Tải bản đầy đủ

Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng ức chế sinh trưởng một số vi sinh vật gây bệnh thực vật và đặc tính sinh học của chúng

Đạ I h ọ c q u ố c g ia h à n ộ i
TRUỒNG ĐAI HOC KHOA HOC T ự N H IÊ N

TUYẾN CHỌN CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NẢNG
ỨC C H Ế S IN H T R Ư Ở N G M Ộ T s ố VI S IN H V Ậ T G Â Y B Ệ N H
T H Ự C V Ậ T VÀ Đ Ặ C T Í N H S IN H H Ọ C C Ủ A C H Ú N G

MÃ SỐ: Q T 0 3 -2 3
C H Ú TRÌ: T H Ạ C SỸ N G U Y Ẻ N K IỂU IÌẢNG TÂ M

ĐẠI HC
TRUNG T

J

HẢ N ỏ ĩ 2005

I


Ket-noi.com

Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
MỤC LỤC

Mớ đ riu.................................................................................................................................................. 5
Chư ơ ng I. T ổ n g q u a n tài l i ệ u .................................................................................................................... 6
1.1 Bệnh h é o x a n h do vi k hu ẩ n P s e u d o m o n a s s o ỉ a n a c e a r u m và h é o vàiiíĩ do vi ná m
Fusarium o x ysp o ru m ....................................................................................................................... 6
] .2.

Giới thiệu c h u n g về q u á trì nh Nilrat h o á .......................................................................... 10

1.3. X ạ k h u ẩ n và khả n ă n g ức c h ế vi sính vật g â y bệ nh ở c â y t r ổ n e ................................. 1 I
Chươ ng II. Đối tư ơng và p hư ơ ng p h á p nghiên c ứ u ...................................................................... !4
2.1. Các c h ủ n g vi s inh vật d ù n g t rong nghi ên c ứ u .................................................................. 14
2.2. P hư ơn g p h á p n g h i ê n c ứ u ............................................................................................................ 14
Chươ ng III. Kết q u ả và t hả o l u ậ n ......................................................................................................... 19
3.1. K h ả n ă n g ức c h ế c ủ a các c h ủ n g xạ khưán với vi n ấ m Fusciriitni o .w s p o r u m .... 19
3.2. Khả n ă n g ức c h ế c ủ a xạ kh uẩ n đối với vi khẩn nitrat h o á ...........................................24
3.3. K h ả n ă n g ức c h ế c ủ a các c h ủ n g xạ khiúỉn dối với vi k h u ẩ n hé o xa nh
P s e u d o m o n a s s o l c m a c c a n i m ................................................................................................... 27
Kết l u ậ n ..............................................................................................................................................................33
Tài liệu ih a m k h a o ........................................................................................................................................34
Phu l u c ............................................................................................................................................................... 35

4


MỞ ĐẨU
Vi sinh vật là mộl thế giới sinh vật vô cùng nhỏ bé mà la không quan sát thây bằng mãt
thường. Nó phân bố ở khắp mọi nơi trong đất, nước, không khí, trong thực phfim . . Vi sinh vật
có vai trò quan trọng trong thiên nhiên cũng như trong cuộc sống, nó tham gia vào các vòng
tuần hoàn vật chất (rong tự nhiên, trong các chuỗi thức ãn. Con người đã biêt ứng dụng vi sinh
vật trong sản xuất và đời sống từ rất lâu. Đăc biệt, ngày nay khoa học

kỹ thuật phát triển



người ta đã tìm ra những tru điếm của vi sinh vật để sử dụ ns c húng vào việc bảo vệ môi trường
vã thiết lập cân bằng sinh thái.
Trong thiên nhiên ngoài những nhóm vi sinh vật có ích còn có những nhóm vi sinh vật
gây hại. Một trong những nhóm bệnh phổ biến thường xuyên xuất hiện và gây hại c ho cây
liồng trên đồng ruộng 1Ì1 nhóm bệnh hco xanh do vi khuẩn P seudom onas soluiiíH eriitm và héo
vàng do vi nấm Fusariimi oxvsporum gây ni. Ước tính thiệt hại c ho sán xtiàt cây trổng do
bệnh héo xanh vi khuẩn P seudom onas solaiiaceai iim gây ra là 1590-95% |4 | và héo vàng do
nấm Fusariiini oxysporium làm giảm năng suất từ 40%-80%. Một số biện pháp chọn giống
kháng bênh, biện pháp canh tác, hiện pháp hoá học và biện pháp sinh hoc đã được áp dụng
nhưng hiệu quả không cao. Xu hướng hiện nay là lựa c họn những c hủng vi sinh vật có tính đối
kháng đặc hiệu như xạ khuẩn đế ức chế và tiêu diệt những vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng
mà không ảnh hưởng đến hệ sinh thái đất.
Xa khuẩn là nhóm vi sinh vật phân bố tương đối rộng rãi trong đất, có khá năng sinh chãi
kháng sinh cao (80% số xạ khuân có khá năng sinh kháng sinh) và có khá năng ức chế chọn
Iọc 1161. Chính vì những lý do trên chúng tỏi dã chọn lựa dề tài " Tuy ển chọn các clnìng x;i
khuẩn có khả năng ức chế sinh trưởng một số vi sinh vật gây bệnh thực vật và đãc tính sinh
học của cluing".

5


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
C H Ư Ơ N G I. TÒ N G Q U A N TÀI LIỆU

1.1 B ệnh h éo x a n ìi do vi kh u ẩn P seu d o m o n a s so la n a cea ru in và h éo vàn g do vi nấm
F u sa riu m ox ysporu itì.
1.1.1 Bản chát cúa hỉện tưựng bệnh héo do vi khuấn Pseudom onas solanucearum Ml vi
nấm Fusarium ơxysporium .
Các tác nhân gây bệnh xàm nhiễm vào hệ thông bó mạch dẩn cíia rể, thân, cành, [á.
Chúng phá huỷ vít lắc bớ irụicli dẫn, linh Ilifting đốn quá trình vân chuyển nước và các cbât
dinh (lưỡng. Bỏ mạch dẫn hoá mầu nâu, thân clcn và dẫn đến cây héo rũ nhanh chóng cày héo
xanh và chếtị 1 1 |.
Ọuá trình kí sinh gây bệnh có thê phá hoại cơ giới, sinh lí và lí học cùa cây, phá hoại lớp
vò bọc ngoài làm cho cây bị bốc hơi mạnh, vì vậy việc cung cấp nước sẽ không kịp trong khi
trọng lượng khô của cây vail cứ tăng lên, do cỉó dẫn đến dẫn đến hiện tượng cây nhăn nheo và
héo rũ 11 11.
Các vi sinh vật gây hại hệ thống rẻ, mạch dãn đã phá huỷ ch ế độ mrức của cây bằng cách
vít tắc bó mạch dẫn. Cây không có khá năng hút nước và vận chuyển nước. Bó mạch dẫn bị
tắc có thể do một số loài nấm (hường phát triển nhanh trong bó mach hoặc do các chất nhờn
và do các tế bào vi khuẩn ứ đọng lại. Kết quá của quá trình xàm nhiễm đó là cây héo[ ] 1Ị.
Trong quá trình kí sinh xám nhiỗm gây hại cây trồng, các vi sinh vật thường tiết ra các
dộc lổ. Các dộc tổ dó có lác dụng phá huỷ chế độ Ill'll nước và vận chuyến nước của ciìy. làm
si ám khả năng «iữ nước của tố bào. Phá lui ỷ khả nâng bán thấm cuả màng nguyên sinh chất,
đáu dỏc. ni ỐI chết 171ó lé bào cày ký chủ, lííìy hiện tương hco rũ và lùm cho cây héo chốt| 1 1 ị.
Các loài vi sinh vật trong dát, nhóm lác nhàn gáy héo rũ chú yếu ớ vùng lẻ, gốc thân
sát mặt ciàt và hệ thốn” bó mạch hâu hốt là các loài da ihưc, phạm vi kí chu rón” Ihuộc các
-nhóm kí sinh và hoại sinh điên hình. Tuỳ theo loài cây kí chú, giai đoạn sinh trướng, thành
phần cơ giứi đất, nguồn bệnh, chế độ phân bón, chế độ chăm sóc, ch ế độ luân canh và điểu
kiện imoụi cánh mà các loai bệnh héo rũ có thê xuất hiện, gây hai ứ các thời điểir. kh;íc nhau,
tác hại c ũ II” khác nhauị ỉ |.
1.1.2. Một sò dặc điếm hình thái và sinh li của vi khuẩn Pseudom onas soỉanacearum và
vi n a m ư u s a r iu m o xysporum .
Vi khtũin Psetuỉomoìnts sohiiiiiceiinmi là loại vi khuẩn có cấu lạo hình gậy, hiếu khí. Vi
k l u i ẩ n c ó 1-3 t i ê n m a o , h a i drill hưi t r ò n , t h u ộ c g r : i m â m [ 1 3 | .

