Tải bản đầy đủ

Nghiên cứu tách và định lượng beta sitosterol trong cây lô hội và dịch chiết từ cây lô hội

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

----------------------------------------------------

Trần Thị Khánh Hòa

NGHIÊN CỨU TÁCH VÀ ĐỊNH LƢỢNG
BETA-SITOSTEROL TRONG CÂY LÔ HỘI
VÀ DỊCH CHIẾT TỪ CÂY LÔ HỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2018

i


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------------------------------------------------


Trần Thị Khánh Hòa

NGHIÊN CỨU TÁCH VÀ ĐỊNH LƢỢNG
BETA-SITOSTEROL TRONG CÂY LÔ HỘI
VÀ DỊCH CHIẾT TỪ CÂY LÔ HỘI
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số

: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. ĐỖ THỊ VIỆT HƢƠNG
PGS.TS. TẠ THỊ THẢO

Hà Nội – Năm 2018

ii


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này lời đầu tiên cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới
TS. Đỗ Thị Việt Hƣơng, Bộ môn Hoá dƣợc – Khoa Hoá học – Đại học Khoa học tự
nhiên – ĐHQG Hà Nội và PGS.TS Tạ Thị Thảo, Bộ môn Hoá phân tích – Khoa
Hoá học - Đại học Khoa học tự nhiên – ĐHQG Hà Nội đã tận tình hƣớng dẫn, đóng
góp những ý kiến quý báu và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực
hiện đề tài.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá học,
đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá phân tích, đã cho em những kiến thức quý
giá, tạo điều kiện cho em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các đồng nghiệp tại labo Hóa – Hoá dƣợc đã
giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình làm thực nghiệm.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên,
chia sẻ mọi khó khăn cùng tôi.
Hà Nội, năm 2018

Trần Thị Khánh Hoà


iii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... iii
DANH MỤC BẢNG BIỂU ....................................................................................... vi
DANH MỤC HÌNH VẼ ............................................................................................vii
BẢNG KÍ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................ ix
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN ..................................................................................... 3
1.1. Khái quát về lô hội ............................................................................................... 3
1.1.1. Mô tả thực vật ................................................................................................... 3
1.1.2. Sự phân bố ......................................................................................................... 4
1.1.3. Thành phần hóa học của lô hội ......................................................................... 4
1.1.4. Nghiên cứu dƣợc lý của cây Lô hội .................................................................. 6
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu........................................................................................ 13
2.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất ............................................................................. 13
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................................... 14
2.3.1. Phƣơng pháp chiết tách β-sitosterol từ dịch chiết cây lô hội .......................... 14
2.3.2. Phƣơng pháp phân tích .................................................................................... 18
2.4. Nghiên cứu các điều kiện tối ƣu và đánh giá phƣơng pháp phân tích ............... 19
2.4.1. Phƣơng pháp nghiên cứu điều kiện tối ƣu ...................................................... 19
2.4.2. Xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng pháp ..................................................... 19
CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................... 21
3.1. Tối ƣu điều kiện xác định trên thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ......... 21
3.1.1. Khảo sát thành phần pha động ........................................................................ 21
3.1.2. Khảo sát tốc độ dòng của pha động ................................................................ 23
3.1.3. Khảo sát độ lặp lại của thiết bị ........................................................................ 24
3.1.4. Điều kiện tối ƣu cho quá trình phân tích β-sitosterol ..................................... 26
3.2. Tối ƣu quá trình tách chiết β-sitosterol từ cây Lô hội ........................................ 26
3.2.1. Khảo sát cấu trúc các hợp chất phân lập đƣợc từ các cặn chiết ...................... 26
3.2.2. Khảo sát dung môi chiết mẫu lô hội thô ban đầu ............................................ 29

iv


3.3. Đƣờng chuẩn xác định β-sitosterol .................................................................... 31
3.3.1. Dựng đƣờng chuẩn .......................................................................................... 31
3.3.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng ..................................................... 32
3.4. Đánh giá phƣơng pháp phân tích ....................................................................... 33
3.4.1. Đánh giá độ lặp lại của phƣơng pháp xử lý mẫu ............................................ 33
3.4.2. Đánh giá hiệu suất thu hồi của phƣơng pháp .................................................. 34
3.5. Phân tích mẫu thực tế ......................................................................................... 37
KẾT LUẬN ............................................................................................................... 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 41

v


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1. Thành phần hoá học của cây Lô hội ...........................................................5
Bảng 3. 1. Độ lặp lại thời gian lƣu và diện tích pic của β-sitosterol ......................... 26
Bảng 3.2 Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất H1.................................28
Bảng 3. 3. Diện tích pic phân tích β-sitosterol trong các hệ dung môi chiết khác
nhau ...........................................................................................................................31
Bảng 3. 4. Kết quả đánh giá độ tuyến tính của β-sitosterol ......................................31
Bảng 3. 5. Bảng kết quả LOD, LOQ của β-sitosterol ...............................................33
Bảng 3. 6. Độ lặp lại quy trình phân tích β-sitosterol trong mẫu lô hội thô .............33
Bảng 3. 7. Kết quả diện tích pic đánh giá hiệu suất thu hồi β-sitosterol...................36
Bảng 3. 8. Kết quả hiệu suất thu hồi xác định β-sitosterol ......................................36
Bảng 3. 9. Kết quả phân tích mẫu lô hội thực tế .......................................................38
Bảng 3. 10. Hàm lƣợng β-sitosterol trong cây lô hội và dịch chiết từ cây lô hội ....39

