Tải bản đầy đủ

Tuyển chọn vi khuẩn lactic kháng với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (vibrio parahaemolyticus) trên tôm thẻ chân trắng (penaeus vannamei) tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Chuyên ngành: Nuôi trồng Thủy sản
Mã ngành: 62620301

NGUYỄN THỊ TRÚC LINH

TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC
KHÁNG VỚI VI KHUẨN
GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP TÍNH
(Vibrio parahaemolyticus)
TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG
(Penaeus vannamei)

Cần Thơ, 2018


CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Người hướng dẫn chính: PGS.TS. Trương Quốc Phú
Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp
trường
Họp tại: Phòng họp 3, Nhà Điều hành, Trường Đại học Cần Thơ
Vào lúc 14giờ00 ngày 21 tháng 9 năm 2018
Phản biện 1: GS. TS. Cao Ngọc Điệp
Phản biện 2: PGS.TS. Võ Văn Nha
Phản biện 3: TS. Nguyễn Hữu Thịnh
Xác nhận đã xem lại của
chủ tịch Hội đồng

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ.
Thư viện Quốc gia Việt Nam.


DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1. Isolation and selection of lactic acid
bacteria
that
can
antagonize
Vibrio
parahaemolyticus causing acute hepatopancreatic
necrosis disease in whiteleg shrimp (Penaeus
vannamei). Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần
Thơ. Vol 7 (74-81).
2. Ảnh hưởng của việc bổ sung vi khuẩn
lactic vào thức ăn lên khả năng kháng bệnh hoại tử
gan tụy cấp tính trên tôm thẻ chân trắng
(Litopenaeus vannamei). Tạp chí khoa học Trường
Đại học Cần Thơ. 52b:122-130.


Chương I
GIỚI THIỆU
1.1. Giới thiệu
Tôm biển được xem là một trong những sản phẩm
có giá trị kinh tế cao và đã trở thành nguồn xuất khẩu


chính của nhiều nước trên thê giới như Thailand, Indo,
Vietnam, Malaysia,... (FAO, 2013). Tuy nhiên, người
nuôi hiện nay đã nuôi tôm với mật số cao nên họ phải đối
mặt với rất nhiều rủi ro. Đặc biệt là bệnh hoại tử gan tụy
cấp tính (AHPND). Bệnh đã gây tác hại rất lớn đối với
nhiều ao nuôi ở phía Nam Châu Á (FAO, 2013). Tổng số
thiệt hại hàng năm hơn 1 tỷ USD (Zorriehzahra and
Banaederakhshan, 2015). Bệnh lần đầu tiên xuất hiện ở
Trung Quốc năm 2009, sau đó lan truyền đến Việt Nam
năm 2010, Malaysia và Thailand năm 2011, và lan truyền
đến Mexico năm 2013 (Tran Loc et al., 2014). Bệnh
AHPND xãy ra khoảng 30 ngày sau khi thả giống, tỷ lệ
chết lên đến 70% (Zorriehzahra and Banaederakhshan,
2015). Hiện nay, có một số biện pháp để ngăn ngừa bệnh
AHPND như dùng hóa chất, kháng sinh và chế phẩm
sinh học. Tuy nhiên, dùng hóa chất, kháng sinh thì hiệu
quả không cao dễ gây ô nhiễm môi trường và tồn lưu hóa
chất và kháng sinh trong cơ thể thịt tôm. Vì thế, cách tốt
nhất là sử dụng chế phẩm sinh học
Vi khuẩn lactic (LAB) đã được ứng dụng rộng rãi
và ngày càng phổ biến trong việc sản xuất chế phẩm sinh
học, bổ sung trong thức ăn động vật thủy sản, thức ăn
chăn nuôi cũng như việc bón vào ao nuôi để ức chế các
loài vi khuẩn gây bệnh cho động vật thủy sản. Trong
nghiên cứu về các loài vi khuẩn hữu ích thì có một số
dòng vi khuẩn tiết ra chất ức chế đề kháng lại với vi
1


khuẩn khác như Lactobacillus sp. kháng lại vi khuẩn
Vibrio sp. (Trịnh Hùng Cường, 2011); Lactobacillus
suntoryeus LII1 có khả năng kháng mạnh đối với
Escherichia coli và Bacillus cereus (Hồ Lê Huỳnh Châu
và ctv., 2010). Trong quá trình lên men, vi khuẩn lactic
sinh ra acid hữu cơ, chúng ức chế vi khuẩn gây bệnh do
sự tác động lên tế bào chất của vi khuẩn, ảnh hưởng đến
chức năng bảo vệ của màng tế bào (Fooks et al., 1999;
Jay, 2000; Gerald, 1999; Kuipers et al., 2000). Các
nghiên cứu vừa nêu đã chỉ ra rằng LAB có khả năng tiết
ra chất ức chế vi khuẩn gây bệnh. Việc nghiên cứu khả
năng phòng trị bệnh của các chủng vi khuẩn là rất khả thi
và đặc biệt là việc giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Vi
thế, nghiên cứu này được thực hiện nhằm mục đích sử
dụng LAB đối kháng với V. parahaemolyticus, gây bệnh
hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm.
1.2. Mục tiêu tổng quát
Sưu tập và chọn lọc bộ chủng vi khuẩn lactic có
nguồn gốc từ ao nuôi tôm cá nước mặn nhằm tạo nguồn
vi khuẩn hữu ích để sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng
cho nuôi trồng thủy sản.
1.3. Mục tiêu cụ thể
Sưu tập và chọn lọc các chủng vi khuẩn lactic từ
ruột tôm thẻ, ruột cá rô phi và bùn đáy ao nuôi tôm đối
kháng mạnh với chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus gây
bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) trên tôm he, từ đó sử
dụng chúng để phòng bệnh AHPND trên đàn tôm nuôi.
1.4. Ý nghĩa nghiên cứu
Luận án đã sưu tập và chọn lọc bộ chủng vi khuẩn
lactic có nguồn gốc từ ruột cá rô phi và ruột tôm thẻ
nhằm góp phần tạo nguồn vi khuẩn hữu ích có khả năng
2


