Tải bản đầy đủ

báo cáo công nghệ sinh học dược

1


BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NGHỆ SINH HỌC DƯỢC
Nội dung báo cáo:
Báo cáo thực tập bài 1, 3, 4, 5 và bài 9 hoặc bài 10.
Mỗi tiểu nhóm báo cáo 1 bài, lớp có 3 nhóm lớn, gồm 24 tiểu nhóm.
Tên của các thành viên trong nhóm, tiểu nhóm, nhóm thực tập ghi ở trang bìa.
Báo cáo trên giấy A4, đánh vi tính font Time New Roman, size 13. Không cần bìa
cứng.
Nội dung bài báo cáo trình bày như sau:
1. Tóm tắt lý thuyết (2 điểm): lý thuyết liên quan đến bài thực hành, không trình bày
lại lý thuyết trong sách thực hành hay sách lý thuyết mà cần biên tập lại.
2. Kết quả (6 điểm): trình bày kết quả thu thập trong quá trình thí nghiệm, không
trình bày lại quy trình thí nghiệm và các bước tiến hành.
3. Bàn luận (2 điểm): nhận định kết quả thực hiện, so sánh các thông số, liên hệ với
các tài liệu liên quan.

2



Bài 1. Chọn lọc giống vi sinh vật
1.1. Tóm tắt lý thuyết
Các giai đoạn của quá trình chọn lọc giống vi sinh vật:
• Phân lập từ tự nhiên.
• Gây đột biến .
• Phát hiện dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn.
• Bảo quản giống
Một số phương pháp phát hiện giống vi sinh vật có đặc tính mong muốn:
• Phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng sinh enzym
• Xác định khả năng kháng khuẩn của vi sinh vật

1.2. Kết quả và bàn luận
1.2.1. Phát hiện vi sinh vật sinh enzym amylase và protease
a. Hình ảnh của đĩa phân lập và phát hiện khả năng sinh enzym
Protease ngoại bào
 Trước khi nhỏ TCA 50%

Gelatin 4

Gelatin 5

Gelatin 6

 Sau khi nhỏ TCA 50%

Gelatin 5

Gelatin 4

Gelatin 6
3


Amylase ngoại bào
 Trước khi nhỏ Lugol

Tinh bột 4

Tinh bột 6


Tinh bột 5

 Sau khi nhỏ Lugol

Tinh
Tinh bột
bột 45

Tinh bột 6
b. Kết quả phân lập và phát hiện khả năng sinh enzym ngoại bào
Bảng 1. Kết quả phân lập và phát hiện khả năng sinh enzym ngoại bào
Chủng
1

Mô tả khuẩn lạc*
1.1 Amylase ngoại bào
- Khóm rìa răng cưa to: 1,3cm
- Khóm rìa gần tròn: 1cm
- Khóm tròn vàng: 0,1cm
- Khóm tròn trắng: 0,1cm
1.2 Protease ngoại bào
- Khóm màu hồng: 0,1cm
- Khóm màu vàng: 0,1cm
- Khóm to nhất có răng: 2cm
- Khóm to nhì: 1,9cm
- Khóm trắng đục: 0,1cm
- Khóm có vòng bên ngoài: 0,4cm

Amylase**
1,13cm

Protease**
0,98cm

4


2

3

- Khóm trắng đục: 0,3cm
2.1 Amylase ngoại bào
- Khóm màu vàng: 0,1cm
- Khóm trắng đục: 0,2cm
- Khóm trắng trong có đốm đục ở giữa:
0,1cm
2.2 Protease ngoại bào
- Khóm có răng cưa: 2,1cm
- Khóm trắng đục: 0,1cm
- Khóm màu vàng: 0,1cm
3.1 Amylase ngoại bào
- Khóm tròn trắng đục, đường kính
0,1cm.
- Khóm tròn vòng, đường kính 0,05cm.
3.2 Protease ngoại bào
- Khóm có răng cưa, đường kính 0,5cm.
- Khóm màu vàng, đường kính 0,1cm.
- Khóm trắng đục, đường kính 0,1cm.