vi


DANH MỤC HÌNH VẼ
Hình 1. 1. Cây lô hội đƣợc tác giả trồng tại vƣờn nhà thuộc tỉnh Nam Định và thu
hoạch để làm mẫu nghiên cứu .....................................................................................3
Hình 1. 2. Vỏ ngoài và lớp gel của cây lô hội ............................................................3
Hình 1. 3. Cấu trúc của các hợp chất anthraquinone tìm thấy trong gel lô hội...........6
Hình 1. 4. Các hợp chất phytosterol có trong gel lô hội .............................................7
Hình 1. 5. Cấu trúc của hợp chất β-sitosterol ..............................................................8
Hình 2. 1. Mẫu lá cây lô hội ......................................................................................13
Hình 2. 2. Quy trình điều chế các cặn chiết n-hexan ................................................15
Hình 2. 3. Sắc ký lớp mỏng TLC khảo sát cặn chiết EH ..........................................17
Hình 2. 4. Phân tách các phân đoạn cặn chiết n-hexan (EH) ...................................18
Hình 3.1. Sắc đồ HPLC khi sử dụng hệ dung môi ACN/AcOH 0,1% .....................22
Hình 3.2. Sắc đồ HPLC khi sử dụng hệ dung môi MeOH/AcOH 0,1% ...................22
Hình 3.3. Sắc đồ HPLC tại tốc độ dòng 0,6 ml/phút, hệ dung môi ACN/AcOH 0,1%
...................................................................................................................................23
Hình 3.4. Sắc đồ HPLC tại tốc độ dòng 0,8 ml/phút, hệ dung môi ACN/AcOH 0,1%
...................................................................................................................................23
Hình 3.5. Sắc đồ HPLC tại tốc độ dòng 1 ml/phút, hệ dung môi ACN/AcOH 0,1%
...................................................................................................................................24
Hình 3. 6. Sắc đồ HPLC của β-sitosterol 5ppm bơm lần 1 .......................................25
Hình 3. 7.Sắc đồ HPLC của β-sitosterol 5ppm bơm lần 2 ........................................25
Hình 3. 8. Sắc đồ HPLC của β-sitosterol 5ppm bơm lần 3 .......................................25
Hình 3. 9. Phổ 1H NMR (CDCl3) của chất H1 ..........................................................27
Hình 3. 10. Phổ DEPT của chất H1 ..........................................................................27
Hình 3. 11. Cấu trúc của H1: 3β-Stigmast-5-en-3-ol. ...............................................28
Hình 3. 12. Sơ đồ quy trình phân tích mẫu lô hội .....................................................29
Hình 3. 13. Sắc đồ HPLC của β-sitosterol trong dịch chiết MeOH tại tốc độ dòng
0,8 ml/phút, hệ dung môi ACN/AcOH 0,1% ............................................................30

vii


Hình 3. 14. Sắc đồ HPLC của β-sitosterol trong dịch chiết EtOH tại tốc độ dòng 0,8
ml/phút, hệ dung môi ACN/AcOH 0,1% ..................................................................30
Hình 3. 15. Mối tƣơng quan giữa diện tích pic và nồng độ β-sitosterol ...................32
Hình 3. 16. Sắc đồ HPLC mẫu trắng thiết bị ............................................................34
Hình 3. 17. Sắc đồ HPLC mẫu không chứa β-sitosterol ...........................................35
Hình 3. 18. Sắc đồ HPLC mẫu thêm chuẩn lƣợng β-sitosterol 5 ppm. .....................35
Hình 3. 19. Sắc đồ HPLC mẫu thêm chuẩn lƣợng β-sitosterol 10 ppm. ...................35
Hình 3. 20. Sắc đồ HPLC mẫu thêm chuẩn lƣợng β-sitosterol 20 ppm. ...................36
Hình 3. 21. Sắc đồ xác định β-sitosterol từ dịch chiết cây lô hội ở lần đo 1 ...........37
Hình 3. 22 .Sắc đồ xác định β-sitosterol từ dịch chiết cây lô hội ở lần đo 2 ...........37
Hình 3. 23. Sắc đồ xác định β-sitosterol từ dịch chiết cây lô hội ở lần đo 3 ...........38