ngăn ngừa bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm nước lợ
nói chung và tôm thẻ nói riêng. Đồng thời, các chủng
LAB này có thể sử dụng để sản xuất chế phẩm sinh học
sử dụng cho nuôi trồng thủy sản, đóng góp vào sự phát
triển nông nghiệp theo hướng bền vững.
Luận án đã góp phần mở rộng cơ hội cho người
nuôi tôm giảm thiểu việc sử dụng thuốc và hóa chất trong
nuôi tôm vùng ven biển, đồng thời tạo ra sản phẩm sạch
và giảm thiểu ảnh hưởng tiêu cực của nghề nuôi đến môi
trường xung quanh.
1.5. Điểm mới của luận án
Luận án đã sàng lọc được 12 chủng LAB có khả
năng kháng tốt với V. parahaemolyticus với đường kính
vòng vô khuẩn từ 16,5-18,5mm. Trong đó có 05 chủng
có khả năng kháng V. parahaemolyticus rất tốt, đường
kính vòng vô khuẩn là 17,5-18,5mm.
Luận án đã định danh được chủng LAB có khả
năng làm giảm thiểu đáng kể bệnh hoại tử gan tụy cấp
tính trong nuôi tôm thẻ là chủng Lactobacillus plantarum
khi trộn vào thức ăn. Chủng vi khuẩn này có thể được sử
dụng để sản xuất chế phẩm sinh học.
Luận án đã xác định được khi bổ sung các thành
phần acid glutamic, KH2PO4, K2HPO4, và đường
trehalose theo tỷ lệ C, N, và P theo tỷ lệ 15, 1 và 0,1 đã
làm tăng sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh hoại tử cấp
tính, đồng thời làm tăng khả năng gây bệnh hoại tử gan
tụy cấp tính trên tôm thẻ.

3


CHƯƠNG 3
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Phân lập LAB từ nhiều nguồn khác nhau
a) Phương pháp thu mẫu và bảo quản mẫu

Mẫu tôm thẻ được thu ở 3 tỉnh Trà Vinh, Bến
Tre và Sóc Trăng, ở mỗi tỉnh thu 6 ao và mỗi ao thu
5 con tôm. Tôm được lựa chọn thí nghiệm phải khỏe
mạnh và có kích cỡ khoảng 20g/con.
Mẫu cá rô phi được thu ở các ao lắng và các ao
nuôi tôm kết hợp với kích cỡ khoảng 100 gam/con.
Địa điểm, cách thu mẫu cá rô phi cũng được thực
hiện giống như thu mẫu tôm.
Mẫu bùn được thu ở các ao thu mẫu tôm thí nghiệm
(Somiri et al., 2006). Trong mỗi ao, mẫu được thu 3 vị trí
(đầu ao, giữa ao, và cuối ao) và lượng bùn thu tại mỗi vị
trí khoảng 100 g. Mẫu thu tại 3 vị trí của cùng 1 ao được
trộn lại với nhau (mẫu hổn hợp), giữ lạnh bằng nước đá
trong thùng xốp và chuyển về phòng thí nghiệm.
b) Phân lập vi khuẩn lactic từ ruột tôm, ruột cá
rô phi và bùn đáy ao nuôi tôm (Nirunya et al., 2008)
Mẫu tôm và cá rô phi được rửa sạch bằng nước cất
vô trùng và khử trùng bên ngoài bằng ethanol 70o, tiếp
theo dùng dụng cụ giải phẫu để tách lấy toàn bộ ruột tôm
và ruột trước của cá rô phi cho vào lần lượt từng ống
nghiệm chứa 5 mL nước muối sinh lý đã được khử trùng.
Sau đó, dùng que thủy tinh nghiền cho đến khi mẫu đã
đồng nhất với nước muối sinh lý, để lắng khoảng 5 phút