Trên mõi Irườiig SPA(Sucrose Pcptonacar), vi khuân hình thành khuâVi lac nho tròn
nhan bóim và cỏ mầu [rang kem. Trên mòi trường TTC (2,3,5-Triphenyl-Tclrnroliman-dorit)
khuẩn lạc có mầu trắng sữa xung quanh và ờ giữa khuẩn lạc điểm mầu hổng nhạiI ỉ 3 Ị. Vi
k í uũm n à v c ỏ t í nh đ ộ c c;io h a y t h à p đ é u c ó c;íc rìa l ỏ n e n h ó vá l u ô n c h u y ế n đỏn<’| 131.

Vi khiiiUn CO the hình thìinh axít, không tao khí trong mõi trường có "lu co /a v i r c i r n / I
lacto, m;i!lo v;i glyxcrin |6 |. Elliot, 1^51(5] cho King vi khuân này khỏnti hình thành axil (roil'’

6


môi Irường có các loai dường nói Ircn. Cliíing có thổ sử tiling các nguon cacbon sau day:
glucoza, saccaroza, glyxerin, xitratnatri, pepton, tyrozin, asparagin và axil glutamic.
Nấm Fusarium o.xysporitm là loài nấm dất, là nhóm bán ký sinh, bán hoại sinh diên
hình, có phạm vi ký chủ rộng, gây nhiễm trên nhiều loại cày khác nhau thuộc họ cà, họ dậu,
họ bầu, bí, họ chuối. Triệu chứng dicn hình do nấm gây ra là hco bó mạch, cây héo vàng và
chết. Nhiều loại bệnh héo có ý nghĩa kinh tế lớn, gây thiệt hại không nhỏ đối với sán xuât ran
màu trong điều kiện nhiệt đới, cận nhiệt đới.
Sợi nấm phát triển mạnh, da bào, tán nấm phát triển có mầu trắng hổng đến màu tím
violet hoặc tím đậm. Loài nấm Fusarium oxysporum gây héo vàng cây trồng cạn có 3 loại bào
tu.
Bào tử lớn thường hình thành nhiều, kích thước bào tử ngắn, trung bình hoặc dài, phần
lớn có 3 - 4 vách ngăn ngang, một đầu hơi nhọn hoặc thon nhỏ, mội đầu hình bàn chân.
Bào tử nhỏ hình thành nhiều, hình dạng bào tử thay dổi có thể hình oval, ẽlip hoặc quá
thận đơn bào, nhưng cũng có khi có một vách ngăn.
Bào tứ hậu vỏ dày do các sợi nấm tạo thành.
Dưa vào đặc điểm hình thái bào tử lớn, bào tú nhỏ và bào tử hậu người ta có ihế chuấn
đoán, giám định các chủng cỉia loài Fiisnritmi o.Yvspornm gây bệnh héo vàng trên nhiểu loại
cây trồng khác nhau.
Sir lan truyền của bệnh héo vàng trên dồng ruộng nhờ gió, mưa. nước, tưới, vậ! liệu
giống nhiễm bênh. Níuiồn bênh tổn tai dưới dan" sơi nấm và các loai hào tử tiong đài, trong
làn dư, tron 5 hat giống, cây giống củ e,iốii” và các cây ký chủ phụ, cỏ dại [ 3 1.
1.1.3. Triệu chứng gây bệnh eúa vi khuẩn Pseudomonas solanacearum và vi nám
Fusarium oxysporum.
Triệu chứng gây bệnh của vi khuẩn Pseudom onas saianacearuD)
Bệnh 'có cá ớ cây non và cây trưởng thành, ở mọi giai đoạn sinh trướng cứa cây. Ó
aiai đoạn đầu khi rể non mới chớm bệnh thì biếu

hiện trước tiên là lá vàng nhẹ,

biếu

hiện

vàní’ nhẹ ở phần gốc cây sát ngang bề mật đất. Kổ từ khi !á bị vàng nhẹ bệnh sẽphát triển rất
nhanh, cây non thì toàn bộ lá sẽ bị héo rũ nhanh chóng và cây khô chết. Còn ờ cây trưởng
thành, ban đầu một số lá sẽ bị héo rũ xuống sau đó một số nhánh trên cây rũ xuốnq. Sau vài
lỉiừ toàn bộ thân SC rũ xuống nhưng van có mầu xanh.
X r i ê u chírnạ, g â y b ệ n h c í ia vi n â m FiisariKil l o x v s p o n i m .

Chủ yếu là làm chết tế bào, tao thành vết bệnh Irên ihân, lá, hoa và tr;íi. Chúng xuất hiện
ờ liên cây trưứnq thành và ờ mọi giai đoan CLÌa cây. Đáu tiên chúng xâm nhiễm qua nhu mõ và
bó mạch dẫn làm cho iluìn có máu nâu iioạc nâu xám khi die II kiện thuận lợi làm cho phán
thân sát đất khò xám, tóp lại, hí héo vàng từ các lá gốc phát triển lén các lá phía trên. Cuối
cùng dẩn tới toàn cày héo vàng và diet. Bó mạch dẫn biến màu nàn, nâu đen, thấy có một lớp
nấm mỏng màu trắng, trắng hổns, trên bé mật vết bệnh Ị 1 ].

7


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
1.1.4. Ánh hương của đỉéu kiện ngoại cảnh đến sinh trương và phát triển cúa vi khuán
Pseudomonas solanncearum và vi nấm Fusarium oxysporum.
Quá trình sinh trưởng cũng như mức dộ gây hại của vi khuẩn và nấm nói chung plui
thuộc rất nhiều vào yếu tô' ngoại cảnh hay sinh thái môi trường.
Độ thoáng của đất và ch ế độ bón phân cho đất có ihê làm tăng hay giám vi khuân Hunt:
đất. Vi khuẩn (ổn tai ở đất ẩm, thoáng khí, bị kìm hãm ử đất khô và ngập nước nên bệnh
thuờng gáy hại ả đất có tưới nước, đất đổi thấp và đất cát ven sông [6|. Bón phân với liều
lượng cao cũng taọ điều kiện cho vi khuẩn phát triển. Bón nhiều đạm cho cây sẽ làm giảm khá
năng tích !uỹ linh bột và giảm khả năng chống chịu bệnh |6]. Còn với vi nấm Fnsariitm
oxyspơrum độ thoáng của đất và chế độ bón phân cho đát có thể làm tăng hay giảm lượng vi
nấm, khi đất đủ độ ẩm, thoáng khí như đất cát pha bạc màn và thịt nhẹ sẽ có xu hướng tâng
mức độ nhiễm bệnh. Loại nấm này phân bố rộng trong các loại đất trổng trọt, đất cỏ có phổ kí
chủ rộng bao gồm hơn 100 dạng chuyên hoá và chủng gây héo vàng dối với nhiều loại rau
mầu, bầu bí, dưa chuột, hổ tiêu, chuối, cây hoa và nhiều loại cây cảnh khác.
Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn lương dối cao lừ 25°C- 35nc , nhiệt độ tối thiêu là 10"c
và nhiệt độ (ối da ỉà 41nc . ớ nhiệt độ 52"c sau 10 phút vi khuẩn

SC

chổi Ị 131. Nliiệl độ cao lừ

25°C-35°C làm tăng sự sinh sản và mật độ của vi khuẩn vào đất, tăng kha năng xâm nhập và
phát bệnh dối với cây chủ. Nhiệt độ đất lớn hơn 25"c ở độ sâu 5cm cùng với đó ẩm lớn hơn
60% (huân lợi cho bệnh phát trie’ll[ 41. Độ ẩm đất và tính chãi đất quyết dinh đôn sự sinh
inrởng và phát triển CỈUI quần thể vi sinh vật đối kháng có trong đất và các quần thổ vi sinh vật
dối kháng dó làm lổn thương lới sự lổn lai và phái liicn của vi kluiấn hco xanh.
Mua nhiều bệnh phát iricn và lan rộng liơn vì nước mưa và gió sẽ làm bắn vi khuẩn
sang cây khoe. Sau khi mưa to thời tiết nóng lén sẽ tạo điều kiện cho bệnh phát triến mạnh và
gày thiệl hại nghiêm trọng cho cây trổng [16],

Nấm truyền lan theo nước (ưới và nhờ gió,

lượng mưu quá lứn cũng là điều kiện thuận lợi cho nấm sinh trưởng và pliál tricnl 11.
1.1.5. Sự xâm nhập cua vi khuẩn Pseudomonas soỉanacearum và niim Fusarium
nxysporium.
Vi khuẩn P seudom onas sohm ưceantm là loại vi khuẩn có thể chuyến động dễ dàne và
có thế gày hại cho 200 loài thực vật khác nhau [4], Cùnq là loài vi sinh vật gây héo rũ nấm
Fusarilim oxvspotiitm với hơn 100 dạng chuyên lioá khác nhau gây hại cho I ất nhiều loại cây
trồng có giá trị cao kể cả các toài cây ăn t]ủa như nhãn, quýt tiều..[2|, khá nano xâm nhập cua
nam vào cãy trổng cùng Iilnr của vi kliiiâii là hcì sức mạnh mõ và hang nhiều con đírờng khác
nhau.
Côn trùng, sáu hạ i:
Côn trùng và sâu hại mang vi khuẩn và nấm gây bệnh từ nơi khác đến rồi chích hút vào
cây chủ, hay qua các vết chích lún của luyến trùng chúng dẻ (làng xâm nhập vào cây chú.
Trên thực tế côn trùng gây hại trên diện rộng nên kéo theo sư lan truyền rất nhanh vi khuẩn vì
nấm gây haị ờ quy mô lớn.
Qua các vi sinh vật sống tron LI đất:

X


Một sô loài sinh vật sống trong đất như giun, ốc sên, kiến...làm tổn thương và biên
dạng bộ rễ, tạo điểu kiện dẻ dàng cho vi khuẩn và nấm là những loại tiềm sinh trong dát xâm
nhập vào rễ. Chúng xâm nhập vào nhu mô cùa rễ, gốc thân sau đó xâm nhập vào bó mạch,
thường làm cho gốc thân nứt vở[ 1 Ị.
Do tác dộng cùa COI1 người:
Các hoat động của con ngưừi nhir vun, xới, tia cành, bấm ngọn, làm cò....cũng có the
làm lây lan vi khuẩn và nấm cho cây trồng. Ngoài ra khi vận chuyên hạt giống cũng

có thể

các hạt giống dược vận chuyển từ nơi có bệnh sang nơi khổng có bệnh.
Xám nhập qua lỗ hở tự nhicn trcn cây:
Vứi khả nâng gây bệnh mạnh mẽ cluing còn có thể xâm nhập vào cày qua các lỗ khí
khổng, thuỷ khổng, các mắt của chồi non, của thân cây con...Đặc biệt qua các lỏ khí khổng là
con đường xâm nhập phổ biến của nấm và vi khuẩn.
i
1.1.6. Hiện pháp phònỊỊ trừ bệnh
Việc tìm ra biện pháp phòní? chống bệnh héo xanh và héo vàng do vi khuân và vi nấm
gây ra hiện nay vẫn còn gặp nhiều khó khăn và phức tạp. Khả năng tốt nliàt là áp dụng các
biện pháp phòng trừ tổng hợp, chú dộng sớm.
Gíc biện pháp phòng trừ chủ yếu hiện nay dang dược áp dụng là:


Biện pháp canh tác

Luân canh để giảm thiệt hại do vi nấm gây héo vàng là biện pháp được dưa ra ngay từ
khi phát hiện bệnh(đầu năm 1896). Nhiều loại cây phi kí chủ phi luân canh với lạc và các cây
họ cà có thể giám tý lệ gây hại và mức độ thiệt hại của bệnh. Việc luân canh cây phi kí chú
như ngô, lúa, mía, bỏng là một biện pháp kiểm soát bệnh. Có thể luân canh khoai lây, cá chua
với lúa nước, ngỏ những cây không phủi là kí chú của bệnh (rong 1-2 nãm. Đối với vùng dái
có nước tưới hoặc niira lớn thì việc luân canh với lạc hoặc các cây họ cà với lúa là tốt nhát,
vùng khỏ hạn luân canh với ngô, cao lương cũng giảm đáng kể thiệt hại do bệnh gây ra. Xứ lý
đất và cải tạo đất bằng việc bón tăng cường phân chuồng, can xi, lưu huỳnh cũng đem lại kết
C]uủ dánq kể (7 Ị. Việc bổ sung các chất hữu cơ và các chất vò cơ làm tăng hoạt dộng của các vi
sinh vật dối kháng cho cây. Don sạch cỏ dại chọn đất dai thời vụ phù hợp với mỗi vùn" sinh
thái Irons’ trọi |31.


Biện pháp khoa học

Giai đoạn tiếp theo nmrời tít đã sử dụng các loại thuốc bào vệ thực vật đê diệt trừ sâu
bệnh cũng như vi nấm. Có thế nói lron« thời gian đầu các loại hoá chất được coi là cứu linh
nền nòng nghiệp. Song do lính liêu diệt hàng loạt của nó mà các sinh vặt có ích với cây iron-'
{phân giải lân, cố định d ạ m . . . ) cũ na liệu diệt dần đến đất đai dỗ bị thoái lioá, sinh vâi bi tiêu
diệt gfly mất cán bủnc sinh thái, ô nhiỗm mỏi trường đất, nước, không khí. Chính vì vậy ni l
trong mấy năm gần dây các giải pháp sử dung chế phẩm sinh hoc claim dược khuyến khích
nhầm hạn chẽ' lioá chất bao vệ tlụrc vật.


Sử c!ỊI n q c ion o chõ im bệnh.


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
Chọn lọc lai tạo giống cây đè’ tìm ra giống có khả năng chống bệnh tốt và cho năng
suất cao là con đường đúng đắn trong công tác phòng chống bệnh. Ngày nay việc sử dụng
giốnq chống bệnh đã trờ thành biện pháp chủ yếu trên thế giới nhờ tính hiệu quả và rất có ý
nghĩa đối với các nước nghèo đang phái triển. Ớ nước ta 1998 Nguyễn Vãn Liễu dã chon được
những giông lạc có tính kháng vi nấm. Sau khi dã trồng thử nghiệm nhiều giống lạc khác
nhau, ông đã chọn được giống lạc Gié Nho Quan và ICG V87157 là mức kháng hênh cao nhất
Ị 1 1J. Một số giống nhập nội cũng được trồng thử nghiệm và chọn được giông KPS13, KPS1X,
dây ]à hai giống nhập nội cho năng suất cao và kháng héo rũ trong điểu kiện miền Bắc nước
ta. Sử dụng giống chông bệnh luôn là xu hướng ưu tiên trong chiến dịch phòng chống bệnh do
vi nấm gáy héo vàng ừ tất cả các quốc gia có bệnh này gáy ra 113|.


Biện pháp sinh học

Biện pháp sinh học đã được nghiên cứu (rong khoảng ba thập niên "ẩn đa). Ciệii pháp
này sứ dụng các vi sinh vật dối kháng như Streptomcyces, H y y o s c o p ii us, Srepnir^er xensis.
Bacillus. sj)ị , P seudom onas ylitnHH Ị 13 Ị. Biện pháp sinh học dựa trên sự cạnh tranh của các tác
nhân sinh hoe với vi nấm ờ vìmy rỗ bang việc lao ra các cliâì có lác dụng h;in ch ế sinh trưỚMíi
và phát iricn của vi nấm gây bệnh héo vàng. Tới nay biện pháp này mới chí thành công và có
nhiều tliên vọng trong phòng (hí nghiệm và nhà kính chưa lỏ ra cỏ hiệu C]ifá cao (rong dieII
kiện dồng lupus. Biện pháp sinh học có nhiều triển vọng trong phòng chống bệnh do vi nấm
gây héo vàng nhưng để triển vọne thành thực tiễn thì phải biến các tác nhân sinh học tron ỉ!
điểu kiện nhân lạo t hành các chế phẩm sinh học dẻ sử dụng cho nông dãn 17 1.

1.2.

G iói th iệu ch u n g về quá trình N itra t hoa
Quá trình nitral hoá hiện nay đang trờ thành vấn đố bức xúc bừi tính nguy hiếm cúa

I1Ó. Nitrat hoá sẽ dẫn đến rửa trôi 2 ây ô nhiễm nguổn nước, dẫn đến quá trình phán nitrat hoá
sinh ra mất đạm của đất. Khi anion NO Ị kết hợp với ion HP trong đất sẽ làm giám pH cúa chít
gày bất lợi cho cây trồ ne.
Có nhiều nẹuyên nhân gây tícli luỹ nitrat trong đất, một trong những nguyên nhân dó là
do hoại dộng của nhóm vi khuẩn nitnit hoá. Trước thực trạng đổ rất nhiều biện pháp khác
nhau dã được sử dụng nhằm làm siám quá trình này. Biện pháp hoá hoc đươc sử dung nhung
dã gày ra ô nhiễm môi trườna và thiệt hại khônc nhỏ cho con người. Các chất chiết xuất từ
thực vậl cỏ ưu diêm hơn vì nó kliôns, gây hai cho cây trồng, con người và đ o n ” vật. Tuy nhiên
biện pháp này lai kliôníí mang lính chọn lọc và ihirừna ức ch ế cá nhũng vi sinh vật có ích
khác trong đất. Vì vậy, nghiên cứu dể lựa chọn Illume clu'inc vi sinh vật có khíi năng ức d i e
IỊIUÍ ninh nitrat hoá một cách có chon lọc ỉà hốt sức quan trọng. Nitrat hoá là một klìâu tron<’
CỊLUÍ trình c h u y ế n h o á nitơ. t ừ nitrat sẽ m ấ l n i t ơ q u a c o n dưò'níỉ p h ả n Iiitrat h o á

h oá s in h h a y

lừa [lỏi.
Tlico FAO thì sử clụnc chất kìm hãm quá trình nitrat lioá là một biên ptiáp UIIIO lie số sử
dụng nilơ và hun ghim mãt Iiilơ do quá trình phán nilnit hoá.
Bill! chat CjIKÍ li mil

10


Nitrit hoá là một khâu trong chu trình khép kín Nitơ trong tự nhiên được thực hiện nhờ nhóm vi
sinh vật gọi chung là nhóm vi khuẩn nitrit hoá
Nhóm vi khuẩn nitrat hoá bao gồm 2 nhóm tiến hành 2 giai đoạn của
oxy hoá N H / — > N 0 2' và giai đoạn oxy hoá

quá trình.

