Tải bản đầy đủ

thu nhận protease từ vi sinh vật

LỜI MỞ ĐẦU
Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế phẩm
enzyme được sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong các lĩnh vực như:
chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng năm lượng enzyme được sản
xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD, được phân
phối trong các lĩnh vực khác nhau.
Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại enzyme đơn
cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy. Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân được
sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên.
Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất
như: chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm pho mát, làm mềm thịt, bổ sung để làm tăng
chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực
phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp…
Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp
protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn. Tuy
nhiên giá thành chế phẩm protease còn khá cao, do đó cũng hạn chế việc sử dụng rộng rãi
enzyme trong sản xuất. Các chế phẩm thu được sau quá trình nuôi cấy sản xuất enzyme
chưa phải là chế phẩm có độ tinh khiết cao vì protein chỉ chiếm 20-30%. Vì vậy, việc
nghiên cứu cải tiến phương pháp tách và tinh chế enzyme nhằm thu được chế phẩm có độ
tinh khiết cao rất cần thiết. Để tách và tinh chế enzyme nói riêng và protein nói chung
thường có một loạt phương pháp hóa-lý và hóa học khác nhau. Có thể chia làm ba nhóm

phương pháp sau:
- Phương pháp kết tủa
- Phương pháp sắc ký
- Phương pháp phân tách hệ hai pha nước
Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn enzyme ở vi
sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và xạ
khuẩn… Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở
quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống.
1.

Giới thiệu chung.
Trang: 1


Nhóm enzyme protease (peptit – hidrolase 3.4) xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết
liên kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là
các axit amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận
chuyển axit amin.

Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế
bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật
(vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật (gan, dạ dày bê...). So
với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt.
Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất
giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng
tinh thể đồng nhất.
Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường
có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng.

Hình 1. Cấu trúc không gian enzyme Protease.
2.

Phân loại Protease
Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) .
Trang: 2


Peptidase (Protease)
(E.C.3.4)


Exopeptidase
(E.C. 3.4.11-17)

Endopeptidase
(E.C. 3.4.21-99)
Serine proteinase

Aminopeptidase
Cystein proteinase
Aspartic proteinase

Carboxypeptidase

Metallo proteinase
Hình 2. Sơ đồ phân loại protease
Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase.
* Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia
thành hai loại:
+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi
polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide.
+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi
polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.
* Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm:
+ Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung
tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme.
Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao
gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm
hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN. Các serine proteinase

Trang: 3


thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối
rộng.
+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động.
Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài
protein động vật và proteinase ký sinh trùng. Các cystein proteinase thường hoạt động ở
vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
+ Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin. Nhóm
pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin. Các
aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt
động mạnh ở pH trung tính.
+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi
khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường
hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA.
Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:
- Protease acid: pH 2-4
- Protease trung tính: pH 7-8
- Protease kiềm: pH 9-11
3.

Nguồn thu nhận enzyme protease:
Enzyme Protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn…gồm nhiều

loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và một số và một
số loại nấm men.


Vi khuẩn
Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm

59% lượng enzyme được sử dụng [6].
Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase
hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó protease của
vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết
peptide trong phân tử protein [6].
Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là
Bacillus subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi
Trang: 4


Clostridium. Trong đó, B. subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất (Nguyễn
Trọng Cẩn và cs, 1998). Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp
ở vùng pH trung tính và kiềm yếu.
Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5-8) và có khả
năng chịu nhiệt thấp. Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein thực phẩm ít
đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng. Các protease trung tính có
khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo và thơm. Chúng được sinh ra nhiều bởi
B. subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi
Clostridium.
Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân tử từ
20.000-30.000. Ổn định trong khoảng pH 6-12 và hoạt động trong khoảng pH rộng 7-12 .


Nấm
Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng dụng

trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A. terricola, A. fumigatus,
A. saitoi, Penicillium chysogenum)… Các loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả ba
loại protease: acid, kiềm và trung tính. Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các protease acid,
có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5-3.
Một số nấm mốc khác như: A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti… cũng có khả
năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất pho mát.