4


sau đó hút 1 mL lấy dịch trong cho vào 5 mL môi trường
MRS broth có bổ sung 1,5% NaCl.
Đối với mẫu bùn, cân 1 gam mẫu hỗn hợp cho vào
ống nghiệm chứa 9 mL nước muối sinh lý đã tiệt trùng,
lắc đều mẫu bằng máy trộn, để lắng, sau đó hút 1 mL
phần dịch trong cho vào ống nghiệm có chứa 5 mL môi
trường MRS broth có bổ sung 1,5% NaCl.
Các ống nghiệm nuôi cấy LAB được ủ ở 28o C
trong 48 giờ. Sau khi ủ, dịch nuôi được pha loãng thành
10-1, 10-2, 10-3 trong muối sinh lý. Kế đến, hút lần lượt 50
µL từ các ống nghiệm có độ pha loãng nêu trên trải lên
môi trường MRS agar (có bổ sung 1,5% NaCl và CaCO3
1%) rồi đem ủ ở 280 C trong 48 giờ. Sau đó tiến hành
chọn khuẩn lạc có màu trắng đục hoặc không màu và có
khả năng làm tan CaCO3, cấy ria ra các đĩa petri có chứa
môi trường MRS agar để tách ròng.
3.3.2. Xác định tính đối kháng của chủng vi khuẩn
phân lập được với vi khuẩn V. parahaemolyticus
trong điều kiện in vitro (Sivakumar et al., 2012)
Vi khuẩn V. paraheamolyticus được nuôi sinh khối
trong môi trường TSB có bổ sung 1,5% NaCl trong 24
giờ. Sau đó sử dụng tăm bông tiệt trùng nhúng vào ống
nghiệm đã nuôi vi khuẩn và tán đều trên các đĩa petri
chứa môi trường NA có bổ sung 1,5% NaCl, đặt vào tủ
mát 40 C khoảng 1 giờ. Sau khi làm mát, mỗi đĩa petri
được đục 4 lỗ để tạo các giếng có đường kính 6 mm.
Các chủng LAB (94 chủng) dùng trong thí nghiệm
xác định tính đối kháng được nuôi trong ống nghiệm có
chứa 5 mL MRS broth có bổ sung 1,5% NaCl, ủ ở 280C
trong 48 giờ. Tiếp theo hút 1mL dịch nuôi cấy cho vào
ống tuýp (1,5 mL), ly tâm 10000 rpm trong 20 phút ở 40
5


C để lấy phần dịch trong. Sau đó hút 50 µL phần dịch
trong bơm vào mỗi giếng. Trên mỗi đĩa petri, bơm dịch
trong vào 3 giếng, giếng còn lại được bơm vào nước cất
vô trùng. Các đĩa petri này sau đó được ủ ở 28 o C trong
24 giờ.
Sau khi ủ, khả năng kháng V. parahaemolyticus của
LAB được xác định thông qua sự hình thành vòng vô
trùng. Mức độ kháng khẩn V. parahaemolyticus của LAB
được đánh giá dựa trên đường kính của vòng vô trùng
(Sivakumar et al., 2012).
3.3.3. Thử nghiệm khả năng kháng bệnh hoại tử gan
tụy cấp khi bổ sung các chủng LAB vào thức ăn
Thí nghiệm được tiến hành trong bể kính có thể
tích 30 L, bể thí nghiệm được rửa bằng nước sạch sau đó
khử trùng trước khi sử dụng.
Nguồn nước được xữ lý và loãng với nước ngọt để
có độ mặn 20‰.
Tôm thẻ chân trắng kích cỡ trung bình khoảng
1g/con thì tiến hành bố trí thí nghiệm. Trước khi bố trí,
tôm được kiểm tra bằng phương pháp PCR, những mẻ
tôm không mang mầm bệnh WSSV và AHPND. Sau khi
bố trí vào các bể thí nghiệm, tôm được thuần dưỡng 3
ngày cho quen với điều kiện môi trường.
Chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh hoại
tử gan tụy cấp tính (Nguyễn Trọng Nghĩa và ctv., 2015)
được phục hồi trong môi trường nutrient broth (NB,
Merck) có bổ sung 1,5% NaCl (NB+), sau đó ủ ở 280C
trong 18 giờ. Ghi nhận màu sắc và hình dạng khuẩn lạc,
nhuộm Gram để kiểm tra tính thuần của vi khuẩn. Khuẩn
lạc vi khuẩn thuần được nuôi tăng sinh trong môi trường
6


NB+ ở 280C trong 18 – 24 giờ sau đó xác định mật độ vi
khuẩn bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 610 nm.
Năm chủng LAB (T3.1, RP5.4.1, T4.2, RP5.5.1,
RP6.5) đã xác định có khả năng kháng mạnh nhất với vi
khuẩn V. parahaemolyticus được nuôi sinh khối trong
môi trường 100 mL MRS broth có bổ sung 1,5% NaCl
trong 48 giờ. Điều chỉnh để đạt mật số 109 CFU/mL.
Tiếp đến, đem ly tâm LAB với tốc độ 7000 vòng trong 5
phút, rửa lại 3 lần bằng nước muối sinh lý đã tiệt trùng,
sau đó từng chủng LAB sẽ được hòa đều vào 10 mL
nước muối sinh lý và trộn đều vào 100g thức ăn và áo
bằng 1mL dầu mực bên ngoài. Thức ăn được cho vào túi
ni lon, dán nhãn bảo quản ở 40C cho đến khi sử dụng.
Phương pháp cảm nhiễm được thực hiện theo
phương pháp Loc Tran et al. (2013). Tôm được ngâm
trong dung dịch vi khuẩn V. parahaemolyticus mật độ 2 x
107 CFU/mL trong 15 phút sau đó vớt và bố trí vào bể thí
nghiệm đã được bổ sung vi khuẩn V.
parahaemolyticus với mật độ vi khuẩn của nước trong bể
ở 106 CFU/mL. Đối với nghiệm thức đối chứng âm tiến
hành ngâm tôm trong môi trường TSB (có bổ sung 1,5%
NaCl) tiệt trùng và cho vào bể không bổ sung vi khuẩn.
Mẫu gan tụy tôm dùng trong phân tích mô bệnh
học được thu khi tôm có dấu hiệu lờ đờ, bỏ ăn, ruột rỗng
sau 3 ngày cảm nhiễm với V. parahaemolyticus. Ngoài
ra, mẫu còn được thu (3 con/bể) khi kết thúc thí nghiệm.