Giai đoạn

NO,' — >NO, [19].

* Giai đoạn Nitrit hoậ ( N O :' ).
Quá trình oxy hoá NH4* tạo Ihìmh N 0 2 dược liên liànli bởi nhóm vi khuân nitrit hoá, chung
thuộc nhóm vi sinh vẠt tự dưỡnỉỊ hoá năng oxy hoá N H / bằng oxy không khí và tạo ra Iiăng
lượng:
NH4+ + 3/2 0 : — -> N O :

+

H:0

+

2 ir

+ Năng lượng.

Enzym xúc tác cho quá trình là cn/ym của các quá trình hô hấp háo khí. Nhóm vikliuán

nitl'il

hoá bao gồm 4 chi khác nhau: N irrozomonas,N ilrozocystis, Nitro-olohiis, Nitrozospira.
* Giai cloạn nilrnt hoá
Quá trình oxy hoá NOọ thành NO, được thực hiện bởi nhóm vi khuẩn nitrat. Chúng cũng là
những vi sinh vật tự dưỡng hoá năng có khả niíng oxy hoá N 0 2 thành năng lượng. Năng lương
dùng để dòng hoá C O ; thành đirờng.
NO. + 1/2 0 , — r > N O /

+NL

Nhóm vi khuấn tiến hành oxy hoá NO, thành NO, bao gồm ba chi khác nhau: Nitrobcicter,
N i t r o x p i r a \'() N i t r o c o c n t s .

Ngoỉu nhóm vi khuẩn lự ílưữim lioá năng nổi trcn, trong đấl CÒI1 cổ một số loài vi sinh vật di
(.lưỡng cũng tiến hành quá trình nil rat hoá, Đó là các loài vi khuẩn và xạ khuẩn thuộc ciíc chi:
Pseitíloinoihts. Corinel)ucterium, Stưj>to!iìiiiyi cs....Qvú trình nitrat gây bất lựi trong nôn"
nghiệp, dọna đạm nitrat thường dễ bị rửa trôi xuốnq tầng sâu, dễ bị đi vào quá trình phán nitrat
tao thành N,.

1.3. X ạ k h u ẩn và k h á n ă n g ức ch ẽ vi sinh vật g à y bện h ở cà y trổn g.
Xạ khuẩn (.Actinonìycctưs) là một một nhóm vi khuẩn thật (bacteria) phân bố rất rộng rãi
trong tự nhicn. Tron” mỗi c đất nói chung thường có trên một triệu xạ khuẩn (lính ỉ!seo sỏ
khuẩn mọc lạc mọc trên mòi trường thạch ) phần lớn xạ khuân là các lố bào Gr am clươnu, hiếu
khí, hoai sinh, cú cấu lạo dang sợi phán

nhánh (khuấn ti). Xạ khuẩn clirợc nqhien cứu một

cách sáu sac vì có the sản sinh nhicii sán phíỉm Ilao dổi chất quan trọng. Trong số xooo chãi
kháim sinh hiện đã dược biết đến trên thế giới thì Irẽn xo % là do xa kluiaii sinh ra. Xạ khu ấn
còn được đùng đc sản xuât

Iiliicu loại en/i m

(như proteinnaza, amilaza, xcnlkilaza

glucoizomcra), một số vilamin \'à chất liữu cơ. MỎI số íl xạ khuẩn kị khí hoặc vi hiếu khí có
thế cày ra các bệnh cho người, dộng vật và cho cây Irồng. Một sô' xạ khuủn (ihuỏc chi Fran
kia) có thể tạo nốt sần trên rễ một số cây không thuộc bỏ dâu và có khá năng cố định nitơ
* Đặ c (liếm hình thái CIU1 xạ khuân,

t


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
Hệ sợi cùa xạ khuẩn chia ra thành khuẩn ti cơ chất và khuẩn ti khí sinh. Chi
Actinom yces và vài chi khác chỉ có khuẩn ti khí sinh. Loại khuẩn ti không mang bào tử được
gọi chung là khuẩn ti dinh dưỡng.
Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn thay dổi trong khoảng từ 0,2 - 1,0 I-Iin đến 2-3 (.un. Đa
số xạ khuẩn có khuẩn tí không có vách ngăn và không tự đứt đoạn. Màu sắc cùa khuẩn ti ử xạ
khuẢn hết sức phong phú. Có thể gặp các màu trắng, vàng, da cam, đỏ, lục, lam, tím, nâu,
đen... Khuẩn ti cơ chất có thể tiết ra môi trường một số loại sắc tố. Có sắc tố tan trong nước,
có sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ.
Khuẩn ti cơ chất phát triển một thừi gian thì dài ra trong không khí thành những khuẩn
ti khí sinh. Người ta còn gọi khuẩn ti khí sinh là khuẩn ti thứ cấp để phân biệt với khuẩn ti sơ
cấp là loại khuẩn ti bắt đầu phát triển từ các bào tử nảy mầm.
Sau một thời gian phát triển trên đinh khuẩn ti khí sinh sẽ xuất hiện các sợi bào tử. Sợi
bào tử có thể cỏ nhiều loại hình dạng khác nhau: thảng, lượn sóng, xoắn, moc đơn, mọc vòng..
Có loai mọc vòng, mọc vòng đơn cấp, mọc vòng hai cấp. Những đặc điếm này đểu rất quan
trong khi định ten xạ khuẩn. Một số có sinh nang bào tử bên trong có chứa các bào tử nang.
Bào tử Irần (conidiospore) của xạ kluián có thể có hình tròn, hình báu dục, hình que,
hình trụ. Mình dạng và kích thước của bào từ có vai trò quan trọng trong định tên xạ khuẩn.
Màng tế hào chất cùa xạ khuẩn dày khoảng 7,5 - 10,Omni, màng tế bào chất có chức nũng
khống chế sự vận chuyển trao đổi ra, vào tế bào của các dinh dưỡng, các sàn phẩm trao dổi
chất, duy trì áp suất thẩm thấu hình thường bên trong tế bào, là nơi tổng hợp thành tế bào, là
nơi tiến hành quá trình photphoryl oxi hoá và photphoryl quang hợp, tổng hợp enzim protein
và cung câp năng lượng cho sự vân động của licn mao.
Khuẩn lạc của xạ khuẩn rất dặc biệt, nó không trcm ướt như ờ vi khuẩn, nấm men mà
thường có dạng tl>ò ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp loả ra theo hình phóng xạ vì
vậy mới có tên xạ khuân. Dùng que cây không đi được khuẩn lạc của xa khuân vì khuẩn ti cơ
chất bám sau vào trong thạch. Tuy vạy, khuẩn lạc của xạ khuẩn cũng kh ôns thế lẫn được với
khuẩn lạc của nám vì khuẩn ti nấm có đường kính thường gấp tới 10 lần đường kính khuẩn ti
xạ khuẩn[5|.
* Quan hệ khána sinh của xạ khuân vói vi sinh vật khác.
Quan hệ kháng sinh là quan hệ dối kháng lẫn nhíiu giữa nhóm vi sinh vãt. Loại này
tlnrờng licit diệt loại kia hoặc han chế quá trình sống cùa nó. Ví dụ xa khuẩn kháng sinh và
nhóm vi khuẩn mần cám với chất kháng sinh do xạ khuẩn sinh ra Ị 14]. Các chất kháng sinh do
xạ khuẩn sinh ra củng như chính bản thân xạ khuẩn tlioả mãn dược những tính chất cán thiết
đè có the sử dụng trong việc bào vệ thực vật như:
Không gây ảnh hưởng xấu đến sinh tnrởng phát triển của cây trồng, ờ một số nốn" độ
thích hợp nó còn kích thích SƯ nảy mầm của hill và sinh trường của cây. Không gây dóc hai
cho người và gia súc có hiệu lực trong thòi sian nhất định ớ ngoài môi trườn 2 tư nhiên
Một số đặc điếm quan trọng thê’ hiện tính ưu việt của ch ế phẩm kháng sinh là có lie
dụng tiêu diệt các sinh vật một cách có chọn lọc. Xạ khuẩn có khả năno thích nghi cao hỏi
12


nhẠp vào tự nhiên một cách khá thuận lợi đê có thể tham gia vào các hoại động đấu tranh sinh
học một cách tích cực. Xạ khuẩn có khả năng tồn tại trong môi trường không thuận lợi ờ dạns
bào tử và khá năng phát tán rộng trong lự nhiên 1131.

