Tải bản đầy đủ

Khảo sát dư lượng thuốc bảo vệ thực vật imidacloprid và azoxystrobin trong lá và rễ cây đinh lăng – polyscias fruticosa (l ) harms ở cần thơ, an giang và đồng tháp

TRƢỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ
KHOA DƢỢC – ĐIỀU DƢỠNG

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: DƢỢC SĨ ĐẠI HỌC
MÃ SỐ: 52720401

KHẢO SÁT DƢ LƢỢNG THUỐC BẢO VỆ
THỰC VẬT IMIDACLOPRID VÀ
AZOXYSTROBIN TRONG LÁ VÀ RỄ CÂY
ĐINH LĂNG – Polyscias fruticosa (L.) Harms
Ở CẦN THƠ, AN GIANG VÀ ĐỒNG THÁP
Cán bộ hƣớng dẫn

Sinh viên thực hiện

Ths. NGUYỄN PHƢỚC ĐỊNH

VÕ THỊ TUYẾT TRÂM
MSSV: 12D720401171
LỚP: ĐẠI HỌC DƢỢC 7B


Cần Thơ, năm 2017


LỜI CẢM ƠN
Trên thực tế không có sự thành công nào mà không gắn liền với những sự hỗ trợ và
giúp đỡ dù ít hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp của ngƣời khác. Để hoàn thành khóa
luận này, lời đầu tiên em xin chân thành cám ơn và tri ân sâu sắc đối với Ban Giám
hiệu nhà trƣờng, lãnh đạo Khoa Dƣợc – Điều dƣỡng và Thầy Cô bộ môn Phân tích –
Kiểm nghiệm trƣờng Đại học Tây Đô đã giúp đỡ và cho em những lời khuyên hữu ích
trong suốt thời gian làm khóa luận. Và đặc biệt em xin chân thành cám ơn Thầy Ths.
Nguyễn Phƣớc Định đã quan tâm giúp đỡ, nhiệt tình hƣớng dẫn em hoàn thành tốt
khóa luận này.
Trong quá trình làm khóa luận cũng nhƣ quá trình làm báo cáo khó tránh khỏi những
sai sót, rất mong các Thầy Cô bỏ qua. Do trình độ lý luận, kinh nghiệm thực tiễn và
thời gian còn hạn chế nên bài báo cáo không tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong
nhận đƣợc ý kiến đóng góp của Thầy Cô để em học thêm đƣợc nhiều kinh nghiệm
hoàn thành tốt báo cáo và đạt đƣợc những kết quả tốt nhất.
Ngoài ra, không thể không kể đến những ngƣời bạn của em, cám ơn các bạn đã ở bên
cạnh em, cùng em vƣợt qua các khó khăn và làm cho khoảng thời gian làm khóa luận
của em trở nên ý nghĩa và khó quên.
Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn và kính chúc Quý Thầy/Cô đƣợc nhiều sức
khỏe và đạt nhiều thành công trong sự nghiệp cao quý. Kính chúc Quý nhà trƣờng đạt
đƣợc nhiều thành công trong công tác giáo dục.


Khóa luận tốt nghiệp dƣợc sĩ đại học – Khóa học: 2012 – 2017
KHẢO SÁT DƢ LƢỢNG THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT IMIDACLOPRID VÀ
AZOXYSTROBIN TRONG LÁ VÀ RỄ CÂY ĐINH LĂNG – Polyscias fruticosa
(L.) Harms Ở CẦN THƠ, AN GIANG VÀ ĐỒNG THÁP

TÓM TẮT
Mục tiêu: khảo sát dƣ lƣợng thuốc BVTV với hai hoạt chất imidacloprid và
azoxystrobin trong dƣợc liệu lá và rễ của cây Đinh lăng lá nhỏ - Polyscias fruticosa
(L.) Harms, Họ Nhân Sâm. Nhằm đảm bảo an toàn về sức khỏe cho ngƣời tiêu dùng
đồng thời kiểm soát chất lƣợng nguồn dƣợc liệu trong nƣớc và xuất khẩu.
Đối tƣợng nghiên cứu: dƣợc liệu tƣơi, khô của lá và rễ Đinh lăng lá nhỏ - Polyscias
fruticosa (L.) Harms, Họ Nhân Sâm ở Cần Thơ, An Giang và Đồng Tháp.
Phƣơng pháp nghiên cứu: khảo sát dung môi chiết có khả năng chiết tối đa dƣ lƣợng
hai thuốc BVTV, đồng thời tối thiểu tạp chất và sử dụng phƣơng pháp loại tạp sơ bộ.


Sau đó tiến hành phân tích bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò
UV/Vis để xác định đồng thời hai hoạt chất trong dƣợc liệu tƣơi, khô của lá và rễ Đinh
lăng lá nhỏ - Polyscias fruticosa (L.) Harms, Họ Nhân Sâm.
Kết quả: qua quá trình phân tích sơ bộ có một số mẫu ở ba tỉnh Cần Thơ, An Giang và
Đồng Tháp có phát hiện hai thuốc BVTV với hàm lƣợng khác nhau nhƣng đều nằm
dƣới mức dƣ lƣợng tối đa cho phép của rau ăn hằng ngày.
Kết luận: qua kết quả có thể thấy hiện nay dƣợc liệu sạch rất hiếm. Đa phần các nơi
trồng đều sử dụng thuốc BVTV để hạn chế sâu bệnh giúp tăng năng suất cho cây
trồng. Nhƣng lại ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sức khỏe ngƣời tiêu dùng, cần phải có
biện pháp thích hợp để hạn chế dƣ lƣợng thuốc BVTV còn tồn tại trên cây nhƣ là kéo
dài thời gian thu hoạch, sử dụng thuốc đúng nồng độ, đúng cách, áp dụng các phƣơng
pháp truyền thống để phòng trừ sâu bệnh nhƣ các loài thiên địch…Tất cả sản phẩm
đến tay ngƣời tiêu dùng cần phải đƣợc kiểm soát chặt chẽ về dƣ lƣợng thuốc BVTV
đối với cây trồng nói chung và dƣợc liệu nói riêng.


