Tải bản đầy đủ

Thiết kế, tổng hợp một số sensor huỳnh quang từ dẫn xuất của cyanine và coumarin để xác định biothiol và Hg(II) tt

24

1

(c). Các sensor huỳnh quang Hg2L2 và AMC đều có thể phát
hiện Cys trong dung dịch với lượng nhỏ dung môi hữu cơ, thời gian
của phản ứng xảy ra nhanh, có thể phát hiện được Cys với nồng độ
thấp hơn trong nội bào và thấp hơn so với các sensor đã công bố.
5. Đã sử dụng phương pháp TD-DFT để nghiên cứu đặc tính
huỳnh quang của các chất dựa trên hình học tối ưu tại trạng thái cơ
bản và các trạng thái kích thích; kết hợp với sử dụng phương pháp
phân tích NBO để xem xét sự biến đổi đặc tính huỳnh quang của các
chất dựa trên nghiên cứu bản chất các liên kết. Kết quả tính toán cho
thấy, ion Hg(II) gây nên phản ứng tạo phức với L dẫn đến làm giảm
khoảng cách năng lượng giữa HOMO và LUMO, đồng thời làm thay
đổi hệ liên hợp electron π, là nguyên nhân dẫn đến sự dập tắt huỳnh
quang trong phức Hg2L2. Sự phát xạ huỳnh quang của AMC, AMCCys, AMC-Hcy và AMC-GSH đều xuất phát từ các trạng thái kích
thích electron ở mức cao (S2, S4) về trạng thái cơ bản S0. Đây là một
trường hợp ngoại lệ của quy tắc Kasha.

MỞ ĐẦU

Glutathione (GSH), Cysteine (Cys) và Homocysteine (Hcy) là
là những hợp chất thiol, đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh
học. Mức độ bất thường của các biothiol có liên quan đến nhiều loại
bệnh. Thủy ngân là một trong những chất gây ô nhiễm nguy hiểm và
phổ biến, ảnh hưởng nghiêm trọng về sức khỏe con người. Vì vậy,
việc xác định biothiol trong tế bào, hàm lượng thủy ngân trong các
nguồn nước là rất quan trọng trong sự chẩn đoán sớm các bệnh liên
quan, bảo vệ môi trường sống và hiện đang thu hút sự quan tâm của
các nhà khoa học trong và ngoài nước.
Có nhiều phương pháp đã được áp dụng phát hiện các
biothiol và ion Hg(II) như phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC), phương pháp phổ khối lượng (MS),…,và phương pháp
huỳnh quang. Trong đó, phương pháp huỳnh quang có nhiều ưu điểm
hơn, đó là không đòi hỏi thiết bị máy móc đắt tiền, dễ thực hiện, ít
tốn kém, và áp dụng phân tích cho nhiều đối tượng, đặc biệt có thể
phân tích các chất trong tế bào sống.
Phương pháp huỳnh quang được Giáo sư Anthony W.
Czarnik ở Đại học Quốc gia Ohio nghiên cứu và đề xuất cách tiếp
cận mới trong lĩnh vực sensor quang học vào năm 1992. Với những
ưu thế của phương pháp huỳnh quang, nên trong nhiều năm qua, các
nghiên cứu về sensor huỳnh quang nhằm phát hiện các ion kim loại,
anion, đặc biệt các phân tử sinh học luôn thu hút sự quan tâm của
các nhà khoa học trong và ngoài nước với số lượng các sensor
huỳnh quang mới được công bố ngày càng nhiều trên thế giới. Ở
Việt Nam, việc nghiên cứu sensor huỳnh quang bắt đầu từ năm 2007
bởi tác giả Dương Tuấn Quang.
Để xác định các biothiol, các nghiên cứu đã thiết kế sensor
huỳnh quang dựa trên các phản ứng đặc trưng của biothiol, phản ứng
trao đổi phức (phức của chất huỳnh quang với ion Cu(II)…). Các
nghiên cứu về sensor huỳnh quang phát hiện ion Hg(II) đã dựa trên
các phản ứng đặc trưng của ion Hg(II) và dựa trên phản ứng tạo phức
giữa ion Hg(II) với các phối tử -O, -N, -S trong vòng hoặc ở mạch hở.


2
Tuy nhiên, đa phần các sensor này vẫn tồn tại một số hạn chế như sử
dụng một lượng lớn dung môi hữu cơ, giới hạn phát hiện còn cao, có
bước sóng phát xạ ngắn gây ảnh hưởng đến tế bào, và phản ứng giữa
sensor với chất phân tích xảy ra chậm. Hiện nay, các nhà khoa học trên
thế giới vẫn đang tiếp tục nghiên cứu thiết kế các sensor huỳnh quang có


độ nhạy và độ chọn lọc cao để phát hiện các biothiol và ion Hg(II).
Hiện nay, hoá tính toán đã trở thành công cụ quan trọng
trong nghiên cứu hoá học nói chung và nghiên cứu sensor huỳnh
quang nói riêng. Sự kết hợp hóa tính toán với nghiên cứu thực
nghiệm là hướng nghiên cứu hiện đại. Tuy nhiên, hiện vẫn còn rất ít
sensor huỳnh quang nghiên cứu theo hướng này được công bố.
Trước những thực trạng trên, chúng tôi thực hiện đề tài:
"Thiết kế, tổng hợp một số sensor huỳnh quang từ dẫn xuất của
cyanine và coumarin để xác định biothiol và Hg(II) ".
Những đóng góp mới của luận án:
- Sensor L mới được thiết kế từ dẫn xuất cyanine đã được
công bố, phát hiện chọn lọc ion Hg(II) dựa trên phản ứng tạo
phức, hoạt động theo kiểu ON-OFF; phức chất của Hg(II) với L
(Hg2 L2) phát hiện chọn lọc Cys dựa trên phản ứng trao đổi phức,
hoạt động theo kiểu tắt-bật (OFF-ON). Giới hạn phát hiện và giới
hạn định lượng ion Hg(II) bằng L tương ứng là 11,8 μg/L và 39,3
μg/L hay 0,059 μM và 0,19 μM; giới hạn phát hiện và giới hạn
định lượng Cys bằng Hg2 L2 tương ứng là 0,2 μM và 0,66 μM.
- Sensor AMC mới được thiết kế từ dẫn xuất coumarin đã
được công bố, phát hiện chọn lọc Cys dựa trên phản ứng cộng
Michael, hoạt động theo kiểu dựa trên sự biến đổi tỷ lệ cường độ
huỳnh quang ở hai bước sóng. Giới hạn phát hiện và giới hạn định
lượng Cys được xác định tương ứng là 0,5 μM và 1,65 μM.
- L và AMC được nghiên cứu bằng sự kết hợp linh hoạt
nghiên cứu tính toán hóa lượng tử với nghiên cứu thực nghiệm.
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan nghiên cứu về sensor huỳnh quang
1.1.1. Tình hình nghiên cứu sensor huỳnh quang

23
NHỮNG KẾT LUẬN CHÍNH CỦA LUẬN ÁN
1. Đã kết hợp linh hoạt giữa tính toán hóa học lượng tử và
nghiên cứu thực nghiệm để nghiên cứu phát triển thành công hai
sensor huỳnh quang mới là L và AMC. Sự kết hợp linh hoạt này đã
giảm đáng kể khối lượng tính toán lý thuyết và thực nghiệm, tiết
kiệm thời gian và chi phí hóa chất sử dụng, tăng khả năng thành
công, làm sáng tỏ được bản chất các quá trình, tạo cơ sở khoa học
cho các nghiên cứu tiếp theo.
2. Các phản ứng tổng hợp sensor L và sensor AMC đã được
nghiên cứu dự đoán từ tính toán và khẳng định từ kết quả tổng hợp
thực nghiệm sau đó.
3. Cấu trúc, đặc tính của sensor L và sensor AMC đã được
xác định ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ với kết quả đáng
tin cậy, thông qua kiểm tra, đối chiếu và khẳng định từ các kết
quả thực nghiệm.
4. (a). Sensor L có thể phát hiện chọn lọc ion Hg(II) trong sự
có mặt các ion kim loại khác, hoạt động theo kiểu bật-tắt huỳnh
quang. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ion Hg(II) theo
phương pháp trắc quang là 0,076 μM và 0,25 μM; theo phương pháp
huỳnh quang là 0,059 μM và 0,19 μM. Phức Hg2L2 có thể phát hiện
chọn lọc Cys trong sự hiện diện các amino acids không có nhóm
thiol, hoạt động theo kiểu tắt-bật huỳnh quang. Giới hạn phát hiện và
giới hạn định lượng Cys tương ứng là 0,2 μM và 0,66 μM. Sensor L
phát hiện ion Hg(II) và phức Hg2L2 phát hiện Cys dựa trên phản ứng
trao đổi phức giữa ion trung tâm Hg(II) với hai phối tử là L và Cys.
(b). Sensor AMC có thể phát hiện chọn lọc các biothiol (Cys,
GSH, Hcy) trong sự hiện diện các amino acids không có nhóm thiol,
hoạt động dựa trên sự biến đổi tỉ lệ cường độ huỳnh quang ở hai bước
sóng. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Cys tương ứng là 0,5
μM và 1,65 μM. Sensor AMC phản ứng với các biothiol (Cys, GSH,
Hcy) theo cơ chế phản ứng AMC cộng Michael.


22

3

Đối với AMC-Cys, các quá trình chuyển electron từ S1 về S0
tại cấu hình REES1 và cấu hình REES2 là bị cấm. Trong khi đó, các quá
trình chuyển electron từ S2 về S0 tại cấu hình REES1 và cấu hình REES2
của AMC-Cys là xảy ra. Thêm vào đó, do cường độ dao động (f) của
cả hai quá trình này là rất lớn, trong đó cường độ dao động (f) ở bước
sóng 340,3 nm là 0,5122, lớn hơn ở bước sóng 324,5 nm là 0,3171;
điều này dẫn đến cường độ huỳnh quang của AMC-Cys quan sát
được trong thực nghiệm là rất mạnh, và ở bước sóng dài 340,3 nm là
mạnh hơn nhiều so với ở bước sóng ngắn 324,5 nm. Ngoài ra, do quá
trình chuyển electron từ S2 về S1 tại cấu hình REES1, với cấu hình S2
tương ứng không phải là cấu hình có năng lượng cực tiểu, nên quá
trình (6) ở Hình 3.48b ít chiếm ưu thế hơn so với quá trình (4) ở Hình
3.48b. Đó có thể là một nguyên nhân khác dẫn đến cường độ huỳnh
quang ở bước sóng dài (340,3 nm) mạnh hơn rất nhiều so với ở bước
sóng ngắn (324,5 nm) như quan sát trong thực nghiệm.
Đối với AMC-Hcy và AMC-GSH (tương tự AMC-Cys).
Như đã trình bày, kết quả nghiên cứu về hình học tối ưu các
trạng thái kích thích của AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy và AMCGSH cho thấy, đối với sensor AMC, có sự xoắn góc mạnh giữa tiểu
phần coumarin và tiểu phần acryloxy tại cấu hình REES1 và REES2, điều
này dẫn đến sự phá vỡ hệ thống electron π liên hợp giữa hai tiểu
phần, kéo theo đó là mật độ electron giữa tiểu phần coumarin và tiểu
phần acryloxy bị phân tách mạnh. Kết quả là có sự xen phủ rất ít giữa
các MO trong các bước chuyển đổi electron ở trạng thái kích thích
của sensor AMC. Ngược lại, tại REES2 của AMC-Cys, AMC-Hcy và
AMC-GSH, tiểu phần coumarin và tiểu phần acryloxy nằm trong
cùng một mặt phẳng. Đây là một yếu tố thuận lợi cho sự xen phủ
giữa các MO trong các bước chuyển đổi trạng thái.
Những phân tích ở trên cho thấy, sự phát huỳnh quang của
sensor AMC và các sản phẩm cộng của nó với các biothiol không bắt
nguồn từ trạng thái S1. Đây là một trường hợp ngoại lệ của quy tắc
của Kasha.