13


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

2.1. C ác ch ủ n g vi sin h vật d ù n g tron g nghiên cứu
r ■
STT

N guồn góc

Tên loài vi sinh vật

1

Vi năm Fusel ri 11)11 o.xỴspornm

Trung tâm vi sinh - ĐH K H TN

2

Vi

khuẩn

cồ

dinh

đạm

Viện KI IKTNN Việt Nam

cố

định

đạm

Viện KỈIKTNN Việt Nam

Rhizobiurn .sp
3

Vi

khuẩn

Azotobater sp
4

Vi khuẩn phỉìn giải Lân PS23

Viện KIIKTNN Việl Nam

5

Các chúng xa khuẩn và vi

Phân lập từ đất, hộ sưu lập của Bộ mòn Sinh thái Mòi

khuẩn ni trai hoá

trường - Khoa Môi Trường

Vi khuân ĩịsettilomoiias

Viện KHKTNN Việt Nam

6

sola/iacearum

2.2. P h ư ơ ng p h á p n gh iên cứu
2.2.1. Phirưny pháp phân láp xạ khiúin
Cách lây mâu (fat
Dụng cụ lấy mẫu và đựng mau phải dược khứ trùng trước khi lấy mím. Khi lấy mẫu đất phai
loại bó lớp đất ở trên mật độ sâu 1 đến 3 cm. Mẫu đất được lấy khoảng 30g, dưa vào túi giấy
chống ẩm vỏ ti ìmg, gói và bảo quán Irong tủ lạnh cho tới khi phân làpTiêh hành p/uìn lập
Mõi trường pliíìn lập xạ khuẩn dược pha chế theo thứ lự các ho;ì chấl trong (hành phấn
đã cho |a|, sau dó phân phối môi trường vào các hình tam giác. Nước cất thrợc done vào các
ống nghiệm mỏi ống 9ml và một bình lam giác chứa 99ml nước cất, dùng nút bỏn<> và "iáy
báo hao kín. Sau đó, dưa vào khử trùng ớ lat m trong 30 phút. Môi trường xạ khuân.khử Im no
xong dể nguội lới nhiệt dộ 45-50"C, phân phối vào các dĩa pctri đã khử irùng, thao tác này
được tic'll hành irong tù cấy hên cạnh imọn dcn CÓI1 . Sau khi (hạch dônc lát ngược hộp de
trong tủ ãm 28 - 30°c !Ừ 2 tic'll 3 ngiìv và kiểm tra đỏ vô trùng cúa mỏi trườn".
Mẫu dài dcni phân tích cfin dược trộn dcu tron" cốc hoặc hộp nhựa vô trù no ờ phòii"
ill í nghiệm, sau đó di.iig kcp sat vô trùng dế loại bó 1C cây và các vát lạ khác. Nếu nrìu díl ở
trong nì lạnh thì trước khi phân tích phái phục hỏi sự phát triển của vi sinh vât ờ Iron" ti ll
bủng cách cho vào tủ ấm ờ 2-S - 3() 'c sail một ticm đem di phân tích.
Cân Ig đất vào chén sứ dã khứ trùng, sau đó nghiền đất bang chày cao su võ trùn" h y
I1ƯỨC ỏ' trong bình tam giác đã kliir trùng ở trên đổ vào chén sứ dể chuyến toàn bô dãì đ i
14


nghiền nát vào hình tam giác, đậy bình bằng nút bông, lắc đều trong 10 phút khi đó dược dung
dịch huyền phù đất ờ độ pha loãng là l ơ °, dùng pipet vô trùng hút lên xuống ít nhất mưừi lần
và hút ra lml dua vào ống nghiệm khác chứa 9ml nước cất vô trùng được nồng độ pha loãng
10'\ Cứ tiếp tục nhu vậy sẽ có các độ pha loãng 10 \ 10”4, 10 \ dùng các nổng dỏ đã pha loãng
này để cấy ra dĩa petri đã có môi trường, dùng pipet sạch hút từ các nồng độ pha loãng trên rồi
nhỏ một giọt vào dĩa petri có chứa môi trường đã chuẩn bị, dùng que gạt trong đều trên mặt
(hạch cho tới khi mặt thạch khỏ, mỗi nồng độ pha loãng được nhắc lại 3 lần. Mọi thao tác đểu
phải dược tiến hành trong lủ cấy hcn cạnh ngọn lửa dèn cồn. Sau khi xong hao gói và đc ờ
nhiệt độ phòng 25-27nc, sail 5 - 7 ngày liíy ra quan sát và tính số lượng khuẩn loc trims bình
liên mội dĩa bằng cách tính số lượng các khuân lạc trôn mỗi đĩa thạch, cộng lại và cilia cho số
đĩa pclri được tính. Số lượng xạ khuẩn trong một gam đất được tính theo công thức san.
X = a. b.c
X: Số lượng xạ khuẩn Irony 1 g (lát.
a: Số khuẩn lạc tiling bình mọc trcn một đĩa pelri.
b: Số giọt trong 1 ml cua pipet sử dụng,
c: Số nghịch đáo cíia nồng độ pha loãng.
Sơ đổ pha loãng dịch nuôi cấy.
Igđất

lml

lml

Im!

2.2.2. Phương pháp cây truyền và ịỉiữ chúng ííiỏnịí
Mỏi trường xạ klnũíii sau khi đun sôi phân phối vào trong các ống nghiệm sao cho
không quá 1/3 chiều dài ống nghiệm để tránh nhiễm khuẩn khi để nghiên, đùng nút bỏno nút
lại và khử trùng ở áp suất Iatm trong 30 phút. Sau khi khử trùng xong đế nghiêng cho đến khi
nguôi. Dìmg que cây lây một ít sinh kliối cíia khuẩn lạc từ đĩa petri cấy sang ôn ° nghiệm
ngliicng. Mỗi khuẩn lạc là một cluing ricng, mọi thao tác đều phai dược tiến hành bên n«n>n
lử;i dèn cồn, trong lủ cấy. Sau khi cấy xong, bao gói và dế ử nhiệt độ phòng 25-27"C. Sau 5 - 7
ngày lây ra kiếm tra, nếu không bị nhiễm khuắn thì dưa vào tủ lạnh bảo quán nếu bị nhiễm
khuẩn ta phái tiến hành cấy truyền lại hay thuần khiết giống các bước tương lự như vừa ticn
hành.
2.2.3. Phương pháp thứ hoạt tinh a i a các chím í; xạ khuan với các vi sinh vật kiếm định
Để thử khá năng ức chế cùa xạ khuấn với các vi sinh vặt kiểm định (vi ncim Fusarim n
vi khuẩn Psetnỉomonus, vi khuẩn nitrat hóa) trước hết cấy truyền xa khuẩn ra mỏi trườne dĩa
thạch:

15


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
Môi trường xạ khuẩn sau khi khử t rùng trong nồi hấp áp lực để nguội đên 45 - 5 0 ' c ,
phân phối vào đĩa petri đã khử trùng đê nguội, nhỏ vào đó một giọt nước cãt vỏ trùng, dùng
que cấy lấy một ít sinh khối từ ống nghiệm giữ giống đưa sang đĩa petri, dùng que gạt trong
đểu trên mặt thạch tới khi mặt thạch khô. Mọi thao tác phải dược ticn hành trong tu cây, bên
ngọn lửa đèn cồn, sau khi cấy xong bao gói và dể ở nhiệt độ thích hợp 2 5 - 2 7 ’c , đến khoảng 7
ngày xạ khuẩn mọc đầy trên mặt thạch sử dụng cho mục đích thử hoạt tính kháng sinh.
Môi trường vi sinh vật kiểm định được pha c hế theo công thức đã cho [bỊ, sau đó khử
trùng ở I aim trong 30 phút, các môi lrường khử Irìing để nguội 35 - 40‘'c.
Dùng khoan vô trùng t;io thành c:íc thỏi thạch từ đìa pctri clã m ọc xạ khuân, lấy thanh
kẹp vô trùng đưa sang đĩa petri vô trùng khác. Sau dó cho lĩiột ít nước cát dưa vào trong ống
nghiệm chứa vi sinh vât kiếm dịnh, dùng que cây gilt đều vào trong nước. Đ ổ dung dịch này
vào trong binh môi trường tương ứng dã khử trùng ở nhiệt độ khoảng 35 - 40°c, lắc đểu. Sau
đó tlổ vào troníí các đĩa petri có chứa các thỏi thạch đã mọc xạ khuẩn sao cho vừa bằng mặt
thỏi thạch. Sail 5 - 7 ngày xem kết quả và do vòng ức chế để biết hoạt lực của xạ khuẩn với vi
sinh vật kiểm định.
2.2.4. Phương pháp nghiên cứu ánh hướng của diều kiện nuôi cấy đẽn sinh trương và khá
năng sinh chất ức chẽ cúa xạ khuẩn
Môi trường xạ khuẩn sau khi pha chế dược lác đều và chia ra các phấn riêng biệl, dùng
máy do pll diều chinh cho đến khi đạt được các pH đã định bằng hoá chất cẩn thiíl
( C H , C O O H , N a O H ) , san đ ó k h ử trùng mòi trường xạ k h u ẩ n ở l a l m troll” 3 0 phút, đè ng uội

lới 40 - 45" c rồi đổ ra các đĩa petri đã khử trùng. Sau khi thạch đông, dùng pctri đã khứ trùng
nhỏ mọi giọl mrớc vô trìing lcn mặt đĩa thạch và dùng quc cấy lấy một ít sinh khối từ oils’
nghiệm ciữ giống đưa vào dặt ớ giọt nước trong đĩa petri, lấy que cấy trang đểu trên mặt thạch
đến khi mặt Ihạch khô. Smi 5 - 7 neàv xạ khuẩn mọc dây trên mặt thạch, tie’ll hành thử hoại
tính ở cáo độ pl ỉ khác nhan như thử hoạt lính với pH = 7.
Tronẹ môi trường nuôi cấy xạ khuẩn, tinh bột gạo dược thay cho tinh bột tan, sau đỏ
liến hành các bước thử hoạt tính nrơng tự như đối với môi trường có tinh bột tan. Kết quá cúa
thí nghiệm sẽ đánh giá khá nàng sinh nương của xạ khuân trên môi trường có chứa tinh bột
c ạ o và khi’ Ji ănu s i n h k h á n u s i n h c ứ a c á c c h ủ n g x ạ k h u ẩ n .