viii


BẢNG KÍ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT
Kí hiệu

Tiếng Anh

Tiếng Việt

ACN

Methyl cyanide

Metyl cyanua

EtOH

Ethanol

Etanol

HPLC

High performance liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

chromatography
kl/kl

Khối lƣợng /khối lƣợng

LOD

Limit of Detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of Quantitation

Giới hạn định lƣợng

ppm

Part per million

phần triệu

RSD

Relative standard deviation

Độ lệch chuẩn tƣơng đối

SD

Standard deviation

Độ lệch chuẩn

UV

Ultraviolet

Tử ngoại

ix


MỞ ĐẦU
Nƣớc Việt Nam chúng ta nằm trong vùng nhiệt đới cho nên những điều kiện
khí hậu nhƣ nhiệt độ, lƣợng mƣa, ánh sáng…và hơn hết điều kiện thổ nhƣỡng đặc
trƣng thích hợp cho nhiều loài thực vật có giá trị tồn tại và phát triển. Đó là nguồn
tài nguyên sinh học quý giá, thuộc loại tài nguyên tái tạo đƣợc. Từ thời xa xƣa
cho đến xã hội loài ngƣời hiện nay đều khai thác nguồn tài nguyên này để làm
thực phẩm, thuốc chữa bệnh, các vật liệu cũng nhƣ nhiên liệu cho cuộc sống
thƣờng ngày.
Lô hội là một loại thực vật đƣợc sử dụng nhiều y học cổ truyền thuộc họ
Liliaceae. Hơn 360 loài lô hội đƣợc biết đến, trong đó loài Aloe vera Linne.var
Sinensis Beger tức cây lô hội lá nhỏ là loài duy nhất đƣợc tìm thấy ở Việt Nam [4].
Lô hội có hai phần chính, phần lá xanh bên ngoài chứa phần lớn các hợp chất
anthraquinon, đƣợc sử dụng nhƣ một loại thuốc xổ và thuốc tẩy nhẹ; phần thứ hai là
một lớp gel màu sáng đƣợc dùng làm thực phẩm, chữa trị vết bỏng nhiệt hay các vết
thƣơng khác [18, 22]; trị viêm da hay các vết thƣơng do côn trùng cắn [13, 19];
viêm khớp, mụn trứng cá, bệnh gout [7]; hen suyễn, bệnh do nấm Candida, chứng
mệt mỏi mãn tính, eczema, viêm loét, rối loạn tiêu hóa [19, 27, 37]. Hợp chất βsitosterol là một đƣợc tìm thấy nhiều trong thực vật trong đó có cả cây lô hội, nó là
hợp chất phi dinh dƣỡng hay còn có tên là hóa chất thực vật, với các chức năng cơ
bản giống nhƣ cholesterol trong động vật nhƣ điều chỉnh tính lƣu động của màng tế
bào thực vật và các chức năng khác trong thực vật. Các hoạt động chức năng gan
(GDP, GOP) có thể đƣợc cải thiện với β-sitosterol [39], và điều này có thể làm
giảm ung thƣ tuyến tiền liệt và tăng trƣởng tế bào ung thƣ ruột kết [7, 12]. βsitosterol cũng đƣợc chứng minh làm ức chế khả năng tăng glucose trong máu
trong thí nghiệm trên chuột đƣợc gây bệnh tiểu đƣờng type 2 do streptozotocin
gây ra [23].
Do tính chất sử dụng rộng rãi của cây lô hội hiện nay cũng nhƣ tác dụng hữu
ích của hợp chất β-sitosterol có trong cây lôi hội, nên nhiều công trình khoa học
nghiên cứu về loài cây này. Để góp phần vào việc nghiên cứu nhằm nâng cao giá trị
sử dụng của lô hội, chúng tôi chọn đề tài: ―Nghiên cứu tách và định lƣợng β1


sitosterol trong cây lô hội và dịch chiết từ cây lô hội‖ và từ đó đƣa ra hƣớng khai
thác, ứng dụng loài lô hội này trong lĩnh vực thực phẩm chức năng. Vì vậy, mục
tiêu của đề tài nhằm:
1. Xây dựng quy trình tách và định lƣợng β- sitosterol từ dịch chiết cây lô
hội
2. Từ đó đánh giá hàm lƣợng β- sitosterol trong cây lô hội và dịch chiết từ
cây lô hội

2


CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN
1.1. Khái quát về lô hội
Aloe vera thuộc họ lô hội (L.var.chinesis (Haw) Berger), chi Aloe. Chi Aloe
là chi quan trọng và đƣợc biết đến nhiều nhất, gồm hơn 400 loài, trong đó chỉ có 4
loài đƣợc sử dụng làm thuốc bổ dƣỡng và chữa bệnh, một số loài có độc tố. Hai loài
đƣợc chú ý nhiều nhất là Aloe Ferox Mill và Aloe Vera [11]. Theo sách ―Cây cỏ
Việt Nam‖ của Phạm Hoàng Hộ thì Aloe ở nƣớc ta chỉ có 1 loài là Aloe Vera
L.sinensis.Beger tức là cây lô hội lá nhỏ [4].

Hình 1. 1. Cây lô hội đƣợc tác giả trồng tại vƣờn nhà thuộc tỉnh Nam Định
và thu hoạch để làm mẫu nghiên cứu
1.1.1.Mô tả thực vật
Theo Võ Văn Chi (1991), Đỗ Thanh Hội (1997), lô hội là 1 loại cây mọng
nƣớc, sống lâu năm, không có thân hoặc thân rất ngắn, thân ngắn hóa gỗ, lá màu
xanh không cuống, mọc sát nhau. Lá dài, dễ gẫy và có gai hai bên mép, trên mặt có
những đốm trắng [2, 3].
Lô hội trƣởng thành có lá mập, dài 30-50 cm, rộng 5-10 cm, dày 1-2 cm. Lá
lô hội gồm 2 phần: phần vỏ ngoài là lớp xanh, khi cắt ngang chảy ra nhựa màu vàng
có mùi hắc, để khô chuyển thành màu đen; phần trong là phần thịt mọng nƣớc ở
3


dạng gel. Hoa nở vào mùa thu và hè, mọc thành chùm dài màu vàng lục hoặc phớt
hồng. Quả nang có hình bầu dục, lúc đầu có màu xanh, sau chuyển sang vàng. Ở
Việt Nam, lô hội thƣờng đƣợc trồng làm cảnh; lá, hoa và rễ đƣợc dùng làm thuốc.