1.1.2. Nguyên lý hoạt động của sensor huỳnh quang
1.1.3. Cấu tạo của sensor huỳnh quang
1.1.4. Nguyên tắc thiết kế các sensor huỳnh quang
1.2. Vai trò của các biothiol trong tế bào và phương pháp phát hiện
1.2.1. Các biothiol và vai trò của chúng
1.2.2. Phương pháp phát hiện các biothiol
1.3. Nguồn ô nhiễm, độc tính, phương pháp phát hiện ion Hg(II)
1.3.1. Nguồn ô nhiễm, độc tính của ion Hg(II)
1.3.2. Phương pháp phát hiện ion Hg (II)
1.4. Sensor huỳnh quang phát hiện các biothiol
1.4.1. Dựa trên phản ứng tạo vòng với các aldehyde
1.4.2. Dựa trên phản ứng cộng Michael
1.4.3. Dựa trên phản ứng ghép nối peptide
1.4.4. Dựa trên phản ứng sắp xếp lại nhóm thế ở nhân thơm
1.4.5. Dựa trên phản ứng phân tách sulfonamide ester hoặc sulfonate
ester bởi thiol
1.4.6. Dựa trên phản ứng phân tách disulfides bởi thiol
1.4.7. Dựa trên phản ứng hình thành và phân hủy phức
1.4.8. Dựa trên các cơ chế khác
1.5. Sensor huỳnh quang phát hiện ion Hg(II)
1.5.1. Dựa trên các phản ứng tạo phức với ion Hg(II)
1.5.2. Dựa trên các phản ứng đặc trưng của ion Hg(II)
1.6. Sensor huỳnh quang phát hiện biothiol và ion Hg(II) dựa
trên fluorophore là cyanine và coumarin
1.7. Tổng quan ứng dụng hóa học tính toán trong nghiên cứu
các sensor huỳnh quang
CHƯƠNG 2
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mục tiêu nghiên cứu
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu thiết kế, tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng
sensor huỳnh quang L từ dẫn xuất của cyanine để phát hiện chọn lọc
các biothiol và ion Hg(II):


4

21

+ Nghiên cứu lý thuyết về thiết kế, tổng hợp và đặc trưng của
sensor L.
+ Nghiên cứu thực nghiệm tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng
của sensor L.
+ Nghiên cứu lý thuyết về ứng dụng của sensor L phát hiện
ion Hg(II).
+ Nghiên cứu sử dụng phức (tạo bởi ion Hg(II) với sensor L)
phát hiện các biothiol. Trong đó, nghiên cứu lý thuyết được tiến hành
trước để định hướng cho việc nghiên cứu ứng dụng của phức tiếp theo.
- Nghiên cứu thiết kế, tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng của
sensor AMC từ dẫn xuất của coumarin để phát hiện chọn lọc
các biothiol:
+ Nghiên cứu lý thuyết về thiết kế, tổng hợp sensor AMC và
phản ứng của sensor AMC với các biothiol.
+ Nghiên cứu thực nghiệm về tổng hợp, đặc trưng và ứng
dụng của sensor AMC.
+ Nghiên cứu lý thuyết về đặc tính và ứng dụng của
sensor AMC.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu tính toán lý thuyết
- Việc xác định cấu trúc hình học bền, năng lượng điểm đơn
được thực hiện bằng phương pháp DFT tại B3LYP/LanL2DZ, sử
dụng phần mềm Gaussian 03.
- Các thông số năng lượng tương tác được hiệu chỉnh ZPE
gồm biến thiên entanpi và biến thiên năng lượng tự do Gibbs của các
phản ứng được tính toán dựa trên sự khác biệt giữa tổng năng lượng
của các sản phẩm và tổng năng lượng các chất tham gia.
- Tính toán trạng thái kích thích và các yếu tố phụ thuộc thời
gian được thực hiện bởi phương pháp TD-DFT ở cùng mức lý thuyết.
- Các phân tích AIM và NBO được tiến hành ở cùng mức lý
thuyết B3LYP/LanL2DZ.
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

quang của AMC là nhỏ như quan sát được trong thực nghiệm. Ngoài
ra, do quá trình kích thích từ S0→S1 (quá trình (1) ở Hình 3.48a) có
cường độ dao động lớn hơn nhiều so với quá trình kích thích từ
S0→S2 (quá trình (2) ở Hình 3.48a), nên quá trình chuyển electron từ
S1 về S0 (quá trình (3) ở Hình 3.48a) sẽ chiếm ưu thế hơn từ S2 về S0
(quá trình (4) ở Hình 3.48a). Điều này có thể là nguyên nhân dẫn đến
cường độ huỳnh quang ở bước sóng dài (469,5 nm) mạnh hơn cường
độ huỳnh quang ở bước sóng ngắn (417,4 nm) như quan sát trong
thực nghiệm.
(a)

(b)

(c)

(d)

Hình 3.48. Giản đồ năng lượng các quá trình kích thích và giải phóng
năng lượng kích thích tại hình học bền ở trạng thái cơ bản (RGS) và trạng thái kích
thích electron (REES1, REES2,...) ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ: (a) AMC;
(b) AMC-Cys; (c) AMC-Hcy; (d) AMC-GSH


20

5

3.2.3.2. Nghiên cứu lý thuyết phổ kích thích và phổ huỳnh quang
a. Nghiên cứu lý thuyết phổ kích thích
Từ kết quả tính toán cho thấy, trong sensor AMC, bước
chuyển electron singlet từ trạng thái cơ bản S0 lên trạng thái kích
thích S1 là bước chuyển chính, với cường độ dao động (f) lớn nhất là
0,5348, tại bước sóng 320,9 nm. Bước chuyển trạng thái S0→S1 chủ
yếu là do sự đóng góp của bước chuyển electron từ HOMO→LUMO,
với tỷ lệ đóng góp lên đến 96,21%. Bên cạnh đó, sự xen phủ giữa
HOMO và LUMO là rất lớn, điều này cho thấy việc chuyển electron
từ HOMO sang LUMO là thuận lợi. Các bước chuyển trạng thái khác
đều có cường độ dao động (f) nhỏ không đáng kể.
Trong khi đó, với AMC-Cys, AMC-Hcy, và AMC-GSH, số
liệu tính toán cho thấy, bước chuyển electron singlet từ trạng thái cơ
bản S0 lên trạng thái kích thích S2 là bước chuyển chính, với cường
độ dao động (f) lần lượt là 0,3723; 0,3694 và 0,3801 (lớn hơn rất
nhiều so với các bước chuyển khác), tại các bước sóng tương ứng là
300,6; 300,4 và 300,7 nm. Trong các bước chuyển trạng thái này,
bước chuyển electron từ HOMO-1→LUMO là bước chuyển chính,
với tỷ lệ đóng góp tương ứng là 89,17; 89,05 và 89,24%. Mặt khác,
sự xen phủ giữa HOMO-1 và LUMO là rất lớn, nên việc chuyển
electron từ HOMO-1 lên LUMO là thuận lợi. Các bước chuyển trạng
thái khác đều có cường độ dao động (f) nhỏ không đáng kể.
Kết quả phân tích các MO biên cũng cho thấy, không có sự
xen phủ giữa HOMO và HOMO-1. Do đó, trong AMC, AMC-Cys,
AMC-Hcy và AMC-GSH không xảy ra quá trình PET từ HOMO đến
HOMO-1. Kết quả, các chất AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy và AMCGSH đều phát huỳnh quang như trình bày ở thực nghiệm.
b. Nghiên cứu lý thuyết phổ huỳnh quang
Đối với sensor AMC, tại cấu hình REES1, các quá trình
chuyển electron từ S1 và S2 về S0 là bị cấm. Tại cấu hình REES2, các
quá trình chuyển electron từ S1 và S2 về S0 là xảy ra. Thêm vào đó,
do cường độ dao động (f) của cả hai quá trình (3) và (4) ở trên là lớn
không đáng kể (0,0137 và 0,0152), điều này dẫn đến cường độ huỳnh

- Đặc trưng cấu trúc của các chất được khẳng định bởi các
phổ 1H -NMR, phổ 13C- NMR, phổ khối MS.
- Đặc tính, ứng dụng của các sensor được thực hiện bởi
phương pháp quang phổ huỳnh quang và UV-Vis.
- Các điều kiện tổng hợp các sensor đã được nghiên cứu dựa
trên kết quả dự đoán từ tính toán lý thuyết và kết quả thực nghiệm
công bố trước đây về các phản ứng tương tự [2], [3], [29]. Quy trình
tổng hợp các sensor được tóm tắt như sau:
a. Tổng hợp sensor L
* Tổng hợp CBZT
2-methylbenzothiazole (3,0 g, 0,02 mol) và acid bromoacetic
(4,18 g, 0,03 mol) được hòa tan trong 50 mL ethanol tuyệt đối. Hỗn
hợp phản ứng được đun hồi lưu trong 8 giờ. Sau đó để nguội đến
nhiệt độ phòng và thu được kết tủa. Rửa sạch kết tủa nhiều lần với
ethanol trong môi trường kiềm, sau đó làm khô thu được chất rắn
CBTZ (khoảng 4,0 g với hiệu suất 75%).
* Tổng hợp sensor L
CBTZ
(290mg,1mmol)

4-diethylamino-2hydroxybenzaldehyde (190 mg, 1 mmol) được hòa tan trong 30 mL
ethanol tuyệt đối. Thêm 1 giọt piperidine, dung dịch phản ứng
chuyển sang màu đỏ. Đun hồi lưu hỗn hợp phản ứng trong 10 giờ,
sau đó làm nguôi đến nhiệt độ phòng. Lọc lấy kết tủa, rửa sạch nhiều
lần bởi diethyl ether và sau đó làm khô thu được sản phẩm L (khoảng
3,0 g, với hiệu suất khoảng 38%).
b. Tổng hợp AMC
Hòa tan 4-methyl-7-hydroxylcoumarin (1,7 g, 9,4 mmol) và
Et3N (7,9 mL, 56,4 mmol) trong CH2Cl2 (20 mL), thêm một lượng
nhỏ chất xúc tác 4-dimethylaminopyridine, thu được dung dịch. Làm
lạnh và giữ dung dịch phản ứng ở nhiệt độ 0 oC. Thêm từ từ (trong
khoảng thời gian 1 giờ) vào dung dịch phản ứng từng giọt dung dịch
acryloyl chloride (1,9 mL, 23,5 mmol) trong CH2Cl2 (20 mL). Sau
đó, khuấy dung dịch phản ứng 2 giờ ở nhiệt độ phòng. Thêm nước
vào dung dịch thu được để hòa tan các muối amine. Tiếp tục rửa sạch
pha hữu cơ thu được bằng nước, sau đó làm khô pha hữu cơ bằng


6

19

muối MgSO4 khan. Làm bay hơi dung môi hữu cơ trên máy cô quay
chân không. Sản phẩm sau đó được tinh chế bằng cách kết tinh lại
trong ethanol, thu được chất rắn kết tinh màu trắng, khối lượng
khoảng 1 gam, hiệu suất khoảng 45%.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Thiết kế, tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng sensor L từ dẫn
xuất của cyanine phát hiện các biothiol và ion Hg(II) dựa trên
phản ứng tạo phức
3.1.1. Nghiên cứu lý thuyết về thiết kế, tổng hợp, đặc trưng của
sensor L
3.1.1.1. Nghiên cứu thiết kế, tổng hợp sensor L
Mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ đã được áp dụng cho hệ
nghiên cứu.
Các dẫn xuất cyanine bao gồm R2N+=CH[CH=CH]n-NR2,
+
Aryl=N =CH[CH=CH]n-NR2, Aryl=N+=CH[CH=CH]n-N=Aryl, các
dạng này đều có cấu trúc donor - hệ liên hợp π - acceptor. Trong đó,
donor (nhóm đẩy electron) là một nhóm amino; aceptor (nhóm rút
electron) là ion amoni. Chúng được biết đến là những hợp chất màu,
phát huỳnh quang mạnh [40].
Sensor L dự kiến thiết kế theo sơ đồ tổng hợp sau:

huỳnh quang của các dung dịch gồm AMC + biothiol + các amino
acids với các dung dịch gồm AMC + biothiol (Hình 3.38b).