MỤC LỤC
DANH MỤC HÌNH……………………………………………………………...i
DANH MỤC BẢNG…………………………………………………………….ii
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT.…………………………...…….iii
CHƢƠNG 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................ 1
CHƢƠNG 2. TỔNG QUAN NỘI DUNG ĐỀ TÀI ..................................................... 3
2.1.

GIỚI THIỆU VỀ ĐINH LĂNG .........................................................................3

2.1.1.

Tổng quan thực vật ...................................................................................... 3

2.1.2.

Thành phần hóa học ....................................................................................7

2.1.3.

Tác dụng dƣợc lý ......................................................................................... 9

2.2.

GIỚI THIỆU VỀ THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT ..........................................11

2.2.1.

Khái niệm thuốc BVTV ............................................................................11

2.2.2.

Phân loại thuốc BVTV ..............................................................................12

2.2.3.

Mức dƣ lƣợng tối đa trong dƣợc liệu ........................................................ 12

2.2.4.

Imidacloprid .............................................................................................. 13

2.2.5.

Azoxystrobin ............................................................................................. 14

2.2.6.

Ƣu, nhƣợc điểm và vị trí của ngành thuốc BVTV hiện nay ..................... 16

2.3.

TÌNH HÌNH SỬ DỤNG thuốc BVTV ............................................................ 17

2.3.1.

Tình hình sử dụng thuốc BVTV trên thế giới ...........................................17

2.3.2.

Tình hình sử dụng thuốc BVTV ở Việt Nam ............................................17

2.4.

CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH THUỐC BVTV .....................................18

2.4.1.

Phƣơng pháp truyền thống ........................................................................18

2.4.2.

Phƣơng pháp QuEChERS .........................................................................19

2.5.

KỸ THUẬT SẮC KÝ HPLC/UV-VIS ............................................................ 21

2.5.1.

Nguyên tắc.................................................................................................21

2.5.2.

Cơ sở lý thuyết .......................................................................................... 22

2.5.3.

Cấu tạo của hệ thống HPLC ......................................................................22

2.5.4.

Ứng dụng của HPLC trong dƣợc liệu ....................................................... 23

CHƢƠNG 3. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 24
3.1.

NGUYÊN VẬT LIỆU - ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU..................................24

3.1.1.

Đối tƣợng nghiên cứu................................................................................24

3.1.2.

Chất chuẩn – Hóa chất – Dung môi .......................................................... 24


3.1.3.
3.2.

Trang thiết bị ............................................................................................. 24

PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................25

3.2.1.

Lựa chọn phƣơng pháp..............................................................................25

3.2.2.

Phƣơng pháp xử lý mẫu ............................................................................25

3.2.3.

Khảo sát dung môi chiết:...........................................................................27

3.2.4.

Khảo sát phƣơng pháp làm sạch mẫu thử .................................................28

3.2.4.1.

Loại tạp bằng SPE (chiết pha rắn) ...................................................... 29

3.2.4.2.

Loại tạp bằng sắc ký cột cổ điển ........................................................ 29

3.2.4.3.

Loại tạp bằng than hoạt tính ............................................................... 30

3.2.5.
3.3.

Đánh giá phƣơng pháp chiết và làm sạch .................................................30

THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP ......................................................................30

3.3.1.

Tính phù hợp hệ thống ..............................................................................30

3.3.2.

Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng................................................32

3.3.3.

Tính đặc hiệu ............................................................................................. 31

3.3.4.

Tính tuyến tính .......................................................................................... 31

3.3.5.

Độ chính xác ............................................................................................. 32

3.3.6.

Độ đúng (tỷ lệ hồi phục %) .......................................................................32

CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................. 34
4.1. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN CHIẾT MẪU HCBVTV TRONG DƢỢC LIỆU
RỄ, LÁ ĐINH LĂNG TƢƠI VÀ KHÔ .....................................................................34
4.1.1.

Khảo sát dung môi chiết mẫu ....................................................................34

4.1.2.

Khảo sát phƣơng pháp loại tạp ..................................................................35

4.1.2.1.

Chiết lỏng – lỏng ................................................................................35

4.1.2.2.

Chiết lỏng – lỏng và than hoạt............................................................ 36

4.1.2.3.

Chiết lỏng – lỏng và silicagel ............................................................. 37

4.1.3.

Đánh giá phƣơng pháp chiết và làm sạch .................................................38

4.2. QUI TRÌNH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI HAI THUỐC
BVTV BẰNG HPLC/UV-VIS...................................................................................39
4.3.

THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP ......................................................................40

4.3.1.

Tính phù hợp hệ thống ..............................................................................40

4.3.2.

Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng................................................42

4.4. KẾT QUẢ KHẢO SÁT DƢ LƢỢNG HAI THUỐC BVTV TRÊN CÂY
ĐINH LĂNG LÁ NHỎ Ở CẦN THƠ, AN GIANG VÀ ĐỒNG THÁP. .................42


CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................. 44
5.1. VỀ TÌNH HÌNH SỬ DỤNG HCBVTV Ở CẦN THƠ, AN GIANG VÀ
ĐỒNG THÁP.. ...........................................................................................................44
5.2.