2.2.5. Ảnh hường của các chúng xạ khuẩn có hoạt tính cao với một số vi sinh vật có ích
p/m'o'tii; phÚỊ) thỏi thuíh
Nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch đĩa. Khi xạ khuẩn đã m ọc dày dặc trên mặt
thạch dùng khoan vô trùng khoan thành các thỏi thạch, lấy thanh kẹp vô trùng đưa các thói
thạch Siinq dĩa petri đã vô trùng.
Một số vi sinh vật có ích được sứ dims* như: Rhizobium, A zotobactcr và vi khuẩn phàn
giải làn PS23. Các mối (rường vi sinh v;ìt có ích này dược pha chế theo thứ tự còng tliírc dã cho
(c, d, e), sau đó khử trùng ó' latm trong 30 pluìt. đổ nguội đến 30 - 40°c, tlùn" một ít nưóc cìt
đira vào tronq ống nchiộin chứa các vi sinh có ích, đánh tan đều vào tron<’ nước đổ vào troi!"

16


môi trường tương ứng đã khử trùng, lắc ti é II rói đổ vào trong các đĩa petri có chứa các thỏi
thạch sao cho vừa bằng mặt thỏi thạch, sau 5 - 7 ngày xem kết quả.

'Phương pháp l ấy vạch
Các môi trường vi sinh vật có ích được pha theo thứ tự công thức (c, d, e), khử trùng ữ
latm

trong 30 phút, để nguôi đến 40 - 45nc rồi đổ vào các đĩa petri đã khứ trùng. Khi thạch

đổng lại, lấy một ít sinh khối trone ống giống xạ khuẩn vạch đôi đĩa petri, dùng que cấy lây
một ít vi sinh vật có ích tương ứng với mỏi trường vạch 2-3 đường từ cạnh đĩa petri vuông góc
vói vạch của xạ khuẩn trên. Sau 5 - 7 ngày xem kết quả.
Ánh hưởng của các chúng xạ klniấn với một số vi sinh vật có ích.
Xạ khuẩn

2.2.6. Thử hoạt tính kháng sinh của chủng xạ khuấn đói vói vi nám bàng dịch kháng
sinh ỉhỏ
Mỏi trường xa klniẩn |a| không chứa thạch đirợc pha với nước cất, khuấy cho hoá chất
lan đồu rồi phàn phối ra các bình tam giác sao cho mòi bình chứa 20Uml tiling dịch mỏi
trưòng. Dùng nút bông và giấy báo bao kín. San dó đem di khử trùng ở latm trong vòng 30
phút, dê’ nguội. Dùng quc cấy lấy một ít sinh khối trong các ống giống xạ khuẩn khác nhau
dưa vào bình tam giác chứa môi lrường xạ khuẩn đã khử trung, các bước đirơc tiến hành trong
tú cấy và hên cạnh ngọn đèn cồn. Các bình tam giác này đirợc đưa vào máy lắc để tạo chất
kháng sinh thô với tốc độ lắc là 200 vòng/phút đối với xạ khuẩn trong thời gian từ 5 - 7 n a à y .
Mỏi lnrò'nIron" 30 phúl, cho một íì nước câl đu';i vào troim ỏng nghiệm chứa vi nấm, lấy que cấy >Tạl cho
vi nấm đểu vào trong nước. Đo dung dịch này vào trong bình mòi trường vi nấm đã khử trùn"
ớ nhiệt độ khoảng 35 - 40 l'c, lac đều, sau dó đổ vào (rong các đìa pctri đã khử trùng các bưức
được ticn hành trong lú cây bên cạnh ngọn đèn cồn, nuôi nấm Fusarimn oxysporium ở nhiêl
độ 25-27"C.
Nấm Fitsariimi o.xysỊìoriitDi dược nuôi ớ nhiệt độ thích hợp trong 2 đến 3 n<>;iy chrợc
lay đùng đế thử hoại tính, dùng bút vẽ kc đôi mặt dưứi đĩa petri ra làm hai phần và đùn*’ que
cấy kẻ đòi môi trường nấm ra làm hai sao cho 2 đường vạch trcn trìiníỉ nhau. Một phấn la ciìmo
Ị DẠI HỌc , ' i Q C G, m

I TRUNG TÁM Th o n g tin ỈHU -■ ■
I

O T /

4 ^ 3

;

17


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
làm đối chứng, phần còn lại sẽ được đổ dịch kháng sinh thô, gói bọc cât đi sau 2 - 3 lấy ra xem
xét kết quả.

18


CH Ư Ơ NG III. K K T Q U Ả VẢ T H Ả O L U Ậ N

3.1. K h ả n ăn g ức c h ế củ a các ch ủ n g xạ khuẩn vói vi n ấ m F u sa riu m o xysp o ru m
Các chủng xạ khuẩn có hoạt tính với vi nấm Fusarium oxysporum ở mức yêu h
mạnh phải căn cứ vào đường kính vòng kháng sinh.
Bảng 1: Khả năng ức chê của các chủng xạ khuẩn với vi nấm F n s a n iim o.xyspornm.
ĐK, VKS

ĐKVKS
STT

STT

Ten chủng

Tên chủng
(D-d, mill)

(D-d, mm)
1

XKI

-

41

XKA14

2

XK2

15

42

XKA13

-

3

XK3A

22

45

XKA8

-

4

XK3B

44

XK A9

5

XK4

2

45

XKAI5

-

6

XK5

16

46

M I /C 2

2

XK6

-

47

M1/C2

-

8

XK7

*

48

M1/C3

-

9

XKS

20

49

M1/C4

-

50

M1/C5

-

51

M1/C6

52

M1/C7

53

M1C8

7

54

M1C9

4

55

M1C1 0

-

56

M1C11

5
-

h

10 XK9
! 1 XK10

10

12 XK11
13 XK12

-

14 X K 13
15 X K 14

-

16 XK15
17 X K 16

-

57

M2C1

18 XK18

-

58

M2C 2

59

M2C3

-

60

M2C4

-

61

M2C5

19 X K52
20 X K53
21

13

X KA23

22 X K A 2 2

-

62

M2C6

-

23 XK A2 5

*

63

M2C7

-


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
24 XKA1

-

25 XKA3
«

64

M2C8

65

M2C9

26 XKA21

-

66

M2CI0

27 XK A i 8

-

67

M3/CI

28 XK A26

68

M3/C2

-

29 XK AI 1

69

M3/C3

-

-

30 X K A I 2

-

70

M3/C4

-

31 XKA6

-

71

M3/C5

-

32 X KA 16

-

72

M3/C6

-

33 XKA19

-

73

M3/C7

34 XKA7

-

74

M3/C8

35 XKA5

3

75

M3/C9

-

76

M3/C10

-

-

36 XKA4
37 XK A10

-

77

M 3 /C 1 1

38 XKA20

-

78

M4/C3

39

M4C6

18

79

V2/M7

20

40

M4T6

19

80

V3/M7

16

Ghi chú:
D - Đường kính vòng kháng 11 ấm
đ - Đười!" kính khoan hình tru

* Có hoạt lính nhưng thể hiện không rõ
(-) không có hoạt tính

Theo số liệu bảng 1 cho thấy trong số 80 chủng xạ khuẩn thứ hoạt tính với vi nấm gây
bệnh thì có 17 chúng có tao vòne kháng nấm chiếm 21,36% tổng số các chúng xa khuấn, thế
hiện banc* kích (hước vòng kháng sinh do dược. Tuy nhiên, do chưa có một tiêu cluiẩn nào dế
so sánh hoạt lính kháng nám của các chủng xạ khuân vì vây chúng (ỏi dưa m cách'phân chia

Kích llnrớc vòng kháne nấm (D-đ, mm) > 20 mm: Hoạt tính manh.
IGnim < D-d, mm <20mm: Hoạt tính (rung bình
D-d, 111111 < lUmm: Hoạt lính yếu.
Như vậy, lỊico cách phân loại tròn, trong 17 chủng xạ khuấn thứ hoạt tính kh I'T*- nam
cỏ 3 chúng có hoạt tính mạnh; 7 chillis có hoạt tính trung bình và 7 chủng hoạt tính yếu