Fluorophore
HO
HO
S

BZT

S

BrCH2COOH

N

(I)

OHC

-

O2C

CBZT

N

S

N

N

N
(II)

-

O2C

L

Receptor

Hình 3.1. Sơ đồ thiết kế và tổng hợp sensor L
Trong đó fluorophore là cyanine, receptor là nhóm -COO-, là
nhóm có ái lực mạnh với ion Hg(II); các phản ứng tổng hợp L thực
hiện qua hai giai đoạn: giai đoạn (I) và giai đoạn (II).

Hình 3.38. (a) Phổ huỳnh quang của AMC (10 μM, C 2 H5 OH/HEPES, pH
=7,4, 1/4, v/v, tại 25 o C) khi thêm Cys, Hcy, GSH, các amino acids khác (bao gồm Arg,
Gly, Ala, Asp, Glu, Leu, Lys, Ile, Met, Thr, Ser, Trp, Tyr and Val); (b)Phổ huỳnh quang
của AMC (10 μM, C 2H5 OH/HEPES, pH =7,4, 1/4, v/v, tại 25 oC) trong sự hiện diện của
hỗn hợp các amino acids (bao gồm Arg, Gly, Ala, Asp, Glu, Leu, Lys, Ile, Met, Thr, Ser,
Trp, Tyr và Val) khi thêm Cys, Hcy và GSH

d. Khảo sát sử dụng sensor AMC phát hiện định lượng Cys
Trong khoảng nồng độ Cys từ 0 đến 10 μM, tỷ lệ cường độ
huỳnh quang ở hai bước sóng 450 và 375 nm (F450/375) có quan hệ
tuyến tính với nồng độ Cys theo phương trình: F450/375 = 1,5431 +
2,257 × [Cys], với R = 0,982. Giới hạn phát hiện và giới hạn định
lượng Cys đã được xác định tương ứng là 0,5 μM và 1,65 μM.
3.2.3. Nghiên cứu lý thuyết về đặc tính và ứng dụng của AMC
3.2.3.1. Hình học tối ưu của AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy và
AMC-GSH ở trạng thái cơ bản và trạng thái kích thích electron
Đối với sensor AMC, ở trạng thái cơ bản S0, tiểu phần
coumarin và acryloxy gần như đồng phẳng. Trong khi đó, ở trạng thái
kích thích electron S1(REES1) và S2(REES2), tiểu phần coumarin và
acryloxy gần như ở trong hai mặt phẳng vuông góc với nhau.
Đối với AMC-Cys, AMC-Hcy và AMC-GSH, trong các cấu
hình S0(RGS) và S1(REES1), có sự xoắn góc giữa tiểu phần coumarin và
acryloxy. Trong khi đó, ở cấu hình S2(REES2), tiểu phần coumarin và
acryloxy gần như đồng phẳng.


18

7

Trong khi đó, dung dịch sensor AMC tự do hiển thị một
dải phát xạ huỳnh quang vai với hai đỉnh cực đại ở bước sóng 375
nm và 450 nm (Hình 3.33b). Hiệu suất lượng tử huỳnh quang (Φ)
của sensor AMC đã được xác định là 0,05. Khi thêm Cys vào
dung dịch sensor AMC, cường độ huỳnh quang tăng dần ở cả hai
đỉnh phát xạ. Trong đó, cường độ phát xạ huỳnh quang ở bước
sóng dài tăng mạnh hơn cường độ phát xạ huỳnh quang ở bước
sóng ngắn. Sự thay đổi cường độ huỳnh quang ở cả hai bước sóng
375 và 450 nm như trên dẫn đến một khả năng có thể sử dụng
AMC để làm sensor huỳnh quang hoạt động dựa trên sự biến đổi
tỷ lệ cường độ huỳnh quang ở hai bước sóng để xác định Cys.
b. Khảo sát phản ứng giữa sensor AMC với Cys
Khi thêm Cys từ 0 đến 10 μM vào dung dịch AMC (10
μM), tỷ lệ cường độ huỳnh quang ở hai bước sóng 450 và 375 nm
(F450/375) có quan hệ tuyến tính chặt chẽ với nồng độ Cys. Sau đó,
tỷ lệ này thay đổi không đáng kể nếu tiếp tục tăng nồng độ Cys.
Điều này cho thấy phản ứng giữa AMC với Cys xảy ra theo tỷ lệ
mol 1:1 (tương tự Hcy và GSH). Kết quả này phù hợp với kết quả
thu được khi xác định hệ số tỷ lượng của phản ứng giữa AMC với
Cys bằng phương pháp đồng phân tử gam và phân tích phổ khối
lượng của sản phẩm phản ứng giữa AMC và Cys.
c. Khảo sát ảnh hưởng của các amino axit cạnh tranh
Kết quả khảo sát cho thấy, khi bổ sung các amino acids có
chứa thiol, cường độ huỳnh quang của dung dịch AMC cũng tăng
lên rõ rệt ở cả hai dải phát xạ, trong đó tăng mạnh mẽ ở bước sóng
450 nm và tăng vừa phải ở bước sóng phát xạ 375 nm. Tuy nhiên,
mức độ gia tăng cường độ huỳnh quang theo thứ tự như sau: Cys>
GSH> Hcy (Hình 3.38a).
Đối với amino acids khác không có chứa nhóm thiol hầu như
không làm thay đổi cường độ huỳnh quang của dung dịch sensor
AMC (Hình 3.38a). Sự có mặt của amino acids này cũng không làm
ảnh hưởng đến phản ứng giữa các biothiol (Cys, GSH và Hcy) với
AMC, bằng chứng là không xuất hiện sự khác biệt đáng kể giữa phổ

Phản ứng ghép nối receptor vào fluorophore, phản ứng số (I)
dựa trên phản ứng giữa 4-metyl quinoline và dẫn xuất acid carboxylic
[29], phản ứng ghép nối tạo fluorophore, phản ứng số (II) dựa trên
phản ứng phản ứng cộng andol và ngưng tụ croton [3].
a. Khảo sát các phản ứng của giai đoạn (I)
S

S

S

Br-

BrCH2 COOH

BZT

CH3CH2 OH

S

(1)

Br- (6)

CH3CH2 OH2+

N+

N

+

N+

N

CBZT-1 COOH

COOH...Br-

S

S

COO-

CBZT-3

HBr (2)

BrCH2 COOH

CBZT

+

N

N

S
BZT

N+

S

S

COOH...Br-

N+

N

H3O+

Br-

(7)

H2O

Br-

(8)

CBZT

S

S

S

COO-

CBZT-3

CBZT-3 COOH...Br

OH-

S

(4)

BrCH2 COOH
N+

N

N+

Br-

CBZT-4 COOH

BZT

S

N+

(3)

BrCH2 COOH

BZT

H 2O

COO-

CBZT-2

COOH...Br-

Br

S

S

N+

CBZT-3

(5)

BrCH2 COOH

COOCBZT

N

N

CBZT-5 COOH

BZT

Hình 3.3. Các phản ứng hình thành
CBZT từ CBZT-3

Hình 3.2. Các sản phẩm có thể có từ phản

Phản ứng hình thành CBZT từ
BZT và acid bromoacetic được
trình bày ở Hình 3.2 và 3.3. Kết quả tính toán cho thấy, phản ứng
giữa BZT với acid bromoacetic để hình thành CBZT-3 và phản ứng
giữa CBZT-3 và dung dịch kiềm để hình thành CBZT là thuận lợi về
mặt nhiệt động.
b. Khảo sát các phản ứng của giai đoạn (II)
Phản ứng hình thành L từ
CBZT với DHB có thể tạo ra
(9)
4 sản phẩm (Hình 3.5). Kết
L-1
quả tính toán cho thấy, biến
(10)
thiên năng lượng tự do Gibbs
L-2
(∆G298) của phản ứng (12) là
âm nhất. Theo đó, phản ứng
giữa CBZT với DHB theo
CBZT
DHB
(11)
hướng hình thành sản phẩm L
L-3
là thuận lợi về mặt nhiệt động.
ứng giữa BZT với acid bromoacetic

HO

S

N

H2O

N

H2O

N

H2O

N

H2O (12)

N+

COO-

S

HO

N+

S

OHC

N

COO-

N+

COO-

HO

HO

S

N+

COO-

S

N+
COO- HO L

Hình 3.5. Các sản phẩm phản ứng có thể
hình thành giữa CBZT với DHB


8

17

3.1.1.2. Nghiên cứu lý thuyết đặc tính của L
a. Cấu trúc phân tử của L

Chiều dài các liên kết, số
đo các góc liên kết, góc
nhị diện trong L đã được
tính toán. Trong đó, các
tiểu phần BZT, acid
bromacetic và DHB ít
thay đổi so với ban đầu.
Trong L có sự hình thành
liên kết mới giữa N7 và C11
Hình 3.6. Hình học bền của L ở mức lý thuyết
và liên kết đôi giữa nguyên
B3LYP/LanL2DZ
tử C10 và nguyên tử C12.
b. Phân tích phổ UV-Vis
của sensor
Phổ UV-Vis của sensor L đạt cực đại ở bước sóng 452,6 nm.
Trong một công bố trước đây, chất BZTVPA có cấu trúc tương tự
như sensor L có bước sóng hấp thụ cực đại ở 405 nm, là một chất
phát xạ huỳnh quang mạnh ở bước sóng 495 nm. Kết quả này dẫn
đến kỳ vọng đặc tính huỳnh quang của L tương tự BZTVPA.
c. Phân tích đặc tính huỳnh quang của sensor L

ester tạo bởi acid acrylic và các ancol (thường là các fluorophore),
ban đầu tạo ra các thioether, tiếp theo là hình thành các hợp chất
dị vòng đối với trường hợp của Cys và Hcy. Trong khi đó, các
thioether của GSH thường bền, không xảy ra quá trình tạo các hợp
chất vòng sau đó.
Khác với nghiên cứu trên, kết quả tính toán về mặt nhiệt
động cho thấy, các phản ứng giữa sensor AMC với các biothiol (bao
gồm Cys, Hcy và GSH) để hình thành các thioether theo tỉ lệ mol 1:1
là thuận lợi về mặt nhiệt động.
3.2.2. Nghiên cứu thực nghiệm tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng
của AMC
3.2.2.1. Thực nghiệm tổng hợp sensor AMC
Sau khi tổng hợp, cấu trúc của sản phẩm AMC đã được
khẳng định bởi phổ 1H-NMR và phổ FAB-MS.
3.2.2.2. Nghiên cứu thực nghiệm về đặc tính và ứng dụng của
sensor AMC
a. Khảo sát phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của sensor AMC

Bảng 3.5. Năng lượng kích thích, cường độ dao động và các MO có liên
quan đến quá trình kích thích chính của L ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ
Bước
MO
Năng lượng
Bước sóng
f
Tỷ lệ %
chuyển
(eV)
(nm)
đóng góp
S0→S1
95→97
2,53
489,8
0,2566
56,44
96→97
S0→S2

S0→S3

S0→S4

93→97

35,80
2,74

452,6

0,5626

29,22

95→97

28,63

96→97

28,66

92→97

2,86

432,9

0,0097

5,90

93→97

8,83

94→97

77,56

92→97
93→97

3,00

413,2

0,5815

5,42
49,94

Hình 3.33. Phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của sensor AMC: (a) Phổ hấp thụ, AMC (10 μM)
trong C 2H 5OH/HEPES (pH=7,4, 1/4, v/v) tại 25 C khi thêm 20 μM Cys; (b) Phổ huỳnh quang,
AMC (10 μM) khi thêm 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 μM Cys
trong C2H 5OH/HEPES (pH =7,4, 1/4, v/v) tại 25 C, bước sóng kích thích 320 nm

Hình 3.33a cho thấy, phổ hấp thụ của dung dịch sensor
AMC tự do đạt cực đại tại bước sóng 275 và 320 nm. Khi thêm
Cys vào dung dịch của sensor AMC, phổ hấp thụ thay đổi không
đáng kể.