Xạ khuẩn
Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi khuẩn và

nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả năng tổng hợp
protease cao như: Streptomyces grieus, S. fradiae, S. Trerimosus...
Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là pronase (Nhật) được tách
chiết từ S. grieus, enzyme này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy phân tới 90%
liên kết peptide của nhiều protein thành amino acid. Ở Liên Xô (cũ), người ta cũng tách
được chế phẩm tương tự từ S. grieus có tên là protelin.
Từ S. fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy phân karetin. Ở Mỹ, chế
phẩm được sản xuất có tên là M-Zim dùng trong sản xuất da. Protease từ S. fradiae cũng
có hoạt tính elastase cao, do đó chúng được dùng trong công nghiệp chế biến thịt.
Trang: 5


Hầu hết các protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu, vì thế có thể sử dụng
các enzyme này theo chiều phản ứng tổng hợp để tổng hợp các liên kết peptide định
trước. Yếu tố tăng cường quá trình tổng hợp bao gồm pH, các nhóm carboxyl hoặc nhóm
amine được lựa chọn để bảo vệ, khả năng kết tủa sản phẩm, phản ứng trong hệ hai pha
lỏng.
Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở
quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống. Dùng nguồn vi sinh vật có những lợi ích
chính như sau:


Chủ động về nguyên liệu nuôi cấy vi sinh vật và giống vi sinh vật.



Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn: 16÷ 100 giờ nên có thể thu hoặc nhiều lần

quanh năm.


Có thể điều khiển sinh tổng hợp enzyme dễ dàng theo hướng có lợi (định hướng sử

dụng và tăng hiệu suất tổng thu hồi).


Giá thành tương đối thấp vì môi trường tương đối rẻ, đơn giản, dể tổ chức sản xuất.
Tuy nhiên trong mọi trường hợp cần lưu ý khả năng sinh độc tố (gây độc, gây

bệnh) để có biện pháp phòng ngừa, xử lý thích hợp.
Để sản xuất chế phẩm enzyme, người ta có thể phân lập các giống vi sinh vật có
trong tự nhiên hoặc các giống đột biến có lựa chọn theo hướng có lợi nhất, chỉ tổng hợp
ưu thế một loại enzyme nhất định cần thiết nào đó.
4.

Thu nhận và làm sạch enzyme Protease từ vi sinh vật.
Nguồn thu protease vi sinh vật chủ yếu là vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn.
Quá trình sản xuất các chế phẩm enzyme vi sinh vật bao gồm các giai đoạn chủ

yếu

Trang: 6


Tuyển chọn và cải tạo giống vi
sinh vật

Phương pháp bảo quản giống
vi sinh vật

Môi trường nuôi cấy vi sinh vật
sinh tổng hợp enzyme

Tách và làm sạch chế phẩm
enzyme
Hình 3. Các công đoạn sản xuất chế phẩm enzyme
4.1.

Tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật cho enzyme có hoạt lực cao.
Để chọn giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao, người ta có thể

phân lập từ môi trường tự nhiên hoặc có thể dùng các tác nhân gây đột biến tác động lên
bộ máy di truyền hoặc làm thay đổi đặc tính di truyền để tạo thành các biến chủng có khẳ
năng tổng hợp đặc biệt hữu hiệu một loại enzyme nào đó, cao hơn hẳn chủng gốc ban đầu.
4.1.1. Phương pháp gây đột biến.
Đây là phương pháp hay được dùng nhất nhằm để:
 Tạo những đột biến bị giảm khả năng sinh tổng hợp repressor hoặc tổng hợp
repressor có ái lực thấp với gene opertor.
 Tạo những đột biến tổng hợp enzyme có cấu trúc bậc 1 thay đổi do đó có thể giảm
độ thay đổi với kiểu kìm hãm theo cơ chế liên hệ ngược.
Nếu sự thay đổi cấu trúc bậc 1 xảy ra ở vùng trung tâm hoạt động hoặc ở gần đó thì có thể
làm thay đổi rõ rệt hoạt tính của enzyme.
 Gây đột biến ở đoạn gene hoạt hóa promotor để làm tăng áp lực của nó đối với
ARN-polymerase do đó làm tăng tốc độ sao chép mã…Dùng biện pháp này có thể làm
tăng lượng glucoza-6-phosphatdehydrogenaza lên 6 lần.
Trang: 7