Hình 1. 2. Vỏ ngoài và lớp gel của cây lô hội
1.1.2.Sự phân bố
Chi Aloe Vera có khoảng hơn 400 loài trên thế giới, phân bố ở vùng nhiệt
đới Châu Phi, Madagasca và Ả Rập. Ở nƣớc ta cây lô hội đƣợc trồng nhiều nhất ở
các tỉnh phía nam và ven biển miền Trung nhƣ Bình Thuận, Ninh Thuận. Lô hội là
cây có biên độ sinh thái khá rộng, thích nghi với nhiều loại đất, kể cả đất cát pha
hoặc chỉ có cát. Chúng chịu hạn và khô nóng rất giỏi vì chúng có khả năng tồn trữ
nƣớc trong lá, sinh trƣởng phát triển mạnh trong điều kiện chiếu sáng đầy đủ và ra
hoa quả nhiều.
1.1.3. Thành phần hóa học của lô hội

Có rất nhiều nghiên cứu tập trung phân lập các hợp chất trong Aloe vera và
kiểm tra các đặc tính dƣợc phẩm của chúng. Aloe vera gel đƣợc báo cáo chứa chủ
yếu các glycoprotein, anthraquinones, saccharides và chất có trọng lƣợng phân tử
thấp [33]. Các hợp chất anthraquinoes đƣợc nhận dạng trong lô hội là aloin, aloe
emodin, balaloin và emodin (bảng 1.1) với các cấu trúc thể hiện trong hình 1.3 [38].
4


Bảng 1.1.Thành phần hoá học của cây Lô hội
Nhóm chất

Hợp chất

Anthraquinones/

Aloe-emodin, aloetic axit, anthranol, aloin A và B (hay đƣợc

anthrone

gọi chung là barbaloin), isobarbaloin, emodin, và este của
axit cinnamic

Carbohydrate

Mannan tinh khiết, Mannan acetyl hóa, Gluco mannan acetyl
hóa, gluco galacto mannan, galactan, galacto galacturan,
arabino galactan, galacto gluco arabino mannan, chất pectic,
xylan, và cellulose

Chromones

8-C-glucosyl-(2'-O-cinnamoyl)-7-O-methylaloediol A, 8-Cglucosyl-(S)-aloesol, 8-C-glucosyl-7-O-methyl-(S)-aloesol,8C-glucosyl-7-O-methylaloediol, 8-C-glucosyl noreugenin, iso
aloeresin D, isorabai chromone, và neoaloesin.

Enzyme

Alkaline phosphatase, amylase, carboxypeptidase, catalase,
cyclooxidase, cyclooxygenase, lipase, oxidase, carboxylase
phosphoenolpyruvate, và superoxide dismutase

Khoáng chất vô cơ Canxi, clo, crom, đồng, sắt, magiê, mangan, kali, phốt pho,
natri, kẽm
Vitamin

B1, B2, B6, C, E, và axit folic

Chất khác, bao gồm Arachidonic acid, acid γ-linolenic, steroid (campesterol,
cả các hợp chất hữu cholesterol,
cơ và chất béo

β-sitosterol,

triglycerides,

triterpenoid,

gibberellin, lignin, kali sorbat, axit salicylic, axit uric, βcarotene, và choline, acid ascorbic.

Axit amin

Alanine, arginine, axit aspartic, axit glutamic, glycine, histidine,
hydroxyproline,

isoleucine,

leucine,

lysine,

methionine,

phenylalanine, proline, threonine, tyrosine, và valine
Protein

Lectin và chất tƣơng tự lectin

Saccharides

Mannose, glucose, L-rhamnose và aldopentose
5


Hình 1. 3. Cấu trúc của các hợp chất anthraquinone tìm thấy trong gel lô hội
1.1.4. Nghiên cứu dƣợc lý của cây Lô hội
Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng các polysaccharides trong lô hội có
khả năng kiểm soát lƣợng đƣờng trong máu, kích thích sản xuất chất chống oxy hóa
của cơ thể và giảm cholesterol. Nó làm giảm lƣợng đƣờng và triglycoside cho bệnh
nhân tiểu đƣờng [19, 21, 22,24].
Nƣớc Aloe vera giúp tăng cƣờng hấp thu các chất dinh dƣỡng và duy trì cân
bằng lƣợng đƣờng trong máu bằng cách cải thiện hoạt động tiêu hóa. Aloe vera có
thể tăng cƣờng tác dụng các loại thuốc hoặc các chế phẩm thảo dƣợc đƣợc sử dụng
với insulin cho bệnh đái tháo đƣờng [36].
Nghiên cứu ảnh hƣởng của Aloe vera lên đƣờng huyết và lipid đã cho thấy
kết quả khác nhau trên các mô hình động vật khác nhau. Trong mô hình động vật
gặm nhấm, kiểm soát mãn tính của Aloe vera với alloxan (chất phá hủy tế bào beta
của tuyến tụy - nơi tiết ra insulin) dẫn đến giảm đƣờng huyết ở chuột mắc bệnh tiểu
đƣờng. Mức độ insulin trong máu, huyết tƣơng lúc đói và làm giảm nồng độ
cholesterol, triglycerid và acid béo tự do trong huyết tƣơng, gan và thận của chuột
bị tiểu đƣờng [23, 26, 31].

6


Trong nghiên cứu thử nghiệm của Kim và cộng sự, tác dụng trị đái tháo đƣờng
của Aloe vera gel đã đƣợc nghiên cứu trên chuột bệnh béo phì (DIO). Uống gel giảm
nồng độ đƣờng trong máu đến mức độ bình thƣờng, giảm đáng kể insulin huyết tƣơng,
và hạ mức chất béo trung tính trong gan và huyết tƣơng của chuột DIO [24].
Năm 2006, Tanaka Mvà cộng sự thuộc phòng thí nghiệm nghiên cứu Sinh
Hóa, Kanagawa, Nhật Bản trong nghiên cứu đánh giá tác dụng chống tăng đƣờng
huyết của Aloe Vera đã tách đƣợc một số hợp chất từ gel. Trên cơ sở dữ liệu
quang phổ, các hợp chất này đƣợc xác định thuộc nhóm phytosterol gồm
lophenol, 24 -methyl-lophenol, 24-ethyl- lophenol, cycloartanol, và 24 methylene – cycloartanol [35].
H
H