VỀ PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DƢ LƢỢNG THUỐC BVTV ................44

5.3. VỀ KẾT QUẢ PHÂN TÍCH DƢ LƢỢNG THUỐC BVTV TRONG CÂY
ĐINH LĂNG LÁ NHỎ.............................................................................................. 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Đinh lăng lá nhỏ ........................................................................................... 4
Hình 2.2. Đinh lăng lá tròn .......................................................................................... 4
Hình 2.3. Đinh lăng đuôi phƣợng ................................................................................ 5
Hình 2.4. Đinh lăng lá xoan xẻ .................................................................................... 5
Hình 2.5. Đinh lăng lá trổ ............................................................................................ 6
Hình 2.6. Đinh lăng lá đĩa ............................................................................................ 6
Hình 2.7. Sơ đồ chiết thuốc BVTV theo QuEChERS ................................................ 20
Hình 2.8. Cấu tạo HPLC ............................................................................................. 22
Hình 3.1. Sơ đồ chuẩn bị mẫu dƣợc liệu tƣơi ............................................................. 26
Hình 3.2. Sơ đồ chuẩn bị mẫu dƣợc liệu khô ............................................................. 27
Hình 4.1. Kết quả khảo sát dung môi chiết ................................................................. 34
Hình 4.2. Kết quả khảo sát loại tạp bằng chiết lỏng – lỏng ........................................ 36
Hình 4.3. Kết quả khảo sát loại tạp bằng than hoạt .................................................... 37
Hình 4.4. Kết quả khảo sát loại tạp bằng silicagel...................................................... 37
Hình 4.5. Kết quả độ thu hồi của hai thuốc BVTV trên rễ Đinh lăng ........................ 39
Hình 4.6. Kết quả độ thu hồi của hai thuốc BVTV trên lá Đinh lăng ........................ 39
Hình 4.7. Kết quả sắc ký đồ khảo sát tính phù hợp hệ thống ..................................... 40

i


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Tóm tắt những tác dụng dƣợc lý quan trọng của Đinh lăng tƣơng tự Sâm
Việt Nam....................................................................................................................... 11
Bảng 2.2. Nghiên cứu về độc tính cấp của imidaclorid ............................................... 14
Bảng 2.3. Giới hạn tối đa dƣ lƣợng imidacloprid trong một số thực phẩm ................. 14
Bảng 2.4. Nghiên cứu về độc tính cấp của azoxystrobin ............................................. 15
Bảng 2.5. Giới hạn tối đa dƣ lƣợng azoxystrobin trong một số thực phẩm................. 16
Bảng 3.1.Thông tin về chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu ..................................... 28
Bảng 4.1. Kết quả độ thu hồi của phƣơng pháp chiết và làm sạch .............................. 38
Bảng 4.2. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống với chất chuẩn imidacloprid ........ 41
Bảng 4.3. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống với chất chuẩn azoxystrobin ........ 41
Bảng 4.4. Kết quả giới hạn định lƣợng ....................................................................... 42
Bảng 4.5. Kết quả khảo sát thuốc BVTV ..................................................................... 43

ii


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Kí hiệu, chữ
viết tắt
ACN

Giải thích
Acetonitril

ADI

Acceptable Daily Intake (mức dung nạp hằng ngày đƣợc chấp nhận của

As

hóa chất)
Hệ số đối xứng

AOAC

Association of analytical communities (Hiệp hội các cộng đồng phân
tích)

FAO
FDA

Food and agriculture organization (Tổ chức Nông nghiệp và Lƣơng thực
của Liên hiệp quốc)
Food and drug administration (Cục dƣợc phẩm và thực phẩm Hoa Kỳ)

BVTV
HPLC
LD50
LC50
LLE
LOD

Bảo vệ thực vật
High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao)
Lethal Dose (Liều chết trung bình)
Lethal Concentration (Liều chết trung bình khi hít phải)
Liquid liquid extraction (Chiết lỏng – lỏng)
Limit of detection (Giới hạn phát hiện)

LOQ

Limit of quantification (Giới hạn định lƣợng)

MRL
ppm
Rs
RSD
PE
SKC
SKLM

Maximum residue limit (Giới hạn dƣ lƣợng tối đa)
Part per million (Phần triệu)
Resolution (Độ phân giải)
Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tƣơng đối)
Petrolium ether
Sắc ký cột
Sắc ký lớp mỏng

SPE
tR
UV-Vis
WHO

Solid phase extraction (Chiết pha rắn)
Retention time (Thời gian lƣu)
Ultraviolet-Visible (Tử ngoại – khả kiến)
Tổ chức Y tế thế giới

iii


CHƢƠNG 1. MỞ ĐẦU
Việt Nam là một nƣớc mà ngành nông nghiệp chiếm phần lớn. Vì thế mà việc sử dụng
hóa chất bảo vệ thực vật (BVTV) để phòng trừ sâu, bệnh hại, chuột, mối mọt … là
điều tất yếu. Nó mang lại hiệu quả lớn đến việc tăng năng suất và chất lƣợng nông sản.
Hiện nay, ƣớc tính trên thế giới có trên 5000 loại thuốc BVTV khác nhau. Trong đó có
khoảng 200 loại thuốc BVTV gây ảnh hƣởng lớn đến sức khỏe con ngƣời và độc hại
cho môi trƣờng. Tuy cơ quan chức năng đã có hƣớng dẫn cụ thể cho ngƣời dân về vấn
đề sử dụng thuốc BVTV an toàn, hiệu quả trên cây nông nghiệp và cây ăn quả nhƣng
lại chƣa có hƣớng dẫn cụ thể trên cây thuốc. Nhƣng việc sử dụng đúng cách còn tùy
thuộc vào trình độ hiểu biết của ngƣời dân ở từng vùng miền. Vì thế mà cần phải kiểm
soát chặt chẽ việc sử dụng thuốc BVTV an toàn và hiệu quả nhằm giảm tối đa các tác
động nguy hại đến sức khỏe con ngƣời và môi trƣờng sinh thái. Đây là vấn đề đang
đƣợc quan tâm.
Kiểm soát mức dƣ lƣợng thuốc BVTV trong thực phẩm nói chung và dƣợc liệu nói
riêng là việc làm cần thiết và cấp bách. Đối với dƣợc liệu là một sản phẩm nông
nghiệp đặc biệt nên cần phải sử dụng thuốc BVTV để bảo vệ chất lƣợng và giúp tăng
năng suất. Dƣ lƣợng thuốc BVTV trong cây trồng là không cần thiết và nó là nguồn
gây ô nhiễm nghiêm trọng. Việc sử dụng này cần đƣợc kiểm soát về mức dƣ lƣợng
thuốc BVTV trong sản phẩm, điều này cũng có ý nghĩa sàng lọc loại bỏ đi những sản
phẩm không an toàn cho ngƣời sử dụng. Đồng thời giúp kiểm soát đƣợc chất lƣợng
nguồn dƣợc liệu trong nƣớc hoặc xuất khẩu.
Từ lâu, dân gian đã biết dùng Đinh lăng để bồi bổ sức khỏe, chữa đau nhức xƣơng
khớp, tăng sức đề kháng cho cơ thể nên danh y Hải Thƣợng Lãn Ông đã gọi cây Đinh
lăng lá nhỏ là “cây sâm của ngƣời nghèo”. Chính vì có nhiều hoạt tính sinh học nhƣ
vậy nên hiện nay Đinh lăng đang ngày càng đƣợc sử dụng phổ biến. Nhƣng đi kèm là
vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm đang ở mức báo động nói chung và dƣợc liệu nói
riêng. Hiện nay trên Thế giới đã có rất nhiều phƣơng pháp nghiên cứu xác định thuốc
BVTV trên rau quả và hầu hết tất cả đều hƣớng đến một phƣơng pháp xác định đồng
thời nhiều HCBVTV trong cùng một lần phân tích. Ở các nƣớc phát triển nhƣ Anh,
Mỹ, Nhật Bản trong các dƣợc điển đã có những qui định về mức dƣ lƣợng của thuốc
BVTV trong thực phẩm và dƣợc liệu. Còn ở Việt Nam vẫn chƣa có qui định cụ thể này
nhƣng cũng đã có một số tác giả nghiên cứu phân tích thuốc BVTV trên dƣợc liệu mà
chƣa cụ thể trên dƣợc liệu Đinh lăng.