Hiện tượng đột biến thường liên hệ với sự thay đổi một gene, chẳng hạn bị “lồi”
một bazo khi tái tạo phân tử ADN.
Để tạo một đột biến gene có thể dùng tác nhân vật lý (tia tử ngoại, tia phóng xạ)
hay hóa học (các hóa chất) tác dụng lên tế bào sinh vật.
4.1.2. Phương pháp biến nạp.
Là sự biến đổi tính trạng di truyền của một nòi vi sinh vật dưới ảnh hưởng của
ADN trong dịch chiết nhận nhận được từ tế bào của vi sinh vật khác. Ở đây yếu tố biến
nạp là AND. Sự chuyển vật liệu di truyền (ADN) từ tế bào cho đến tế bào nhận có thể
xảy ra trong ống nghiệm (invitro) khi cho tế bào nhận tiếp xúc với dịch chiết từ tế bào cho
mà không có sự tiếp xúc giữa các tế bào.
Các tế bào có thể nhận bất kỳ loại ADN nào chớ không đòi hỏi phải là ADN từ các
giống họ hàng. Tuy nhiên tế bào chỉ có thể nhận một số đoạn ADN nhất định, thường
không quá 10 đoạn. Các đoạn ADN được di truyền trong biến nạp có M=10 6-107 và phải
có cấu trúc xoắn kép. Hiện tượng biến nạp phổ biến ở nhiều loài vi khuẩn như:
Diplococus, Staphylocus, Hemophilus, Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus, Xantomonas.
4.1.3. Phương pháp tiếp hợp gene.
Khác với biến nạp, ở đây vật liệu di truyền chỉ được truyền từ tế bào cho đến tế
bào nhận khi hai tế bào tiếp xúc với nhau. Do vậy các vi sinh vật có khả năng biến nạp thì
sẽ không có khả năng tham gia tiếp hợp gene nữa. Hiện nay quá trình tiếp hợp gene đã
được nghiên cứu ở một số loài vi khuẩn như E.coli, salmonella, Pseudomonas
aeruginosa.
4.1.4. Phương pháp tải nạp
Vật liệu di truyền (ADN) được chuyển từ tế bào cho sang tế bào nhận nhờ vai trò
trung gian của thực khuẩn thể (phage). Trong quá trình tải nạp, các đoạn AND được
chuyển từ tế bào cho đến tế bào tiếp hợp với AND của tế bào nhận. Do đó làm biến đổi
tính chất di truyền của tế bào nhận.
4.2.

Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật.
Khi sử dụng vi sinh vật để sản xuất enzyme cần chọn giống thuần chủng, đã được

kiểm tra đầy đủ về các đặc tính hóa sinh, vi sinh, nuôi cấy và cần đặc biệt lưu ý đến điều
kiện bảo quản giống. Thực tế khi bảo quản giống gốc trong một thời gian có thể tạo ra các
Trang: 8


biến dị ngẫu nhiên không mong muốn do đó định kỳ phải cấy chuyền và kiểm tra lại các
đặc tính ban đầu.


Phương pháp cấy chuyền.
Đây là phương pháp phổ biến nhất dễ thực hiện bằng cách giữ giống trên môi

trường thạch (thạch nghiêng, hộp petri,…) với thành phần môi trường nuôi cấy và điều
kiện nuôi cấy thích hợp cho giống vi sinh vật đó. Sau khi giống đã mọc tốt cần bảo quản ở
nhiệt độ lạnh 3-40C và sau mỗi tuần phải cấy chuyền lại. Khi cấy chuyền chỉ lấy bào tử
hoặc khuẩn lạc mà không nên lấy cả môi trường dinh dưỡng để đảm bảo không chuyền
các sản phẩm trao đổi chất vào môi trường mới (có thể gây biến đổi bất lợi không thể
lường hết được). Nếu là xạ khuẩn thì không nên bảo quản giống trên môi trường thạch mà
nên giữ trong đất để khử trùng.
Để kéo dài thời gian bảo quản giống từ hàng tháng đến 1 năm, người ta phủ 1 lớp
paraphin lỏng để tiệt trùng trên bề mặt giống để hạn chế sự phát triển của nó. Cần lưu ý
chỉ phủ lớp dầu sau khi cấy vi sinh vật đạt đến độ chín sinh lý.
Phương pháp cấy chuyền rất có hiệu quả để bảo quản các giống nấm men, vi khuẩn và rất
hữu hiệu, dễ dàng triễn khai giống ra sản xuất lớn, hạn chế các tai biến có thể dẫn đến hư
hỏng giống gốc.