7


a) Ảnh hưởng của việc bổ sung vi khuẩn lactic
vào thức ăn lên tỷ lệ sống và khả năng kháng bệnh
hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm thẻ chân trắng
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm
12 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần (36
lô thí nghiệm). Các nghiệm thức thí nghiệm gồm:
1. ĐCA: Tôm ăn thức ăn không bổ sung LAB và không
gây cảm nhiễm vi khuẩn V. parahaemolyticus.
2. LAB1: Tôm ăn thức ăn có bổ sung LAB, chủng T3.1
và không gây cảm nhiễm.
3. LAB2: Tôm ăn thức ăn có bổ sung LAB, chủng
RP5.4.1 và không gây cảm nhiễm.
4. LAB3: Tôm ăn thức ăn có bổ sung LAB, chủng T4.2
và không gây cảm nhiễm.
5. LAB4: Tôm ăn thức ăn có bổ sung LAB, chủng
RP5.5.1 và không gây cảm nhiễm.
6. LAB5: Tôm ăn thức ăn có bổ sung LAB, chủng RP6.5
và không gây cảm nhiễm.
7. ĐCD: Tôm ăn thức ăn không bổ sung LAB và gây cảm
nhiễm V. parahaemolyticus.
8. VP-LAB1: Tôm ăn thức ăn có bổ sung LAB, chủng
T3.1 và gây cảm nhiễm V. parahaemolyticus.
9. VP-LAB2: Tôm ăn thức ăn có bổ sung LAB, chủng
RP5.4.1, gây cảm nhiễm V. parahaemolyticus.
10. VP-LAB3: Tôm ăn thức ăn có bổ sung LAB, chủng
T4.2 và gây cảm nhiễm V. parahaemolyticus.
11. VP-LAB4: Tôm ăn thức ăn có bổ sung LAB, chủng
RP5.5.1, gây cảm nhiễm V. parahaemolyticus.
8


12. VP-LAB5: Tôm ăn thức ăn có bổ sung LAB, chủng
RP6.5, gây cảm nhiễm V. parahaemolyticus.
Thí nghiệm được tiến hành trên bể kính chứa 20 L
nước có độ mặn 20‰, sục khí liên tục trong thời gian thí
nghiệm. Mỗi bể thí nghiệm bố trí 30 con tôm khỏe với 3
lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức thí nghiệm, kích cỡ trung
bình 1g/con. Ở nghiệm thức ĐCA và ĐCD, tôm được
cho ăn bằng thức ăn viên CP chứa 40% đạm. Ở các
nghiệm thức còn lại, tôm được cho ăn thức ăn cùng loại
nhưng có bổ sung các chủng LAB với mật số 109CFU/g
trong suốt thời gian thí nghiệm. Tôm được cho ăn 3 lần
mỗi ngày vào lúc 7, 13, và 17 giờ, cho ăn theo nhu cầu.
Bảy ngày sau khi được bổ sung LAB ở các nghiệm thức
thí nghiệm bao gồm nghiệm thức 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10,
11, và 12, tôm được gây cảm nhiễm vi khuẩn V.
parahaemolyticus, sau đó thí nghiệm được tiếp tục theo
dõi trong thời gian là 14 ngày.
Các chỉ tiêu theo dõi trong quá trình thí nghiệm bao gồm:
- Tỷ lệ sống của tôm sau khi cảm nhiễm vi khuẩn V.
parahaemolyticus 14 ngày.
- Theo dõi và ghi nhận dấu hiệu bệnh lý và khả năng
kháng bệnh ở tôm bằng cách tiến hành thu mẫu và phân
tích mô bệnh học sau khi cảm nhiễm.
b) Thử nghiệm khả năng kháng bệnh hoại tử gan
tụy cấp của các chủng LAB trong điều kiện có bổ sung
các thành phần C, N, P (acid glutamic, KH2PO4,
K2HPO4, và đường trehalose)
Thí nghiệm sử dụng acid glutamic (C5H9NO4) là
nguồn cung cấp C và N. Đường trehalose cũng là nguồn

