệu XhoI-

104

HA/ HindIII-HA với các dòng cây đậu tương thế hệ T1
Hình 3.29

Hình ảnh protein HA1 hiện phim được phân tích bằng
Western blot từ protein tổng số chiết từ hạt của dòng
đậu tương chuyển gen H11.

105


1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Cúm là một căn bệnh nguy hiểm gây tử vong cao và hằng năm trên thế
giới đã có hơn nửa tỷ người mắc bệnh. Hiện nay, virus cúm A/H5N1- chủng
virus nguy hiểm nhất ở gia cầm đã lan truyền trên 40 quốc gia ở châu Á,
Trung đông, châu Âu và châu Phi. Ở nước ta, dịch cúm gia cầm H5N1 xảy ra
từ những tháng cuối năm

gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn

nuôi gia cầm và ảnh hưởng đến sức khoẻ con người. Việt Nam và Indonesia
là hai quốc gia có số người nhiễm virus cúm A/H5N1 và có tỷ lệ tử vong cao
nhất so với các quốc gia trên thế giới. Chính vì vậy nghiên cứu làm sáng tỏ
bệnh cúm A/H5N1 và nhân tố gây bệnh để xây dựng biện pháp phòng và
khống chế bệnh là yêu cầu thực tiễn đặt ra.
Dịch cúm gia cầm diễn biến ngày càng phức tạp vì hệ gen của virus cúm
A luôn biến đổi. Bên cạnh đó, nguồn tàng trữ và lây lan bệnh là chim di cư và
thủy cầm rất khó kiểm soát và khống chế. Hiện nay, việc phòng chống virus
cúm A nói chung và H5N1 nói riêng, bên cạnh các biện pháp phòng chống
dịch như tiêu độc, xử lý gia cầm bị bệnh, thanh lý gia cầm nhiễm hoặc nguy
cơ nhiễm thì biện pháp sử dụng vaccine vẫn là hướng thiết yếu nhất để khống
chế và ngăn chặn sự lây lan dịch sang người. Ngoài các loại vaccine truyền
thống, vaccine thế hệ mới được tạo ra bằng các phương pháp tái tổ hợp và di
truyền ngược đang được sử dụng rộng rãi, tuy nhiên, các loại vaccine này có
nhược điểm như giá thành cao, khó bảo quản và mức độ an toàn thấp. Do vậy,
các nhà khoa học trên thế giới vẫn đang tiếp tục phát triển những loại vaccine
mới có tính ưu việt hơn, rẻ hơn, dễ bảo quản, an toàn và hiệu quả hơn.
Vaccine ăn được từ thực vật là vaccine tác động vào thể dịch, kích thích cả hệ


2

thống miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào. Vaccine thực vật có hoạt tính
tương tự như vaccine thông thường, chỉ khác là vaccine này được thực vật sản
xuất trong những phần ăn được như lá, củ, quả và hạt. Vaccine thực vật có
một số ưu điểm nổi bật so với các loại vaccine khác ở chỗ có thể ăn tươi hoặc
nấu chín; dễ dàng sản xuất khối lượng lớn bằng cách tăng diện tích trồng cây
chuyển gen có khả năng sản xuất kháng nguyên; vaccine thực vật có tính ổn
định, an toàn cao, dễ bảo quản, dễ sử dụng và có hiệu quả kinh tế.
Ở Việt Nam, đậu tương là cây có giá trị kinh tế cao, hạt đậu tương là
nguồn thực ph m chính cho vật nuôi và con người. Sự biểu hiện thành công
gen gus trên cây đậu tương là cơ sở của việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen để
sản xuất các chất có dược tính như vaccine trong hạt đậu tương. Với ưu điểm
nổi bật như sản xuất đơn giản, giá thành thấp, hiệu quả cao trong phòng bệnh
và có độ an toàn, vaccine sản xuất từ thực vật được xem là hướng đi phù hợp
trong chiến lược chăm sóc sức khoẻ cộng đồng ở các quốc gia đang phát triển.
Xuất phát từ lý do trên chúng tôi đã tiến hành đề tài luận án là: “Nghiên
cứu chuyển gen mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 vào cây đậu tương
phục vụ sản xuất vaccine thực vật”
2. Mục tiêu nghiên cứu
Thiết kế được vector mang cấu trúc gen HA, đoạn gen HA1 của virus
cúm A/H5N1.
Tạo được cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc đoạn gen HA1 và
biểu hiện được protein tái tổ hợp HA1 ở hạt đậu tương.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Thiết kế và tổng hợp gen HA và đoạn gen HA1 có khả năng biểu hiện tối
ưu ở thực vật, nhân dòng gen HA và đoạn gen HA1 trong tế bào vi khu n
E.coli và tạo vector chuyển gen mang cấu trúc gen HA và đoạn gen HA1.