16

9

0,998. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng đã được xác định
tương ứng là 0,2 μM và 0,66 μM.
3.2. Thiết kế, tổng hợp, đặc trưng và ứng dựng của sensor huỳnh
quang AMC từ dẫn xuất của coumarin phát hiện các biothiol dựa
trên phản ứng cộng Michael
3.2.1. Nghiên cứu thiết kế, tổng hợp sensor AMC và phản ứng
giữa sensor AMC với các biothiol
3.2.1.1. Nghiên cứu lý thuyết thiết kế và tổng hợp sensor AMC
Hợp chất 4-methyl-7-hydroxycoumarin hấp thụ cực đại ở
bước sóng 359 nm và phát xạ cực đại ở bước sóng 449 nm [159].
Để thiết kế sensor huỳnh quang AMC (7- acryloyl -4metylcouramin) từ dẫn xuất của coumarin dùng để phát hiện các
biothiol dựa trên phản ứng cộng Michael, hợp chất 4-methyl-7hydroxylcoumarin được chọn làm fluorophore, còn receptor là
acryloyl chloride, vì phản ứng gắn receptor lên fluorophore dễ dàng
thực hiện thông qua phản ứng ester hóa giữa nhóm phenol với dẫn
xuất axit [2] và receptor này có thể gây ra phản ứng cộng với
các biothiol.
Sensor AMC dự kiến thiết kế theo sơ đồ tổng hợp sau:
+

Fluorophore

Cl
O

O (B)
O

O

OH

(A)

O

O

O

+

HCl

Bước
chuyển

MO

Năng lượng
(eV)

Bước sóng
(nm)

f

94→97

S0→S5

95→97

9,35

96→97

11,07

92→97

3,05

406,0

0,0060

86,61

3,92

316,7

0,0051

44,35

93→97
S0→S6

Tỷ lệ %
đóng góp
10,62

90→97

7,68

91→97

41,32

96→97

8,40

Kết quả tính toán (Bảng 3.5) cho thấy, các trạng thái kích
thích có cường độ dao động lớn là S0→S1, S0→S2 tại các bước sóng
tương ứng lần lượt là 489,8 nm và 452,6 nm đều có sự đóng góp khá
lớn (tương ứng là 35,80% và 28,66%) của bước chuyển electron từ
MO-96 lên MO-97. Do đây là các MO liên tiếp, nên không có quá
trình PET nào can thiệp đến bước chuyển này. Kết quả này dẫn đến
một kỳ vọng rằng L là hợp chất phát huỳnh quang.
3.1.2. Nghiên cứu thực nghiệm tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng
của sensor L
3.1.2.1. Thực nghiệm tổng hợp L
Sau khi tổng hợp, cấu trúc của sản phẩm CBZT và L đã
được khẳng định bởi phổ 1H-NMR, 13C-NMR và phổ FAB-MS.
3.1.2.2. Khảo sát thực nghiệm ứng dụng sensor L phát hiện ion Hg(II)
a. Khảo sát phổ UV-Vis và phổ huỳnh quang của sensor L

AMC

Receptor

Hình 3.29. Sơ đồ thiết kế và tổng hợp sensor AMC
Kết quả tính toán cho thấy, ΔG298 của phản ứng tổng hợp
sensor AMC là âm, theo đó phản ứng tổng hợp sensor AMC là thuận
lợi về mặt nhiệt động.
3.2.1.2. Nghiên cứu lý thuyết về phản ứng giữa sensor AMC với
các biothiol
Theo các kết quả nghiên cứu đã công bố trước đây, phản
ứng cộng Michael giữa các biothiol (Cys, Hcy và GSH) với các

Hình 3.10. Phổ hấp thụ UV-Vis và phổ huỳnh quang của L: (a) Phổ UV-Vis, L (5,0 μM)
trong C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH ~7,4; (b) Phổ huỳnh quang, L (5 μM) trong C2H5OH/H2O
(1/9, v/v), pH ~7,4, bước sóng kích thích 540 nm


10

15

Như dự đoán từ tính toán, L phát huỳnh quang màu đỏ, với
hiệu suất lượng tử huỳnh quang là 0,175; bước sóng huỳnh quang
cực đại 585 nm, bước sóng hấp thụ cực đại 540 nm.
b. Khảo sát phổ chuẩn độ UV-Vis và phổ huỳnh quang của
sensor L phát hiện ion Hg(II)

Hình 3.24 cho thấy, khi tăng dần Cys vào dung dịch phức
Hg2L2: ở phổ UV-Vis, đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 460 nm dần
dần biến mất, đồng thời xuất hiện một đỉnh hấp thụ cực đại mới với
cường độ hấp thụ rất mạnh ở bước sóng 540 nm; ở phổ huỳnh quang,
cường độ huỳnh quang tăng dần trở lại.
b. Khảo sát ảnh hưởng của các amino acids cạnh tranh và phản
ứng của Hg2L2 với các biothiol

Hình 3.11. Phổ chuẩn độ UV-Vis và phổ huỳnh quang của L bởi ion Hg(II): (a) Phổ UV-Vis, L (5,0
μM) trong C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH ~7,4, Hg(ClO4)2 (0 -5,0 μM); (b) Phổ huỳnh quang, L (5,0 μM)
trong C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH ~7,4, Hg(ClO4)2 (0 -5,0 μM), bước sóng kích thích 540 nm

Hình 3.11 cho thấy, Hg(II) phản ứng và làm thay đổi phổ
UV-Vis và phổ huỳnh quang của L. Cường độ huỳnh quang dung
dịch L giảm dần khi tăng nồng độ Hg(II).
c. Khảo sát phản ứng giữa sensor L với ion Hg(II)
Hình 3.12 cho thấy,
cường độ huỳnh quang
dung dịch L giảm mạnh
khi nồng độ ion Hg(II)
tăng từ 0 đến 5,0 M; và
sau đó giảm không đáng
kể khi tiếp tục tăng nồng
độ ion Hg(II). Điều này
cho thấy L phản ứng với
Hình 3.12. Đồ thị xác định quan hệ tỷ lượng phản
Hg(II) theo tỷ lệ mol 1:1.
ứng giữa ion Hg(II) với L (L (5,0 M) trong
C2H5OH/H2O (1/9, v/v) ở pH ~7,4, bước sóng huỳnh
quang 585 nm, bước sóng kích thích 540 nm

Hình 3.25. (a) Phổ huỳnh quang của Hg2L2 (2,5 μM) trong C 2H5OH/HEPES (pH =7,4, 1/9, v/v)
tại 25 oC khi thêm các amino acids khác nhau (mỗi loại 10 μM), bao gồm Cys, Hcy, GSH, Ala, Asp, Arg, Gly,
Glu, ILe, Leu, Lys, Met, Thr, Ser, Tyr, Trp, Val, và His (Others: hỗn hợp gồm tất cả các amino acids kể trên
ngoại trừ Cys, Hcy và GSH). (b) Cường độ huỳnh quang (ở bước sóng phát quang 585 nm) của dung dịch
Hg 2L2 (2,5 μM) với các nồng độ khác nhau của Cys, GSH, Hcy, và các amino acids khác

Kết quả trình bày ở Hình 3.25a cho thấy, chỉ các amino acids
có chứa nhóm thiol mới làm thay đổi mạnh mẽ cường độ huỳnh
quang của dung dịch. Các amino acids khác không chứa nhóm thiol
hầu như không làm thay đổi tín hiệu huỳnh quang của dung dịch
phức Hg2L2. Điều này cho thấy, phức Hg2L2 như một sensor huỳnh
quang để phát hiện chọn lọc các biothiol trong sự hiện diện của các
amino acids không chứa nhóm thiol. Kết quả thí nghiệm ở Hình
3.25b cho thấy, cường độ huỳnh quang tăng mạnh nhất là Cys, tiếp
đến là GSH, Hcy.
c. Khảo sát sử dụng Hg2L2 phát hiện định lượng Cys
Trong khoảng nồng độ Cys từ 0 đến 5 μM, biến thiên cường
độ huỳnh quang (F585) quan hệ tuyến tính với nồng độ Cys, thể hiện
bởi phương trình F585 = (11,1 ± 5,9) + (133,3 ± 2,0) × [Cys], với R =


14

11

3.1.4. Nghiên cứu sử dụng phức Hg2L2 phát hiện các biothiol
3.1.4.1. Nghiên cứu tính toán lý thuyết từ các phản ứng tạo phức
Hằng số bền của phức đã được xác định bằng phương pháp
chuẩn độ huỳnh quang. Kết quả tính toán đã xác định được hằng số
bền của phức Hg2L2 bằng 1017,45 (M-3). Trong khi đó, hằng số cân
bằng tạo phức Hg(RS)2 từ ion Hg(II) với các biothiol RSH, (2Hg(II)
+ 2RSH = Hg(SR)2 + 2H+, Ka) đối với Cys, GSH, Hcy tương ứng là
1020,1; 1020,2 và 1019,7. Vì vậy, phản ứng giữa Hg2L2 với các
biothiol (Cys, GSH, Hcy) để tạo thành phức Hg(II) với các biothiol
và giải phóng L tự do có thể xảy ra.
Kết quả nghiên cứu về mặt nhiệt động của sự tương tác giữa
ion Hg(II) với Cysteine (H2Cys) cho thấy, phản ứng (14) xảy ra vì có
ΔG298 là âm nhất (ΔG298 = -821,6 kcal.mol-1)
2Hg2Cys + Hg(II) + 4OH-

[Hg(Cys)2]2+ + 4H2O (14)

Sự biến thiên của năng lượng tự do của phản ứng tạo Hg2L2
từ ion Hg(II) và sensor L là -410,2 kcal.mol‾1.
Do đó, phản ứng sau xảy ra (vì có ΔG298 là -1232 kcal.mol-1):
Hg2L2 + 4 H2Cys

+ 80H-

2

2Hg(Cys)2

+ 8 H20 + 2L

3.1.4.2. Khảo sát thực nghiệm sử dụng phức Hg2L2 làm sensor
huỳnh quang phát hiện các biothiol
a. Khảo sát phổ chuẩn độ UV-Vis và phổ huỳnh quang của Hg2L2

