Tải bản đầy đủ

Cố định glucoamylase ứng dụng trong quy trình sản xuất đường glucose

tên đề tài.txt
CỐ ĐỊNH GLUCOAMYLASE ỨNG DỤNG TRONG QUY TRÌNH SẢN XUẤT ĐƯỜNG GLUCOSE
(Giảng viên hướng dẫn:PGS.TS.Nguyễn Tiến Thắng)
SV: Thân Thị Tâm
Lớp: 07DSH3
MSSV: 107111143

Page 1


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến

Chương 1: LỜI MỞ ĐẦU

SVTH: THÂN THỊ TÂM

1


MSSV: 107111143


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến

1. Đặt vấn đề
Enzyme là chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghĩa cho sự sinh trưởng, phát
triển của mọi sinh vật mà nó còn đóng vai trò rất quan trọng trong ngành công
nghiệp chế biến thực phẩm, y học, chăn nuôi, bảo vệ môi trường…
Hiện nay, trên thế giới lượng enzyme sản xuất theo quy mô công nghiệp rất lớn.
Giá trị enzyme công nghiệp tăng hàng năm từ 10 - 15%. Năm 2005, tổng doanh thu
từ các sản phẩm enzyme đạt 3,5 tỷ USD, riêng glucoamylase hàng năm thu trên 40
triệu USD [12].
Việc sử dụng enzyme hòa tan trong quá trình thủy phân thường phải tốn chi phí
rất lớn cho quá trình tinh sạch sản phẩm, tái sử dụng enzyme cũng là vấn đề không
phải dễ dàng. Với việc sử dụng enzyme cố định thay thế enzyme hòa tan đã khắc
phục được những điểm yếu đó. Tuy nhiên việc nghiên cứu khả năng ứng dụng thủy
phân bằng enzyme cố định còn hạn chế do hoạt tính enzyme thấp và thời gian thủy
phân thường kéo dài.
Kết quả một vài nghiên cứu mới đây cho thấy glucoamylase tạo ra từ chủng nấm
mốc Asp.kawasaki, khi nuôi trên môi trường bán rắn sẽ tạo ra năng suất và hoạt tính
cao. Tuy vậy, việc cố định enzyme glucoamylase từ chủng mốc này và ứng dụng
chúng thì chưa được nghiên cứu.
Mặt khác, khoai mì có hàm lượng tinh bột cao nhưng chỉ được sử dụng làm thức
ăn gia súc, một phần được sử dụng trong công nghiệp tinh bột và thực phẩm cho
con người. Điều này làm cho giá trị kinh tế của loại cây này khá thấp. Cho nên, việc
tạo ra các sản phẩm mới có giá trị kinh tế cao từ khoai mì là cần thiết.
Vì vậy, việc cố định enzyme glucoamylase, khảo sát điều kiện thủy phân và ứng
dụng enzyme cố định trong thủy phân tinh bột khoai mì là vấn đề nên quan tâm
nghiên cứu.
2. Tình hình nghiên cứu
Ngày nay, có một vài quy trình công nghiệp ở quy mô lớn đang hoạt động mà có
sử dụng enzyme cố định. Hai ví dụ điển hình là quá trình sản xuất siro fructose từ
tinh bột bắp và quá trình sản xuất L - amino acid từ hỗn hợp L và D amino acid.
SVTH: THÂN THỊ TÂM

2



MSSV: 107111143


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến

Enzyme cố định penicillin acylase cũng được sử dụng rộng rãi trong quá trình sản
xuất penicillin bán tổng hợp.
Tuy nhiên việc sử dụng trực tiếp enzyme glucoamylase ứng dụng trong công
nghệ thực phẩm thì đã ứng dụng lâu. Nhưng việc dùng glucoamylase ở dạng cố
định ứng dụng vào trong quá trình sản xuất thì còn ở dạng nghiên cứu chưa úng
dụng rộng rãi.
3. Mục đích
- Sản xuất đường glucose bằng cách sử dụng enzyme glucoamylase ở dạng
cố định.
4. Mục tiêu
- Thu nhận enzyme glucoamylase từ việc nuôi cấy nấm mốc Asp.kawasaki
trên môi trường bán rắn.
- Cố định enzyme glucoamylase trên gel natrialginate.
- Dùng enzyme cố định này thử nghiệm thủy phân tinh bột khoai mì tạo sản
phẩm đường glucose.
5. Yêu cầu
- Nuôi nấm mốc Asp.kawasaki trên môi trường bán rắn có tỷ lệ cám gạo và
bã khoai mì là 3:2
- Trích ly enzyme bằng nước cất tỷ lệ sinh khối và nước cất là 1:4
- Tủa dịch enzyme trích ly bằng cồn 960 với tỷ lệ dịch enzyme và cồn là 1:3,
thu nhận được enzyme hòa tan.
- Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh lên enzyme glucoamylase.
- Tinh sạch, phân tách và xác định hoạt tính enzyme glucoamylase.
- Cố định enzyme hòa tan trên gel natrialginate 3%.
- Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh lên enzyme glucoamylase cố
định.
- Khảo sát điều kiện thủy phân tối ưu khi thủy phân tinh bột khoai mì bằng
Termamyl ở giai đoạn dịch hóa và glucoamylase cố định ở giai đoạn đường hóa.
- Từ điều kiện thủy phân tối ưu thử nghiệm tạo sản phẩm đường glucose.