1


Nhằm để nâng cao chất lƣợng dƣợc liệu và đảm bảo an toàn cho ngƣời sử dụng nên
chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Khảo sát dƣ lƣợng thuốc bảo vệ thực vật
Azoxystrobin và Imidacloprid trong lá và rễ cây Đinh lăng – Polyscias fruticosa
(L.) Harms ở Cần Thơ, An Giang và Đồng Tháp” với mục tiêu:
1.
Xây dựng qui trình chiết xuất đồng thời hai thuốc bảo vệ thực vật azoxystrobin
và imidacloprid trong cây Đinh lăng.
2.
Định tính, định lƣợng đồng thời hai thuốc BVTV một cách nhanh chóng, chính
xác bằng HPLC với đầu dò UV-Vis.

2


Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. GIỚI THIỆU VỀ ĐINH LĂNG
2.1.1. Tổng quan thực vật
Cây Đinh lăng có nguồn gốc từ Thái Bình Dƣơng, thuộc họ Araliaceae, chi Polyscias.
Chi này có gần 100 loài trên thế giới đƣợc phân bố rải rác nhƣng nhiều nhất là ở vùng
Thái Bình Dƣơng. Đa số cây cảnh thông dụng đƣợc trồng đều mang tên Đinh lăng nên
rất dễ nhầm lẫn, chỉ có một số loài đƣợc dùng làm cây thuốc. Loài Đinh lăng đƣợc sử
dụng phổ biến nhất không chỉ làm cây cảnh, rau ăn mà còn là một vị thuốc nam đƣợc
biết đến hiện nay là Polyscias fruticosa (L.) Harms hay còn gọi là Đinh lăng lá nhỏ,
cây gỏi cá hoặc nam dƣơng lâm.(Đỗ Huy Bích và cs.,2004)
Đinh lăng đã đƣợc đƣa vào Dƣợc điển Việt Nam nhƣ một vị thuốc bổ, tăng lực, sinh
thích nghi… Ngoài ra còn đƣợc nhiều nƣớc trên thế giới sử dụng nhƣ: Trung Quốc,
Liên Xô, Ấn Độ và nhiều nƣớc trên thế giới sử dụng với chức năng giải độc, kháng
khuẩn, kháng viêm…
Theo điều tra của Trung tâm Sâm Việt Nam ở các tỉnh phía Nam, Đinh lăng có 6 loài:
(Nguyễn Thượng Dong và cs, 2007)
Polyscias fruticosa (L.) Harms (Đinh lăng hƣơng, Đinh lăng lá xẻ, cây gỏi cá)
Polyscias balfouriana Bailey (Đinh lăng lá tròn, Đinh lăng lá xà cừ)
Polyscias filicifolia (Merr. et Fourn) Bailey (Đinh lăng đuôi phƣợng, Đinh lăng
lá rách)
Polyscias guilfeylei var. licinita Bailey (Đinh lăng lá xoan xẻ, Đinh lăng lá xà
cừ nhỏ)
Polyscias guilfeylei (Cogh et March) Baylei (Đinh lăng lá trổ)
Polyscias scutellarie (N.L.Burn) Fosberg (Đinh lăng đĩa)

3


Một số hình ảnh về các loài Đinh lăng:

Hình 2.1. Đinh lăng lá nhỏ

Hình 2.2. Đinh lăng lá tròn

4


Hình 2.3. Đinh lăng đuôi phƣợng

Hình 2.4. Đinh lăng lá xoan xẻ

5


Hình 2.5. Đinh lăng lá trổ

Hình 2.6. Đinh lăng đĩa
Ngoài ra còn có Aralia chinensis L. Araliacea – Đinh lăng Trung Quốc có ở rừng Đà
Lạt.
6


2.1.2.