Phương pháp làm khô
Bằng cách giữ giống trên cát, đất, silicagen trong điều kiện khô ráo (tất cả đều được

khử trùng cẩn thận). Trong điều kiện như vậy sẽ hạn chế sự phát triển tiếp tục của giống
khi bảo quản. Phươg pháp này rất hay được sử dụng để bảo quản nấm mốc, xạ khuẩn,
một vài loại nấm men, vi khuẩn thời gian giữu giống có thể được 1 năm.
Phương pháp làm khô cũng thực hiện đơn giản, không cần dụng cụ đắt tiền. Tuy
nhiên giống như phương pháp cấy chuyền thời gian bảo quản tương đối ngắn.


Phương pháp đông khô
Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ở trạng thái

lạnh sâu. Ở đây vi sinh vật được huyền phù trong môi trường thích hợp và được làm lạnh
trong môi trường chân không. Thiết bị đông khô sẽ hút nước và cuối cùng mẫu được làm
khô đến mức nhất định. Mẫu được hàn kín để cho môi trường chứa mẫu là chân không.
Đây là phương pháp phổ biến có hiệu quả cao cho bảo quản các đối tượng vi sinh vật
Trang: 9


khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn và một số virut. Tuy nhiên, phương pháp này
ít được ứng dụng đối với tảo, động vật nguyên sinh và tế bào động vật.


Phương pháp bảo quản lạnh sâu:
Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu thì vi sinh vật được bảo quản trong môi trường

dịch thể và nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt ở nhiệt độ lạnh sâu (196°C -> -80 °C).
Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu.
Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích luỹ các chất điện giải trong mẫu bảo
quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm này người ta
đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol, DMSO
(dimethyl sulfoxide). Việc bảo quản theo phương pháp lạnh sâu này được thực hiện ở các
thang nhiệt độ khác nhau như -20 ° C, -30° C, -40° C, -70° C, -140°C và -196° C. Nói chung
mức nhiệt độ cao hơn -30° C cho hiệu quả thấp do tế bào chịu nồng độ muối cao sinh ra từ
các chất điện giải. Phương pháp bảo quản này có hiệu quả với nhiều nhóm vi sinh vật
khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn và virut.
Đặc biệt với phương pháp bảo quản lạnh sâu trong nitơ lỏng là phương pháp vạn
năng hơn cả. Phương pháp này thích hợp với nhiều đối tượng vi sinh vật khác nhau như vi
khuẩn, nấm sợi, nấm men, virut, tảo và cả các dòng tế bào động vật. Tuy nhiên, phương
pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểm như đầu tư kinh phí cho thiết bị và điện, nitơ
lỏng hoặc rủi ro như cháy nổ... Đặc biệt phương pháp này không thích hợp với các chủng
vi sinh vật thường xuyên dùng đến. Nói chung phương pháp này thường được dùng với
các chủng vi sinh vật có những đặc tính quí mà không thích hợp với phương pháp đông
khô.
4.3.

Tách và làm sạch chế phẩm enzyme.
Một điều cần nói thêm nữa là enzyme thường chứa ở các tế bào sinh vật gọi là các

enzyme trong tế bào (intracellular), nhưng nó cũng có thể được các sinh vật tiết ra môi
trường sống. Đó là các enzyme ngoài tế bào (extracellular). Enzyme vi sinh vật thường
chiết là enzyme ngoại bào.