SVTH: THÂN THỊ TÂM

3

MSSV: 107111143


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến

6. Phương pháp nghiên cứu
- Sinh tổng hợp enzyme glucoamylase.
- Xác định hàm lượng và hoạt tính enzyme theo phương pháp Bradford và
phương pháp Miller.
- Tinh sạch enzyme bằng phương pháp sắc ký lọc gel.
- Phân tách protein bằng điện di trên polyacrylamide.
- Cố định enzyme trên natrialginate 3%
- Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến enzyme (nhiệt độ, pH, độ bền nhiệt).
- Xác định hoạt tính enzyme amylase Termamyl theo Rose - Smith.
-

Khảo sát quá trình thủy phân tinh bột khoai mì với sự kết hợp enzyme

Termamyl và glucoamylase cố định theo phương pháp tối ưu hóa thực nghiệm.
- Tạo sản phẩm đường glucose.
7. Các kết quả đạt được
- Thu được enzyme glucoamylase.
- Tinh sạch được enzyme và xác định được trọng lượng phân tử của protein.
-

Đã cố định thành công 5g enzyme trên natrialginate 3%. Xác định hoạt

tính, số lần tái sử dụng và hiệu suất cố định.
- Khảo sát được ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh đến glucoamylase và
điều kiện thủy phân tối ưu của tinh bột khoai mì..
-

Tạo sản phẩm đường glucose.

8. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp
Đồ án tốt nghiệp gồm 5 chương:
Chương 1: Lời mở đầu
Chương 2: Tổng quan về tài liệu
Chương 3: Vật liệu và phương pháp
Chương 4: Kết quả và biện luận
Chương 5:Kết luận và kiến nghị

SVTH: THÂN THỊ TÂM

4

MSSV: 107111143


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến

Chương 2:TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU

SVTH: THÂN THỊ TÂM

5

MSSV: 107111143


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến

2.1.Sơ lược về enzyme
2.1.1 Khái quát chung về enzyme [5, tr. 32]
Enzyme theo tiếng Hi Lạp là chất trong nấm men, là một chất xúc tác sinh học
chỉ được tạo thành trong tế bào sinh vật.
Enzyme đóng một vai trò rất quan trọng trong việc tham gia xúc tác cho các phản
ứng sinh hóa của tế bào cơ thể trong điều kiện đẳng nhiệt, đẳng áp. “Sự sống có thể
được định nghĩa là được điều phối của các phản ứng enzyme” [6].
Enzyme tham gia xúc tác cho các phản ứng trong hoặc ngoài tế bào, với đặc điểm
này đã được con người chúng ta ứng dụng enzyme vào cuộc sống.
Mỗi enzyme có tính đặc hiệu riêng biệt với một phản ứng nhất định. Dưới tác
dụng của enzyme các phản ứng sinh hóa xảy ra đạt hiệu quả cao, nhiều phản ứng
xảy ra đồng thời theo dây chuyền, ít tiêu tốn năng lượng.
Enzyme là protein có tính đặc hiệu cao và có hiệu quả hơn gấp nhiều lần so với
các chất xúc tác vô cơ như HCl, H2SO4.
Enzyme là chất rất khó tổng hợp bằng phương pháp hóa học mà nó được thu từ
các nguồn vi sinh vật, thực vật, động vật vì vậy việc sử dụng chúng an toàn.
Enzyme được thu từ nhiều nguồn khác nhau nhưng chỉ có nguồn enzyme từ vi
sinh vật mới đáp ứng được nhu cầu và sản xuất trên quy mô công nghiệp.
Các enzyme từ vi sinh vật có hoạt tính cao, đa dạng, dễ thu nhận. Đặc biệt là
nguyên liệu sản xuất enzyme từ nguồn vi sinh vật đa dạng, phong phú, dễ kiếm và
rẻ tiền.

SVTH: THÂN THỊ TÂM

6

MSSV: 107111143


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến

2.1.2. Lịch sử phát triển của enzyme [5, tr.7]
Bảng 2.1: Tóm tắt lịch sử phát triển của công nghệ enzyme
Stt Năm

Nội dung nghiên cứu, phát triển

1

1833

Payen và Peoz tách được diatase từ malt.

2

1874

Hansen là người đầu tiên tách được gen từ bào tử cừu.

3

1876

Kiihne đầu tiên gọi chất xúc tác sinh học là enzyme.

4

1897

Hai anh em Buchner chứng minh dịch chiết từ nấm men
có thể chuyển hóa đường glucose thành cồn và CO2.

5

1900

Rohm sử dụng protease vào công nghiệp thuộc da và
tẩy rửa.

6

1926

Samner kết tinh được uerase và Northrop kết tinh được
protease.

7

1928

Fleming phát hiện ra penicilline.

8

1930 – 1945

Bắt đầu sản xuất kháng sinh theo quy mô công nghiệp.
Sử dụng glucoamylase thủy phân tinh bột.

9

1972

Boyeretal đưa ra kỹ thuật di truyền và được ứng dụng
vào công nghệ enzyme sau này.

10 1984

Nito xác lập quy trình cơ bản tạo acrylamide và một
loạt các quá trình sản xuất có sự tham gia của enzyme.

11 1984 - nay

Là giai đoạn của việc tạo ra hàng trăm loại enzyme
khác nhau. Enzyme được ứng dụng rộng rãi trong đời
sống con người. Kỹ thuật enzyme cố định ra đời đã đưa
công nghệ enzyme lên tầm cao mới, 1998 Yang đã sử
dụng chất mang pefluorpolymer phủ poly-vinil-alcohol
để cố định -amylase từ B.licheniformis.
(Võ Viết Phi, luận văn thạc sĩ, 2001)