Thành phần hóa học

Theo Ngô Ứng Long và cộng sự thuộc Viện Y học Quân sự: rễ và lá của Đinh lăng có
chứa saponin, alkaloid, glucosid, flavonoid, tanin, vitamin B1, B2, B6, C, phytosterol,
acid hữu cơ, tinh dầu, nhiều nguyên tố vi lƣợng, các acid amin nhƣ lysin, cystein,
methionin là những acid amin không thể thay thế đƣợc và 21,1 % đƣờng. (Đỗ Tất Lợi,
2004)
Võ Duy Huấn đã phân lập đƣợc một số saponin mới từ rễ và lá Đinh lăng.
Ngoài ra, Trần Công Luận và cộng sự còn phân lập đƣợc 5 hợp chất polyacetylen
trong lá nhƣ: panaxydol, panaxynol, (8Z)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3-ol-10-on,
(8E)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3-ol-10-on, (8E)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10diol. Hai hợp chất sau chỉ thấy trong lá Đinh lăng mà chƣa thấy trong cây khác thuộc
chi Panax và họ Araliaceae. Trong lá, còn có saponin triterpen (1,65 %) là một genin
dạng oleanolic.
Trong rễ, cũng tìm thấy 5 hợp chất polyacetylen nhƣng chỉ có panaxydol, panaxynol,
(8E)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol là 3 chất có tác dụng kháng khuẩn mạnh
và chống một số dạng ung thƣ.
Cấu trúc hóa học của một số hợp chất polyacetylen:
OH
HO

6

4

8

3
10

17

1

(8E)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol
HO

4

6

8

3
O
1
10

17

(8Z)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3-ol-10-on

7


HO

6

4

8

3
1

10

O

(8E)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3-ol-10-on

HO

17

6

4

17

3
1

10

panaxynol

HO

4

6
8

3
10

1
O

17

panaxydol

8


2.1.3. Tác dụng dƣợc lý (Nguyễn Thị Ánh Tuyết, 2009; Trần Cao Sơn, 2015)
Ở Việt Nam, các loài Đinh lăng đƣợc trồng rất nhiều và đa phần đều có thể sử dụng
làm thuốc. Nhƣng có rất ít tài liệu nghiên cứu về tác dụng dƣợc lý của từng loài. Chỉ
có cây Đinh lăng Polyscias fruticosa (L.) Harms là đƣợc nghiên cứu nhiều nhất về
thành phần hóa học cũng nhƣ tác dụng dƣợc lý.
Đinh lăng đã đƣợc các nhà nghiên cứu ở Liên Xô thử nghiệm tác dụng tăng lực và
chống stress trên các phi công, nhà du hành vũ trụ và công nhân làm việc dƣới môi
trƣờng có bức xạ siêu tần, tác nhân độc hại.
Qua các nghiên cứu và thử nghiệm ở Việt Nam, Viện Y học quân sự cũng đã tìm đƣợc
rễ Đinh lăng làm tăng sức dẻo dai và sức đề kháng của cơ thể, chống mệt mỏi.
Năm 1985, Ngô Ứng Long và cộng sự đã nghiên cứu độc tính của Đinh lăng cho thấy
liều gây chết LD50 theo đƣờng tiêm phúc mạc là 32,9 g/kg chuột. Kết quả cho thấy với
liều uống hằng ngày 60 g/kg, sau 3 ngày có hiện tƣợng chuột chết. Nhƣ vậy, Đinh lăng
rất ít độc. Nếu so sánh với Nhân sâm về LD50 cùng tiêm phúc mạc là 16,5 g/kg thì
Đinh lăng ít độc kém 2 lần. Ở liều độc gây xung huyết ở gan, tim, phổi, dạ dày, ruột.
Saponin trong đinh lăng có thể gây huyết tán (vỡ hồng cầu). Ở ngƣời, uống quá nhiều
Đinh lăng sẽ bị say, mệt mỏi, tiêu chảy. Đồng thời Đinh lăng không gây tăng huyết áp
nhƣ Nhân sâm.
Các thí nghiệm trên chuột cho thấy, Đinh lăng có khả năng gây tăng tiết niệu trên năm
lần so với ngƣời bình thƣờng. Làm tăng sức đề kháng của chuột đối với các bức xạ cao
tầng, kéo dài thời gian sống của chuột khi bị nhiễm kí sinh trùng sốt rét Plasmodium
berghei và làm tăng tác dụng của thuốc chống sốt rét cloroquin.
Thực nghiệm trên ngƣời cho thấy, Đinh lăng làm tăng khả năng chịu đựng của bộ đội
và vận động viên thể thao. Tác dụng tăng cân, tăng lực và bổ cũng đã đƣợc thực
nghiệm trên ngƣời và chuột.
Ngoài ra Đinh lăng giúp cơ thể ngƣời bị suy mòn, mới khỏi ốm nhanh chóng hồi
phục, ăn ngon, ngủ tốt. Dùng Đinh lăng nấu nƣớc uống hằng ngày nhƣ thuốc bổ. Các
hợp chất polyacetylen nhƣ: (8E)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol trích từ cây
Panax vietnamensis và Polyscias fruticosa cho thấy có hoạt tính kháng chuẩn khuẩn
Gram dƣơng, kháng nấm Candida albican nhƣng không kháng đƣợc chủng khuẩn
Gram âm.
Từ năm 2000, Nguyễn Thị Thu Hƣơng và cộng sự đã nghiên cứu về cao phối hợp giữa
rễ và lá Đinh lăng (hay còn gọi Cao Đinh lăng), nhƣng tập trung chủ yếu vào lá vì đây
là nguồn nguyên liệu dễ thu hái. Dùng chuột nhắt trắng để thử nghiệm về tác dụng
chống stress và trầm cảm. Kết quả cho thấy Cao Đinh lăng có tác dụng chống trầm
cảm và phục hồi thời gian ngủ bị rút ngắn bởi stress ở mức liều 45 – 180 mg/kg thể
trọng. Ở khoảng liều này cũng có các tác dụng khác nhƣ: tăng lực, kích thích hoạt
9