0,2cm

1,03cm

0,1cm

0,67cm

*Mô tả khuẩn lạc gồm: hình thái khuẩn lạc, kích thước khuẩn lạc.
** Ghi nhận đường kính vòng phân giải, hoặc đường kính vùng kháng khuẩn.
1.2.2. Phát hiện khả năng sinh kháng sinh
Bảng 2. Kết quả phát hiện khả năng sinh kháng sinh
Chủng
E. coli**
S. aureus**
Bacillus 1
1,8
2
Bacillus 2
2,1
2,3
Bacillus 3
2,2
2,5
Bacillus 4
0
0
** Ghi nhận đường kính vùng kháng khuẩn (cm)
1.2.3. Bàn luận
a) Phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng sinh enzym.
 Amylase ngoại bào.
- Vi sinh vật có sinh amylase sẽ có vòng sáng quanh chỗ vi sinh vật mọc
(tinh bột bị phân giải thành glucose, nên không tạo màu với iod thuốc
thử).
- Từ kết quả thí nghiệm cho thấy chủng vi sinh vật trong mẫu đất sau khi
phân lập trên môi trường thạch tinh bột và ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ
có khả năng tiết amylase ngoại bào chỉ tại môi trường phát hiện dùng ống
4.
5


-

-

-

Sau khi nhỏ Lugol phát hiện:
+ Vòng sáng rõ tại môi trường phát hiện ống 4.
+ Tại môi trường phát hiện ống 5 hầu như không có vòng sáng.
+ Tại môi trường phát hiện ống 6 không có vòng sáng.
 Protease ngoại bào.
Vi sinh vật có sinh protease sẽ có vòng sáng quanh chỗ vi sinh vật mọc
(gelatin bị phân giải nên không tạo tủa với TCA).
Từ kết quả thí nghiệm cho thấy chủng vi sinh vật trong mẫu đất sau khi
phân lập trên môi trường thạch gelatin và ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ
có khả năng tiết protease ngoại bào.
Cụ thể: + Môi trường phát hiện ống 4>5>6 về khả năng sinh protease.
+ Sau khi nhỏ TCA 50% cả 3 môi trường đều tạo vòng sáng quanh
chỗ vi sinh vật mọc.

b) Kháng sinh.
- Chủng Bacillus B1,B2,B3 có khả năng sinh kháng sinh ức chế sự phát triển của
E.coli (Khả năng sinh kháng sinh: B3>B2>B1).
- Chủng Bacillus B1,B2,B3 có khả năng sinh kháng sinh ức chế sự phát triển của
S.aureus (Khả năng sinh kháng sinh: B3>B2>B1). .

6


Bài 2: Đánh giá một số đặc điểm có lợi của vi khuẩn probiotic

1.3. Tóm tắt lý thuyết
-

-

Sinh vật probiotic là những vi sinh vật sống khi được cung cấp với số
lượng vừa đủ sẽ có lợi cho sức khỏe vật chủ.
Lựa chọn chủng probiotic dựa vào các yếu tố:
+ Tính an toàn.
+ Lợi ích đối với sức khỏe.
+ Sự tồn tại và phát triển trong ống tiêu hóa.
+ Khả năng sản xuất trong công nghiệp.
+ Khả năng sống và không bị biến đổi chức năng ở dạng sử dụng.
+ Không gây mùi vị khó chịu.
+ Phải đến được nơi có tác động.
+ Khả năng thực hiện chức năng tại vị trí định cư.
Sau khi uống, probiotic đi qua dạ dày trước khi đến ruột non (pH acid tại
dạ dày dao động từ 1,5-6 sau ăn). Acid dịch vị và hoạt tính thủy phân của
pepsin làm giảm đáng kể khả năng sống sót của probiotic. Ngoài ra, acid
mật và dịch vị tại ruột non cũng là một thách thức với probiotic => Ở bài
thực hành này ta khảo sát tỉ lệ sống sót của vi sinh vật probiotic (tế bào
sinhdưỡng và bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis PY79) trong dịch vị
nhân tạo ( ở các pH1 và 3) và dịch mật nhân tạo ( ở nông độ muối mật 0.3
và 0.5%).