3

3.2. Biến nạp cấu trúc vector chuyển gen mang gen HA và đoạn gen HA1 vào
vi khu n A. tumefaciens. Lây nhiễm vi khu n A. tumefaciens tái tổ hợp vào
mô lá thuốc lá và tái sinh tạo cây thuốc lá chuyển gen mang gen HA và đoạn
gen HA1;
3.3. Phát triển hệ thống tái sinh đa chồi phục vụ chuyển gen ở cây đậu tương;
3.4. Chuyển cấu trúc vector mang gen gus biểu hiện ở hạt vào cây đậu tương.
Đánh giá hiệu quả chuyển gen gus ở giống đậu tương ĐT1 và DT84;
3.5. Chuyển cấu trúc vector mang đoạn gen HA1 vào cây đậu tương và phân
tích sự có mặt của đoạn gen chuyển HA1 ở cây đậu tương của thế hệ T0;
.6. Phân tích dòng cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T1 bằng kỹ thuật PCR
và lai Western blot để xác định sự biểu hiện của protein HA1 ở hạt đậu tương.
4. Những đóng góp mới của luận án
4.1. Hai cấu trúc vector mang gen HA và mang đoạn gen HA1 biểu hiện trong
hạt thực vật đã được thiết kế thành công và tạo được chủng vi khu n
Agrobacterium tumefaciens mang cấu trúc gen HA, đoạn gen HA1 của virus
cúm A/H5N1.
4.2. Giống đậu tương ĐT1

và DT 4 đã được thử nghiệm chuyển gen gus.

Hiệu suất chuyển gen được kiểm tra ở giai đoạn hạt là ,
ĐT1 và 4,

đối với giống

với giống DT 4.

4. . Chuyển thành công cấu trúc SLHEP-HA1 vào cây đậu tương và thu được
8 dòng cây đậu tương ở thế hệ T0 mang cấu trúc SLHEP-HA1 biểu hiện đặc
trưng trong hạt. pPhân tích cây đậu tương ở thế hệ T1và T2 đã xác định được
sự di truyền của gen chuyển HA1 qua thế hệ T0, T1 và T2
4.4. Ở thế hệ T1 đã thu được dòng đậu tương H11 chuyển gen mang đoạn gen
HA1 và biểu hiện thành công protein HA1 trong hạt của dòng đậu tương H11.


4

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Về khoa học: Đã thiết kế được vector chuyển gen mang cấu trúc gen HA và
đoạn gen HA1 biểu hiện ở hạt thực vật. Biểu hiện thành công gen gus ở hạt.
Đã hoàn thiện được quy trình tái sinh đa chồi ở cây đậu tương. Với việc lây
nhiễm vi khu n A. tumefaciens tái tổ hợp vào mô đậu tương đã tổn thương,
tạo cây đậu tương chuyển gen và đã biểu hiện thành công protein HA1 của
virus H5N1 trong hạt đậu tương.
Về thực tiễn: Với kết quả protein HA1 đã được biểu hiện thành công trong hạt
đậu tương ở thế hệ T1 là cơ sở của việc tiếp tục kiểm tra đáp ứng khả năng
miễn dịch của gia cầm, đồng thời làm tiền đề cho việc nghiên cứu sản xuất
vaccine ăn được ở thực vật.