20


Khá năng ức ché của các chúng xạ khuẩn đối với vi nám Fusarium oxysporium ở các
điều kiện pH khác nhau.
pH của môi trường có ý nghĩa quyết định đôi với sự sinh trương cua nhiều vi sinh vật.
Cúc ion i r và OH là hai ion hoại dộng lớn nhất trong lâl cả các ion, những bicn dổi nhó trong
các nồng độ cùa chúng cũng ảnh hưởng đến mạnh mẽ đến giá trị của pH. Clic phẩm sinh hoc
tù những chủng xạ khuẩn có khả năng sinh kháng sinh trong khoảng pH rộng sẽ clirực ứnt;
dụng rộng rãi cho những vùng dát khác nhau. Các giá trị pH được chọn là 5; 6,5; 7; 7,5; s.
Báng 2: Khả năng ức ch ế của các chủng xạ khuẩn với Fusarinm ox y sp o n tm ờ pH = 5
ĐKVKS

ĐKVK S
SÍT

STT

Tên chủng

Tên chủng
(D-d, inm)

(D-il, mm)
1

V2M7

14,3

6

XK8

s

2

XK2

16,7

7

V3M7

0

3

XKK)

13

8

M4T6

0

4

XK5 +

9,3

9

M4C6

0

5

XK3A

9,7

10

XK53

6,7

Ở pH = 5 thì 3 chúng xa khuẩn V3M7; M4T6; M4C6 mất hoàn toàn hoạt tính, các xạ
khuân còn lại déu giủm hoạt lực xuống mức hoạt tính trung bình và yếu.
Bảng 3: Khả năng ức c h ế của chủng xạ khuẩn với vi nấm Fusdi iii/n ox y sp o n tm ờ pH = 6,5.
ĐKVKS

ĐKVKS
STT

STT

Tên chủng

Ten chủng

(D-d, min)

(D-d, m m )

1

XK5

0

6

XK2

0

2

XK3A

0

7

V 2M7

1

3

XK10

0

8

M4C6

0

4

XK53

*

9

V3M7

0

5

XK8

0

10

M4T6

3

() pi I - 6,5 hầu hốt các clnmu tiều 111 fit liếl ho;\t lực chỉ có V 2 M 7 và M4T6 có hoạt lưc
rút t hấp.
lỉảim 4: Khá lìănlĩ ức chê của các chung XK vói vi nấm Fusarium OXXSỊHH Itm ơ pH = 7.
ĐKVK S
STT

l òn chúna

ĐKVKS
STT

Tên cluing

(D-d, Iiim ì

(D-d, 111111)

1

V2M7

20

6

XK53

13

7

V 3 M7

16

7

XKS

20

s

M4C6

18

s

XK 10

IU


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
4

M4T6

19

9

XK2

15

5

XK3A

22

10

XK5

16

Ở pH = 7 có 3 chủng xạ khuẩn V2M7; XK3A; XK8 có Đ K V K S > 20m m có 7 chung
có ĐKVKS trung bình lOmm Kết quả trcn cho ta thấy ở đất trung tính hầu hết các chủng xạ khuẩn tạo vòne kháng
nấm là lớn nhất.
Bảng 5: Khả năng ức c h ế các chúng xa khuẩn với nấm Fusarium o x y sp o n im ở pH = 7,5
ĐKVKS

ĐKVKS
STT

STT

Tổn ch Ún 2

Tên chủng
(D-d, mm)

(D-đ, mm)
1

M4C6

0

6

XK5

5

2

M4T6

0

7

XK8

0

3

V2M7

8

8

X K10

0

4

V3M7

0

9

X K 3A

9

5

XK2

3

10

XK53

0

ơ pH = 7,5 các clúmg đổ 11 giám hoạt lính xuống râì thấp và 6 chúng xạ khuân: M4/C6;
M4T6; XK5; XK8; XK10; XK53 mất hoạt tính kháng nấm.
Bíìng 6: Khả năng ức ch ế của các chủng xạ khuẩn với vi nấm Fusarium oxys pomm ờ pri =s.
ĐKVKS
STT

Tên chủng

ĐKVKS
STT

Tên chủng

(D-d, mm)

(D-d, mm)

6

XK5

0

6

V2M7

0

7

XK10

0

7

X K 3A

0

8

XK53

0

8

XK8

0

M4C6

0

9

V3M7

0

M4T6

0

10

XK2

0

|9



10

pll = 8: Cíìc chủng xa khuân đểu niấl In>àlì loàn ho;il tính.
Khả năng ức ch ế của các chủng xạ khuân với vi nấm Fusarium oxysporum ớ các tliếm
pll khác nhau cho thấy không có chủng xạ khuan nào có thể tồn tại ở khoáng pH rộn". Nhìn
cluinc, các chủnq xạ khuẩn có hoạt tính mạnh nhất vần ờ pH = 7.
Khả năng sinh chất ức c h ế cùa XK2 thổ hiện mạnh nhất pH = 5. Vậy chủno X K 2 thích
nghi với những vùng đất chua.
Chủng M4C6 thể hiện khả năng ức c hế vi nấm gáy bệnh mạnh nhất ờ pH trung tính.
Chỉmg XK8 thể hiện khá nâng ức chế vi nấm gây bệnh manh nhất ờ pH trung tính và
chua.


Khá năng sinh chất ức chế của chủng xạ klniấM M4T6 mạnh nliâì ơ pl ỉ - 7 VÌI kiiong có
khả năng ức chế vi nấm ở pH chua và kiểm.
Chủng XK53 thê hiện khá Hãng ức chế vi nấm gây bệnh mạnh nil At ở pH Inmg tính VÌI
trung bình ờ pH chua.
Khả năng sinli chất ức ch ế của XK5 thể hiện mạnh nhất ở pH=7 và trung hình ờ pi I - 5.
Chủng XK 10 thể hiên khả nàng ức chế vi nấm gây bệnh mạnh n h ít ở pH mang tính
chua và có khả năng ức c h ế ở mức trung bình khi pH=7.
Chủng V2M7 the hiện khá năng ức chê' vi nấm gây bệnh m;inh nhíìl ờ pll nu n g tính và
ớ mức trung bình khi pH hơi chua.
Chủng XK3A thể hiện khá năng ức chế vi nấm gây bệnh mạnh nhâl ờ pH trung tính và
pi I hơi kiềm.
Kết lu á n : Háu hết các chúng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh ức chế vi
nấm ở pH trung lính. Một số chủng xạ khuẩn: XK3A , V2M7, XKIO, XK5, XK53, XK8, XK2
có khả nâng sinh chất kháng sinh ức chế vi nấm ở mức trung bình với pH chua.
Khả năng ức chê của cluing xạ khuẩn khi thay mỏi trường chứa tinh bột tan bằng tinh
bột gạo.
Chái dinh clưữiií’ đối với vi sinh vật là bất kì chất nào được chúng hấp thụ lừ mỏi trường xung
quanh VÌI thrơo sứ dung làm nguyên liêu đê cung cấp cho các quá trình sinh tone; hợp, tao ra
các tluìnli phần lố bào hoặc đẽ cung cáp cho các quá trình trao đổi năng lượng. Tinli bộ! tan là
mội hoá châì đắt tiền vì vậy đế góp phần tìm ra hoá chất rẻ hơn có khá năng thay thế, các
clủmíỊ xạ khuẩn dược tiến hành nuôi cấy VÌ1 Ihửhoạt tính với môi trường dược (hay tinh bột tan
hằng tinh bột gạo. Kél quá các chilli” xạ khuân dược cấy trên mỏi trường chứa tinh bột gạo
p h á t t r i ể n rất t ốt v à k h ả I1ÍI112 s i n h c h á t ức c h ẽ t h ế h i ệ n ở b ủ n " 7.
Bá Hí' 7: K h á II ill Ít’ ức c h ê c ủ a c h ủ n g x ạ klnifin k hi ( h a y m ô i t r ư ờ n g c h ứ a t i n h h ộ t l a n h a n g t i n h

bột gạo.
ĐKVKS
STT

Tên chủníi

ĐKVKS
STT

Tên chủng

(D-d, 11)111)

(D-d, mm)

V2M7

18,3

6

XKK

0

XK2

25,7

7

M4T6

0

3

XK 10

5,7

X

M4C6

ơ

4

XK5

0

9

XK53

9

5

XK3A

5,7

10

V3M7

5

1

ơ môi Inrờng chứa tinh bột gạo các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy phát triển ma nh nhìn
chung hoat lực của các c hủng xa khuân đểu giảm riêng chí có XK2 hoạt tính c ao kích thirớc
vònq khans sinh là 25,7 mm.

23


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
Ảnh hưởng của các chung xạ khuấn đến mật số vi sinh vật có ích trony đát.
Với mục đích là tìm ra các chủng có hoạt tính cao, chịu được ảnh hirởiig của ngoại
cảnh mà không ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của các vi sinh vật có ích trong đất

VI

các

vi sinh vật có ích có vai trò tổng hợp đạm, phân giải lân cung cấp dinh dưỡng cho sự phát trien
cây trổng. Dưới đây là bảng kết quả phản ánh ảnh hireling của xạ khuẩn đến một số vi sinh vật
có ích trong đất.
Bảng 8: Ánh hưởng của các chủng xạ khuẩn tới một số vi sinh vật có ích trong đất.