1.4. Kết quả và bàn luận
1.4.1. Đánh giá đặc điểm có lợi của vi khuẩn probiotic
a. Hình ảnh của thử nghiệm khả năng chịu acid dịch vị và dịch mật nhân tạo.
Khả năng chịu đựng dịch vị.
• Tế bào sinh dưỡng
Pha loãng cấp 2

Pha loãng cấp 3

 Đối chứng

7


 pH 2

60 phút

120 phút

 pH3

60 phút

120 phút

• Bào tử

 Đối chứng

8


 pH 2

60 phút

90 phút

 pH 3

60 phút

90 phút

9


Khả năng chịu đựng muối mật.
• Tế bào sinh dưỡng

Pha loãng cấp 2

Pha loãng cấp 3

 Đối chứng

 0,3%

60 phút

120 phút

 0,5%

60 phút

10


• Bào tử

120 phút

 Đối chứng

 0,3%

60 phút

120 phút

 0,5%

60 phút

11


120 phút

b. Kết quả khả năng chịu acid dịch vị và dịch mật nhân tạo
Bảng 3. Kết quả đánh giá khả năng chịu dịch vị nhân tạo*
Thời
gian
pH
(phút)
Đối chứng
MT pH 2
TBSD

Bào tử

TBSD

MT pH 3

Bào tử

TBSD

Bào tử

0

69x104

90x104

/

/

/

/

60

/

/

5x104

16x104

24x104

53x104

120

/

/

1x104

4x104

10x104

74x104

Bảng 2. Kết quả phần trăm tế bào sống sót ở pH dịch vị khác nhau (%)**
Thời gian

pH 2
TBSD

pH 3

Bào tử

TBSD

Bào tử

0

/

/

/

/

60

7,25

17,78

34,78

58,89

90

1,45

4,44

14,49

82,22

** Tỉ lệ sống sót = Số tế bào ở thời điểm và pH khảo sát/ Số tế bào ở mật đối chứng
tương ứng x100.
Bảng 3. Kết quả đánh giá khả năng chịu dịch mật nhân tạo*
Nồng độ muối mật (%)

Thời gian
(giờ)

Đối chứng
TBSD

0,3

Bào tử

TBSD

0,5

Bào tử

TBSD

Bào tử

0

97x104

161x104

/

/

/

/

1

/

/



156 x104

27 x104

156 x104

2

/

/

14 x104

84 x104

18 x104

115 x104

Bảng 2. Kết quả phần trăm tế bào sống sót ở nồng độ muối mật khác nhau (%)**
Thời gian

0,3
TBSD

0

/

0,5

Bào tử
/

TBSD
/

Bào tử
/
12


Thời gian

0,3

0,5

60



96,89

27,84

96,89

90

14,43

52,17

18,56

71,43

* Chọn đĩa có số tế bào nằm trong khoảng đếm được, ghi nhận lại số tế bào và tính
toán mật độ tế bào.
** Tỉ lệ sống sót = Số tế bào ở thời điểm và pH khảo sát/ Số tế bào ở mật đối chứng
tương ứng x100.
c. So sánh khả năng chịu acid dịch vị và muối mật của dịch mật ở các nồng độ khác
nhau.
- Tại cùng giá trị pH và thời gian, số lượng bào tử sống sót nhiều hơn số lượng tế bào
sinh dưỡng tương ứng.
- Khả năng sống sót của VSV ở nồng độ muối mật 0,5% cao hơn tương đối so với
nồng độ muối mật 0,3%.
- Thời gian tiếp xúc với dịch vị càng lâu, số lượng tế bào sinh dưỡng và bào tử càng
giảm đi (số lượng tế bào sinh dưỡng giảm nhanh hơn số bào tử)
1.4.2. Bàn luận

13


Bài 3: Tinh chế enzyme amylase bằng alginat

1.5. Tóm tắt lý thuyết
-

-

Tinh chế amylase là một khâu quan trọng trong sản xuất. Có nhiều phương
pháp tinh chế. Trong bài này, ta thực hiện bằng gel alginat.
Phương pháp tinh chế là phương pháp cố định enzym, theo cơ chế hấp
phụ, amylase xem alginat cơ chất nên bám lên bề mặt các hạt gel, do đó có
thể lọc lấy amylase dễ dàng.
Xác định hoạt tính amylase được thực hiện bằng phương pháp Heinkel.