5

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. BỆNH CÚM GIA CẦM VÀ VIRUS CÚM A/H5N1
1.1.1. Bệnh cúm gia cầm và dịch bệnh cúm A/H5N1
Cúm gia cầm (Avian Influenza, AI) là bệnh truyền nhiễm cấp tính của
gia cầm, do nhóm virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra [38]. Đây
là nhóm virus có biên độ rộng, được phân chia thành nhiều phân type khác
nhau dựa trên kháng nguyên HA và NA có trên bề mặt capsid của hạt virus.
Nhóm virus cúm A có 16 phân type HA (từ H1 đến H16) và 9 phân type NA
(từ N1 đến N9) và sự tái tổ hợp giữa các phân type HA và NA sẽ tạo ra nhiều
phân type khác nhau về độc tính và khả năng gây bệnh [42].
Virus cúm A H5N1 có độc lực cao và gây bệnh trên người vào những
năm 1996-2008 [106]. Chủng virus cúm A H5N1 được phát hiện lần đầu tiên
gây bệnh dịch trên gà tại Scotland vào năm 1959. Sau đó, cúm A H5N1 đã tái
xuất hiện tại Quảng Đông 1996 và Hồng Kông (1997) với sự biến đổi sâu
sắc, không những gây chết gia cầm mà còn thích ứng trên người và gây chết
người bệnh [142]. Năm

, virus H5N1 gây ra dịch cúm trên gia cầm tại

Hồng Kông, Trung Quốc và lây lan sang hàng chục quốc gia ở châu Á, châu
Âu và châu Phi, trong đó có Việt Nam. Cấu trúc virus cúm A/H5N1 vẫn như
trước đó, nhưng xét về độc lực, loài vật chủ nhiễm bệnh, tính kháng nguyênmiễn dịch và mức độ truyền lây có nhiều nét đặc trưng hơn và khác với những
biến chủng H5N1 trước đây. Các chủng virus cúm A/H5N1 thuộc phân dòng
Thanh Hải (nguồn gốc vùng Bắc Trung Quốc) xuất hiện cuối năm

5, bắt

đầu lan sang một số nước vùng Trung Á, Nga rồi tràn ngập vào các nước


6

vùng Tây Á, bao gồm cả Thổ Nhĩ

ỳ, các nước Bắc-Trung Phi, trong đó Ai

Cập và Nigeria là các nước chịu thiệt hại nhiều nhất [25].
Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới WHO đến tháng
có tới 6

trường hợp mắc cúm A H5N1, trong đó có

1 , đã

1 trường hợp đã tử

vong, chiếm 59,65%. Trong đó quốc gia có số người mắc bệnh và số tử vong
cao là các nước Ai cập, Indonesia và Việt Nam. Kết quả điều tra dịch tễ học
cho thấy, hầu hết những ca nhiễm cúm gia cầm H5N1 trên người đều có liên
quan đến tiếp xúc với gia cầm bị bệnh hoặc trung gian qua thực ph m chế
biến từ gia cầm bị bệnh hoặc qua tiếp xúc trực tiếp như giết mổ, vận chuyển,
mua bán gia cầm.
Việt Nam được WHO xác định là quốc gia “điểm nóng” do virus cúm
A H5N1 có các điều kiện thuận lợi để tiến hóa thích nghi lây nhiễm và trở
thành virus của người. Ở Việt Nam, đại dịch bùng phát từ năm

, đã tái

phát qua bốn đợt dịch. Đợt thứ nhất xảy ra ở 57 tỉnh, thành phố; đợt dịch thứ
tư gần đây nhất xảy ra ở 21 tỉnh, thành phố, đã tiêu hủy trên 50 triệu gia cầm
các loại, thiệt hại lên đến hàng ngàn tỷ đồng [9].
Qua điều tra dịch tễ, các trường hợp nhiễm cúm A/H5N1 trên người
được ghi nhận đồng thời với thời điểm có dịch cúm trên gia cầm. Mặc dù số
ca nhiễm ít nhưng tỷ lệ tử vong rất cao 59%) và chi phí điều trị rất tốn kém,
do vậy biện pháp tốt nhất là dự phòng để tránh mắc bệnh [7].
1.1.2. Virus cúm A/H5N1
1.1.2.1. Đặc tính của virus cúm A/H5N1
Virus cúm A/H5N1 mẫn cảm với nhiệt độ, với các dung môi hòa tan
lipid, với các loại hóa chất sát trùng và oxy hóa, với formaldehyde và với các
tia phóng xạ. Các hạt virus tồn tại trong pH từ 6,5 đến ,9. Trong điều kiện
quá acid hoặc quá kiềm đều làm giảm khả năng lây nhiễm. Virus A/H5N1 bị
bất hoạt dưới ánh sáng trực tiếp sau 40 giờ, tồn tại được 15 ngày ánh sáng