H2C

CH3
H

H3C

H

H

H

CH3

CH3 H

H

H
HO

CH3

H3C

H3C

H

HO

H

H3C

lophenol

H

24 -methyl- lophenol
CH3

CH3
H3C
CH3

H3C

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3
HO

HO

H3C

CH3

24 - ethyllophenol

H
CH3

cycloartanol
CH2

H3C
CH3
OH

CH3
CH3

H
CH3
H3C

H
CH3

24 - methylene – cycloartanol
Hình 1. 4. Các hợp chất phytosterol có trong gel lô hội

7

CH3
CH3


1.2. Tổng quan về β-sitosterol
β-sitosterollà một phytosterol, khối lƣợng mol phân tử 414,718g/mol trong
thiên nhiên thường ở dạng ester ho ặc glycoside (hai da ̣ng này dễ hòa tan ho ̛n), hoặc
ở dạng đơn hay phố i hơ ̣p với các phytosterol khác . β-sitosterol có cấu trúc hoá học
tƣơng tự nhƣ cholesterol. β-sitosterol có màu trắng, dạng tinh thể và có mùi đặc
trƣng, không tan trong nƣớc nhƣng tan trong ancol [8].
β-sitosterolcũng đƣợc tìm thấy trong các loài lô hội, nó có cấu trúc hoá học
tƣơng tự cholesterol, trong phân tử có chứa 1 liên kết đôi rất dễ bị oxi hoá từ đó
đƣợc đặc trƣng bởi đặc tính chống ung thƣ và chống xơ vữa. Nó có tác dụng làm
giảm cholesterol trong máu do phong toả sự hấp thu cholesterol, kích thích chức
năng miễn dịch, kiểm soát sự tăng sinh tế bào. Ngoài ra, β-sitosterol còn làm giảm
lƣợng đƣờng trong máu và là tác nhân kháng khuẩn, kháng vi rút và kháng nấm. βsitosterol có nhiều trong giới thực vật và đã đƣợc tìm thấy trong các loại hạt, quả
bơ, hạt bông, lúa mì [8, 15, 29, 32].
β-sitosterolcòn là một trong những thành phần chính của một số loại thảo
dƣợc, nó có tác dụng kiểm soát hàm lƣợng cholesterol, giảm hoạt động của tế bào
ung thƣ, thúc đẩy sức khoẻ tuyến tiền liệt, tăng khả năng miễn dịch trong cơ thể
ngƣời. β-sitosterol cũng đã đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sắc kí lỏng hiệu năng
cao từ một số loại thảo mộc và dầu thực vật [20].

Hình 1. 5. Cấu trúc của hợp chất β-sitosterol
8


Trong một nghiên cứu đánh giá về khả năng kháng viêm của β-sitosteroltrên
loài chuột, các tác giả tiến hành nghiên cứu khả năng kháng viêm của βsitosterolvới hội chứng phù nề chân của chuột, chuột phù tai và viên màng phổi ở
chuột. Các kết quả thu đƣợc đều cho thấy tác dụng ức chế từ 50% đến 70% với
chuột phù nề chân, với chuột viêm phổi thì lƣợng dịch giảm tới 46%, còn với chuột
phù tai khả năng ức chế là 75%. Từ các kết quả cho thấy khả năng kháng viêm của
β-sitosterolkhá tốt [46].
1.3.Tổng quan về phƣơng pháp tách và định lƣợng β-sitosterol
Một số nghiên cứu đã tách và xác định hàm lƣợng β-sitosterol cùng với các
sterol thực vật khác bằng các phƣơng pháp sắc kí khí thƣờng hoặc có kết nối nhƣ
kết nối với đầu dò ngọn lửa, hoặc kết hợp khối phổ có kĩ thuật ion hoá điện tử nhƣ 2
nghiên cứu đƣợc trình bày dƣới đây:
TheoSorenson WR và Sullivan D [40]thì β-sitosterolđƣợc tách ra từ cây Saw
Palmetto và đƣợc định lƣợng bằngphƣơng pháp sắc kí khí với đầu dò ion hoá ngọn
lửa(GC-FID). Mẫu cây Saw Palmetto sau khi thực hiện xà phòng hoá ở nhiệt độ cao
với dung dịch KOH và dung môi ethanol, phần không xà phòng hoá có chứa những
phytosterol đƣợc chiết với toluene. Sau đó đƣợc mang đi định lƣợng bằng phƣơng
pháp sắc kí khí với đầu dò ion hoá ngọn lửa (GC-FID). Hàm lƣợng của β-sitosterol
đƣợc phát hiện ở nồng độ khá lớn, đƣờng chuẩn xác định β-sitosterol cho hệ số
tƣơng quan lớn hơn hoặc bằng 0,995, với độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD là 1,39 10,5%, hiệu suất thu hồi từ 85 – 103%.
Trong một nghiên cứu khác [43], cholesterol và 4 phytosterol trong đó cóβsitosterol đã đƣợc xác định trong thực phẩm không dẫn xuất (dầu thực vật, trứng,
sữa, nƣớc giải khát) bằng phƣơng pháp sắc kí khí kết hợp khối phổ có kết hợp kĩ
thuật ion hoá điện tử (GC-EI-MS/MS). Các mẫu phân tích đƣợc xà phòng hoá với
KOH 7,5% trong methanol, đun nóng trong thời gian 60 phút để quá trình xà phòng
hoá xảy ra hoàn toàn. Dung dịch thu đƣợc đem chiết với hỗn hợp n-hexane/ ete dầu
hoả (50:50,v/v). Dịch chiết thu đƣợc tiến hành cô quay chân không để đuổi bớt
dung môi sau đó rửa giải với tetrahydrofuran. Lớp tetrahydrofuran đƣợc lọc với
màng lọc 0,22mm và bơm vào hệ thống GC. Giới hạn định lƣợng với cholesterol và
9