SVTH: THÂN THỊ TÂM

7

MSSV: 107111143


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến

2.1.3.Tính chất của enzyme [6, tr. 12]
2.1.3.1. Bản chất sinh học:
Enzyme được tạo ra bên trong tế bào và chịu sự điều khiển của gen.
Phản ứng của enzyme ít hao tốn năng lượng và có khả năng tham gia phản ứng
cả trong và ngoài tế bào. Một gen  một enzyme  một phản ứng.
Enzyme có thể thu nhận dễ dàng từ các nguồn nguyên liệu khác nhau từ sinh vật,
các enzyme thu nhận từ nguồn thực vật như rau quả thông dụng không có tính chất
gây độc.
Đa số các enzyme hoạt động xúc tác trong các phản ứng sinh học ở điều kiện
nhiệt độ 20 – 450C, 1atm, pH acid yếu, kiềm yếu hay trung tính.
Mỗi enzyme tham gia xúc tác đặc hiệu với một cơ chất nhất định, vận tốc phản
ứng tăng gấp nhiều lần so với chất xúc tác sinh học vì vậy enzyme cần dùng với
lượng rất nhỏ. Có thể điều chỉnh hay ngừng phản ứng bằng nhiệt độ, pH…
2.1.3.2. Bản chất hóa học
Gồm hai nhóm:
 Nhóm enzyme đơn cấu tử: Enzyme chỉ được cấu tạo bởi một thành phần duy
nhất là protein.
 Nhóm enzyme đa cấu tử: Là những loại enzyme mà được cấu tạo bởi hai
thành phần gồm: Một thành phần là protein và thành phần còn lại không phải
protein. Thành phần này là những chất hữu cơ đặc hiệu có vai trò thúc đẩy quá trình
xúc tác.
2.1.4. Nguồn thu nhận enzyme[10]
2.1.4.1. Nguồn enzyme từ động vật
Enzyme có thể lấy từ các tuyến dịch hoặc trên các bộ phận khác trên cơ quan tiêu
hóa như: Tuyến tụy, dạ dày, màng nhầy, tim…chủ yếu cho enzyme protease.
 Ưu điểm: Enzyme từ nguồn động vật có hoạt tính cao và ổn định.
 Nhược điểm: Thu nhận khó, hiệu quả thu nhận và hiệu quả kinh tế không
cao. Có nhiều rủi ro và không ổn định về nguồn nguyên liệu. Chưa có nghiên cứu
nào nhằm tạo ra giống động vật với mục đích thu nhận enzyme.

SVTH: THÂN THỊ TÂM

8

MSSV: 107111143


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến

2.1.4.2. Nguồn enzyme từ thực vật
 Ưu điểm: Trong các bộ phận của thực vật có chứa rất nhiều enzyme và có
hoạt tính rất cao. Phần lớn gồm các loại sau:
 Enzyme amylase: Từ đại mạch nảy mầm (malt).
 Enzyme papain: Từ quả đu đủ.
 Enzyme bromelin: Từ cây dứa.
 Enzyme ficin: Từ quả sung.
 Nhược điểm: Tuy các loài thực vật cho enzyme có hoạt tính cao nhưng cũng
gặp rất nhiều khó khăn do lệ thuộc vào điều kiện thiên nhiên và thời gian thu hoạch
dài, khó đáp ứng nhu cầu sử dụng.
2.1.4.3. Nguồn enzyme từ vi sinh vật
Đây là nguồn enzyme duy nhất được sử dụng để sản xuất enzyme trên quy mô
công nghiệp, nó được quan tâm nhiều để phát triển về khối lượng và số lượng
enzyme. Khác với nguồn động – thực vật các loài vi sinh vật là động vật đơn bào
nên có những ưu điểm hơn hẳn như: Thời gian thu nhận enzyme tương đối ngắn, số
lượng enzyme lớn…
Hoạt tính của enzyme từ nguồn vi sinh vật cao hơn các nguồn động vật, thực vật.
Tốc độ sinh sản của vi sinh vật cao trong thời gian ngắn nên có thể thu được lượng
sinh khối lớn. Từ đó ta có thể chiết xuất ra lượng lớn enzyme.
Ưu điểm lớn nhất của vi sinh vật là chúng rất nhỏ nên dễ dàng được đưa vào các
thiết bị lên men, từ đó sẽ rất dễ dàng điều khiển và kiểm soát các điều kiện nhiệt độ,
pH, nồng độ cơ chất, ánh sáng, lưu thông khí… Nên ta có thể điều khiển được tốc
độ sinh tổng hợp enzyme.
Nguyên liệu dùng để nuôi vi sinh vật sản xuất enzyme là nguồn nguyên liệu rẻ
tiền và dễ kiếm, thường là các phế liệu của các ngành công nghiệp.
Có nhiều phương pháp để nuôi cấy và thu nhận enzyme từ vi sinh vật tùy vào
điều kiện khác nhau nhưng hiện nay việc nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường bán
rắn đang được tập trung nghiên cứu và được đánh giá là mang lại hiệu quả cao trong
việc thu nhận enzyme.

SVTH: THÂN THỊ TÂM

9

MSSV: 107111143


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến

2.2. Sơ lược về hệ enzyme amylase
2.2.1. Giới thiệu về amylase [13]
Amylase là hệ enzyme quan trọng nhất và có ý nghĩa to lớn trong công nghệ chế
biến thực phẩm. Các enzyme này có trong dịch tiêu hóa, hạt nảy mầm, trong nấm
mốc... mặc dù được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau nhưng chỉ có enzyme từ vi
sinh vật mới đáp ứng được nhu cầu sản xuất công nghiệp.
Đối với amylase được thu nhận từ nguồn vi sinh vật thì có khả năng chịu nhiệt
cao. Tuy nhiên để thu được enzyme có hiệu suất cao thì cần phải lưu ý tới việc phân
lập và tuyển chọn giống kỹ.
Với những tiến bộ trong công nghệ sinh học, hiện nay amylase được ứng dụng
rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: Trong y học, hóa phân tích, đường hóa
tinh bột, dệt nhuộm, công nghiệp thực phẩm, đồ uống và công nghiệp lên men.
Đây là nhóm enzyme thủy phân, xúc tác các phản ứng phân giải liên kết nội phân
tử trong polysaccharide với sự tham gia của nước.
Tinh
bột