9


cung cấp C. KH2PO4 và K2HPO4 là nguồn cung cấp P với
tỷ lệ C, N, P là 15, 1, 0,1. Nhịp bổ sung là 7 ngày/lần.
Các chủng LAB và vi khuẩn V. parahaemolyticus
dùng trong thí nghiệm này cũng chính là các chủng đã
được sử dụng ở thí nghiệm ở Mục 3.3.3a. Tuy nhiên,
trong thí nghiệm này chỉ chọn 3 chủng có khả năng
phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính là chủng LAB1,
LAB2 và LAB5 để thực hiện. Thí nghiệm được bố trí với
10 nghiệm thức. Các bước thí nghiệm cũng được thực
hiện tương tự như thí nghiệm ở mục 3.3.3a với 10
nghiệm thức:
1. ĐCA: Tôm ăn thức ăn không bổ sung LAB và không
gây cảm nhiễm V. parahaemolyticus, không bổ sung C,
N, P.
2. ĐCA+CNP: không cảm nhiễm V. parahaemolyticus,
cho ăn thức ăn không chứa LAB, có bổ sung C, N, P.
3. ĐCD: có cảm nhiễm V. parahaemolyticus, cho ăn thức
ăn không chứa LAB, không bổ sung C, N, P.
4. ĐCD+CNP: có cảm nhiễm V. parahaemolyticus, cho
ăn thức ăn không chứa LAB, có bổ sung C, N, P.
5. LAB1+CNP: cho ăn thức ăn có bổ sung LAB1, không
cảm nhiễm V. parahaemolyticus, có bổ sung C, N, P.
6. VPLAB1+CNP: cho ăn thức ăn có bổ sung LAB1, có
cảm nhiễm V. parahaemolyticus, có bổ sung C, N, P.
7. LAB2+CNP: Cho ăn thức ăn có bổ sung LAB2, không
cảm nhiễm V. parahaemolyticus, có bổ sung C, N, P.
8. VPLAB2+CNP: Cho ăn thức ăn có bổ sung LAB2, có
cảm nhiễm V. parahaemolyticus, có bổ sung C, N, P.
10


9. LAB5+CNP: Cho ăn thức ăn có bổ sung LAB5, không
cảm nhiễm V. parahaemolyticus, có bổ sung C, N, P.
10. VPLAB5+CNP: Cho ăn thức ăn có bổ sung LAB5,
có cảm nhiễm V. parahaemolyticus, có bổ sung C, N, P
Các chỉ tiêu theo dõi trong tương tự như Mục 3.3.3a
3.3.4. Định danh chủng LAB có khả năng kháng bệnh
hoại tử gan tụy cấp tính
Sản phẩm PCR gen 16S rRNA được gởi đến công
ty Nam Khoa giải trình tự. Kết quả giải trình tự được so
sánh bằng chương trình Blast search trên cơ sở dữ liệu
ngân hàng gen của NCBI để định danh loài vi khuẩn.
3.4. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu thập được tính toán giá trị trung bình,
độ lệch chuẩn bằng phần mềm Excel, so sánh sự khác
biệt giữa các nghiệm thức theo phương pháp phân tích
ANOVA một nhân tố và 2 nhân tố với phép thử Duncan
thông qua phần mềm SPSS 22.0.

11


Chương 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN

4.1. Phân lập các chủng LAB và xác định các chỉ tiêu
hình thái, sinh lý và sinh hóa.
4.1.1. Phân lập LAB
Trong tổng số 198 mẫu thí nghiệm đã tìm ra 94
chủng LAB được phân lập từ ruột tôm, ruột cá rô phi và
bùn đáy ao nuôi tôm biển. Trong tổng số 94 chủng LAB
phân lập được có 30 chủng LAB được phân lập ở tỉnh
Trà Vinh, 25 chủng được phân lập ở tỉnh Sóc Trăng và
39 chủng được phân lập ở Bến Tre. Số lượng LAB phân
lập được nhiều nhất là trong ruột tôm (51/94 chủng), kế
đến ruột cá rô phi là 41/94 chủng. Số lượng LAB được
phân lập ít nhất ở bùn đáy ao nuôi tôm 2/94 chủng.
4.1.2. Xác định các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh
hóa của LAB
Tất cả các khuẩn lạc có khả năng làm tan CaCO3
được chọn để xác định đặc điểm hình thái, sinh lý, và
sinh hóa cho thấý tất cả các khuẩn lạc của LAB đều có
màu trắng đục, tròn, lồi, có kích cỡ 1-2 mm và có khả
năng làm tan CaCO3 sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường
MRS agar (bổ sung 1,5% NaCl và 1% CaCO3). Kết quả
này cũng tương đồng với nghiên cứu của Klaenhammer
(1987) vi khuẩn lactic là một nhóm các vi khuẩn Gram
dương, chúng là trực khuẩn ngắn hay que (rod) và cầu
khuẩn (cocci) không sinh bào tử.

12


Kết quả xác định tính đối kháng của vi khuẩn
lactic với vi khuẩn V. parahaemolyticus.

4.2.