7

thường, tia tử ngoại bất hoạt được virus nhưng không phá hủy được kháng
o

nguyên của virus. Tuy nhiên, virus bị phá hủy hoàn toàn ở 100 C hoặc 30
o

phút ở 60 C, tồn tại 3 tháng ở nhiệt độ thấp (trong phân gia cầm), và hàng
o

o

năm ở -70 C. Trong phủ tạng gia cầm (40 C) tồn tại được 25o

ngày, nhưng
o

trong cơ thể người (37 C) chỉ sống được 7-8 ngày, còn ở nước 30 C tồn tại
được 4 ngày [24] [26] [75].
Về mặt dịch tễ học, virus cúm A có nhiều biến chủng khác nhau. Các phân
type (subtype) là kết quả tái tổ hợp của 15 HA (H1-H15) và 9 NA (N1-N9).
Hemagglutinin mới, dạng thứ 16 H16 , được tìm thấy năm

5 từ con

mòng biển đầu đen. Trình tự H16 có độ tương đồng cao với H13 [25] [32].
Các phân type gây nhiễm cho hầu hết các loài sinh vật bao gồm loài người,
các loài lông vũ gà, thủy cầm), lợn, ngựa, chim, chồn đất, hải c u, cá voi...
Chúng thích ứng hầu hết với mọi loại vật chủ và hệ gen luôn luôn biến đổi,
định kỳ gây nên những vụ dịch cúm kinh hoàng trong lịch sử ở động vật và
người [140]. Do đặc tính biến đổi gen nhanh chóng và trao đổi gen để tái tổ
hợp tạo biến thể mới lan truyền trong quần thể sinh vật, cúm A là nhóm virus
nguy hiểm truyền bệnh từ động vật sang người .Virus A/H5N1 được coi là
loại biến chủng có mức độ độc lực cao nhất đối với các loài động vật và người,
có nhiều minh chứng khoa học cho thấy chủng này bắt nguồn từ H6N2 hoặc
và trao đổi gen thông qua H9N2 trên lợn [77].
Về danh pháp, để ký hiệu và lưu trữ một cách khoa học và đầy đủ, các
chủng virus cúm sau khi phân lập phải được ký hiệu theo danh pháp quy định
với trật tự như sau: tên serotype/loài bị nhiễm nơi phân lập/số hiệu chủng/thời
gian phân lập/loại hình subtype (HA (H) và NA (N)) [35][25]. Ví dụ: virus
cúm có ký hiệu A/chicken/Vietnam/HG4/ 2005(H5N1) có thông tin về danh
pháp là cúm nhóm A, loài nhiễm là gà chicken , nơi phân lập là Việt Nam, số


8

hiệu chủng là HG4 – Hậu Giang 4, thời gian phân lập là năm

5, phân type

là H5N1.
Tính gây bệnh hay độc lực của virus cúm A được chia làm hai loại: (1)
loại độc lực cao (HPAI - Highly pathogenic avian influenza) và (2) loại độc
lực thấp LPAI - Low pathogenic avian influenza). Cả hai loại đều cùng tồn
tại trong tự nhiên [30]. HPAI là loại virus cúm A có khả năng gây tổn thương
nhiều cơ quan nội tạng trong cơ thể nhiễm, trên gia cầm chúng thường gây
chết
1

số gia cầm bị nhiễm trong vòng 4 giờ sau nhiễm. Loại này rất nguy

hiểm gây lo ngại cho cộng đồng. Virus loại HPAI phát triển tốt trên tế bào
phôi gà và tế bào thận chó trong môi trường nuôi cấy không có trypsin [29].
LPAI là loại virus khi phát triển trong cơ thể nhiễm, có thể gây bệnh cúm nhẹ
không có triệu chứng lâm sàng điển hình và không làm chết vật chủ. Đây là
loại virus lây truyền rộng rãi và tạo nên các ổ bệnh trong tự nhiên của virus
cúm A, loại này có thể trao đổi gen với các chủng virus có độc lực cao đồng
nhiễm trên cùng một tế bào và trở thành loại virus HPAI nguy hiểm [68]
[155].
1.1.2.2. Cấu trúc hệ gen của virus cúm A/H5N1
Hệ gen của virus cúm A/H5N1 có khoảng 13500 nucleotide, gồm 8
phân đoạn gen mã hoá cho 8 phân tử protein [34]. Các phân đoạn 1,





những phân đoạn mã hóa tổng hợp các enzyme trong phức hợp polymerase
RNA transcriptase của virus, có độ dài ổn định và có tính bảo tồn cao, cụ thể
là:
Phân đoạn 1 (gen PB2) mã hóa tổng hợp enzyme P