-amylase

Dextrin +
oligosaccaride

Dextrin - amylase
maltos
e

Dextrin không nhánh

 - amylase

Glucose

Hình 2.1: Hoạt động của hệ enzyme amylase
2.2.2. Phân loại enzyme amylase [1, tr. 35]
Hiện nay có 6 loại enzyme amylase bao gồm: -amylase, -amylase, -amylase,
dextrin-6-glucanhydrolase,

amylopectin-6-lucanhydrolase



cuối

cùng



oligodextrin-6-glucanhydrolase thủy phân các liên kết oligodextrin -1,6 glucoside.
Trong đó được ứng dụng nhiều nhất là các enzyme amylase gồm , ,  -amylase.
SVTH: THÂN THỊ TÂM

10

MSSV: 107111143


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến

2.2.2.1. - amylase (endo-1 ,4-a-D-glucan glucohydrolase )
Enzym -amylase là enzyme ngoại bào tan tốt trong nước, nó phân cắt một cách
ngẫu nhiên các liên kết -D-1,4-glucoside trong mạch tinh bột, thủy phân tinh bột
tạo ra đường được gọi là -amylase đường hóa. Sản phẩm chính của quá trình thủy
phân tinh bột bằng -amylase dịch hóa gồm dextrin, maltodextrin.

-amylase
Tinh bột
(hoặc glucogen)

dextrin + maltose + glucose

Hình 2.2: Sơ đồ thủy phân tinh bột bằng -amylase
2.2.2.2. - amylase (a-1,4-glucan maltohydrolase)
Thường có nguồn gốc thực vật. Đây là một enzyme phân cắt từ đầu không khử
của phân tử amylose, amylopectin và phân tử glycogen.
Enzyme  - amylase tham gia vào phân hủy liên kết -1,4-glucoside và tạo ra
maltose (dưới dạng -anomeric). -amylase không thể thủy phân liên kết -1,6glucoside trong phân tử amylopectin, sản phẩm thủy phân gồm 50-60% là maltose
và dextrin.

-amylase
tinh bột

maltose + dextrin

Hình 2.3: Sơ đồ tác dụng thủy phân của - amylase
2.2.2.3.  - amylase hay glucoamylase
Được gọi dưới nhiều tên gọi khác nhau: -1,4:1,6-glucan-4:6-glucohydrolase;
glucoamylase (GA); amyloglucosidase; maltulase…

SVTH: THÂN THỊ TÂM

11

MSSV: 107111143


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến

Glucoamylase là enzyme ngoại bào, có khả năng thủy phân liên kết -1, 4 và liên
kết -1,6 glucoside. Khi thủy phân liên kết -1, 4 glucan trong chuỗi polysaccaride,
glucoamylase tách lần lượt từng phân tử glucose ra khỏi đầu không khử của mạch
để tạo đường glucose.
Glucoamylase còn có khả năng thủy phân liên kết -1, 2 và -1, 3 glucoside.
Nhờ có tính năng này mà glucoamylase trở thành enzyme hàng đầu về hiệu lực thủy
phân tinh bột.

Hình 2.4: Cấu trúc phân tử glucoamylase
(Nguồn: http://nte-serveur.univ-lyon1)

Glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glycogen, amylopectin,
dextrin, maltose thành glucose, chúng phân giải các polysacharide có phân tử lớn
nhanh hơn các phân tử nhỏ.
Sơ đồ thủy phân glucid bởi enzyme glucoamylase như sau:
Tinh bột hay oligosaccharide

80% -100% glucose

(có liên kết -1, 4 và -1,6 glucoside)

Hình 2.5: Sơ đồ thủy phân glucid bởi glucoamylase
SVTH: THÂN THỊ TÂM

12

MSSV: 107111143


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến

Khi đun nóng lên 700C thì glucoamylase gần như bị mất hoạt tính. Chúng bị các
chất độc sulfurhydryl kìm hãm, do chúng liên kết với nhóm –SH trong trung tâm
hoạt động của enzyme. Các chế phẩm GA của nấm sợi và của mô động vật khác
nhau về độ bền vững đối với tác động của kim loại nặng như: Cu, Fe, Hg…
Glucoamylase bền với acid hơn - amylase nhưng kém bền hơn trong nước,
aceton và không được bảo vệ bởi Ca2+.
Các glucoamylase có hoạt lực cao nhất ở vùng pH acid 3,5-5,5 và nhiệt độ tốt
nhất từ 45-600C.
Bảng 2.2: Khả năng hoạt động của glucoamylase từ một số loài vi sinh vật
Stt Nguồn enzyme

1

2

Aspergillus niger

Khoảng pH hoạt

Khoảng nhiệt độ

động tối ưu

tối ưu (0C )

3,0-6,0

55-60

Tối ưu ở 4,5-5,0

Mất hoạt tính ở 90 C

Aspergillu sawamori 2,0-7,0
Tối ưu ở 3,0-5,0

0

55-65
0

Mất hoạt tính ở 85 C
55-60

3

Rhizopus niveus

3,0-6,0
Tối ưu ở 3,0-5,5

0

Mất hoạt tính ở 70-80 C

Đa số các chế phẩm glucoamylase của các vi sinh vật (vi khuẩn, nấm sợi, nấm
men) và của mô động vật đều có pH hoạt động tối thích ở vùng acid trừ
glucoamylase của Saccharomyces italicus và một số mô động vật (gan chuột, niêm
mạc ruột non chuột) có pH hoạt động tối thích ở vùng trung tính.
Mỗi loại vi sinh vật cho một số lượng enzyme glucoamylase khác nhau và đặc
biệt là khả năng hoạt động của các enzyme tạo ra từ các nguồn đó cũng khác nhau.
SVTH: THÂN THỊ TÂM

13

MSSV: 107111143


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến

Sau đây là các nguồn thu nhận glucoamylase chính từ vi sinh vật [11]:
Bảng 2.3: Một số tính chất của glucoamylase từ các loài vi sinh vật
Kiểu enzyme