Kết quả xác định tính đối kháng của LAB với V.
parahaemolyticus ở Trà vinh được thể hiện qua Hình 1

Hình 1: Khả năng kháng khuẩn của LAB với V.
parahaemolyticus được phân lập tại Trà Vinh

Kết quả xác định tính đối kháng với V.
parahaemolyticus của các chủng LAB đã cho thấy hai
chủng LAB có khả năng kháng với V. parahaemolyticus
nhưng đường kính kháng khuẩn yếu (+) nhỏ hơn 11 mm
và 20 chủng LAB có khả năng kháng V.
parahaemolyticus ở mức trung bình (++), với đường kính
vô trùng (11.00 - 16.00 mm). Tám chủng LAB còn lại có
khả năng kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus với vòng
kháng khuẩn lớn (+++), đặc biệt là đối với chủng LAB
phân lập từ ruột cá rô phi và ruột tôm RP5.4.1, RP5.5.1
và T4.2 có vòng tròn kháng khuẩn lớn nhất tương ứng là
18,2±0,289 mm, 18 mm và 17,5 mm. Do đó, các chủng
LAB này có thể sử dụng làm chế phẩm sinh học. Kết quả
13


tương tự cũng được Nguyễn Văn Minh và ctv. (2014) đã
nghiên cứu Bacillus polyfermenticus F27 đối kháng với
vi khuẩn V. parahaemolyticus NT7 với đường kính lớn
nhất là 18,5 mm và có khả năng sử dụng làm chế phẩm
sinh học.
Kết quả xác định tính đối kháng của vi khuẩn lactic
với V. parahaemolyticus ở Sóc Trăng được thể hiện qua
Hình 2

A

B

Hình 2: Khả năng kháng khuẩn của các chủng LAB với V.
parahaemolyticus thu tại Sóc Trăng

Nhìn chung, kết quả từ Hình 2 đã cho thấy rằng các
chủng LAB đã được phân lập ở Sóc Trăng mặc dù có khả
năng kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus nhưng vòng
kháng khuẩn không lớn từ 11-15mm.
Kết quả xác định tính đối kháng của LAB với V.
parahaemolyticus ở Bến Tre được thể hiện qua Hình 4.3

A

14
B


Hình 3: Khả năng kháng khuẩn của LAB với V.
parahaemolyticus thu tại Bến Tre

Kết quả từ biểu đồ đã chỉ ra rằng có 14 chủng LAB
có khả năng kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus với
đường kính vô trùng rất yếu (+) nhỏ hơn 11.00 mm. Hai
mươi mốt chủng LAB có khả năng kháng với V.
parahaemolyticus với vòng kháng khuẩn trung bình (++)
vòng kháng khuẩn 11.00-16.00 mm. Bốn chủng còn lại
có khả năng kháng mạnh với vi khuẩn V.
parahaemolyticus với đường kính của vòng vô trùng lớn
hơn 16 mm (+++). Chủng vi khuẩn tạo ra vòng kháng
khuẩn lớn nhất là RP6.5 và T3.1, chủng vi khuẩn này
được phân lập từ ruột cá rô phi và ruột tôm với vòng
kháng khuẩn lớn hơn 17 mm. Điều này có thể khẳng định
rằng chủng vi khuẩn được xác định là có tiềm năng trong
phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính là chủng RP6.5 và
T3.1.
Tóm lại, hầu hết vi khuẩn lactic có khả năng đối
kháng với vi khuẩn V. parahaemolyticus nhưng có 5
15


chủng được lựa chọn sử dụng để phòng bệnh hoại tử gan
tụy cấp tính trên tôm biển là T3.1, RP5.4.1, T4.2,
RP5.5.1, RP6.5.
Thử nghiệm khả năng kháng bệnh hoại tử gan
tụy cấp tính của các chủng LAB bằng phương pháp
cho ăn.

4.3.

4.3.1. Ảnh hưởng của việc bổ sung LAB vào thức
ăn lên tỷ lệ sống và khả năng kháng bệnh hoại tử gan
tụy cấp tính trên tôm thẻ chân trắng
a) Ảnh hưởng của LAB lên tỷ lệ sống của tôm thẻ
Khi bổ sung các chủng LAB vào thức ăn, tỷ lệ
sống của tôm thẻ có cải thiện đáng kể. Kết quả này được
thể hiện qua hình 4

Hình 4. Tỷ lệ sống của tôm thẻ được cho ăn thức ăn có
bổ sung LAB
Ghi chú: a, b, c, d : các số liệu biểu thị trên cột có chữ
cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê

Số liệu ở Hình 4 cho thấy tôm có tỷ lệ sống cao
nhất ở nghiệm thức bổ sung LAB5 (92,23%), kế đến là
16