, là tiểu đơn vị

thành phần trong phức hợp polymerase của virus, chịu trách nhiệm khởi đầu
phiên mã RNA virus. P

3

có khối lượng phân tử 87.10 Da [38]. Tính thích

nghi nhiệt độ cơ thể loài vật chủ được cho là có liên quan đến vị trí amino
acid 6

ở protein P

ở virus cúm gia cầm vị trí này là Glu - thích ứng với
o

nhiệt độ cơ thể gia cầm khoảng 4 C, còn ở virus thích nghi trên người là Lys
- thích ứng nhiệt độ cơ thể người khoảng

o

C) [7] [19] [63].


9

Phân đoạn 2 (gen PB1) mã hóa tổng hợp enzyme P 1 - tiểu đơn vị xúc
tác của phức hợp enzym polymerase trong quá trình tổng hợp RNA virus, chịu
trách nhiệm gắn mũ RNA [38]. Gần đây, đã có phát hiện thêm một protein
(PB1-F

được mã hóa bởi một khung đọc mở khác của P 1, có vai trò gây ra

hiện tượng apoptosis hiện tượng tế bào chết theo chương trình [38].
Phân đoạn 3 (gen PA) là phân đoạn gen bảo thủ cao, mã hóa tổng hợp
protein enzyme PA có khối lượng phân tử là 96.1

3

Da. PA là một tiểu đơn vị

của polymerase chịu trách nhiệm kéo dài sự phiên mã RNA trong quá trình
tổng hợp RNA của virus [8].
Các phân đoạn 4 và 6 mã hóa cho các protein HA và NA bề mặt capsid
của virus, có tính kháng nguyên đặc trưng theo từng chủng virus cúm A, cụ
thể như sau:
Phân đoạn 4 gen HA có độ dài thay đổi tuỳ theo từng chủng virus cúm
A Gen HA mã hóa tổng hợp protein HA - kháng nguyên bề mặt virus cúm,
gồm hai tiểu phần là HA1 và HA2. Vùng nối giữa HA1 và HA2 gồm một số
amino acid mang tính kiềm được mã hóa bởi một chuỗi oligonucleotide, đó là
điểm cắt của protease và đây là vùng quyết định độc lực của virus [8].
Protein HA có khối lượng phân tử khoảng 6 .1
3

3

Da nếu không được
3

glycosyl hóa) và 77.10 Da nếu được glycosyl hóa, trong đó HA1 là 48.10 Da
3

và HA2 là 29.10 Da) [29].
Phân đoạn 6 gen NA là một gen kháng nguyên của virus, có kích thước
thay đổi theo từng chủng virus cúm A. Đây là gen mã hóa tổng hợp protein
NA, kháng nguyên bề mặt capsid của virus, có khối lượng phân tử là 5 3

60.10 Da. Các nghiên cứu phân tử gen NA của virus cúm cho thấy phần đầu
5’- của gen hay phần tận cùng N của polypeptide NA có tính biến đổi cao và
phức tạp giữa các chủng virus cúm A, sự thay đổi này liên quan đến quá trình
thích ứng và gây bệnh của virus cúm trên nhiều đối tượng vật chủ khác nhau [


10

93]. Đặc trưng biến đổi của gen NA trong virus cúm A là hiện tượng đột biến
trượt-xóa một đoạn gen là 5 nucleotide, rồi sau đó là 6 nucleotide [42].
Các phân đoạn gen M, NP và NS mã hóa tổng hợp các protein chức năng
khác nhau của virus, có độ dài tương đối ổn định giữa các chủng virus cúm A,
cụ thể:
Phân đoạn 5 (gen NP) mã hóa tổng hợp nucleoprotein NP - thành phần
của phức hệ phiên mã, chịu trách nhiệm vận chuyển RNA giữa nhân và bào
tương tế bào chủ. NP là một protein được glycosyl hóa, có đặc tính kháng
nguyên biểu hiện theo nhóm virus, tồn tại trong các hạt virus ở dạng kết hợp
với mỗi phân đoạn RNA, có khối lượng phân tử theo tính toán khoảng 56.1