Nguồn enzyme

Tên gọi

% tinh bột
thủy phân

Rhizopus

Rh. delemar

Glucoamylase

92

delemar

Rh. delemar

Amylase cắt nhánh

100

A. awamori

Amyloglucosidase

100

A. niger

Glucoamylase

100

Amyloglucosidase

100

Aspergillus

A. usamii

-amylase

70

niger

Rh.tonkinensis

Amyloglucosidase

80

A. niger

Amyloglucosidase

80

A. niger

Taka-amylase

80

A.oryzae

Amylase

đường

hóa 78

A. awamori

Amyloglucosidase

78

Neurospora

Amyloglucosidase

75

Monaseus

Amyloglucosidase

74

2.2.3. Ứng dụng của amylase [5, tr. 398]
Các chế phẩm của amylase được ứng dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực phục
vụ đời sống con người, đặc biệt là công nghiệp thực phẩm.
2.2.3.1. Trong công nghiệp thực phẩm [9]
Chế phẩm enzyme amylase được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm
như sản xuất bánh mì, bánh ngọt, sản xuất rượu bia, trong công nghiệp dệt để rũ hồ
vải, trong nông nghiệp, sản xuất thức ăn gia súc, trong y dược phẩm…
Trong những ứng dụng của amylase thì ứng dụng trong công nghiệp lên men (sản
xuất rượu, bia) và công nghiệp thủy phân tinh bột là quan trọng nhất.

SVTH: THÂN THỊ TÂM

14

MSSV: 107111143


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến

Sử dụng các enzyme amylase vi sinh vật cho phép thủy phân sâu tinh bột thành
đường trong một thời gian ngắn (30-40 phút).
Mặt khác trong các chế phẩm dùng trong công nghiệp rượu thì ngoài các enzyme
amylase ra còn có mặt enzyme protease. Vì vậy, khi dùng chế phẩm enzyme
amylase, không chỉ tinh bột bị thủy phân mà cả thành tế bào nguyên liệu thực vật,
màng vỏ… cũng bị phân hủy làm cho tinh bột tiếp xúc với các amylase tốt hơn,
mức độ sử dụng chất khô của nguyên liệu tăng lên. Kết quả là hiệu suất thu hồi rượu
tăng trung bình 1,5% nhờ các đường lên men được tạo thêm từ các polysacharide
khác (hemicellulose, cellulose, ...).
Trong quá trình đường hóa, glucoamylase chiếm vị trí hàng đầu và đóng vai trò
quyết định trong việc chuyển tinh bột thành đường tạo ra nhiều sản phẩm có giá trị
như: Siro glucose, đường glucose tinh có thể sử dụng trong công nghiệp thực phẩm.
Ngoài ra, amylase còn được dùng trong sản xuất bia, nước giải khát, nước trái
cây hòa tan, bánh mì, bánh ngọt, trong dược phẩm…
2.2.3.2. Trong y học
Amylase cùng các loại enzyme khác được ứng dụng rất nhiều trong lĩnh vực y
học để chữa các bệnh do thiếu enzyme như kém khả năng chuyển hóa các chất,
bệnh về tiêu hóa… Ngoài ra chế phẩm amylase dùng để điều chế môi trường nuôi
cấy vi sinh vật phục vụ cho công tác nghiên cứu khoa học.
2.2.3.3. Trong chăn nuôi
Amylase được sử dụng để sản xuất các loại thức ăn gia súc dễ tiêu hóa, giúp gia
súc sử dụng và hấp thu một số loại thức ăn khó tiêu. Amylase thường được sử dụng
cùng một số loại enzyme khác như: protease, hemicellulase, cellulase… nhằm sản
xuất ra các loại thức ăn dễ tiêu cho gia súc, gia cầm.
2.2.3.4. Trong công nghiệp dệt, giấy
Chế phẩm amylase dùng để tẩy lớp hồ bột trên vải làm vải mịn, mềm, dễ tẩy
trắng, dễ bắt màu khi nhuộm. Xử lý vải bằng enzyme tốt hơn phương pháp hóa học
rất nhiều. Xử lý bằng enzyme không những nhanh mà còn bền, đảm bảo vệ sinh,
nước thải sẽ được xử lý dễ dàng hơn, từ đó nâng cao được năng suất.

SVTH: THÂN THỊ TÂM

15

MSSV: 107111143


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến

2.2.4. Cơ chất của amylase: Cơ chất của amylase là tinh bột, glycogen.
2.2.4.1. Tinh bột [1, tr. 123]
 Đặc điểm
Tinh bột là chất bột vô định hình màu trắng, không tan trong nước lạnh nhưng
khi đun sôi thì tinh bột sẽ bị hồ hóa khoảng 60-80%. Tinh bột là nhóm carbohydrate
ở thực vật chủ yếu có trong các loại củ như: Khoai mì, khoai tây, khoai lang, lúa mì,
gạo, bắp… là chất cung cấp năng lượng quan trọng.
Năm 1940, Meyer đã cho biết rằng tinh bột được cấu tạo từ amylose và
amylopeptin.
Dưới tác dụng của enzyme amylase hoặc acid thì chúng bị thủy phân do các liên
kết glucoside bị phân cắt. Khi tác dụng với I2 chúng có màu xanh.
 Tính chất
Tinh bột là một polysacharide bậc hai, đồng thể. Phân tử có khối lượng lớn mà
các đơn phân là -D-glucose liên kết với nhau bằng liên kết 1,4- glucoside và liên
kết 1,6-glucoside. Công thức hóa học tổng quát (C6H1005)n, tồn tại ở hai dạng cấu tử
là amylose và amylopectin có cấu tạo và tính chất khác nhau. Tuy nhiên đa phần các
tinh bột gồm 20-30% amylose và 70-80% là amylopectin.
 Amylose: Có trọng lượng phân tử từ 50.000-160.000 và amylose được
cấu tạo bởi 200 -1.000 phân tử D-glucose nối với nhau bằng liên kết -1,4glucoside tạo thành một mạch xoắn dài không phân nhánh. Amylose dễ tan trong
nước tạo thành dịch nhớt không cao và bắt màu với iod.