4 phytosterol là 2 mg/kg. Hiệu suất thu hồi của cholesterol và 4 phytosterol từ thực
phẩm trong khoảng 91% đến 100% [42].
Trong một nghiên cứu khác [45], β-sitosterol và cholesterol đã đƣợc chiết
tách và xác định hàm lƣợng từ các mẫu dầu đậu tƣơng và dầu hƣớng dƣơng. Trong
nghiên cứu, các tác giả đã đồng nhất các mẫu dầu với Triton X-100, sau đó thêm
methanol để tạo 2 pha. Sau đó tiến hành li tâm để thu đƣợc phần chiết Triton X100, sau đó đƣợc xử lí bằng hỗn hợp nƣớc và chloroform (1000 μL:300 μL) để
chiết chất phân tích trong pha chloroform bằng hệ thống rung siêu âm. Sau khi ly
tâm, lớp chloroform đƣợc bơm vào hệ thống GC-FID. Sự ảnh hƣởng của một số
yếu tố đến kết quả phân tích đã đƣợc đánh giá. Trong quá trình tối ƣu hoá các điều
kiện thực nghiệm, khoảng tuyến tính của phƣơng trình đƣờng chuẩn trong khoảng
1,0 – 30,0 mg/L, với hệ số tƣơng quan là 0,994 cho các chất phân tích. Giới hạn
phát hiện của phƣơng pháp nằm trong khoảng 0,2 – 0,7 mg/L. Giới hạn định lƣợng
trong khoảng 0,7 – 2,4 mg/L. Trong cùng ngày, độ lệch chuẩn tƣơng đối trong
khoảng 1,0 đến 2,7%. Các điều kiện phân tích đã đƣợc áp dụng thành công và cho
kết quả đáng tin cậy trong việc xác định hàm lƣợng β-sitosterolvà cholesterol trong
mẫu dầu đậu nành và dầu hƣớng dƣơng. Hiệu suất thu hồi trung bình dao động từ
93,6% đến 105,0%
Ngoài ra β-sitosterolcòn đƣợc định tính bằng phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng,
sau đó định lƣợng bằng phƣơng pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao, hoặc định lƣợng
bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao với các loại detector, và các loại dung môi pha động
khác nhau nhƣ:
Susmlta Chawla và Yogendra Kumar Bansal [41] đã định tính và định lƣợng
β-sitosterol từ việc nuôi cấy in vitro vỏ thân và vỏ của cây Helicteres Isora L. Trong
nghiên cứu này, dung môi chiết axetone đƣợc sử dụng cho phƣơng pháp sắc kí lớp
mỏng với thành phần pha động là toluene : diethyl ether : ethylacetate : axit acetic
(80:10:10:0,2) đã định tính đƣợc sự có mặt của β-sitosterol. Sau đó sử dụng phƣơng
pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) định lƣợng đƣợc β-sitosterol tại bƣớc sóng
196nm.Hàm lƣợng β-sitosterol tối đa đƣợc xác định trong thân và vỏ của cây
Helicteres Isora L bằng nuôi cấy in vitro là 0,18%.
10


Một báo cáo cũng đã đƣợc đƣa ra về sử dụng phƣơng pháp HPLC để phân
tích β-sitosterol trong một số dƣợc liệu và dầu thực vật. Báo cáo cho thấy phƣơng
pháp HPLC là phƣơng pháp thích hợp để xác định β-sitosterol. Một số điều kiện về
thành phần pha động đã đƣợc bài báo đƣa ra với các mẫu phân tích khác nhau. Phân
tích hàm lƣợng β-sitosteroltrong mẫu β-sitosterolchuẩn và viên nén βsitosterolđƣợc thực hiện với thành phần pha động là 100% acetonitril ở pH 6,5 cho
thấy thời gian lƣu là 67,25 và 67,89. Với thành phần pha động là 95% acetonitrile
và 5% ethanol cho thấy thời gian lƣu đều là 55,75 với 85% acetonitrile và 15%
ethanol cho thấy thời gian lƣu lần lƣợt là 36,23 và 36,81. Trong một số loại dầu
thực vật, khi xác địnhβ-sitosterolthì tài liệu cũng đƣa ra thời gian lƣu nhƣ: với dầu
mầm lúa mì là 36,91; dầu hạt bông là 36,21; dầu đậu phộng 36,12 [41].
Nair VD, Kanfer I và Hoogmartens J[42] đã định lƣợng đồng thời
stigmasterol, β-sitosterolvà stigmastanol trong các loại thảo dƣợc bằng phƣơng
pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao với detector ELSD. Các hợp chất đƣợc xác định trên
hệ thống HPLC, pha tĩnh là cột C18, pha động là methanol: nƣớc (95:5 v/v), tốc độ
dòng 1ml/phút, với thời gian lƣu là 12 phút. Trong nghiên cứu các tác giả đã sử
dụng cholesterol (50 microg/ml) là chất chuẩn nội, methanol là dung môi chiết tách.
Các thông số giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) là 2 và 5
microg/ml. Giá trị độ lệch chuẩn (%RSD) 3%, hiệu suất thu hồi từ 97 đến 103% khi
phân tích 5 sản phẩm thảo dƣợc. Từ đây, các tác giả đã nhận định phƣơng pháp này
có thể đƣợc dùng để khảo sát các sản phẩm thảo dƣợc có sẵn công thức nhằm kiểm
soát chất lƣợng sản phẩm.
Bên cạnh đó β-sitosterolcũng đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sắc kí lỏng
hiệu năng cao với kĩ thuật ion hoá tia điện và kết hợp với khối phổ nhƣ ở nghiên
cứu sau đây: Hàm lƣợng các phytosterol tự do (cholesterol, ergosterol, stigmasterol,
β-sitosterol) đã đƣợc xác định từ lá cây thuốc lá bằng phƣơng pháp sắc kí lỏng siêu
hiệu năng với kĩ thuật ion hoá tia điện kết hợp với khối phổ. Việc tách 4 phytosterol
trên đƣợc thực hiện trên hệ pha đảo cột C18, trong thời gian là 6 phút. Kỹ thuật ion
hoá tại áp suất khí quyển (API) đƣợc sử dụng kết hợp với phổ khối cho thấy hiệu
quả cao trong việc phân tích. Quá trình định tính và định lƣợng các chất phân tích
đƣợc thực hiện ở chế độ khảo sát đa phản ứng (MRM), từ đó cho hiệu suất thu hồi
11