3

3

Da trên thực tế là 50 - 60.10 Da) [38].
Phân đoạn 7 (gen M) mã hóa cho protein đệm matrix protein - M của
virus gồm hai tiểu phần là M1 và M được tạo ra bởi những khung đọc mở
khác nhau của cùng một phân đoạn RNA , cùng với HA và NA có khoảng
phân tử MP trên bề mặt capsid của virus cúm A, có mối quan hệ tương
tác bề mặt với hemagglutinin. Protein M1 là một protein nền, là thành phần
chính của virus có chức năng bao bọc RNA tạo nên phức hợp RNP và tham
gia vào quá trình “nảy chồi” của virus [38]. Protein M2 là chuỗi polypeptide
bé, có khối lượng phân tử là 15.1

3

Da, là protein chuyển màng - kênh

ion (ion channel cần thiết cho khả năng lây nhiễm của virus, chịu trách nhiệm
“cởi áo” virus trình diện hệ gen ở bào tương tế bào chủ trong quá trình xâm
nhiễm trên vật chủ.
Phân đoạn 8 gen NS , là gen mã hóa protein không cấu trúc non
structural protein , có độ dài ổn định nhất trong hệ gen của virus cúm A mã
hóa tổng hợp hai protein là NS1 và NS

còn gọi là NEP, nuclear export

protein , có vai trò bảo vệ hệ gen của virus [42]. Độc tính của virus có sự liên
quan với gen không cấu trúc non-structural gen này được tìm thấy ở biến


11

chủng A H5N1 9 [24 ], trong tự nhiên, việc đột biến xóa đi một phần gen có
3

liên quan đến giảm độc lực [25]. NS1 có khối lượng phân tử là 5.10 Da,
chịu trách nhiệm vận chuyển RNA thông tin của virus từ nhân ra bào tương tế
bào nhiễm, và tác động lên các RNA vận chuyển cũng như các quá trình cắt
và dịch mã của tế bào chủ. NEP hay NS , là gen hình thành từ hai đoạn gen
(30 nucleotit và 336 nucleotit mã hóa loại protein có khối lượng phân tử là
3

12x10 Da, đóng vai trò vận chuyển các RNP của virus ra khỏi nhân tế bào
nhiễm để lắp ráp với capsid tạo nên hạt virus mới [42].
Như vậy, virus cúm A H5N1 có hệ gen được cấu trúc từ

phân đoạn

riêng biệt và không có gen mã hóa enzyme sửa chữa RNA. Do vậy, trong thực
tế dễ xuất hiện các đột biến điểm trong mỗi phân đoạn gen và trong hệ gen
qua quá trình sao chép nhân lên của virus, hoặc trao đổi các phân đoạn gen
giữa các chủng virus cúm đồng nhiễm trên cùng một tế bào, rất có thể dẫn đến
thay đổi đặc tính kháng nguyên tạo nên các chủng virus mới [29].

C

A

Hình 1.1. H nh thái, mô h nh cấu tạo, cấu trúc ribonucleoprotein
của virus cúm A/H5N1 [7]
A: Các dạng h nh thái khác nhau của virus cúm A dưới kính hiển vi điện tử; B: Mô
hình cấu tạo hạt virus cúm A (Hemagglutinin: phân tử kháng nguyên HA,
Neuraminidase: phân tử kháng nguyên NA;

B2,

B ,

A: ba tiểu phầndưới đơn vị

phức hợp enzyme polymerase của virus) C: Cấu trúc của phức hợp ribonucleoprotein
(RNP)


12

Nucleic acid và protein của virus sắp xếp theo kiểu xoắn lò so xung
quanh một trục tạo nên cấu trúc đối xứng xoắn hình cầu đường kính 89 – 120
nm) hoặc hình sợi kéo dài (tới vài μm) của virion. Nucleocapsid được bao bọc
bởi màng protein nền M1, phía ngoài màng là lớp lipid kép có nguồn gốc từ
màng sinh chất của tế bào chủ, có chức năng chính là ổn định cấu trúc của
virus. Lớp vỏ ngoài của virus còn có các glycoprotein