Trang: 10


. Các phân tử enzyme không có khả năng đi qua màng của tế bào và màng của các
cấu tử của tế bào. Do đó để có thể chiết rút các enzyme nội bào, bước đầu tiên là phải phá
vỡ cấu trúc của các tế bào có chứa enzyme và chuyển chúng vào dung dịch.
Có thể phá vỡ cấu trúc của các tế bào bằng các biện pháp cơ học như nghiền với
bột thủy tinh hoặc cát thạch anh, làm đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa (homogenizator).
Muốn tách được các enzyme trong các cấu tử của tế bào, người ta còn phải dùng
các yếu tố vật lý và hóa học khác nhau như sóng siêu âm, dùng các dung môi hữu cơ như
butanol, aceton, glycerin, ethyl acetate... và chất detergent. Các hóa chất có tác dụng tốt
cho việc phá vỡ các cấu tử của tế bào vì trong các cơ quan này thường chứa mỡ.
Sau khi đã phá vỡ các cấu trúc của tế bào, enzyme được chiết bằng nước cất, bằng
các dung dịch đệm thích hợp hoặc các dung dịch muối trung tính.
Có một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rút cần lưu ý. Trước hết đó là nhiệt
độ. Để tránh mất hoạt tính hoặc thậm chí vô hoạt, cần chiết rút và tiến hành kết tủa
enzyme ở nhiệt độ thấp (từ 3 đến 5 0C). Các thao tác phải nhanh. Một số chất điện ly làm
tăng quá trình chiết rút enzyme như NaCl, ZnCl 2, CaCl2. Tác dụng của chúng còn phụ
thuộc vào phương pháp dùng khi chiết rút.
Để loại bỏ muối khoáng và các loại đường... là các tạp chất có phân tử lượng thấp,
người ta thường dùng phương pháp thẩm tích (dialysis) đối nước hay đối các dung dịch
đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex.

Trang: 11


Để loại bỏ các protein tạp (protein cấu trúc, protein trơ) và các chất có phân tử
lượng cao khác người ta hay dùng kết hợp các phương pháp khác nhau: phương pháp biến
tích chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường, phương pháp kết tủa
phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các phương pháp sắc ký (sắc
ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion), điện di, phương pháp lọc gel.
- Mục đích yêu cầu: Các chế phẩm enzyme được sử dụng ở các dạng khác nhau
theo mức độ tinh khiết (hoạt độ riêng). Trong một số trường hợp, canh trường nuôi cấy vi
sinh vật có chứa enzyme được sử dụng trực tiếp dưới dạng thô không cần tách tạp chất
nếu chúng không gây ảnh hưởng đáng kể đến sản phẩm và quy trình công nghệ sau này
(Ví dụ: sản xuất rượu, nước chấm thực vật, da). Cũng có khi người ta cần sử dụng chế
phẩm enzyme tinh khiết trong công nghiệp dệt, công nghiệp mạch nha, y học, nghiên cứu
khoa học.
Enzyme nói chung rất dễ bị giảm hoạt tính dưới tác dụng của các tác nhân bên
ngoài do đó khi tách và tinh chế enzyme để tránh sự biến hình protein ảnh hưởng lớn đến
hoạt tính enzyme cần tiến hành nhanh chóng ở nhiệt độ thấp, độ pH thích hợp không có
mặt các chất gây biến hình enzyme.
4.3.1. Phương pháp kết tủa
Phương pháp kết tủa phân đoạn bằng (NH4)2 SO4 dựa trên cơ sở sự khác nhau về
khả năng kết tủa của các protein enzyme ở một nồng độ muối (tính theo phần % nồng độ
bão hòa) xác định được dùng phổ biến để loại bỏ bước đầu protein tạp của các dịch
enzyme. Các loại muối có thể được dùng là (NH 4)2 SO4, Na2 SO4, MgSO4 ... người ta đã
nhận thấy muối (NH4)2 SO4 là tốt nhất vì nó không làm hại mà làm ổn định (làm bền) hầu
hết các loại enzyme. Loại muối này lại rẻ và phổ biến. Độ hòa tan của nó lại rất lớn (bão
hòa 767g/l ở 250C).
4.3.2. Phương pháp sắc ký


Các kỹ thuật sắc ký cột
Dịch chiết enzyme đã được loại bỏ phần lớn các protein tạp nhưng vẫn chưa đảm

bảo độ đồng nhất cần thiết. Do đó dịch chiết enzyme được tiếp tục làm sạch bằng phương
pháp sắc ký cột.
- Phương pháp dùng chất rây phân tử (lọc gel - gel filtration)
Trang: 12


Cơ sở của phương pháp lọc gel là dựa vào sự khác nhau về kích thước hình dạng
và phân tử lượng của enzyme có trong hỗn hợp để tách chúng ra.
Để đảm bảo cho việc tách enzyme được tốt, chất rây phân tử phải là chất trơ,
không phản ứng với protein enzyme. Chất này cũng không hòa tan và tương đối bền với
các yếu tố về cơ học cũng như sinh học. Ngoài ra chất được sử dụng cho mục đích lọc
phân tử phải là chất không có tính đàn hồi (không co) và phải là chất ưa nước
(hydrophyl).