động của não bộ và nội tiết, tăng sức đề kháng của cơ thể, chống viêm và xơ vữa động
mạch.
Theo dân gian, Đinh lăng đƣợc dùng làm thuốc bổ chữa suy nhƣợc cơ thể, mệt mỏi,
tiêu hóa kém, ho ra máu, đau tử cung, làm thuốc lợi tiểu và chống độc. Một số bài
thuốc dân gian có sử dụng Đinh lăng:
Chữa mệt mỏi, biếng hoạt động: rễ Đinh lăng phơi khô thái mỏng 5 g. Thêm 100 ml
nƣớc, đun sôi trong 15 phút, chia 2 - 3 lần uống trong ngày.
Chữa sốt lâu ngày, nhức đầu, háo khát, ho, đau, tức ngực, nƣớc tiểu vàng: Đinh
lăng tƣơi (rễ, cành) 30 g, lá vỏ chanh 10 g, vỏ quýt 10 g, sài hồ (rễ, lá, cành) 20 g, lá
tre tƣơi 20 g. Các vị cắt nhỏ, đổ ngập nƣớc, sắc đặc lấy 250 ml, chia uống 3 lần trong
ngày.
Chữa sƣng vú: cành lá Đinh lăng 30 – 40 g. Thêm 300 ml, sắc còn 200 ml, uống
nóng. Ngày uống 1 - 2 lần.
Thuốc lợi sữa: lá Đinh lăng tƣơi 50 – 100 g, bong bóng lợn 1 cái, thái nhỏ, trộn với
gạo nếp, nấu cháo ăn.
Chữa đau tử cung: cành và lá Đinh lăng rửa sạch, sao vàng, sắc uống thay chè.
Chữa mẩn ngứa do dị ứng: lá Đinh lăng 80 g, sao vàng, đổ 500 ml nƣớc sắc còn 250
ml uống trong ngày. Dùng liên tục trong 2 – 3 tháng.
Chữa thiếu máu: rễ Đinh lăng, hà thủ ô, thục địa, hoàng tinh, mỗi vị 100 g, tam thất
20 g. Tán bột, sắc uống ngày 100 g.
Chữa viêm gan mạn tính: rễ Đinh lăng 12 g, nhân trần 20 g, ý dĩ 16 g, hoài sơn, biển
đậu, rễ cỏ tranh, xa tiền tử, ngũ gia bì, mỗi vị 12 g, uất kim, nghệ, ngƣu tất, mỗi vị 8 g.
Sắc uống ngày một thang.
Chữa liệt dƣơng: rễ Đinh lăng, hoài sơn, ý dĩ, hoàng tinh, hà thủ ô, kỷ tử, long nhãn,
cám nếp, mỗi vị 12 g. Trâu cổ, cao ban long, mỗi vị 8 g. Sa nhân 6 g. Sắc uống, ngày
một thang.
Chữa sốt rét: rễ Đinh lăng, sài hồ, mỗi vị 20 g. Rau má 16 g. Lá tre, cam thảo nam,
mỗi vị 12 g. Bán hạ sao vàng 8 g, gừng 6 g. Sắc uống.
Bồi bổ cơ thể, ngừa dị ứng: lá Đinh lăng tƣơi (150 – 200 g) đun sôi trong 200 ml
nƣớc. Sau khi đun sôi 5 – 7 phút, chắt ra để uống nƣớc đầu tiên, đổ tiếp thêm khoảng
200 ml nƣớc, nấu sôi lại lần thứ hai.
Chữa tắc tia sữa: rễ Đinh lăng 40 g, gừng tƣơi 3 lát, đổ 500 ml nƣớc sắc còn 250 ml,
chia làm hai lần uống trong ngày, uống khi thuốc còn nóng.
Ho suyễn lâu năm: rễ Đinh lăng, bách bộ, đậu sắn, rễ cây dâu, nghệ vàng, rau tần dày
lá, mỗi vị đều 8 g. Củ xƣơng bồ 6 g, gừng khô 4 g, đổ 600 ml nƣớc, sắc còn 250 ml,
chia làm hai lần uống trong ngày, uống lúc còn nóng.
10


Phong thấp, thấp khớp: rễ Đinh lăng 12 g, cối xay, hà thủ ô, huyết rồng, rễ cỏ xƣớc,
thiên niên kiện tất cả 8 g. Vỏ quýt, quế chi 4 g (riêng vị quế chi bỏ vào sau cùng khi
sắp nhắc xuống). Đổ 600 ml nƣớc vào sắc còn 250 ml, chia làm 2 lần uống trong ngày.
Uống khi còn nóng.
Ngoài ra, lá Đinh lăng phơi khô đem lót gối hoặc trải giƣờng cho trẻ em nằm giúp
phòng bệnh kinh giật.
Ở Ấn Độ, ngƣời ta cho là cây có tính săn nên dùng trong điều trị sốt.
Ở Campuchia, ngƣời ta dùng lá phối hợp với các cây thuốc khác làm bột hạ nhiệt,
thuốc giảm đau. Lá dùng xông để ra mồ hôi, chữa chứng chóng mặt, dùng tƣơi hoặc
giã nát đắp ngoài trị viêm thần kinh khớp và vết thƣơng. Lá nhai nuốt với chút phèn trị
hóc xƣơng cá.
Bảng 2.1. Tóm tắt những tác dụng dƣợc lý quan trọng của Đinh lăng tƣơng tự Sâm
Việt Nam.
Tác dụng dƣợc lý

Chữa trị

1.Tăng thể lực, chống nhƣợc sức

Suy nhƣợc cơ thể

2. Kích thích các hoạt động não bộ

Suy nhƣợc thần kinh

3.Tác dụng kiểu nội tiết tố sinh dục

Suy nhƣợc sinh dục

4.Antistress, giải lo âu và chống trầm cảm

Các bệnh lý gây bởi stress

5.Tác dụng tăng cƣờng chức năng gan và bảo vệ tế bào

Xơ gan, giải độc gan

6.Giảm cholesterol huyết, giảm lipid

Xơ vữa động mạch

7.Chống oxy hóa (antioxidant)