Hình 3.24. Phổ chuẩn độ UV-Vis (a) và phổ huỳnh quang (b) của dung dịch
Hg2 L2 (2,5 μM) trong C2 H5OH/HEPES (1/9, v/v), pH ~7,4, ở 25 C khi thêm 0-10
μM Cys, bước sóng kích thích 540 nm, bước sóng phát huỳnh quang 585 nm

d. Khảo sát ảnh hưởng của các ion kim loại cạnh tranh

Hình 3.13. Phổ UV-Vis (a) và phổ huỳnh quang (b) của L (1,5 μM) với sự hiện diện của các ion
kim loại Hg(II), Cd(II), Fe(II), Co(III), Cu(II), Zn(II), Pb(II), Ca(II), Na(I), K(I) (7,5 μM cho mỗi
ion kim loại) trong C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH ~7,4, bước sóng kích thích 540 nm

Hình 3.13 cho thấy, không có bất kỳ sự thay đổi đáng kể nào
trong phổ UV-Vis cũng như phổ huỳnh quang khi thêm các ion kim
loại Cd(II), Fe(II), Co(III), Cu(II), Zn(II), Pb(II), Ca(II), Na(I), K(I)
với nồng độ gấp 5 lần so với L. Như vậy, L có thể phát hiện chọn lọc
ion Hg(II) trong sự hiện diện các ion này.
e. Khảo sát sử dụng sensor L phát hiện định lượng ion Hg(II)
Trong khoảng nồng độ ion Hg(II) từ 0 đến 400 μg/L: biến
thiên mật độ quang (ΔA540) và biến thiên cường độ huỳnh quang
(∆I585 ) quan hệ tuyến tính với nồng độ ion Hg(II) bởi các phương
trình tương ứng: ΔA540= (0,01 ± 0,01) + (0,0011 ± 0,0000) × [Hg(II)],
∆I585= (-1,0 ± 0,4) + (0,3 ± 0,0) × [Hg(II)], với R=0,999. Giới hạn
phát hiện và giới hạn định lượng bằng phương pháp trắc quang tương
ứng là 15,3 μg/L và 51,2 μg/L hay
0,076 μM và 0,25 μM và phương
pháp huỳnh quang tương ứng là
11,8 μg/L và 39,3 μg/L hay 0,059
μM và 0,19 μM.
3.1.3. Nghiên cứu lý thuyết ứng
dụng sensor L phát hiện ion Hg(II)
Hình 3.16. Hình học bền của phức Hg2L2
tại mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ


12
a. Nghiên cứu cấu trúc phân tử phức Hg2L2
Kết quả tính toán sự hình thành phức giữa ion Hg(II) và L
theo tỷ lệ mol 1:1 ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ cho thấy, có
một cấu trúc hình học bền được tìm thấy là Hg2L2 và được thể hiện
ở Hình 3.16. Sự hình thành phức Hg2L2 là thuận lợi về mặt nhiệt
động, với giá trị ∆G298 là -410,2 kcal mol-1. Các liên kết tạo phức
gồm O25Hg93, O71Hg93, S55Hg93, và O26O71. Các liên
kết này hình thành được cho là dựa trên kết quả tính toán khoảng
cách giữa các nguyên tử nhỏ hơn đáng kể so với tổng bán kính Van
der Waals của nguyên tử tham gia liên kết.
Để khẳng định cấu trúc của phức Hg2L2, phân tích AIM đã
được tiến hành. Kết quả phân tích cho thấy: có sự tồn tại các điểm tới
hạn liên kết (BCPs) giữa các điểm tiếp xúc giữa các phối tử O, S với
Hg(II), các liên kết này là liên kết cộng hóa trị và có sự tồn tại các
điểm tới hạn vòng RCPs giữa các tiếp xúc O, S, N, Hg (phức có cấu
trúc vòng)
Nhằm giải thích tính chất huỳnh quang dựa vào bản chất
electron của các liên kết, phân tích NBO cũng được tiến hành. Kết
quả cho thấy, L tự do có cấu trúc kiểu: D-hệ liên hợp π-A (phát
huỳnh quang); L trong phức: cặp electron của N7 không còn liên hợp
vào hệ liên hợp π (cấu trúc D-hệ liên hợp π-A bị phá vỡ), nên có sự
chuyển dịch electron dẫn đến dập tắt huỳnh quang của phức.
b. Phân tích đặc tính huỳnh quang của phức Hg2L2
Kết quả tính toán ở Bảng 3.8 cho thấy, sự hình thành phức
Hg2L2 đã dẫn đến sự chuyển dịch đáng kể mật độ electron từ các phối
tử L đến các ion kim loại Hg(II) trung tâm và thu hẹp khoảng cách
năng lượng giữa HOMO và LUMO. Kết quả, ở trạng thái kích thích
chính (cường độ dao động lớn nhất và bằng 0,5913) từ S0→S2, với sự
đóng góp chủ yếu từ bước chuyển HOMO→LUMO (53,12%), có
năng lượng kích thích rất nhỏ là 1,37 eV. Điều này dẫn đến bước
sóng phát xạ huỳnh quang của phức sẽ chuyển về vùng bước sóng
dài, lớn hơn 900 nm. Vì vậy, trong thực tế không phát hiện được
huỳnh quang từ phức Hg2L2.

13
Bảng 3.8. Năng lượng kích thích, cường độ dao động và các MO có liên quan đến
quá trình kích thích chính của Hg2L2 ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ

Bước
chuyển

MO

Năng lượng
(eV)

S0→S1

201→203

1,29

S0→S2

S0→S3

Bước sóng
(nm)
961,2

f
0,0838

S0→S5

4,63

202→203

30,06

202→204

59,58

201→203

1,37

903,4

0,5913

2,41

201→204

3,99

202→203

53,12

202→204

24,77

201→203

1,57

788,7

0,1063

201→204
S0→S4

Tỷ lệ %
đóng góp

201→203

38,83
39,46

1,59

778,5

0,0647

32,24

201→204

43,20

202→204

3,52

197→203

1,93

642,3

0,0183

2,66

199→203

50,52

199→204

10,31

200→203

25,64

S0→S5

201→205

2,29

S0→S6

198→204
199→203

1,95

636,4

0,0121

2,30
19,80

199→204

2,57

200→204

27,67


24

1

(c). Sensors Hg2L2 and AMC is for the detection of Cys in a
small amount of organic solvent, the reaction time occurs fast can
detect Cys with lower concentration than that in the intracellular and
lower than that in the similar sensors of previous studies.
5. TD-DFT method is used to study the fluorescent properties
of substances based on the optimized geometry at the ground state
and the excited one in the combination with NBO analysis to
consider the the change of the fluorescent properties of substances,
based on the nature of bondings. The results of calcuations shows
that ion Hg(II) creates complexion reactions with L, leading to the
decrease in the energy distance between HOMO and LUMO in the
meantime change the conjugated π-electron system, which is the
cause for the fluorescence quenching in the complextion of Hg2L2.
All the fluorescent emission of AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy and
AMC-GSH comes from the higher-lying electron excited states (S2,
S4) to the ground state S0. This is an exceptional case of Kasha rule.

INTRODUCTION
Cysteine (Cys), glutathione (GSH), and homocysteine (Hcy)
are thiol compounds play vital roles in many biological processes.
Mercury is one of popular dangerous pollutants which can cause
serious effects to human’s health. Therefore, that the determination of
biothiol in living cells and water sources helps diagnose related
diseases and protect habitats and has caught much attention from local
and oversea scientists.
Many methods have been used for the detection of different
biothiols and Hg(II) ions like high-performance liquid
chromatography, mass spectrometry,…,and fluorescent method.
Among them, fluorescent method has outstanding benefits than other
optical methods in term of investment of less expensive equipments
and its simplicity. Furthermore, it can be applied to analyze many
diffrent substances especially those in living cells.
Professor Czarnik at Ohio University studied Fluorescent
method and proposed a new approach to the field of sphere optical
sensor in 1992. With advantages of fluorescent method, studies of
fluorescent sensors to detect metal ions, anion, especially
biomolecules is paid much attention by many local and oversea
scientists, that have announced more and more Fluorescent sensors
all over the world. In Vietnam, the study of the fluorescent sensors has
been conducted by Duong Tuan Quang since 2007.
To detect biothiols, the studies have designed fluorescent
sensors based on the characterized reaction of biothiol, complex
reactions (complex between fluorescence and ion Cu(II)..). The studies
of fluorescent sensors detect Hg(II) based on the characterized reaction
of ion Hg(II) and complex reactions between ion Hg(II) and legands O,-N,-S in closed and opened circuit. However, most of these sensors
have shortcomings like the use of a large amount of organic solvents,
the limited detection just for high concentration, short
excitation/emission wavelengths causing bad effects to living cells
and slow reaction between sensors and analytes. Now, scientists are


2

23

continuing to study and design fluorescent sensors with high sensitivity
and selectivity to detect biothiols and ions Hg(II).
At present, quantum chemical calculations have been become
an important tool in chemical studies in general and fluorescent
sensors in particular. The combination between quantum chemical
calculations and experimental studies is a modern trend in which, however,
the numbers of studies announced in fluorescent sensors is still limited.
From demand and situation of studies in the fluorescent sensors
in the world and Vietnam, we have conducted the project “Design,
synthesis of fluorescent sensors from cyanine and coumarin
derivatives to detect biothiol and Hg(II)”
New findings of the thesis:
- A new fluorescent sensor L designed from derivatives of
cyanine which has been reported, selective detection of Hg(II) ions,
based on complexation reaction, ON-OFF mechanism; the complex of
Hg(II) with L (Hg2L2) selective detection of Cys, based on
decomplexation reaction and OFF-ON mechanism. The limit of detection
and the limit of quantification for Hg(II) ions by L is 11,8 μg/L and 39,3
μg/L or 0,059 μM and 0,19 μM, respectively; limit of detection and limit
of quantification Cys by Hg2L2 is 0,2 μM and 0,66 μM, respectively.
- A new fluorescent sensor AMC designed from derivatives of
coumarin which has been reported, selective detection of Cys based on
Michael addition reaction, based on the change of ratiometry of
fluorescent intensity at two different wavelengths. The limit of detection
and limit of quantification Cys is 0,5 μM and 1,65 μM, respectively.
- L and AMC studyed by flexible combination quantum
chemical calculations and experimental studies.
Chapter 1. OVERVIEW
1.1. Overview of fluorescent sensors
1.1.1. Current situation of fluorescent sensors
1.1.2. Operating principles of fluorescent sensors
1.1.3. Structure of fluorescent sensors
1.1.4. Design principles of fluorescent sensors

CONCLUSIONS
1. Flexible combination between quantum chemical
calculations and experimental studies has been successfully applied
for research and development of two new fluorescent sensors
including L and AMC. This decreases the calculations of the theory
and experiment, saving the time and expense for the chemicals,
increase the possibility of success, clarify the nature of the proccesses
and set ground for the further study.
2. Synthesis reactions sensor L and sensor AMC are studied,
anticipated from calculations and afterwards verified from the
synthesis results.
3. The structures, characteristics of sensor L and sensor
AMC are determined at theoretical levels of B3LYP/LanL2DZ
bringing about reliable results through contrastive tests and
verification from experiment results.
4. (a). Sensor L is for selective detection of Hg(II) ions, in the
presence of ther metal ions, based on fluorescent ON-OFF mechanism.
The limit of detection and the limit of quantification for Hg(II) ions by
colorimetric method is 0,076 μM and 0,25 μM; and by fluorescent
method is 0,059 μM and 0,19 μM. Complextion of Hg2L2 is for
selective detection of Cys in the presence amino acids without thiol
groups based on decomplexation reaction and OFF-ON mechanism. The
limit of detection and the limit of quantification Cys is 0,2 μM and 0,66
μM, respectively. Sensor L for the detection of ion Hg(II) and
complextion Hg2L2 for the detection of Cys, based on complexation
reaction between core ions Hg(II) with two ligands of L and Cys.
(b). Sensor AMC is for the selective detection of biothiols
(Cys, GSH, Hcy) in the presence of amino acids without thiol groups,
based on the change of ratiometry of fluorescent intensity at two
different wavelengths. The limit of detection and limit of quantification
Cys is 0,5 μM and 1,65 μM, respectively. Sensor AMC reacts with
biothiols (Cys, GSH, Hcy) based on Michael addition reaction.