Hinh 2.6: Cấu trúc phân tử amylose
(Nguồn: http://images.google.com.vn/imgres)

SVTH: THÂN THỊ TÂM

16

MSSV: 107111143


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến

 Amylopectin: Có trọng lượng phân tử rất lớn tới hàng chục triệu đơn
vị, được cấu tạo bởi từ 600 – 6.000 phân tử D -glucose, các phân tử D -glucose nối
với nhau bởi liên kết -1,4- glucoside và -1,6- glucoside tạo thành các mạch nhiều
nhánh. Amylopectin cho màu tím đỏ với iod, hòa tan trong nước nóng tới 60- 90%
cho dung dịch có độ nhớt cao.
Hinh: Cấu trúc phân tử amylopectine

Hình2.7: Cấu trúc phân tử amylopectin
(Nguồn: http://images.google.com.vn/imgres)

2.2.4.2.

Glycogen [10]

Glycogen là một loại carbohydrate được dự trữ ở các bộ phận của động vật và
được cơ thể chuyển hóa sử dụng từ từ. Glycogen được cấu tạo bởi các glucose liên
kết với nhau bởi sự liên kết các -1,4- glucoside.
Glycogen có số mạch nhánh nhiều hơn tinh bột, phân tử lượng từ 2- 3 triệu, dễ
tan trong nước, tập trung chủ yếu ở gan động vật.
Cấu trúc phân tử glycogen

Hình 2.8: Cấu trúc glycogen
(Nguồn: http://hoanmysaigon.com/index.php)

SVTH: THÂN THỊ TÂM

17

MSSV: 107111143


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến

2.3. Sơ lược về enzyme cố định [5, tr. 102]
2.3.1. Khái niệm
Enzyme cố định (hay còn gọi là enzyme không hòa tan) là những enzyme chuyển
động trong không gian bị giới hạn. Sự giới hạn của enzyme đạt được bằng cách đưa
nó vào một pha cách ly, tách rời khỏi pha dung dịch tự do mà ở đó nó vẫn có khả
năng tiếp xúc được với các phân tử cơ chất. Pha chứa enzyme cố định thường
không tan trong nước nhưng cũng có thể là các polymer ưa nước cao phân tử.
Theo Michea Trevan, thuật ngữ cố định (immobilization enzyme, insoluble
enzyme) được hiểu là đưa những phân tử enzyme vào những pha riêng rẽ, pha này
được tách riêng với dung dịch tự do.
Theo Kalus Mosbach, các chất xúc tác sinh học cố định là enzyme, tế bào hoặc
tổ hợp giữa chúng trong một trạng thái cho phép sử dụng lại và liên tục.
2.3.2. Đặc điểm và ứng dụng
Như chúng ta đã biết, enzyme không tan có nhiều ưu điểm, nó có thể được tách
khỏi hỗn hợp sản phẩm và phần cơ chất chưa phản ứng dễ dàng. Có thể tái sử dụng
trong phản ứng tiếp theo.
Enzyme cố định thường có độ bền cao trong một dải rộng pH, nhiệt độ và có khả
năng sử dụng trong các thiết bị phản ứng liên tục. Tuy nhiên, các enzyme cố định
còn ít được ứng dụng trong công nghiệp do một số hạn chế như khó khăn khi sử
dụng ở quy mô lớn, chi phí cho chất mang và kỹ thuật cố định cao… Đặc biệt đối
với trường hợp enzyme amylase.
Do enzyme thường được cố định trong các chất mang dạng hạt xốp, cơ chất của
amylase có kích thước lớn nên cơ chất và enzyme khó tiếp xúc với nhau và hiệu
suất enzyme cố định không cao.
Hiện nay enzyme cố định được dùng nhiều nhất trong sản xuất sirô giàu fructose,
còn ở mức độ nghiên cứu, amylase cố định chủ yếu là GA. Người ta sử dụng
enzyme cố định trên màng có độ bền nhiệt độ cao, được sử dụng trong thiết bị có
khả năng hiệu suất thủy phân và khả năng tách sản phẩm khỏi cơ chất.

SVTH: THÂN THỊ TÂM

18

MSSV: 107111143


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến

2.4. Cơ chất được sử dụng làm môi trường bán rắn
2.4.1. Cám gạo
2.4.1.1. Đặc điểm
Cơ chất chính của môi trường lên men tạo amylase bằng phương pháp bề mặt
thường là cám gạo. Nó là nguyên liệu hoàn hảo và có thể là một cấu tử duy nhất của
môi trường để nuôi vi sinh vật.
Cám gạo là phụ liệu của một ngành sản xuất lương thực lớn ở nước ta, một nước
xuất khẩu gạo đứng hàng thứ hai trên thế giới về sản lượng cũng như chất lượng.
Do đó, việc dùng cám gạo làm nguyên liệu là một lựa chọn đúng đắn về giá thành,
đặc biệt phù hợp để nuôi cấy nấm mốc thu nhận enzyme bằng phương pháp lên men
bán rắn.
2.4.1.2. Thành phần [17]
Độ ẩm của cám gạo không quá 15%, tạp chất độc không quá 0,05%, …
Thành phần chính gồm: 20% tinh bột, 10-15% chất béo, 10-14% protein, 8-16%
cellulose, các chất hòa tan không chứa nitơ 35-59%.
2.4.2. Bã khoai mì
2.4.2.1. Đặc điểm
Ở Việt Nam, hiện nay có khá nhiều nhà máy sản xuất tinh bột khoai mì. Ở Tây
Ninh, có hơn chục nhà máy với tổng công suất 2.000 tấn củ/ ngày, như vậy lượng
bã thải ra là 1000 tấn / ngày và còn nhiều công ty khác như công ty Ajinomoto,...
Bã khoai mì tươi chứa hàm lượng nước rất cao. Việc chọn bã khoai mì trong sản
xuất amylase bằng phương pháp lên men bán rắn là chọn lựa phù hợp nhất cả về
mặt kỹ thuật, giá cả và nguồn cung cấp.
2.4.2.2. Thành phần [11]
Theo tác giả Keliku thành phần chủ yếu của khoai mì gồm: Tinh bột chiếm 8487%, đường tổng số 4%, protein 1,2%, lipid 0,3%, chất xơ 1,5%, chất tro 0,8%, còn
lại là các chất khác như: Ca, P, Fe, vitamin C, caroten, niacin. Bã khoai mì là phần
còn lại của củ khoai mì sau khi đã tách tinh bột, thành phần chủ yếu là chất xơ và
lượng tinh bột ít.