STT

Tên chủng

Kích thước vòng kháng sinh
Rhizobium

i

Azotobacter

Phàn giải lân

1

XK5

-

2

XK 53

?

4

2

3

X K 3A

5,

-

6

4

XK2

12,3

*

8

5

M4C6

3

-

6

M 4T6

-

-

-

7

V 3M7

-

8

XK8

9

XK 10

10

V2/M 7

-

*

-

-

6

3

-

Chú giải :
(-) Không ức chế
;i: ức chê khô n” rõ
Các chủng xạ khuẩn ; XK5 ; M4 /T6; V2M7 không ức ch ế với 3 loại vi sinh vật có ích.
Còn lọi là các chủng ức chê' từ I đến 3 loại vi sinh vật có ích trong đất.

3.2. K h á n ăn g ức c h ế củ a xạ kh u ẩn đ ó i với vi kh ẩn n itra t h oá
Khác phục những yếu tố n;ìy độc cho cày trổng là một vân clc quan trọng mà nghành
nòng nghiệp dang phải quan tâm. Hàm lượng nitral được tích !uỹ quá nhiều trong cây lương
tlụrc



thực phẩm tà một trong những nguyên nhân gây ra nhiều bệnh tạt nguy hiểm cho

COI1

người, ngoài ra nitrat trong đất còn dề bị rửa trôi làm giảm hàm Urợng nitơ trong đất và khi
anion NO, kết hợp với hydro sẽ tao thành UNO, làm cho pH đất giảm xuốno rất bất lơi cho
cây trồng. Một trong những nguycn nhân chính của việc tích !uỹ nitrat trong cây lươn" thirc
thực phẩm là do sự tích luỹ nitơrat trong đất do một nhóm vi khuẩn nitrat hoá. Đ ế hạn ch ế qu-í
trình nitrat hoá người ta đã áp đụng các biện pháp hoá học, nhưng nhiìno biện pháp này đã dẫn
24


dến ô nhiễm môi trường và gây nén khống ÍI thiội hại cho con người. Việc sử dụng chât chiẽt
xuất từ thực vật có ưu điểm hơn vì nó không gãy hại cho người và động vật, không gây ô
nhiễm môi trường. Tuy nhiên biện pháp này lại không có tính chọn ỉọc và thường ức ch ế ca
những vi khuẩn có ích trong đất. Chính vì những lý do trên nên hướng nghiên cứu của chung
tôi là lựa chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng ức ch ế quá trình nitrat hoá mòt cách có
chọn lọc. Kết quả đưgrc trình bày ờ bảng 9.
Bảng 9: Khả năng ức c h ế vi khuẩn nitrat hoá của một sô chủng xạ khuẩn
Kích Ihơớc vòng vô khuẩn (D= d,m m)

Ký hiộu chủng
ĐL

ĐM

ĐỌ

SI 93

34

31

30

S3 5

0

0

0

SI 22

18

0

0

S23

23

24

27

S58

27

23

20

S92

0

0

0

S64

0

0

IS

S76

0

0

0

S94

12

10

12

S98

0

0

0

V2I

IX

21

19

p 131

ro
to

xạ khuẩn

18

21

T52

0

0

26

TI 3

0

0

0

TI 6

ơ

0

0

T33

0

0

0

T4I

0

12

0

T4

0

0

0

I-I35

0

22

0

KS

0

17

14

C 1 13

30

0

33

C3 1

0

0

0

b-102

0

0

0

32

0

0

0

I5L

0

0

0

P66

0

0

0

P8

0

0

0



i
25


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi
DL: Vi klniẩn nitrat hoá được phán lập lìrđâì trồng lúa
DM: Vi khuẩn nitrat hoá được phân lập từ đất trồng màu
DQ: Vi khuÁn nilrat hoá dược phân lập lừ đất trồng cây ăn quá

Qua bảng 9 ta thây số lượng xạ khuẩn có khá năng ức c h ế sư sinh trưởng của các vi
khuẩn nitrat hoá là 13 trong số 27 chủng, chiếm tỷ lệ 48,1%. Trong số 27 chủng xạ khuấn đa
lựa chọn, số lượng xạ khuẩn ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn nitrat hoá trong đất trổng lua
là X (chiếm 29.6%), trong đất trồng màu là 9 (chiếm

33,3%) và trong đất trồng cây ăn quá là

10 (chiếm37,0%). v ề phổ kháng sinh có 5 chúng xạ

khuẩn có khả năng ức chê cả 3 loại vi

khuẩn nitrat lioá. Có 14 chủng không có khá năng ức chê một loại vi khuẩn nitrat hoá nào,
chiếm tỷ lệ 51,8%. Từ kết quá trên có thể nhận thây số lượng xạ khuẩn có khả năng ức ché SƯ
sinh trường cả vi khuẩn nitrat hoá chiếm tỷ lệ trung bình. Song tỷ lệ này không mang ý nghía
thông kê do sở krợng giới hạn của chùng xạ khuẩn được sử dụng, v ề hoạt lực thì ít chung xạ
khuẩn có vòng klẮíng sinh rộng. Đa số thuộc loại trung bình hoặc yếu. Đặc biệt có chủng S I 93
và C1 13 cỏ hoạt lực khá mạnh, đường kính vònơ kháng sinh rộng tới 33-34mm.
Sự ức c h ế một số vi sinh vật có ích cúa xạ khuẩn
Chất khá 11 c sinh do xa kluũm sinh ra có tính ứcchê chọn lọc, nó có kha năng ưc chê

vi

sinh vật này mà không ức c hế các vi sinh vật khác. Dựa vào dặc tính này, chúng tôi muốn lựa
chọn nliửng xạ k In úi 11 chí có tác dụng ức chế vi kln:â nitrat hoá mà không ức chế các vi khuân
c ó ích k h á c I r o n ” d á i . Đ ố i t ư ợ n g k i ể m d i n h c ủ a c h ú n g tôi là:

Vi khuẩn not sần Rhizobium sp. Ký hiệu Am của cây cái tạo đất Acacia mangium
Vi khuẩn Pseudomonas sp. Có khả năng phân liuỷ photpho, ký hiệu p
Vi khuẩn nốt sần lạc, ký hiệu TAL 10Ơ0.
Những vi khuần kiểm định trên đirơc đem thử với khá năng kháng sinh của 5 clnìng
xạ khuẩn có khả nă n" ức chế cả 3 loại vi khuẩn nitrat íioá.
Kết qua được trình bày ớ báng 10
Bánq 10: Hoạt lính kha ns sinh của 5 chủng xạ khLiấn chọn lọc đối với 1 số vi khuẩn có ích
i r ons’ đ ất .

KÝ hiệu ch ú n ?4
xạ khuân

Vi khuan nitrat hoá

VK p

VKNSL

VK NS

TI, A 1000

Am

ĐL

OM

ĐỌ

SI 93

34

31

30

0

0

0

S23

23

24

21

21

32

31

S58

27

23

20

0

0

0

V2I

1S

21

l l)

0

0

0

1S

21

0

0

0

p 131
.

Qua bail" trên có the thây rằng kct qiici tuy ngẫu nhicn nhưng rất phù hợp với muc đích
cần đạt. Trong 5 chủng xạ khuẩn có kha nfmg kháng lại vi khuấn nilrat hoá là vi khuân <>V'


độc cho cây thì chi có một chủng xạ khuẩn có khá năng ức chê những vi khuán có ích, dó là
chủng xạ khuẩn S23. Bốn chủng còn lại không có khả năng ức chê các vi khuân trên. Đay
chính là một điểm mạnh cùa phương pháp sứ dụng xạ khuân sinh kháng sinh.

3.3. K tìả n ă n g ức ch ê của các ch ủ n g xạ kh u ẩn đ ố i với vi kh u ẩn h éo xanh
P seu d o m o n a s so la n a cea ru m
Để xác định khả năng ức chế của các chủng xạ khuẩn đối vói các vi khuân gây bệnh, thí
nghiệm dã được tiến hành trẽn 4 loai vi khuân gây bệnh ờ khoai tây (VKHXKT), cà cluia
(VKHXCC), lạc (VKHXL), vừng(VK! IXV). Kêì quá thí nghiệm dược the liiện ờ hàng I I .
Bâng 11: Khả năng ức chế của các chúng xạ khuẩn với V K H X K T, V K H X L , VKHXCC,
VKHXV.

f
Tên chủng

STT

Đường kính vòng khans sinh (D-d, mm)
VKIIXKH

1

1122

2

1154

3

H6I

4

H33

5

H2D

6

H2T

7

113 1

8

M3 8

9

H62

10

H40

11

H32

12

H58

13

1143

VK HX L

13

8

VKHXV

*

20

-



*

-

-

-

*

15

21

*

-

5

7

-

*

-

-

V K HX CC

-

-

-

-

1
1

■■
15

-

1



-

-

7

12

5

!
'A'
1

14

H5

15

1

25

20



27

119

15

10

16

*

16

HIU

14

-

-

12

17

HI I

*

12

-

-

18

H12

19

í 120

-

8



------------------

IX
~I7


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×