22

3

For AMC-Cys, electron transitions from S1 to S0 at REES1 and
R
are forbid. Meanwhile, electron transitions from S2 to S0 at
REES1 and REES2 occur. In addition, because the oscillator intensity (f)
of both processes are very large, while the oscillator intensity (f) at
the wavelength of 340,3 nm is 0,5122, and obviously 0,3171 larger
than that at the wavelength of 324,5 nm. This leads to the fact that
fluorescence intensity of AMC-Cys observed in experiment is very
strong, and that at the long wavelengths of 340,3 nm is stronger than
short wavelengths of 324,5 nm. Besides, because the transitions
processes of electron from S2 to S1 at REES1, with the S2 respectively
do not have minimum energy, so processes (6) at Fig.3.48b is less
dominant than processes (4) at Fig.3.48b. That may be another cause
leading to fluorescence intensity at long wavelengths (340,3 nm)
which is very stronger than the fluorescence intensity at short
wavelengths (324,5 nm) as observed in experiment. This may be
another cause to make fluorescence intensity at long wavelengths
(469,5 nm) stronger than that at short wavelengths (417,4 nm), as
observed in the experiment.
For AMC-Hcy and AMC-GSH (similarly, AMC-Cys).
As presented, the research results on optimum geometry with
excited states of AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy and AMC-GSH show
that for AMC, there are twist angles between the coumarin moieties and
acryloxy moieties at REES1 and REES2, causing the breakdown of the πelectron conjugate system between two moieties, which in turn leads to
the fact that the electron density between the coumarin moieties and
acryloxy moieties is strongly fragmented. As a result, there is very little
overlap between the MOs in electron transfer at the excitation state of
the sensor AMC. In contrast, at REES2 of AMC-Cys, AMC-Hcy and
AMC-GSH, the coumarin moiety and acryloxy moiety are almost in the
same plane. This is a favorable factor for the overlap between MOs in
the state transitions.
The above analysis shows that the fluorescence of the sensor
AMC and its additive products with the biothiolis are not derived from
the S1 state. This is an exceptional case of Kasha rule.

1.2. Roles of biothiols in cells and methods for detection
1.2.1. Biothiol và and roles of them
1.2.2. Method for detection of biothiols
1.3. The sources of pollution, toxicities and methods for detection
of Hg(II) ions
1.3.1. The sources of pollution, toxicities of Hg(II) ions
1.3.2. Method for detection of Hg(II) ions
1.4. Fluorescent sensors for detection of biothiols
1.4.1. Based on the cyclization reactions with aldehydes
1.4.2. Based on the Michael addition reactions
1.4.3. Based on the native chemical ligation of peptide reactions
1.4.4. Based on the aromatic substitution-rearrangement reactions
1.4.5. Based on the cleavage of sulfonamide or sulfonate ester reactions
by thiols.
1.4.6. Based on the cleavage of disulfides reactions by thiols
1.4.7. Based on the reactions complexation and decomplexation
1.4.8. Based on the mechanisms
1.5. Fluorescent sensors for detection of Hg(II) ions
1.5.1. Based on the reactions complexation with Hg(II)
1.5.2. Based on the characteristic reactions of Hg(II) ions.
1.6. Fluorescent sensors for detection of biothiol and Hg(II) ions
based on the fluorophore are cyanine and coumarin
1.7. Overview of application of computational chemistry in the
study on fluorescent sensors
Chapter 2. RESEARCH CONTENTS AND METHODS
2.1. Research objectives
2.2. Research contents
- Study on the design, synthesis, characteristics, and applications
of cyanine derivatives based on sensor L for selective detection of
biothiols and Hg(II) ions:
+ Theoretical study on design, synthesis and characteristics
of sensor L.

EES2


4

21

+ Experimental research on characteristics and application of
sensor L.
+ Theoretical research on the application of the sensor L
detects Hg (II).

processes (3) and (4) above is not large enough (0,0137 and 0,0152),
this results leads to the fact that fluorescence intensity of AMC is as
small as observed in experiment. Moreover, because the excitation
process from S0→S1 (process (1) in Figure 3.48a) has much greater
oscillator intensity than that from from S0→S1 (2) in Fig 3.48a), so
the transfer process of electrons from S1→S0 (process (3) in Fig.
3.48a) will be more dominant than that from S2→S0 (process (4) in
Fig.3.48a). This may mainly cause the fluorescence intensity at long
wavelengths (469,5 nm) stronger than that at short wavelengths
(417,4 nm) as observed in the experiment.

+ Study the use of complex (form by Hg(II) ions with sensor L)
detection of biothiol. In particular, theoretical research is conducted first
to guide the study of the application of the next complex
- Study on the design, synthesis, characteristics, and application of
coumarin derivatives based on sensor AMC for selective detection
of biothiols:
+ Study of design theory, synthesis of sensor AMC and reaction of
sensor AMC with biothiols.
+ Experimental research on the synthesis, characteristics and
applications of sensor AMC.
+ Theoretical study on characteristics and applications of sensor AMC.
2.3. Research methods
2.3.1. Theoretical calculation methods
- The determination of the structure of geometry
optimizations and single point energy was carried out by the density
functional theory (DFT) method with the software of Gaussian 03.
- The interaction energies adjusted for ZPE includesthe
variation of enthalpy and variation of Gibbs free energy were derived
as the differences between the total energy of the reaction products
and the energy of the reactant substances.
- The calculation of the excited state and the time-dependent
factors was carried out using time-dependent density functional
theory (TD-DFT) at the same theory level as the geometry
optimisation procedure.
- The analysis of AIM and NBO was executed at the
B3LYP/LanL2DZ level of theory.
2.3.2. The experimental investigation methods
- The structures of compounds were confirmed by 1H -NMR
and 13C- NMR spectrum, mass spectrometry.

(a)

(b)

(c)

(d)

Fig.3.48. Energy diagrams of excitation processes and excitation energy release at
geometry in ground state (RGS) and electron excitation states (REES1, REES2,...) at
theoretical level B3LYP/LanL2DZ: (a) AMC; (b) AMC-Cys;
(c) AMC-Hcy; (d) AMC-GSH

(d)


20

5

state S1 (REES1), S2 (REES2), the coumarin moiety and acryloxy moiety
are almost in two planes perpendicular to each other.
For AMC-Cys, AMC-Hcy and AMC-GSH have twist angles
between the coumarin moieties and acryloxy moieties in the RGS and
REES1. In REES2 and the coumarin moiety and acryloxy moiety are almost
in the same plane.
3.2.3.2. Research theories of spectral excitation and fluorescence
spectrum
a. Theoretical study on excitation and fluorescents pectra
The calculated results show that in the sensor AMC, the singlet
electronic transition from S0 ground state to S1 excited state is the main
transition with the greatest oscillator strength (f) of 0,5348 at 320,9 nm
wavelength. The S0→S1 transition is the main contribution to transition
from HOMO→LUMO, with a percentage contribution up to 96,21%.
Besides, the overlap between HOMO and LUMO is very large, which shows
that the transfer of electrons from HOMO to LUMO is favorable. The
transition of other states have a small unnoticeable oscillator intensity (f).
Meanwhile, with AMC-Cys, AMC-Hcy, and AMC-GSH,
calculated data show that the singlet electronic transition from S0 to S2 is
the main transition with oscillator intensity (f) of 0,3723; 0,3694 and
0,3801, respectively (much larger than other transfers) at the wavelength
of 300,6; 300,4 and 300,7 nm, respectively. In the transition of the states,
the transfer of electrons from HOMO-1→ LUMO is the main transition
with a percentage contribution of 89,17; 89,05 and 89,24%,
respectively. On the other hand, the overlap between HOMO-1 and
LUMO is very large so the transfer of electrons from HOMO-1 to
LUMO is very favorable. Other transitions of states have small,
unnoticiable oscillator strength (f).
The analyzed results of the MO frontier also show that there is
no overlap between HOMO and HOMO-1. Thus in AMC-Cys, AMCHcy and AMC-GSH do not occur in the PET process from HOMO to
HOMO-1. As a result, AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy and AMC-GSH
are fluorescents as presented in the experiment.
b. Theoretical study on fluorescent spectra
For sensor AMC, at REES1, the electron transition from S1 and
S2 to S0 are forbidden. At REES1, the lectron transition from S1 and S2
to S0 occur. In addition, because the oscillator intensity (f) of both

- The characteristics and applications of the sensors were
performed by fluorescence spectroscopy and UV-Vis spectroscopy.
- The conditions of sensors synthesis have been studied based
on the predicted results from theoretical calculations and previous
experimental results [2], [3], [29] on similar reactions. The synthesis
process is summarized as follows:
a. Sensor L synthesis:
* The synthesis of CBTZ
2-methylbenzothiazole (3,0 g, 0,02 mol) and bromoacetic
acid (4,18 g, 0,03 mol) were dissolved in 50 mL absolute ethanol.
The mixture was boiled for 8 hours to, then cooled to room
temperature until the precipitation was formed. This precipitation
was washed with ethanol in alkali solution for several times, then
dried to get the solid CBTZ (4,0 g, 75% yield).
* The synthesis of L
CBTZ (290 mg, 1 mmol) and 4-diethylamino-2hydroxybenzaldehyde (190 mg, 1 mmol) were dissolved in 30 mL of
absolute ethanol. With the addition of one drop of piperidine, the
reaction solution turns red immediately. The reaction was kept
boiling for 10 hours to cool to room temperature. The precipitation
was formed and filtered, washed for several times with diethyl ether
and then dried for the desired product L (3,0 g, 38% yield).
b. Sensor AMC synthesis:
4-Methyl-7-hydroxylcoumarin (1,7 g, 9,4 mmol) and Et3N
(7.9 mL, 56,4 mmol) were dissolved in CH2Cl2 (20 mL) with small
addition of a catalyst amount of 4-dimethylaminopyridine to get a
solution. The solution is made cool and keep at 0 oC. Each drop of
acryloyl chloride (1,9 mL, 23,5 mmol) in CH2Cl2 (20 mL) is
gradually added to the reaction solution in an hour. Then, the
solution was stirred for 2 hours at room temperature and water was
added to dissolve the amine salt. The organic phase was washed with
aqueous solution and then dried over MgSO4. After the solvent was


19

evaporated, the product was purified by recrystallization from ethanol
to form a white crystalline solid (1,0 g, 45%, yield).
Chapter 3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1. Design, synthesis, characteristics, and application of sensor L
from cyanine derivatives for detection of biothiols and Hg(II) ions
based on the reactions complexation
3.1.1. Theoretical study on design, synthesis, characteristics of
sensor L
3.1.1.1. Theoretical study on design, synthesis of sensor L
B3LYP/LanL2DZ levels of theory was applied for
of research.
Cyanine
derivatives
including
R2N+=CH[CH=CH]nNR2,Aryl=N+=CH[CH=CH]n-NR2, Aryl=N+=CH[CH=CH]n-N=Aryl,
which all have the same structure, donor - π conjugated system acceptor. Here, donor (the electron of push group) is an amino group;
aceptor (the electron of withdrawal group) is amoni ions. They are
known as color compounds with strong fluorescence [40].
Sensor L the design is planned as shown in the following
synthesis diagram:

For other amino acids without thiol groups do not change
distinct fluorescence variations of sensor AMC solution (Fig.3.38a).
The presence of this miscellaneous amino acids also do not have
effect on the reation between AMC and biothiols (Cys, GSH and
Hcy) with the clue that there is no significant difference between the
fluorescence spectrum of solutions (AMC + biothiol + amino acids)
with solutions (AMC + biothiol) (shown in Fig.3.38b).