1.6. Kết quả và bàn luận
1.6.1. Hàm lượng protein
Bảng 4. Hàm lượng protein của enzym thô và tinh chế
Mẫu

OD280

Thể tích (ml)

Enzym thô

0,456

Vthô = 10

Enzym tinh chế

0,059

Vtinh chế = 20

Hàm lượng protein (mg)
0,456x10x20 = 91,2
0,059x20 = 1,18

1.6.2. Hoạt tính enzym
Đường chuẩn hoạt tính enzym và OD560
a.
Bảng 2. Thông số đường chuẩn tinh bột
Ống

0

1

2

3

4

5

U/ml

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

OD560

0,034

0,215

0,394

0,587

0,782

0,954

0

0,181

0,360

0,553

0,748

0,92

∆OD560
Vẽ đường chuẩn.

14


Hoạt tính enzym

b.

Bảng 3. Hoạt tính enzym thô và tinh chế
Mẫu

OD560
chứng

OD560
thử

Độ pha
loãng

Enzym thô

0,864

0,348

100

0,560x100x10 =
560

560/91,2 = 6,14

tinh 0,852

0,671

10

0,199 x10x20 =
39,8

39,8/1,18 = 33,73

Enzym
chế

Hoạt tính
enzym (U)

tổng Hoạt tính riêng
(U/protein)

Tính:
OD560 thô = OD560 chứng (thô) – OD560 thử (thô) = 0.864 – 0.348 = 0.516
OD560 tinh = OD560 chứng (tinh) – OD560 thử (tinh) = 0.852 – 0.671 = 0.181
Lượng tinh bột (mg) phân giải tính theo đường chuẩn : y = 0.9277x - 0.0035
 xthô = (0.516 +0.0035)/0.9277 =>xthô =0.560 =>HTE(thô) = 0.560
xtinh = (0.181 +0.0035)/0.9277 = >xtinh =0.199 =>HTE(tinh) = 0.199
Hoạt tính tổng enzym:U = HTE x V x N
Hoạt tính riêng enzym : HTR = HTC/ lượng protein
Hiệu suất tinh chế:
Mức tinh chế =
c.

=

= 5.49

Nhận xét về hiệu suất tinh chế và mức tinh chế.
• Hiệu suất tinh chế là 7,107% là quá thấp, lượng amylase bị thất thoát
trong quá trình tinh chế.
• Mức tinh chế có kết quả là 5,49 lần, đã đạt yêu cầu.
15


1.6.3. Bàn luận
- Sau khi tinh chế, hoạt tính chuyên biệt của amylase tăng lên.
- Hiệu suất tinh chế còn thấp (7,107%).
- Amylase bị thất thoát trong quá trình tinh chế, có thể do:
+ Thao tác chưa chính xác: amylase thôi chưa hết, khi lọc lấy dịch
amylase còn sót trong tủa gel, đo quang không cẩn thận gây sai số….
+ Thời gian tối ưu quá trình ủ chưa đúng.
- Mức tinh chế giúp đánh giá hiệu quả của quá trình tinh chế. Mức tinh chế
trên 1 là đạt yêu cầu và tốt nhất là trên 4 ( trong bài này mức tinh chế 5,49
là đã đạt yêu cầu).

16


Bài 4: Cố định CGTase lên alginat

1.7. Tóm tắt lý thuyết
-

CGTase là enzym duy nhất chuyển hóa tính bột và các chất tương tự thành
hỗn hợp cyclodextrin.
Tinh bột  CGTase chuyển hóa tinh bột  β-Cyclodextrin
Trong bài thực hành này, enzym được cố định bằng phương pháp hấp phụ
và bắt giữ.
+ Nguyên tắc là cho enzym lẫn vào mạng lưới gel Ca-alginat, enzym có
thể bám trên bề mặt (hấp phụ) hoặc nằm trong hạt gel (bắt giữ).
+ Đệm Tris-HCl pH=8 tạo môi trường ổn định cho enzym hoạt động tối
ưu. Tránh dùng đệm phosphat vì gel alginat không bền.
 Tái sử dụng CGTase đắt tiền, tăng tính ổn định và hoạt tính enzym.