Trang: 13


- Phương pháp sắc ký trao đổi ion
Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa vào sự khác nhau về điện tích tổng số của các
protein enzyme. Hay nói cách khác, phương pháp này được dựa trên cơ sở của phản ứng
trao đổi ion giữa protein được tan trong nước hoặc dung dịch đệm loãng và các tác nhân
trao đổi ion. Tác nhân (hay nguyên liệu) trao đổi ion có thể là chất nhựa có tích nhóm sinh
ion hoặc là chất ionit. Đây là những chất giá trơ, không tan trong nước, có bản chất là
cellulose hoặc chất gel dextran có lưới phân nhánh (Sephadex, Molselect) hoặc là chất
nhựa polystirol. Chất giá thể này thường kết hợp với các nhóm ion hóa. Các chất trao đổi
ion có chất giá là cellulose, sephadex, molselect thông thường được dùng để tách protein
enzyme, còn các chất trao đổi ion có chất giá là polystirol (ví dụ như Dowex, Amberlite)
chỉ dùng để tách các peptid có trọng lượng phân tử nhỏ hơn.
Anionit DEAE - cellulose (diethylamino - ethyl - cellulose)

Đây là chất trao đổi anion
Nếu chất giá là sephadex thì chúng ta có chất trao đổi ion sephadex. Đó là các loại
DEAE - sephadex và CM - sephadex. Ưu điểm của loại này là vừa tách được protein

Trang: 14


enzyme về kích thước và về điện tích tổng số của các protein enzyme. Trường hợp CM sephadex trên chất giá sephadex có gắn nhóm COO-

Đây là chất trao đổi cation.
Ngoài ra có các phương pháp :
- Phương pháp dùng chất hấp phụ
- Phương pháp dùng chất hấp phụ đặc hiệu sinh học hay là phương pháp sắc ký ái
lực (affinity chromatography)
4.3.3. Phương pháp tách hệ hai pha nước.
Cơ sở kỹ thuật này dựa vào sự phân bố khác nhau của hỗn hợp trong dung dịch
hai pha không hòa tan vào nhau. Các hệ hai pha đặc trưng bằng cách trộn các hệ dung môi
vào nhau để tạo thành hai pha riêng biệt. Hệ dung môi được sử dụng trong phương pháp
này có thể là polymer/polymer như: polyethylene glycol (PEG) và dextran hoặc
polymer/muối như PEG và potassium phosphate, sodium sulphate, sodium phosphate,...
Các protein và mảnh vỡ tế bào có khả năng hòa tan khác nhau giữa hai pha, vì vậy
phương pháp này có thể được dùng cho cả hai trường hợp: phân tách protein khỏi mảnh
vỡ tế bào và phân chia các enzyme trong suốt quá trình tinh sạch protein. Hệ hai pha
nước được xem là phương pháp tốt cho việc phân tách và tinh sạch các hỗn hợp, vì phân
tách chất lỏng có mật độ khác nhau dễ dàng hơn phân tách các chất rắn ra khỏi các chất
lỏng. So với các phương pháp tinh sạch khác thì hệ hai pha nước có một số ưu điểm hơn
như: có độ hòa tan trong nước của hai pha lớn (70-80%), đạt độ tinh sạch cao, hiệu suất
cao, dễ dàng sử dụng ở quy mô lớn và đặc biệt polymer được tái sử dụng.
Sự phân tách đạt hiệu quả cao tùy thuộc vào các thông số như khối lượng phân tử
và điện tích của đối tượng nghiên cứu, nồng độ và khối lượng phân tử của các polymer,
nhiệt độ, pH, thời gian, lực ion của hỗn hợp và sự hiện diện của các loại muối đa hóa trị
như phosphaste hoặc sulphate...
Trang: 15



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×