HO
HO
S

BZT

S

BrCH2COOH

N

(I)

OHC

N
-

O2C

N

S

N

N
(II)

-

O2C

L

CBZT

Receptor

Fluorophore

Fig. 3.1. Schematic design and synthesis sensor L

Here, the fluorophore is cyanine, receptor is -COO- group, a
strong affinity group with Hg(II) ion; The sensor L synthesis reaction
occurs in two phases: phase (I) and phase (II).
Reaction pairing the receptor to the fluorophore, the reaction (I) is
based on the reaction between 4-methyl quinoline and carboxylic acid

fluorescence intensity (a.u)

fluorescence intensity (a.u)

6

Wavelength/nm

Wavelength/nm

Wavelength/nm

Fig.3.38. (a) Fluorescence spectra of AMC (10 μM, ethanol/HEPES, pH 7,4, 1/4, v/v,
at 25 o C) upon addition of Cys, Hcy, GSH, others amino acids (including Arg, Gly,
Ala, Asp, Glu, Leu, Lys, Ile, Met, Thr, Ser, Trp, Tyr and Val). (b) Fluorescence
spectra of AMC (10 μM, ethanol/HEPES, pH 7.4, 1/4, v/v, at 25 oC) in the presence of
others amino acids mixture (including Arg, Gly, Ala, Asp, Glu, Leu, Lys, Ile, Met, Thr,
Ser, Trp, Tyr and Val) when upon addition of Cys, Hcy, and GSH

d. The survey on the use of sensor AMC to detect Cys
In the concentration range of Cys from 0 to 10 μM, The
ratiometric fluorescent intensity at two different wavelengths sóng
450 và 375 nm (F450/375) has a good linear relationship with Cys
concentration in the equation: F450/375 = 1,5431 + 2,257 × [Cys], R =
0,982. The limit of detection and limit of quantitation for Cys are 0,5
μM and 1,65 μM, respectively.
3.2.3. Theoretical study on characteristics and application
of sensor AMC
3.2.3.1. Optimized geometries (RGS, REES1, REES2) of AMC, AMC-Cys,
AMC-Hcy, and AMC-GSH at electronically ground state and excited state
In the ground state (S0) of sensor AMC, the coumarin moiety
and acryloxy moiety are almost in the same plane, but at the excited


18

7

increases more strongly than that of fluorescent emission at short
wavelength. The fluorescence intensity change at both 375 and
450 nm wavelengths above leads to an ability to use AMC as a
fluorescence sensor based on rate variation in fluorescence
intensity at two wavelengths to detect Cys.

derivative [29] while reaction pairing to form fluorophore, the reaction (II)
is based on the adol addition reaction ethanol and croton condensate [3].
a. Survey of the reactions of the phase (I)
S

S

S

Br-

BrCH2 COOH

BZT

CBZT

N

N

S

fluorescence intensity (a.u)

Absorbance

COO-

CBZT-3

HBr (2)
+

BZT

CBZT-2

N+
COOH...Br-

N+

N

N+

N+

Br-

CBZT-4 COOH

(7)

H2O

Br-

(8)

S

CBZT-3

(5)

BrCH2 COOH

N+
COOH...Br-

Br

S

S

OH-

(4)

BrCH2 COOH

BZT

Br-

CBZT

S

S

S

H3O+

COO-

CBZT-3

CBZT-3 COOH...Br

N

S

N+

(3)

BrCH2 COOH

BZT

H 2O

COO-

S

S

COOCBZT

N

N

CBZT-5 COOH

BZT

Fig 3.3. The reactions formed CBZT
from CBZT-3

Wavelength/nm

b. Survey on reaction between sensor AMC and Cys
When Cys were added from 0 to 10 μM to the sensor
AMC solution (10 μM), the fluorescent ratio (F450/375) has a good
linear relationship with the concentration of Cys. Then, this ratio
has unnoticeable change if the concentration of Cys continues to
increase. This shows that the reaction beween AMC and Cys
occurs with 1:1 stoichiometry (similar for Hcy and GSH). This
result is consistent with the result when determining the ratio of
the reaction between AMC and Cys ratio with Job’s plot method
and mass analysis of product reation betweent AMC and Cys.
c. The survey on effects of the competitive amino acids
These results of the survey reveal that when adding thiolcontaining amino acids, the fluorescence intensity of AMC solution also
increased markedly in both emission bands, in which the emission at
450 nm gave more fluorescent enhancement, whereas the emission at
375 nm produces a moderate increase. However, the the level of
fluroescence enhancement is in this order: Cys>GSH> Hcy (Fig.3.38a).

Br- (6)

N+
COOH...Br-

S
BrCH2 COOH

Fig.3.33. (a) Absorbance spectra of the sensor AMC (10 μM) in C2H5OH/HEPES (pH 7.4,
1/4, v/v) at 25 C upon addition of 20 μM of Cys. (b) Fluorescence spectra of AMC (10 μM)
upon addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 equiv of Cys
in C2H5OH/HEPES (pH 7.4, 1/4, v/v) at 25 C, excitation wavelength at 320 nm

S
CH3CH2 OH2+

N+

CBZT-1 COOH
S

Wavelength/nm

CH3CH2 OH

(1)

N+

N

Fig 3.2. The possible products formed from the
reaction between BZT and bromoacetic acid

The reaction to form CBZT
from BZT and bromoacetic
acid is shown in Figures 3.2 and 3.3. The calculated results show that
reaction between BZT and bromoacetic acid forms CBZT-3 and
reaction between CBZT-3 and alkali solution forms CBZT, which is
thermodynamically favorable.
b. Survey of the reaction of phase (II)
The reactions to form L
HO
from CBTZ and DHB can
H O (9)
N
S
N
create four products (Fig.3.5).
L-1
COO
The calculated results have
H O (10)
N
S
showed that the free energy
HO
N
HO
S
L-2
OHC
N
(∆G298) of reaction (12) is
COO
N
negative. Accordingly, the
COO
HO
S
CBZT
DHB
N
H O (11)
N
reaction between CBZT and
COO
L-3
DHB in the trend to form L
S
is clearly thermodynamically
H
O
(12)
N
N
favorable.
HO
COO
L
2

+

-

2

+

-

+

-

+

2

-

+

2

-

Fig.3.5. The possible products formed from the
reaction between CBTZ and DHB


8

17

3.1.1.2. Theoretical study on characteristics of L
a. The molecular structure of L
The bond lengths, bond angles, and dihedral angles of L were
calculated. In particular, these values of BZT, bromacetic acid and
DHB have little change compared with that from the beginning. In L,
there is the formation of new
bond between N7 and C11 and
double one of bond C10 and
C12.
b. UV-Vis spectral analysis of
sensor L
The UV-Vis spectra of L at
gains the maximum value at
452,6 nm. In a previous
Fig. 3.6. The optimized geometry of L at the
announcement, BZTVPA had
B3LYP/LanL2DZ level of theory
the same structure as the sensor
L with a maximum absorption
wavelength of 405 nm, which is a strong fluorescent emission at 495
nm. This result led to an expectation that the fluorescent properties of
L would be similar to BZTVPA fluorescence.
c. The analysis of Fluorescent properties of sensor L

The calculated results show that the free energy (∆298) of sensor
AMC synthesis reaction is negative. Accordingly, its reaction is
thermodynamically favorable.
3.2.1.2. Theoretical study on the reation between sensor AMC
and biothiols
According to the previously published works, the Michael
addition reactions beween biothiols (Cys, Hcy and GSH) and esters
created by acrylic acid and alcols (usually the fluorophore)
initially generates thioethers, then followed by the formation of
heterocycles compounds in the case of Cys and Hcy. Meanwhile, the
thioether of GSH is usually stable with no subsequent ring formation.
Different from the above study, the calculated results in term
of the thermodynamics show that reactions between the sensor AMC
and biothiols (including Cys, Hcy and GSH) to form thioether with
the 1: 1 molar ratio is thermodynamically advantageous.
3.2.2. Experimental study on synthesis, characterization and
application of sensor AMC
3.2.2.1. Experimental synthesis of sensor AMC
After synthesis, the structure of AMC products was obtained
with 1H- NMR and FAB-MS spectra.
3.2.2.2. Experimental study on the characteristics and application
of sensor AMC
a. Absorption and the fluorescence spectrum of the AMC sensor
As shown in Fig.3.33a, the free sensor AMC shows a
characteristic absorption band peaked at 275 and 320 nm. When Cys
were added to the solution of sensor AMC, the absorption spectrum
was negligibly changed.
Meanwhile, the free sensor AMC displays fluorescence
emission band peaked at 375 nm and 450 nm (Fig.3.33b).
Fluorescence quantum yield (Φ) of sensor AMC was determined
to be 0,05. When Cys were added to the solution of sensor AMC
fluorescence tensity increases gradually at both emission bands. In
particular, the intensity of fluorescent emission at long wavelength

Table 3.5. Calculated excitation energy (E), wavelength (λ), and oscillator strength (f) for
low-laying singlet state of L at B3LYP/LanL2DZ
λ
State
MO
E
f
Percentage

S0→S1

95→97

(eV)
2,53

(nm)
489,8

0,2566

96→97
S0→S2

S0→S3

93→97

contribution(%)
56,44
35,80

2,74

452,6

0,5626

29,22

95→97

28,63

96→97

28,66

92→97

2,86

432,9

0,0097

5,90

93→97

8,83

94→97

77,56


16

9

not change the signals of the Hg2L2 solution’s fluorescence. This
proves that the ensemble Hg2L2 complex is like a fluorescent sensor
for the selective detection in the presence of amino acids without the
thiol group. As shown in Fig.3.25b, fluorescence intensity gain
strongest increase is Cys, then GSH and Hcy.
c. Survey on the use of Hg2L2 for quantitative detection of Cys
In the concentration range of Cys from 0 to 5 μM, there is a
good linear relationship between the variation of fluorescence intensity
(F585) of Hg2L2 and Cys concentration, shown in the following equation:
F585 = (11,1 ± 5,9) + (133,3 ± 2,0) × [Cys], R = 0,998. The limit of
detection and limit of quantitation for Cys are 0,2 μM and 0,66 μM,
respectively.
3.2. Design, synthesis, characteristics, and application of sensor
AMC from coumarin derivatives for the detection of biothiols based
on the Michael addition reactions
3.2.1. Theoretical design, synthesis sensor AMC and reaction
between AMC sensor with biothiols
3.2.1.1. Study on design, synthesis of sensor AMC
4-methyl-7-hydroxycoumarin compound gains maximum
absorbance at 359 nm wavelength and maximum emission at 449 nm
wavelength [159].
To design AMC fluorescence sensor (7- acryloyl -4metylcouramin) from coumarin-based derivatives to detect biothiols
based on the Michael addition reactions, 4-methyl-7-hydroxylcoumarin
compounds are chosen as fluorophore and receptor as acryloyl chloride,
because reaction of receptor to fluorophore is conducted easily with ester
reation among phenol groups with the acid derivative [2] and this receptor
can cause an addition reaction with the biothiols.
The sensor AMC is designed in the following synthesis
scheme:
+

Fluorophore

Cl
O

O (B)
O

O

OH

(A)

+
O

O

HCl

O
AMC

Receptor
Fig. 3.29. Schematic design and synthesis sensor AMC

State
S0→S4

S0→S5

MO
92→97

E
(eV)
3,00

λ

f

(nm)
413,2

0,5815

93→97

49,94

94→97

10,62

95→97

9,35

96→97

11,07

92→97

3,05

406,0

0,0060

93→97
S0→S6

Percentage
contribution(%)
5,42

90→97

86,61
7,68

3,92

316,7

0,0051

44,35

91→97

41,32

96→97

8,40

Calculated results (Table 3.5) showed that, excited states have
great oscillator strength namely S0→S1, S0→S2 at wavelengths 489,8
nm and 452,6 nm, respectively to make a significant contribution
(35,80% and 28,66%, respectively) to transition from MO-96 to MO97. Because of continuous MOs, there is no PET to intervene this
transition. This result led to an expectation that the L is fluorescence
emission compound.
3.1.2. Experimental study on synthesis, characteristics and
application of sensor L
3.1.2.1. Experimental study on synthesis of L
After synthesis, the structure of CBZT and L products was
obtained with 1H- NMR, 13C-NMR and FAB-MS spectra.
3.1.2.2. The experiamental survey of application of L for the
detection of Hg(II) ions
a. The survey of UV-Vis and fluorescence spectra of
As expected from calculations, L performs red fluorescence
with a quantum yield of 0,175. The maximum fluorescence wavelength
is 585 nm and the maximum absorption wavelength is 540 nm
(Fig.3.10).