nghiệm thức LAB2 (90%) và thấp nhất là nghiệm thức
VP+LAB3 (29,97%) và nghiệm thức đối chứng dương
(45,57%). Kết quả thí nghiệm còn chỉ ra rằng khi trộn
LAB vào thức ăn trong điều kiện không cảm nhiễm vi
khuẩn V. parahaemolyticus, tôm thẻ có tỷ lệ sống khá
cao và khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với
nghiệm thức đối chứng âm. Cụ thể là ở nghiệm thức bổ
sung LAB (LAB1, LAB2, LAB3, LAB4, LAB5) vào
thức ăn, tỷ lệ sống lần lượt là 88,9; 90; 86,6; 82,23%; và
92,23%. Các nghiệm thức này khác biệt không có ý nghĩa
thống kê so với đối chứng âm (87,77%). Kết quả này
tương tự như nghiên cứu của Aly et al. (2008),
Lactobacillus có khả năng làm tăng tỷ lệ sống của động
vật thủy sản khi được bổ sung vào thức ăn.
Đối với các nghiệm thức có cảm nhiễm V.
parahaemolyticus thì tỷ lệ sống của tôm trong nghiệm
thức VP+LAB1; VP+LAB2 và VP+LAB5 tương đối cao
và khác biệt không có ý nghĩa giữa các nghiệm thức với
nhau (lần lượt là 73,37%; 79,97%; và 73,33%) và với
nghiệm thức đối chứng âm (87,77%) nhưng lại khác biệt
có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng dương
(45,57%). Tóm lại, trong các nghiệm thức có bổ sung
LAB1; LAB2 và LAB5, tỷ lệ sống của tôm có cải thiện
hơn so với nghiệm thức đối chứng dương. Điều này cũng
tương đồng với nghiên cứu của Scharifuzzaman et al.
(2011) khi bổ sung vi sinh vật có lợi vào đường ruột sẽ
mang lại hiệu quả về mặt dinh dưỡng, tăng đáp ứng miễn
dịch và khả năng đề kháng bệnh của vật nuôi. Kết quả
nghiên cứu này cũng phù hợp với với nghiên cứu của
Natesan et al.(2012), khi cho tôm sú ăn vi khuẩn
Lactobacillus trong điều kiện có cảm nhiễm vi khuẩn V.

17


alginolyticus, tỷ lệ sống cũng được cải thiện từ 20% lên
đến 87% trong 10 ngày cảm nhiễm.
Tóm lại, khi bổ sung chủng LAB1; LAB2 và
LAB5 vào thức ăn tỷ lệ sống của tôm tăng lên đáng kể kể
cả trong điều kiện có cảm nhiễm V. parahaemolyticus.
b) Kết quả phân tích mô bệnh học
Kết quả phân tích mô học trên các mẫu tôm thí
nghiệm cho thấy các mẫu tôm không cảm nhiễm vi
khuẩn V. parahaemolyticus vùng gan tụy tôm bình
thường với cấu trúc hình sao của ống gan tụy và sự hiện
diện của các loại tế bào B, R,và F (Hình 5 A, B). Trong
khi đó, một số nghiệm thức có cảm nhiễm vi khuẩn V.
parahaemolyticus có sự biến đổi vùng gan tụy với mức
độ ảnh hưởng tùy thuộc theo từng nghiệm thức. Ở
nghiệm thức đối chứng dương có 70% mẫu gan tụy tôm
thu được có biểu hiện một số biến đổi đặc trưng trên
vùng gan tụy của các mẫu tôm này tương tự mô tả của
Lightner et al., (2012) trên tôm bệnh hoại tử gan tụy cấp
tính như cấu trúc mô gan tụy bị biến đổi, ống gan tụy
không có tế bào B, F và R và một số tế bào của ống gan
tụy có nhân to khác thường, các tế bào gan thoái hóa và
rơi vào lòng ống, xuất hiện melanin hóa ở các vùng hoại
tử (Hình 5 C, D) và 30% mẫu gan tụy tôm còn lại chỉ có
biểu hiện là các tế bào B, R, F bị giảm số lượng trên mẫu
mô phân tích. Kết quả tương tự cũng được ghi nhận ở
nghiệm thức VP+LAB3 và VP+LAB4, ở 2 nghiệm thức
này đã tìm thấy 40% số mẫu gan tụy tôm thu được có
biểu hiện bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm như ống
gan tụy teo, giảm số lượng tế bào B, R, F, các tế bào gan
thoái hóa và rơi vào lòng ống. 60% số mẫu gan tụy tôm
còn lại không có dấu hiệu bệnh lý của bệnh hoại tử gan
tụy cấp tính. Trong khi đó, hiệu quả của các nghiệm thức
18


bổ sung LAB vào thức ăn lên bệnh hoại tử gan tụy cấp
tính được thể hiện thông qua phân tích mô bệnh học ở
nghiệm thức VP+LAB1, VP+LAB2 và VP+LAB5 có cải
thiện đáng kể. Các biến đổi trên gan tụy ở các nghiệm
thức tương ứng này cho thấy chỉ 20, 30, và 20% mẫu gan
tụy tôm có biểu hiện giảm tế bào B, R, F và ống gan tụy
bị teo. Tất cả các mẫu gan tụy còn lại có dấu hiệu bình
thường tương tự như đối chứng âm. Nhìn chung, mức độ
nhiễm bệnh hoại tử gan tụy cấp tính của các nghiệm thức
VP+LAB1, VP+LAB2 và VP+LAB5 thấp hơn so với các
nghiệm thức cảm nhiễm khác, đồng thời tỉ lệ biểu hiện
bệnh cũng thấp hơn với đa số các mẫu gan tụy đều có dấu
hiệu bình thường.