Sự lão hóa

8.Gia tăng sức đề kháng không đặc hiệu

Sự miễn dịch

2.2.
GIỚI THIỆU VỀ THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT
2.2.1. Khái niệm HCBVTV
Tổ chức Nông nghiệp và Lƣơng thực của Liên hiệp quốc (FAO) đã đƣa ra định nghĩa
về thuốc BVTV nhƣ sau: “Thuốc BVTV là bất kì hợp chất hay hỗn hợp đƣợc dùng với
mục đích ngăn ngừa, tiêu diệt hoặc kiểm soát các tác nhân gây hại bao gồm vật chủ
trung gian truyền bệnh của con ngƣời hoặc động vật, các bộ phận không mong muốn
của động vật và thực vật gây hại hoặc ảnh hƣởng đến quá trình sản xuất, chế biến, bảo
quản, vận chuyển, mua bán thực phẩm, nông sản gỗ và sản phẩm từ gỗ, thức ăn chăn
11


nuôi, hoặc hợp chất đƣợc phân tán lên động vật để kiểm soát côn trùng, nhện hay các
đối tƣợng khác trong hoặc trên cơ thể chúng. Thuốc BVTV còn đƣợc dùng làm tác
nhân điều hòa sinh trƣởng thực vật, chất làm rụng lá, chất làm thƣa cây, tác nhân làm
thƣa quả hoặc ngăn chặn rụng sớm. Cũng có thể dùng thuốc BVTV cho trồng cây
trƣớc cũng nhƣ sau khi thu hoạch để bảo vệ sản phẩm không bị hỏng trong quá trình
bảo quản và vận chuyển”.
2.2.2. Phân loại thuốc BVTV
Thuốc BVTV đƣợc sử dụng rộng rãi với số lƣợng và chủng loại ngày càng tăng. Vì
thế, để thuận tiện trong quá trình sử dụng và công tác quản lý ngƣời ta thƣờng phân
loại thành các nhóm khác nhau. Sự phân loại này cũng rất đa dạng tùy thuộc mục đích
nhƣ: theo cấu tạo hóa học, theo mục đích sử dụng, theo nguồn gốc hay theo độc tính…
Theo công dụng thì thuốc BVTV đƣợc phân loại nhƣ sau: trừ sâu, trừ nấm, trừ cỏ, trừ
chuột, trừ nhện, trừ vi khuẩn, trừ ốc sên …
Thuốc trừ sâu là chất nào đó hoặc hỗn hợp các chất có thành phần hóa học hoặc
sinh học dùng để đẩy lùi, phá hủy và kiểm soát sâu bệnh hay điều hòa sự sinh trƣởng
của thực vật.
Thuốc trừ nấm là thuốc có tác dụng bảo vệ cây trồng và hạt giống, không để
cho nấm bệnh xâm nhập và gây hại, hoặc có tác dụng tiêu diệt nấm bệnh.
2.2.3. Mức dƣ lƣợng tối đa trong dƣợc liệu
Các nƣớc trên thế giới đều có mối quan tâm chung là nông nghiệp sạch, đặc biệt là rau
sạch và hiện nay mối quan tâm hàng đầu của ngành Dƣợc là dƣợc liệu sạch dùng để
làm thuốc, không còn tồn dƣ lƣợng hóa chất bảo vệ thực vật mà có thể ảnh hƣởng đến
sức khỏe con ngƣời. Mặc dù vậy nhƣng hiện nay các nghiên cứu về thuốc BVTV ở
nƣớc ta còn rất hạn chế.
Tổ chức Nông nghiệp và Lƣơng thực của Liên hiệp quốc (FAO) và Tổ chức Y tế thế
giới (WHO) đã đƣa ra qui định Codex về dƣ lƣợng tối đa cho phép của một số hoạt
chất thuốc BVTV trong nông sản, trong đó qui định cụ thể về thuốc BVTV trên từng
nền mẫu. Dƣ lƣợng là phần còn lại của hoạt chất, các sản phẩm chuyển hóa và các
thành phần khác có trong thuốc, tồn tại trên cây trồng, nông sản, đất, nƣớc sau một
thời gian dƣới tác động của hệ sống và điều kiện ngoại cảnh.
MRL (Maximun Residue Limit): là lƣợng tối đa một loại thuốc bảo vệ thực vật đƣợc
chấp nhận tồn tại trong nông sản, thực phẩm mà không gây hại cho con ngƣời. MRL
đƣợc biểu thị bằng miligam thuốc bảo vệ thực vật trong một kilogam thực phẩm
(mg/kg). (Bộ Y Tế, 2016)
12


ADI (Acceptable Daily Intake): lƣợng chất độc chấp nhận hấp thu vào cơ thể, không
gây hại cho ngƣời hay vật nuôi trong một ngày, đƣợc tính bằng mg hoặc µg hợp chất
độc cho đơn vị thể trọng. (Bộ Y Tế, 2016)
Mỗi thuốc BVTV có MRL riêng trên từng nền mẫu khác nhau. Tuy nhiên, với sự phát
triển của ngành công nghệ hóa học thì hàng loạt thuốc BVTV ra đời nên có rất nhiều
thuốc BVTV chƣa có qui định MRL trên từng nền mẫu. Để giải quyết vấn đề này,
nhiều quốc gia trên thế giới nhƣ Nhật, Mỹ, châu Âu … sử dụng giá trị MRL chung cho
tất cả thuốc BVTV là 0,01 mg/kg. Vì thế, các phòng thí nghiệm ở Việt Nam cũng đã
sử dụng giá trị này trong kiểm nghiệm dƣợc liệu. (Trần Cao Sơn, 2015)
2.2.4. Imidacloprid (Fishel F.M., 2013)
NO2

N
N
Cl

H 2C

N

N

H

Imidacloprid
Tên hóa học: 1-(6-chloro-3-pyridylmethyl)-N-nitroimidazolidin-2-ylideneamine
Khối lượng phân tử: 255,7 g/mol
Công thức phân tử: C9H10ClN5O2
Nhiệt độ nóng chảy: 144 oC
Là một thuốc BVTV thuộc nhóm Neonicotinoid, có phổ rất rộng. Đại diện của nhóm
này gồm có acetamiprid, imidacloprid, nitenpyram, thiamethoxam và thiacloprid. Đây
là nhóm chất gây kích thích thần kinh trung ƣơng tƣơng tự nicotin. Imidacloprid đƣợc
sử dụng từ giữa những năm 1990 ở các nƣớc Đông Nam Á và châu Âu. Nó đƣợc sử
dụng rộng rãi trong nông nghiệp nhƣ là một chất tăng trƣởng cho cây bằng cách phun
lên lá, xử lý giống và xử lý đất ở liều khá thấp. Imidacloprid là một chất không màu,
không mùi. Gần đây, một số nƣớc hạn chế sử dụng sử dụng những chất của nhóm này
vì có nhiều bằng chứng cho thấy nguy cơ gây hội chứng CDD (rối loạn sụt giảm bầy
đàn) đối với ong mật. Nguyên nhân là do các chất này phá huỷ hệ thống miễn dịch tự
nhiên của ong mật nhạy cảm với nhiều trƣờng hợp nhiễm trùng gây chết. Hiện nay, ở
Việt Nam các chất này vẫn đƣợc phép sử dụng làm HCBVTV trong nông nghiệp. (Bộ
Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 2013)