khả quan, dao động từ 86,3% đến 106,4% ở nồng độ thấp trong lá thuốc lá. Độ
chính xác của phép đo trong ngày và độ chính xác của phép đo giữa các ngày trong
khoảng 0,43% và 2,42%. Giới hạn định lƣợng (LOQ) là 4,8 đến 9,7 ng/mL. Từ đó
nhóm tác giả nhận định đây là phƣơng pháp đơn giản, có độ nhạy cao, thời gian
phân tích nhanh cho quá trình phân tích các phytosterol tự do trong lá thuốc lá [44].
Nhƣ vậy trong rất nhiều nghiên cứu đã chỉ ra nguồn gốc thực vật của βsitosterol, nhƣ có trong các loại hạt, quả, và đặc biệt có trong cây lô hội, một loại
cây rất dễ trồng và đƣợc trồng khá phổ biến ở Việt Nam, cùng với những lợi ích
đáng kể của β-sitosteroltrong hỗ trợ điều trị một số chứng bệnh, chúng tôi nhận
thấy việc phân tích đánh giá hàm lƣợng β-sitosteroltrong dịch chiết cây lô hội và
cây lô hội là rất cần thiết. Theo điều kiện phòng thí nghiệm cùng với việc nghiên
cứu các tài liệu tham khảo, chúng tôi đã lựa chọn phƣơng pháp sắc kí lỏng hiệu
năng cao làm phƣơng pháp phân tích. Hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao Agilent
1200, detector PDA (max = 210nm), cột C30 (5μm; 4,6 x 250mm). Khi tiến hành
phân tích bằng phƣơng pháp HPLC chúng tôi tiến hành khảo sát các yếu tố thành
phần pha động và thời gian lƣu của chất phân tích. Để tách β-sitosterolra khỏi cây
lô hội chúng tôi dự kiến chiết bằng phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng với các dung môi
phân cực nhƣ các ancol, và chúng tôi dự kiến khảo sát các loại dung môi chiết để
phân tách β-sitosterol.

12


CHƢƠNG 2 -NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tƣợng nghiên cứu là phần gel của lá cây lô hội đƣợc nuôi trồng ở vƣờn
nhà tại tỉnh Nam Định và đƣợc thu hái vào tháng 9/2017.

Hình 2. 1. Mẫu lá cây lô hội
Mẫu thực vật đƣợc xác định là loài Aloe Vera Linne. var Sinensis Beger bởi
giáo sƣ Nguyễn Thế Nhã, Khoa Quản lý tài nguyên rừng và môi trƣờng, ĐH Lâm
Nghiệp, Hà Nội kết hợp với tham khảo tài liệu.
2.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
+) Thiết bị
- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1200, detector PDA.
- Cột sắc ký Acclaim C30 (250mm × 4,6mm × 5μm) hãng Thermo.
- Máy lắc xoáy (vortex) VELP.
- Máy ly tâm MIKRO 22R có thể đạt đƣợc tốc độ tối thiểu 4000 vòng/phút
với ống ly tâm 50 mL.
- Cân phân tích (có độ chính xác 0,1mg và 0,01mg) (Metter Toledo).
- Máy cất quay chân không có bể điều nhiệt Buchi, rotavapor R215.
- Sắc kí bản mỏng silica gel tráng DC Alufolien 60F254.
- Máy Bruker AM x 500, TMS (tetrametyl silan)
13