Hình 5: Mô bệnh học tôm thí nghiệm. A, B: Mô gan tôm khỏe

19


4.3.2. Thử nghiệm khả năng kháng bệnh hoại tử gan
tụy cấp tính của các chủng LAB có bổ sung C, N, P
(acid glutamic, KH2PO4, K2HPO4, và đường
trehalose) vào môi trường thí nghiệm.
a) Ảnh hưởng của LAB lên tỷ lệ sống
Kết quả xác định tỷ lệ sống của tôm khi cảm
nhiễm V. parahaemolyticus trong điều kiện có bổ C, N, P
và bổ sung các chủng LAB được thể hiện qua Hình 6

Hình 6: Tỉ lệ sống của tôm thẻ chân trắng sau 14
ngày cảm nhiễm
Kết quả đã chỉ ra rằng, các nghiệm thức có bổ sung
C, N, P vào trong môi trường nước thì tỷ lệ sống lại thấp
hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức
không bổ sung C, N, P. Tỷ lệ sống thấp nhất là ở nghiệm
thức ĐCD+CNP là 53,33%, kế đến là nghiệm thức ĐCD
(50%) và cao nhất ở nghiệm thức đối chứng âm không bổ
sung C, N, P và bổ sung C, N, P lần lượt 88,2% và
82,5%. Đối với các nghiệm thức bổ sung LAB vào thức
ăn thì tỷ lệ sống tăng lên khá cao và khác biệt có ý nghĩa
20


so với nghiệm thức đối chứng dương thể hiện cụ thể như
sau: tỷ lệ sống cao nhất ở nghiệm thức cho ăn chủng
LAB1 trong trường hợp không cảm nhiễm và cảm nhiễm
V. parahaemolyticus lần lượt là 76,7 và 75%. Tỷ lệ sống
giảm đi ở nghiệm thức cho ăn chủng LAB2 lần lượt là
76,3 và 66% và tỉ lệ sống thấp nhất là ở nghiệm thức cho
ăn vi khuẩn LAB5 là 69,2 và 67%. Vậy, khi bổ sung
chủng LAB1 vào thức ăn cho tôm, tỉ lệ sống đạt cao nhất
so với các chủng LAB thí nghiệm. Theo kết quả nghiên
cứu của Andlid et al. (1995), Balcázar et al. (2006) khi
cho sinh vật ăn LAB, chúng sẽ làm tăng hệ thống miễn
dịch để chống lại mầm bệnh vi sinh vật. Ngoài ra, vi
khuẩn lactic còn có khả năng ức chế sự duy trì điện thế
màng tế bào, ức chế sự vận chuyển, giảm pH nội bào và
ức chế hàng loạt chức năng trao đổi chất (Ross et al.,
2002).
b) Kết quả phân tích mô bệnh học
Kết quả phân tích mô học cho thấy 100% mẫu tôm
không cảm nhiễm V. parahaemolyticus đều bình thường
với sự hiện diện của số lượng lớn các không bào (tế bào
B) và tế bào dự trữ (tế bào R) (Hình 4.7A). Trái lại, các
nghiệm thức có cảm nhiễm vi khuẩn V. parahaemolyticus
có sự biến đổi vùng gan tụy với mức độ ảnh hưởng tùy
thuộc theo từng nghiệm thức. Tôm ở nghiệm thức ĐCD,
ĐCD+CNP, VPLAB1+CNP, VPLAB2+CNP, và
VPLAB5+CNP sau khi cảm nhiễm V. parahaemolyticus
3 ngày đã xác định được lần lượt có 7/9, 8/9, 3/9, 5/9, và
4/9 mẫu gan tụy tôm có những dấu hiệu bệnh tích điển
hình của AHPND tương tự mô tả của Lightner et al,
(2012) trên tôm bệnh hoại tử gan tụy cấp tính như: là cấu
trúc của mô gan tụy bị biến đổi, ống gan tụy không có tế
bào B, F và R và các tế bào gan thoái hóa và rơi vào lòng
21


ống, xuất hiện hiện tượng melamin hóa ở vùng gan hoại
tử và xuất hiện của các tế bào máu quanh các cụm vi
khuẩn trong vùng bị hoại tử (Hình 7B). Sau lần thu mẫu
thứ nhất, khi phát hiện tôm có dấu hiệu lờ đờ, bỏ ăn và
màu sắc nhạt màu, tiến hành thu mẫu và phân tích mô
bệnh học. Kết quả đã cho thấy rằng 60% mẫu tôm thu
được ở nghiệm thức ĐCD và ĐCD+CNP có dấu hiệu
bệnh hoại tử gan tụy cấp như ống gan tụy teo, giảm số
lượng tế bào B, R, F, các tế bào gan thoái hóa và rơi vào
lòng ống. Tương tự, ở các nghiệm thức VPLAB1+CNP;
VPLAB2+CNP, và VPLAB5+CNP cũng cho thấy rằng
có 20, 40, và 40% mẫu gan tụy tôm có dấu hiệu tương tự.
Tuy nhiên, đến khi kết thúc thí nghiệm thì hầu hết mẫu
gan tụy tôm khi phân tích mô bệnh học đều có dấu hiệu
bình thường ngoại trừ 1 mẫu gan tụy ở nghiệm thức
ĐCD+CNP còn có biểu hiện giảm số lượng tế bào B, R,
F, các tế bào gan cũng bị thoái hóa và rơi vào lòng ống.
Tóm lại, ở các nghiệm thức cho ăn LAB và cảm nhiễm V.
Parahaemolyticus thì gan tụy tôm ít bị ảnh hưởng của sự
cảm nhiễm AHPND từ đó làm giảm tỉ lệ tôm chết.

Hình 7: Hình Kết quả mô học gan tụy tôm

22


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×