1.8. Kết quả và bàn luận
1.8.1. Hàm lượng protein
a. Đường chuẩn BSA
Bảng 1. Thông số đường chuẩn BSA
Ống nghiệm
0
1
2
Nồng độ BSA (mg/ml)
0
0,2
0,4
∆OD595 nm
0,384
0,613 0,842

3
0,6
1,034

4
0,8
1,226

5
1
1,415

b. Hàm lượng protein
Bảng 5. Hàm lượng protein của enzym thô và tinh chế
17


Mẫu

OD595

Thể tích (ml)

Hàm lượng protein (mg)

Enzym ban đầu

0,7120

Vban đầu =1

0,298 x 10 x 1 = 2,98

Enzym không CĐ 0,8752
theo bắt giữ

Vgộp =40,5

(0,457 : 17) x 40,5 = 1,089

Enzym CĐ theo bắt
giữ

2,98 – 1,089 = 1.891

Enzym không CĐ 1,054
theo hấp phụ

(0,631 : 17) x 38 = 1,411

Vgộp =38

Enzym CĐ theo
2,98 – 1,411 = 1.569
hấp phụ
 Theo đường chuẩn BSA (OD595nm), ta có :
 Enzym ban đầu : OD595nm = 0,7120
Theo đường chuẩn y = 1,0266x + 0,4057
 0,7120 = 1,0266x + 0,4057
 x =0,298
Vậy nồng độ protein có trong mẫu là 0,298
 Enzym không cố định theo bắt giữ : OD595nm = 0,8752
Theo đường chuẩn y = 1,0266x + 0,4057
 0,8752 = 1,0266x + 0,4057
 x = 0,457
Vậy nồng độ protein có trong mẫu là 0,457
 Enzym không cố định theo hấp phụ : OD595nm = 1,054
Theo đường chuẩn y = 1,0266x + 0,4057
 1,054 = 1,0266x + 0,4057
 x =0,631
Vậy nồng độ protein có trong mẫu là 0,631

1.8.2. Hoạt tính enzym
a. Đường chuẩn CD
Bảng 3. Thông số đường chuẩn CD
Số thứ tự

1

2

3

4

5

6

Nồng độ CD (mg/ml)

0

2

4

6

8

10

OD550
∆OD550

1.7309 1.5120 1.3558 1.1694 1.0133 0.9007
0

0.2189 0.3751 0.5615 0.7176 0.8302

Vẽ dường chuẩn CD.

18


b. Hoạt tính enzym
Bảng 4. Hoạt tính enzym
Mẫu

OD550 OD550
chứng thử

Hoạt tính chung
(U)

Hoạt tính riêng
(U/mg protein)

Enzym
ban đầu

1,8170 1,5830 ((2,422x10x30)/(1135x15))x1000=42,678 42,678/2,98
14,322

=

Enzym
1,8069 1,0321 ((8,937x10)/(1135x0,6x15))x1000=8,749 8,749/1,891=4,627
CĐ theo
bắt giữ
Enzym
1,7042 1,342
CĐ theo
hấp phụ

((3,966x10)/ (1135x0,6x15))x1000=3,883 3,883/1,569=2,475

Tính:
 Hiệu suất cố định:
 Phương pháp hấp phụ: H = (menzym CĐ theo hấp phụ / mban đầu )x100% =
( 1,569/2,98)x100% = 52,65%
 Phương pháp bắt giữ: H = (m enzym CĐ theo bắt giữ / mban đầu )x100% =
( 1,891/2,98)x100% = 63,46%
 Tỉ lệ hoạt tính riêng của enzym:
 Phương pháp hấp phụ: TLHT= (HTR enzym CĐ theo hấp phụ / HTR enzym tự
do)x100% = (2,475/14,322)x100% = 17,28 %
 Phương pháp bắt giữ: TLHT= (HTRenzym CĐ theo bắt giữ / HTR enzym tự
do)x100% = (4,627/14,322)x100% = 32,31 %

19


c. Nhận xét về hiệu suất cố định và và tỉ lệ hoạt tính riêng của enzym
- Hiệu suất cố định enzym bằng phương pháp bắt giữ cao hơn 1,21 lần
phương pháp hấp phụ.
- Hoạt tính của enzym bị cố định theo bắt giữ cao hơn 1,87 lần so với hấp
phụ.
- Hoạt tính của enzyme bị cố định thấp hơn nhiều so với enzyme tự do.
1.8.3. Bàn luận
-

-

Phương pháp bắt giữ là phương pháp cố định không thuận nghịch, CGTase bị
nhốt trong hạt gel không thoát ra được.
Phương pháp hấp phụ là phương pháp cố định thuận nghịch, CGTase bám lên bề
mặt gel.