15

Wavelength/nm

fluorescence intensity (a.u)

Wavelength/nm

540 nm wavelength appears; in the fluorescence spectrum, the
intensity of the fluorescence increases gradually again

Absorbance

Absorbance

fluorescence intensity (a.u)

10

Fig.3.10. UV-Vis and fluorescence spectra of L: (a) UV-Vis spectra, L (5 µM) in C2H5OH
/H2O (1/9, v/v), pH ~ 7.4; (b) fluorescence spectra, L (5 µM) in C2H5OH/H2O (1/9, v/v),
pH ~ 7.4, excitation wavelength at 540 nm.

Fig.3.11 showed that Hg (II) ions reacted and changed the UVVis, and fluorescence spectra of L. The fluorescence intensity of L was
decreased gradually while the concentration of Hg(II) ions is increased.
c. The survey on the reaction between L and Hg(II) ions
Fig 3.12 shows that, the fluorescence intensity of solution L
decreases noticeably when the concentration of Hg (II) ions increases from 0
to 5.0 μM; and then decrease unsignificantly when we continue to decrease
concentration of Hg (II) ions. This shows that L reacts with Hg (II) ions in a
molar ratio of 1:1

Fig.3.24. Absorbance spectra (a) and emission spectra (b) of Hg2L2 (2,5 μM) in
C2H5OH/HEPES (1/9, v/v), pH ~7,4, at 25C upon addition of 0-10 equiv of Cys,
excitation wavelength at 540 nm, emission wavelength at 585 nm

b. Survey on effects of competitive amino acids and reation
between of Hg2L2 and biothiols
fluorescence intensity (a.u)

Wavelength/nm
Wavelength/nm
Fig.3.11. The UV-Vis and fluorescence spectra of L with Hg(II) ions: (a) UV-Vis spectra, L (5 µM)
in C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH ~7,4, Hg(ClO4)2 (0-5µM); (b) Fluorescence spectra, L (5 µM) in
C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH ~7,4, Hg(ClO4)2 (0-5µM)), excitation wavelength at 540 nm

Wavelength/nm

Wavelength/nm

fluorescence intensity (a.u)

fluorescence intensity (a.u)

Absorbance

b. They survey of UV-Vis and fluorescence titration spectra of L
for the detection Hg(II) ions

Wavelength/nm

Concentration (μM)

Fig.3.25. (a) Emission spectra of Hg 2 L2 (2,5 μM) C 2 H5OH/HEPES (pH =7,4, 1/9, v/v) at
25 oC upon addition of different amino acids (10 equiv each) including Cys, Hcy, GSH, Ala,
Asp, Arg, Gly, Glu, ILe, Leu, Lys, Met, Thr, Ser, Tyr, Trp, and Val, respectively (Others: a
mixture of miscellaneous amino acids without mercapto group). (b) Emission intensity at 585
nm of Hg 2 L2 (2,5 μM) vs different concentions of Cys, GSH, Hcy, and other amino acids.

The results presented in Fig.3.25a show that only the thiolcontaining amino acids make strong change to fluorescence intensity
of solution. In contrast, other amino acids without the thiol group do


14

11

Hg2L2 + 4 H2Cys

+ 80H-

2

2Hg(Cys)2

+ 8 H20 + 2L

3.1.4.2. Experimental study on the use of Hg2L2 complex as
fluorescence sensor to detect biothiol
a. Survey on UV-Vis and fluorescence titration spectra of Hg2L2
Fig.3.24 indicates that when Cys is gradually added in Hg2L2
complex solution: in the UV-Vis spectra, the maximum absorption
peak at 460 nm wavelength disappears constantly while a new
maximum absorption peak with a very strong absorption intensity at

fluorescence intensity (a.u)
fluorescence intensity (a.u)

fluorescence intensity (a.u)

d. Survey on the
effects
of
the
competitive metal ions
Fig.3.13 shows
that
there is no
significant change in
UV-Vis spectra as well
as in
fluorescence
spectra
when
adding Cd
Fig.3.12. The graph for determination of the molar ratio
of the reaction between Hg(II) ions and L: L 5 µM in
(II), Fe (II), Co (III), Cu
C2H5OH/H2O (1/9, v/v) pH ~7,4, emission wavelength
(II) , Zn (II), Pb (II), Ca
at 585 nm, excitation wavelength at 540 nm.
(II), Na (I), K (I) with a
5
times
higher
concentration of L. Thus, L can detect selectively Hg (II) ions in the
presence of these ions.

Absorbance

Calculated results in Table 3.8 show that the formation of
Hg2L2 complex leads to the significant transfer of the electron density
from L ligands to metal core Hg(II) ions and shorten the energy gap
between HOMO and LUMO. As the results, at main excited states
(maximum oscillator intensity is 0,5913) from S0→S2, with the main
contribution of transition from HOMO to LUMO (53,12%), with a
small amount of excitation energy of 1,37 eV. This leads to the fact
that fluorescence emission wavelength of complex shifts to the long
wavelength, greater than 900 nm. Therefore, in practice, there is no
fluorescence from Hg2L2 complex to be detected.
3.1.4. Study on the use of Hg2L2 complex to detect biothiols
3.1.4.1. Study on theoretical calculations from complex reactions
Constant association of complex was calculated by
fluorescence titration method. The calculated results reveal that
constant association of complex Hg2L2 is 1017,45 (M-3). Meanwhile,
the association constant of Hg(RS)2 from Hg(II) ions with biothiols
RSH, (2Hg(II) + 2RSH = Hg(SR)2 + 2H+, Ka) for Cys, GSH, Hcy
are 1020,1; 1020,2 and 1019,7, respectively. Hence, the reation between
Hg2L2 with biothiols (Cys, GSH, Hcy) to format complex (Hg(II)
with biothiols the freedom of L may be available.
The research results in term of thermodynamics of reation
between Hg(II) ions and Cysteine (H2Cys) show that the reation (14)
occurs beacause ΔG298 is negative (value ΔG298 of -821,6 kcal.mol-1).
2Hg2Cys + Hg(II) + 4OH[Hg(Cys)2]2+ + 4H2O (14)
The free energy (ΔG298) of reaction to form Hg2L2 from
Hg(II) ions and L with a value ΔG298 of -410,2 kcal.mol‾1.
Thus, the reation occurs (for the reason that the value ΔG298 is
-1232 kcal.mol-1):

Wavelength/nm
Wavelength/nm

Wavelength/nm

Fig.3.13. Absorbance (a) and fluorescence (b) spectra of sensor L (1,5 μM) with different metal
ions Hg(II), Cd(II), Fe(II), Co(III), Cu(II), Zn(II), Pb(II), Ca(II), Na(I), K(I) (5 equiv each) in
C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH ~7,4, excitation wavelength at 540 nm

e. The survey on the use of sensor L for quantitation detection of
Hg(II) ions
In the concentration range of Hg(II) ions from 0 to 400 μg/L:
the variation of absorbance (ΔA540) and variation of fluorescence intensity
(∆I585) maitain a good linear relationship with the ion concentration of
Hg(II) with respective equations: ΔA540= (0,01 ± 0,01) + (0,0011 ±
0,0000) × [Hg(II)], R=0,999; ∆I585= (-1,0 ± 0,4) + (0,3 ± 0,0) ×


12
[Hg(II)], R=0,999. The limit of detection and limit of quantitation for
Hg(II) ions of colorimetric method are respectively 15,3 μg/L and
51,2 μg/L or 0,076 μM and 0,25 μM and the fluorescent method is
11,8 μg/L và 39,3 μg/L or 0,059 μM and 0,19 μM, respectively.
3.1.3. The theoretical study on the application of L for detection
Hg(II) ions
a. The study on the molecular structure of Hg2L2
The calculated results of the complex formation between
Hg(II) ions and L with the molar ratio of 1: 1 at the theoretical level
of B3LYP/LanL2DZ show that there is a unchanged geometrical
structure found as Hg2L2, which is and shown in Fig.3.16. The
formation of Hg2L2 complex is thermodynamically favorable, with a
∆G298 value of 410,2 kcal mol-1. The bonds of complexes include
O25Hg93, O71Hg93, S55Hg93, and O26O71. These bonds
are known to be formed based on the calculated results of the distances
among atoms, significantly smaller than the sum of van der Waals radii
of relevant atoms.
To confirm that the structure of the Hg2L2 complex, AIM
analysis was conducted. The results of the analysis show that there
are bond critical points (BCPs) between the contact points between
O, S ligands and Hg (II),
which are covalent bonds
with the existence of the ring
critical
points
(RCPs)
between contacts O, S, N, Hg
points (complex have ring
structure).
To
explain
fluorescence characteristics
based on nature of the
electrons of the bonds, NBO
analysis was conducted. The
Fig.3.16. The optimized geometry of Hg2L2 at the
B3LYP/LanL2DZ level of theory
results show that free L has
the structure: D-π conjugated
- A (Fluorescent); L in complex: the electron pair of N7 is no longer
conjugated to the conjugate π (the structure of D - π conjugated - A
was broken), therefore there is an electron transfer leading to
fluorescence quenching of the complex.

13
b. The analysis of fluorescent properties of Hg2L2
Table 3.8. Calculated excitation energy (E), wavelength (λ), and oscillator
strength (f) for low-laying singlet state of Hg2L2 at B3LYP/LanL2DZ
State

S0→S1

S0→S2

S0→S3

MO

201→203

E
(eV)
1,29

λ

f

(nm)
961,2

0,0838

S0→S5

4,63

202→203

30,06

202→204

59,58

201→203

1,37

903,4

0,5913

2,41

201→204

3,99

202→203

53,12

202→204

24,77

201→203

1,57

788,7

0,1063

201→204
S0→S4

Percentage
contribution(%)

201→203

38,83
39,46

1,59

778,5

0,0647

32,24

201→204

43,20

202→204

3,52

197→203

1,93

642,3

0,0183

2,66

199→203

50,52

199→204

10,31

200→203

25,64

S0→S5

201→205

2,29

S0→S6

198→204
199→203

1,95

636,4

0,0121

2,30
19,80

199→204

2,57

200→204

27,67



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×