protein đã được

glycosyl hoá). Những protein này thực chất là protein của màng tế bào nhiễm
đã được chuyên hoá để gắn protein màng của virus vào, gồm protein M đâm
xuyên và nhô ra khỏi vỏ ngoài và 2 protein gai nhô ra ngoài bề mặt (HA và
NA).
1.1.2.3. Đặc trưng của kháng nguyên HA và NA
HA và NA là các protein chính bề mặt capsid đặc trưng cho bản chất của
từng chủng virus cúm A [38] [19].
Protein HA (Hemagglutinin)
Gen HA có kích thước thay đổi tùy theo từng chủng virus cúm. Gen
HA mã hóa cho protein kháng nguyên ngưng kết hồng cầu có độ dài 568-569
amino acid. Gen HA được phân lập từ chủng H1N1 (1934) Tây Ban Nha,
chủng H5N1 (1996) ở Quảng Đông, Trung Quốc như các chủng nguyên thủy
[42]. Nhiều gen HA phân lập từ các chủng trong giai đoạn 1997-2003 là các
biến chủng có khả năng gây bệnh rất cao. Hệ gen của virus biến đổi nhanh,
trong đó, những biến đổi gen HA thường xảy ra nhiều và sử dụng chính sự
biến đổi này để phân định nhóm kháng nguyên, phân type và phân tích mối
quan hệ tiến hóa của các chủng H5N1. Các chủng phân lập trong giai đoạn từ
1997-2002 vẫn mang tính đồng kháng nguyên, nhưng các chủng thu được
trong giai đoạn từ 2003 -

5 đã có bằng chứng của sự lệch kháng nguyên

của A/H5N1. Virus cúm A/H5N1 có 12 genotype, những dạng cũ A, B, C,
D trước 2002 không còn tồn tại, mà tồn tại 8 dạng mới (V, W, X1, X2, X3,
Y, Z và Z+). Các chủng H5N1 phân lập tại Việt Nam từ

4 đến

6 đều


13

thuộc dòng Quảng Đông, tập trung chủ yếu ở genotype Z, nhưng phân thành
nhóm: Nhóm N – miền Bắc và nhóm S - miền Nam thuộc nhóm tiến hóa
clade 1. Năm

đã phát hiện thêm dưới dòng Phúc kiến thuộc clade 2.3.4

[4]. Gen HA được phân lập từ chủng A/Ck/Vietnam/HG4/2005 (Hậu Giang)
có 9 vị trí nucleotide sai khác hoàn toàn so với các chủng khác phân lập ở
Việt Nam và Đông Nam Á, được xác định thuộc nhóm dưới dòng Quảng
Đông và clade 1 [7].
Hemagglutinin (HA) có thể được coi là một loại protein vừa quyết định
tính kháng nguyên, vừa quyết định tính độc lực của virus cúm A. Protein HA
là một glycoprotein thuộc protein màng type I (lectin), có khả năng gây ngưng
kết hồng cầu gà trong ống nghiệm (in vitro), kháng thể đặc hiệu với HA có
thể phong tỏa sự ngưng kết đó, được gọi là kháng thể ngăn cản ngưng kết
hồng cầu (HI-Hemagglutinin Inhibitory andibody). Có 16 phân type HA đã
được phát hiện (H1-H16), ba phân type (H1, H2 và H3) thích ứng lây nhiễm
gây bệnh ở người liên quan đến các đại dịch cúm trong lịch sử [102]. Có
khoảng 400 phân tử HA trên bề mặt capsid của một virus và khởi động quá
trình xâm nhiễm của virus vào tế bào chủ [9] [7]. Phân tử HA có dạng hình
trụ, dài khoảng 1

Å, thường ở dạng kết 3 (trimer), mỗi chuỗi polypeptid

được tạo thành từ HA1 (36 kDa) và HA2 (27 kDa) và các chuỗi polypeptid
liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide (-S-S-). Các chuỗi polypeptid sau
khi tổng hợp đã được glycosyl hóa và gắn vào mặt ngoài capsid là chuỗi HA2,
phần đầu tự do hình chỏm cầu được tạo bởi hạt HA1 chứa đựng vị trí gắn với
thụ thể thích hợp của HA trên bề mặt màng tế bào đích. Sự kết hợp của HA
với thụ thể đặc hiệu (glycoprotein chứa sialic acid) trên bề mặt màng tế bào,
khởi đầu quá trình xâm nhiễm của virus trên vật chủ giúp cho virus xâm nhập,
hòa màng và giải phóng RNA hệ gen thực hiện quá trình nhân lên ở tế bào
cảm nhiễm 150. Quá trình kết hợp phụ thuộc vào sự phù hợp cấu hình
không


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×