Hiệu suất cố định enzym bằng phương pháp bắt giữ cao hơn 1,21 lần
phương pháp hấp phụ. Vì ở phương pháp bắt giữ enzym bị giữ bên trong
hạt gel không thoát rađược, đây là quá trình cố định không thuận nghịch.
Còn ở phương pháp hấp phụ là quátrình cố định thuận nghịch, enzym chỉ
bị hấp phụ lên bề mặt của hạt gel.
Hoạt tính của enzym bị cố định theo bắt giữ cao hơn 1,87 lần so với hấp
phụ.
Hoạt tính của enzyme bị cố định thấp hơn nhiều so với enzyme tự do, do
lúc này enzyme đã bị gắn với chất mang nên sự tiếp xúc của enzym với cơ
chất bị cản trở về mặt không gian cũng như cấu trúc của enzym bị thay
đổi, vì vậy khả năng gắn với cơ chất sẽ bị giảm.

20


Bài 5: Tinh chế protein bằng sắc ký ái lực

1.9. Tóm tắt lý thuyết
-

-

Nguyên tắc: Dựa vào sự gắn thuận nghịch của một nhóm chức năng trên
protein với một nhóm chức năng trên pha tĩnh sắc ký  Chỉ protein đích
mang nhóm chức năng đặc hiệu mới gắn vào pha tĩnh.
Là kỹ thuật sắc ký đơn giản và hiệu quả nhất để tinh chế protein.

1.10. Kết quả và bàn luận
Đường chuẩn được sử dụng trong bài này là: y=1,0266x + 0,4057
1.10.1. Kết quả xác định hàm lượng protein
Bảng 1. Hàm lượng protein trong các phân đoạn
Mẫu

A

A280

0,9167

Thể
tích

1

1

1

1

Độ pha
loãng

10

1

1

1

Lượng(
0,2928
mg)
Hiệu
suất

B*

C*

D12

D34

D56

0,6402 0,517 0,4268

0,0134 0,0064 0,0012

Mẫu gộp D**
0,528
3

0,021

HS= (Mẫu gộp D)/Mẫu A(%) = 0,021/0,2928 =7,17%

* Cộng tổng các mẫu B từ B0 đến Bn, cộng tổng các mẫu C từ C0 đến Cn
**Mẫu gộp D: là tổng lượng protein trong các ống D1 đến Dn
Nhận xét về hiệu suất tinh chế


Mẫu A:
Nồng độ protein : OD =0,9167 = 1,0266x + 0,4057
⇔ x = 0,4978
Tổng hàm lượng protein trong A = (x/17)x10x1 = (0,4978/17)x10x1 = 0,2928
• Mẫu D:
Nồng độ protein : D12 : 0,6402 = 1,0266x + 0,4057⇔ x = 0,2284
Tương tự: D23 : x = 0,1084
D34 : x = 0,0206
Hàm lượng protein trong : D1 = (0,2284/17)x1 = 0,0134
Tương tự : D23 = 0,0064 ; D34 = 0,0012
• Hiệu suất tinh chế 7,17% là thấp và không hiệu quả.

1.10.2. Bàn luận
- Dịch A chứa toàn bộ lượng protein nên có lượng protein lớn nhất, dịch B và C chứa protein
không phải Histag, dịch D là protein đích chiết được.

21


- Hiệu suất tinh chế 5,57% thấp và không hiệu quả, từ đó cho thấy trong mẫu D ( mẫu tinh
chế) chứa rất ít protein cần phân tách.
Trên lý thuyết:
Ta có: B+C+D=A
Trên thực tế B+C+D Giải thích:
- E.coli sau khi tán siêu âm sẽ chứa hỗn hợp : protein-Histag, tạp E.coli vàt ạp E.coliHis.
- Các vật liệu để rửa cột như đệm chạy H 8X, đệm rửa H 8X nhằm cạnh tranh vị trí để
loại bỏ tạp E.coli-His. Sau đó sử dụng đệm thôi H 4X để thu được protein đích là
protein-Histag trong dung dịch D.
- Hiệu suất tinh chế còn thấp và chưa đạt tuyệt đối là do:
o Chưa hoạt hoá tối đa khả năng trao đổi ion của cột sắck ý.
o Thao tác tinh chế chưa cẩn thận, cột chưa được nén chặt.
o Thao tác bơm, hút dịch vào eppendoff chưa chính xác, ảnh hưởng đến kết quả
đo quang.
o Các thể tích đo chưa chính xác ảnh hưởng đến kết quả nồng độ protein.