+) Dụng cụ
- Cốc có mỏ dung tích 50, 100, 200mL.
- Ống đong dung tích 10,50, 100 mL.
- Micropipet loại 10 µL, 200 µL, 1000 µL,và đầu côn tƣơng ứng.
- Ống ly tâm 50 mL.
- Màng lọc 0,45 µm.
- Vial loại 10 mL.
- Bình định mức thuỷ tinh loại A dung tích 10, 25, 50, 100, 500 mL.
- Ống nghiệm thủy tinh
+) Chất chuẩn
- Chất chuẩn: 10 mg β-sitosterol độ tinh khiết 98% đƣợc cung cấp bởi viện
Hóa sinh biển, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Độ tinh khiết của hợp chất
đã đƣợc xác định bằng các phƣơng pháp vật lý.
- Dung dịch chuẩn gốc β-sitosterol 500 ppm: cân chính xác 5,1021 mg chất
chuẩn β-sitosterol bằng cân phân tích có độ đọc là 0,0001g, hòa tan và định mức tới
10 mL bằng ACN. Bảo quản trong tủ lạnh 40C, thời gian 4 tuần.
+) Các loại hóa chất, dung môi khác:
Methanol (Merck 99,9%), Acetonitril (Merck 99,9%), acid acetic băng (Merck),
ethylacetat (Trung Quốc), n-hexan (Trung Quốc)...Nƣớc cất hai lần, nƣớc cất deion.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phƣơng pháp chiết tách β-sitosterol từ dịch chiết cây lô hội
2.3.1.1. Điều chế các cặn chiết từ dịch chiết cây lô hội
β-sitosterollà một hợp chất thuộc nhóm steroid, có độ phân cực thấp, vì vậy
nó tan tốt trong các dung môi hữu cơ có độ phân cực kém nhƣ benzene, diethyl
ether, n-hexan, toluene, chloroform, ancol...Lá lô hội có đặc điểm có lớp vỏ khá dày
và phần gel chứa một lƣợng nƣớc khá lớn, đồng thời là mẫu thực vật có chứa rất
nhiều các hợp chất hữu cơ thuộc các lớp chất khác nhau nhƣ phân cực trung bình và
rất phân cực, vì vậy việc loại bớt các hợp chất này là cần thiết để làm giảm khả
năng ảnh hƣởng của chúng đến quá trình phân tích, từ đó việc chọn phƣơng pháp
chiết lỏng-lỏng là phù hợp. Do trong mẫu thực vật có chứa nhiều các hợp chất hữu
cơ nên trƣớc hết phải dùng một dung môi có độ phân cực cao để tách toàn bộ phần
14


hữu cơ ra khỏi phần vô cơ và các chất xơ của mẫu thực vật. Từ đó chúng tôi tiến
hành khảo sát loại dung môi chiết mẫu thô ban đầu, cụ thể là 2 loại dung môi
ethanol và methanol. Sau đó tiến hành chiết dịch chiết ethanol và methanol với
dung môi có độ phân cực kém. Qua tham khảo các tài liệu 42, chúng tôi lựa chọn
dung môi chiết lần 2 là n-hexan và khảo sát cấu trúc của các hợp chất có thể phân
lập từ các cặn chiết n-hexan. Quy trình điều chế cặn chiết n-hexan đƣợc thể hiện ở
sơ đồ dƣới đây:

Hình 2. 2. Quy trình điều chế các cặn chiết n-hexan
2.3.1.2. Xử lí mẫu nghiên cứu
15


Thu hái khoảng 2 kg lá lô hội, rửa sạch, tráng bằng nƣớc cất sau đó phơi khô
trong bóng râm cho ráo nƣớc trong. Tách lấy phần gel lô hội khỏi lớp vỏ xanh, phần
gel lô hội đƣợc sấy khô trong tủ sấy ở 45oC trong 24 giờ, sau đó để nguội và cân
trên cân phân tích đƣợc khối lƣợng thô gel lô hội (mthô = 104,1089g). Tiến hành
ngâm gel lô hội thô trong 2 loại dung môi là methanol và ethanol, rung siêu âm 30
phút ở nhiệt độ 40oC để giúp quá trình hoà tan các chất phân tích dễ dàng hơn. Sau
đó lọc lấy dịch chiết 3 lần và gộp dịch chiết. Tiến hành cô quay dịch chiết ở áp suất
thấp để loại bớt dung môi (Büchi, Rotavapor R215). Các dịch chiết methanol và
ethanol thu đƣợc lại mang chiết với dung môi n-hexan. Dịch chiết này lại đƣợc cô
quay ở áp suất thấp để loại bớt dung môi thu đƣợc các cặn chiết ở dạng cao lỏng
tƣơng ứng n-hexan là cặn EH. Sau đó tiến hành xác định thành phần và phân tích
hàm lƣợng trong cặn EH.
2.3.1.3. Phân lập β-sitosterol từ cặn chiết cây lô hội
β-sitosterol là một hợp chất thuộc nhóm steroid, có độ phân cực thấp, vì vậy
theo dự đoán hợp chất này sẽ nằm chủ yếu trong cặn chiết n-hexan EH, nên chúng
tôi tiến hành phân lập β-sitosterol từ cặn chiết EH.
Trƣớc khi thực hiện phân lập β-sitosterol từ cặn chiết n-hexan (EH) bằng
phƣơng pháp sắc ký cột thƣờng CC, việc khảo sát hệ dung môi tách tốt nhất trên sắc
ký lớp mỏng TLC để có thể thu đƣợc các hợp chất tinh khiết là điều cần thiết. Tiến
hành khảo sát các cặn chiết trên sắc ký lớp mỏng TLC: sử dụng bản mỏng silica gel
tráng DC Alufolien 60F254 để khảo sát hệ dung môi tách tốt nhất cho các cặn chiết.
Sau khi triển khai sắc kí, quan sát sắc ký đồ dƣới ánh sáng tử ngoại (bƣớc sóng  =
254 nm) và phun thuốc thử vanillin sunfat 1% lên lớp mỏng và hơ nóng, đanh dấu
các vết tách hiện trên TLC, nhận thấy cặn chiết EH tách tốt nhất với hệ dung môi nhexan/etylacetat 19:1 (v/v). Sau đó tiến hành tách cặn chiết thành các phân đoạn
trong trên sắc kí cột nhồi silicagel bằng phƣơng pháp rửa giải gradient với hỗn hợp
dung môi khác nhau, và triển khai sắc kí lớp mỏng TLC để gom các phân đoạn
giống nhau.

16


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×