SVTH: THÂN THỊ TÂM

19

MSSV: 107111143


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến

2.4.3. Gạo lứt [16]
2.4.3.1. Đặc điểm
Là nguyên liệu gạo sau xay xát chưa kỹ, hàm lượng chất dinh dưỡng cao và chứa
đủ dưỡng chất. Gạo lứt cho hiệu quả rất lớn trong nuôi cấy vi sinh vật thu nhận
enzyme từ môi trường bán rắn. Tuy nhiên việc sử dụng chúng sẽ tốn kém hơn các
cơ chất là phế liệu công – nông nghiệp.
2.4.3.2. Thành phần
Thành phần chính gồm tinh bột 66.1%; protein 7,1%; cellulose 10%; chất béo
2,3%; kali 0,2%; độ ẩm 10-11% (Sliva 1998).
2.5. Tổng quan về nấm mốc Asp. kawasaki [2]
2.5.1. Phân loại
Sử dụng chủng thương mại do Jaegaki Bio - Industry Inc Nhật Bản cung cấp.
Bào tử giống được giữ tại Viện Sinh học Nhiệt đới trên môi trường gạo lứt.
Asp.kawasaki thuộc:
Giới

Nấm

Ngành:

Ascomycote

Bộ:

Eurotiales

Họ:

Trichocomaceae

Giống:

Aspergillus

Loài:

Aspergillus kawasaki

Hình 2.9: Hệ sợi nấm Asp.kawasaki ở thời điểm 40 giờ
(Nguồn: Võ Viết Phi, luận văn thạc sĩ, 2001 )

Nấm Asp.kawasaki là loại nấm mốc phát triển rất nhanh, khả năng tồn tại trong
môi trường cao. Nhưng hiện tại rất ít được biết tới tại Việt Nam, chỉ những năm gần
SVTH: THÂN THỊ TÂM

20

MSSV: 107111143


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến

đây do đặc tính tạo glucoamylase với hiệu suất cao nên đang được nghiên cứu ở các
viện nghiên cứu.
Asp.kawasaki có màu vàng nâu, màu hoa cau… Hệ sợi, khuẩn ty có vách ngăn,
sinh sản bằng bào tử, trên đầu tế bào mọc các cuống sinh bào tử đính. Các bào tử
đính xòe ra như những bông hoa, không có diệp lục tố, khả năng sinh ra độc tố chưa
được biết tới nhưng cũng như những loài mốc khác nó cũng gây hư hỏng các sản
phẩm nông nghiệp.
2.5.2. Đặc điểm sinh học
Asp.kawasaki sinh trưởng nhiệt độ tối ưu 30 – 350C, nhiệt độ tối đa 60 – 650C,
tối thiểu 6 – 80C, pH tối ưu 5,0, độ ẩm tối thích 40 – 45%, sinh trưởng và phát triển
trong môi trường cần có oxy. Quá trình sinh trưởng, phát triển sinh ra nhiệt độ giải
phóng nhiệt. Phát triển rất tốt trong môi trường khoáng Czapeck, có mặt của ion
Mn2+, Cu2+ sẽ sinh ra glucoamylase nhiều hơn.
2.5.3. Đặc điểm sinh hóa
Asp.kawasaki có khả năng đồng hóa tốt đường glucose và maltose. Có khả năng
tổng hợp các lại enzyme amylase ngoại bào nhưng nhiều nhất là glucoamylase để
thủy phân rất tốt tinh bột thành dextrin và từ dextrin ra glucose. Nếu pH > 6 thì
glucoamylase bị mất hoạt tính nên nuôi loài nấm mốc nào phải chú ý tới pH của
chúng.
2.5.4. Môi trường phát triển tối ưu
Asp. kawasaki phát triển tốt nhất trên môi trường chứa nhiều tinh bột và xốp mà
nổi bật nhất là môi trường cám gạo : bã khoai mì (tỷ lệ 3:2).
Độ ẩm môi trường 40 – 45%, cần oxy (thoáng khí), pH5, môi trường khoáng
Czapeak hoặc khoáng Czapeak có bổ sung thêm hai thành phần đồng và kẽm đã
được nghiên cứu gần đây.
2.6. Các yếu tố ảnh hưởng tới tổng hợp glucoamylase[9]
Mọi hoạt động sống của vi sinh vật đều liên quan chặt chẽ tới môi trường sống
của chúng, các vi sinh vật không chỉ có những nhu cầu về thành phần và số lượng
các chất dinh dưỡng mà còn chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác như: Nhiệt độ,