Bài 6: Tinh chế protein bằng sắc ký trao đổi ion
1.11. Tóm tắt lý thuyết
-

-

-

Nguyên tắc: Dựa vào sự trao đổi thuận nghịch của các điện tích trên
protein với các điện tích trái dấu của pha tĩnh sắc ký, tùy theo cân bằng
ion và pH trong dung dịch mà protein sẽ được gắn vào nhựa hay bị đẩy ra
khỏi nhựa.
Là phương pháp được sử dụng phổ biến tinh chế protein.
Các loại nhựa trao đổi ion
• Theo điện tích : cation, anion
• Theo độ mạnh của nhóm mang điện tích trên nhựa: mạnh, yếu.
• Theo bản chất của vật liệu mang: Matrix, dextran, agarose…

Tinh chế protein bằng sắc ký trao đổi ion dựa trên cơ sở điểm đẳng điện pI
(giá trị pH mà protein có tổng điện tích bằng 0):
+ pH > pI, protein tích điện âm.
+ pH < pI, protein tích điện dương.

1.12. Kết quả và bàn luận
Đường chuẩn sửa dụng trong bài này là đường chuẩn Bradford trong bài 4:
y = 1,0266x + 0,4057
1.12.1. Kết quả xác định hàm lượng protein
Bảng 1. Hàm lượng protein trong các phân đoạn
Mẫu

A

B*

C*

D12

D34

D56

A280

1.493

0.978

0.446

0.712

0.593

0.413

Mẫu
gộp D*

22


Thể tích
1
Độ
pha
10
loãng
Lượng
0.623
(mg)
Hiệu suất

HS =

1

4.5

1

1

1

10

10

1

1

1

0.328

0.104

0.017

0.011

0.0004

=

3

0.0284

= 4.56%

* Cộng tổng các mẫu B từ B0 đến Bn, cộng tổng các mẫu C từ C0 đến Cn
**Mẫu gộp D: là tổng lượng protein trong các ống D1 đến Dn
Nhận xét về hiệu suất tinh chế






Mẫu A:
Nồng độ protein : OD =1,493 = 1,0266x + 0,4057 ⇔ x = 1,0591
Tổng hàm lượng protein trong A = (x/17)x10x1 = (1,0591/17)x10x1 = 0,623
Mẫu B:
Nồng độ protein : OD =0,978 = 1,0266x + 0,4057 ⇔ x =0,5575
Tổng hàm lượng protein trong B = (x/17)x10x1 = (0,5575/17)x10x1 = 0,328
Mẫu C:
Nồng độ protein : OD =0,446 = 1,0266x + 0,4057 ⇔ x =0,0393

Tổng hàm lượng protein trong C = (x/17)x4,5x10 = (0,0393/17)x4,5x10 = 0,104
Mẫu D:
Nồng độ protein : D12 : 0,712 = 1,0266x + 0,4057 ⇔ x = 0,2984
Tương tự: D34 : x = 0,1825 ; D56 : x = 0,0071
Hàm lượng protein trong : D12 = (x/17)x1x1 = (0,2984/17)x1x1 = 0,017
Tương tự :
D34 = 0,011 ; D56 = 0,0004
• Nhận xét hiệu suất:
- Hiệusuất tinh chế chỉ có 4,56 % là quá thấp. Do đó, mẫu tinh chế (dịch D) chứa rất ít protein
cần phân tách
- Theo lý thuyết, A=B+C+D. Nhưng thực tế, A>B+C+D
- Dịch B và C chứa nhiều protein tạp.


1.12.2. Bàn luận
-Dịch B và C chứa nhiều protein tạp, lysozym trong lòng trắng trứng chứa ít protein.
-Hiệu suất thấp có thể do:
 Thao tác thực hành gây sai số: pha loãng và hút thiếu chính xác, sai số do dụng cụ,
thuốc thử, khả năng trao đổi của cột giảm,...
 Chưa hoạt hóa tối đa khả năng trao đổi ion của cột sắc kí.
 Quá trình bơm, dịch vào eppendoff chưa chính xác, dẫn đến kết quả đo quang sai và
trong quá trình đọc kết quả đo quang có thể còn sai sót.

23


24



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×