13


Bảng 2.2. Nghiên cứu về độc tính cấp của imidacloprid (Robert Krieger, 2001)
Động vật thí nghiệm

Đƣờng dùng

LD50/LC50 (mg/kg thể
trọng / mg/m3 không khí)

Chuột nhắt

Uống

131 – 168

Chuột cống

Uống

424 – 475

Chuột cống

Da

> 5000

Chuột cống

Hít

> 69

Chuột cống

Hít bụi 4h

> 5323

Thỏ

Da

Không bị kích ứng

Thỏ

Mắt

Không bị kích ứng

Chuột lang

Da

Không thấy nhạy cảm

Bảng 2.3. Giới hạn tối đa dƣ lƣợng imidacloprid trong một số thực phẩm (Bộ Y Tế,
2016)
Tên thuốc
BVTV

ADI (mg/kg thể
trọng)

Thực phẩm

2

Rau xà lách

Imidacloprid

0 – 0,06

MRL (mg/kg)

Các loại rau từ rễ và củ

0,5

Các loại bắp cải

0,5

Dƣa chuột

1
0,5

Cà chua

2.2.5. Azoxystrobin (Ehab M.H. Abdelraheem, 2015; T. Nageswara Rao, 2012)
N
O

N

O

CN
MeO2C

Azoxystrobin
14

OMe


Tên hóa học: Methyl (E)-2-{2[6-(2-cyanophenoxy)pyrimidin-4yloxy]phenyl}3-methoxyacrylate
Khối lượng phân tử: 403,4 g/mol
Công thức phân tử: C22H17N3O5
Nhiệt độ nóng chảy: 116 oC
Azoxystrobin là một thuốc diệt nấm thuộc nhóm Strobin, một trong số những hóa chất
đƣợc sử dụng chủ yếu để hạn chế sự hƣ hỏng của các loại cây trồng do nấm tấn công.
Thuốc này có phổ rộng, có nguồn gốc từ tự nhiên và đƣợc xếp và nhóm Strobilurin.
Tác động diệt nấm bằng cách ức chế hô hấp ở ty thể của nấm. Nó đƣợc hấp thu qua rễ
và di chuyển trong mạch gỗ đi đến thân, lá hoặc thấm qua bề mặt lá đi đến mép lá và
rìa lá đang phát triển. Azoxystrobin đƣợc sử dụng để hạn chế nguy cơ gây bệnh trên lá
và đất nhƣ bệnh nấm lá, bệnh đốm trắng, bệnh rụng lá và các mầm bệnh khác trên
nhiều cây trồng.
Bảng 2.4. Nghiên cứu về độc tính cấp của azoxystrobin
Động vật thí nghiệm

Giới

Đƣờng dùng

LD50 (mg/kg)

Chuột nhắt

Đực, cái

Uống

>5000

Chuột cống

Đực, cái

Uống

>5000

Chuột cống

Đực, cái

Da

>2000

Chuột cống

Đực, cái

Hít trong 4h

LC50 (mg/l)

Đực 0,698
Cái 0,962
≥ 4,7

Chuột cống

Cái

Hít

Thỏ

Cái

Kích ứng da

Không đáng kể

Thỏ

Cái

Kích ứng mắt

Không đáng kể

Chuột lang

Cái

Trên da nhạy
cảm

Không nhạy
cảm

15


Bảng 2.5. Giới hạn tối đa dƣ lƣợng azoxystrobin trong một số thực phẩm (Bộ Y Tế,
2016)
Tên thuốc

ADI (mg/kg thể

BVTV

trọng)

Thực phẩm

MRL (mg/kg)

Các loại rau họ bắp cải, cải

5

bắp, cải bông

Azoxystrobin

0 – 0,02

Các loại rau bầu bí

1

Các loại rau họ đậu, rau xà
lách, lá rau diếp

3

Sâm

0,1

Sâm khô (kể cả sâm đỏ)

0,3

Chiết xuất sâm

0,5

2.2.6. Ƣu, nhƣợc điểm và vị trí của ngành thuốc BVTV hiện nay (Michelangelo
Anastassiades et al., 2003)
Ưu điểm:
dịch.
-

Diệt dịch hại nhanh, có khả năng chặn đứng và phòng trừ khi xảy ra các trận
Cho hiệu quả trực tiếp, rõ rệt và tƣơng đối triệt để.
Nâng cao năng suất rõ rệt.
Dễ ứng dụng rộng rãi ở nhiều nơi, nhiều vùng khác nhau.

Nhược điểm:
-

Dễ gây độc cho ngƣời trực tiếp sử dụng thuốc (pha chế, phun thuốc …)
Ảnh hƣởng sâu sắc đến các quần thể sinh vật gây mất cân bằng sinh thái.

Tác động mạnh mẽ đến môi trƣờng sống xung quanh nhất là những thuốc có độ
bền lớn và thời gian lƣu trong đất dài. Với DDT phải mất đến 10 năm để phân hủy
95% thuốc.
Gây ra hiện tƣợng kháng thuốc. Là một vấn đề đang cần đƣợc quan tâm hàng
đầu, do sử dụng một loại thuốc liên tục trong nhiều năm.
Với những ƣu và nhƣợc điểm trên, hiện nay trên thế giới đã có xu hƣớng hạn chế sử
dụng thuốc BVTV có độc tính cao gây hại cho môi trƣờng, thay vào đó cố gắng để tìm
ra những loại thuốc mới có ƣu điểm tốt và tránh đƣợc những nhƣợc điểm trên.
16


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×