SVTH: THÂN THỊ TÂM

21

MSSV: 107111143


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến

độ ẩm, dinh dưỡng… các yếu tố này có thể làm kích thích hoặc ức chế sinh tổng
hợp enzyme thậm chí còn làm vi sinh vật bị tiêu diệt suốt thời gian bảo quản cả khi
sử dụng.
2.6.1. Ảnh hưởng của pH
Mỗi loài vi sinh vật thích hợp với một giá trị pH nhất định của môi trường nuôi
cấy. Thậm chí cùng một chủng vi sinh vật thì pH thích hợp cho sự sinh trưởng cũng
khác với pH cần cho sự sinh tổng hợp một sản phẩm.
Trong quá trình lên men, vi sinh vật tạo ra những sản phẩm trao đổi chất có tính
acid hay kiềm làm cho pH của môi trường không thích hợp cho hoạt động sống. Vì
vậy, việc chủ động điều chỉnh pH của môi trường luôn ở giá trị thích hợp trong suốt
quá trình lên men là điều cần thiết.
2.6.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của vi sinh vật
và hiệu quả lên men, nhiệt độ cao ảnh hưởng rất mạnh và trực tiếp đối với vi sinh
vật, nhiệt độ từ 60 – 700C kéo dài trong 30 phút có thể gây biến tính protein hoặc có
thể làm hệ enzyme không hoạt động được, vi sinh vật dễ dàng bị tiêu diệt.
Khi hạ nhiệt độ xuống thấp không ảnh hưởng mãnh liệt như lúc tăng nhiệt độ lên
cao, tuy không tiêu diệt vi sinh vật nhưng sẽ gây ức chế mọi hoạt động sống của
chúng.
Đối với nấm mốc Asp.kawasaki thì nhiệt độ tối ưu là 30 – 350C để sống và sinh
tổng hợp ra enzyme tốt nhất, nếu tăng nhiệt độ lên 100C thì sự tạo ra enzyme sẽ
giảm. Nhưng nếu hạ nhiệt độ xuống mức như vậy tuy ảnh hưởng không bằng nhưng
cũng làm giảm hoạt tính của enzyme.
2.6.3. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng
Enzyme chia làm 2 nhóm:
 Nhóm 1: Là enzyme cảm ứng có nghĩa là sự tồn tại cơ chất của môi trường
sẽ kéo theo sự tăng lên của enzyme tương ứng để thủy phân cơ chất đó. Cơ chất
nuôi Asp.kawasaki để tổng hợp glucoamylase là tinh bột.

SVTH: THÂN THỊ TÂM

22

MSSV: 107111143


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến

 Nhóm 2: Là enzyme bản thể, được tạo thành trong cơ thể không phụ thuộc cơ
chất có hay không có trong môi trường.
Thành phần môi trường cũng cần chứa các chất khoáng như: P, S, Mn2+, K, Na…
Nếu không sẽ làm thay đổi đáng kể sự trao đổi chất trong tế bào vi sinh vật nhưng
chỉ cần lượng cần thiết nhất định.
2.6.4. Ảnh hưởng của độ ẩm
Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu của môi trường là 35-60% đối với các
chủng nấm mốc như Aps.niger, Aps.awamori, Asp.flavus, Asp.oryzae và phải giữ
cho môi trường có độ ẩm đó trong suốt quá trình nuôi, tuỳ thuộc vào đặc tính sinh
lý của từng chủng vi sinh vật.
Độ ẩm vượt quá 55-70% sẽ làm giảm độ thoáng khí, nhưng nếu nhiệt độ thấp
hơn 40 – 55% thì kìm hãm sự sinh trưởng, phát triển và tạo enzyme của nấm mốc.
Khi nuôi trong điều kiện không được vô trùng tuyệt đối (trên các khay), thì độ ẩm
môi trường sau khi cấy giống không vượt quá 60%, vì cao hơn nữa sẽ dễ bị nhiễm
khuẩn.
2.6.5. Ảnh hưởng của thời gian thu nhận enzyme
Thời gian nuôi cấy để có lượng amylase cực lớn được xác định bằng thực
nghiệm. Tùy thuộc vào tính chất sinh lý của chủng vi sinh vật và sự sinh tổng hợp
enzyme mà có thể ngừng sinh trưởng của nấm mốc vào bất kỳ lúc nào thấy cần
thiết. Đối với đa số nấm mốc sự tạo bào tử là hiện tượng không mong muốn vì như
thế thường làm giảm hoạt tính enzyme. Trong điều kiện thoáng khí tốt, thời gian
nuôi cấy để có thể tích lũy amylase cực đại đối với từng loại nấm mốc khác nhau
cũng khác nhau.

SVTH: THÂN THỊ TÂM

23

MSSV: 107111143


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến

2.7. Tổng quan về cây khoai mì và tinh bột khoai mì
2.7.1. Đặc điểm cây khoai mì[18]
Cây khoai mì còn được gọi với tên khác là cây
sắn, tên khoa học của nó là Manihot esculenta
Crantz, tiếng anh là Cassava hay Tapioca là một
trong số những loại cây lương thực mọc ở hơn 80
quốc gia có khí hậu nhiệt đới ẩm.
Cây khoai mì cao khoảng 1-5m, thân cây có 3
lõi đơn hoặc phân nhánh, lá có thùy sâu dạng chân
vịt, vỏ củ có màu đỏ hoặc xanh, thời gian tạo củ
sau khi trồng khoảng 45-60 ngày, thời gian thu
hoạch sau khi trồng khoảng 10-12 tháng. Với kỹ
Hình 2.10 : cây khoai mì

thuật trồng trọt ngày nay cây khoai mì có thể đạt

(Nguồn:http://vi.wikipedia.org)

năng suất 40-60 tấn/ha, hàm lượng tinh bột 2535% khối lượng củ tươi và đến 85% khối lượng
chất khô..

Bảng 2.4: Thành phần dinh dưỡng của khoai mì trong 100g nguyên liệu
Thành phần

Dạng củ tươi chưa bóc vỏ Dạng bột thô

Nước (g)

59,4

9,5

Năng lượng (kcal)

157

338

Protein (g)

0,7

1,6

Lipid (g)

0,2

0,4

Chất xơ (g)

0,6

8

Carbonhydrate (g)

38,1

84,9

Tro (g)
Calcium (mg)

1
50

18
60

Thiamin (mg)

0,05

0,08

Sắt (mg)

0,9

3,5

Vitamin (mg)

25,2

----

SVTH: THÂN THỊ TÂM

24

MSSV: 107111143


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×