Tải bản đầy đủ

Tiểu luận HỆ ENZYM PECTINASE

Tiểu Luận

MỞ ĐẦU
Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất protein làm nhiệm vụ xúc tác cho các
phản ứng hóa sinh xảy ra trong cơ thể sinh vật.
Enzyme tồn tại trong tất cả các tế bào sống của động vật, thực vật, vi sinh vật. Các
phản ứng do enzyme xúc tác có thể xảy ra ở ngay trong cơthể s ống hoặc ở ngoài cơ thể.
Hiện nay đã tách được rất nhiều enzyme khác nhau từ nguồn động vật, thực vật, đặc biệt là
từ vi sinh vật, trong đó có nhiều loại đã được thu nhận với độ thuần khiết cao. Xúc tác
enzyme có nhiều ưu điểm hơn hẳn xúc tác thông thường như cường lực xúc tác lớn, tính đặc
hiệu cao, không độc, có thể tác dụng trong điều kiện nhẹ nhàng, đơn giản. Hơn nữa có thể
sản xuất enzyme từ các nguyên liệu giá rẻ nhưng đem lại hiệu quả kinh tế cao, nhờ v ậy việc
ứng dụng enzyme rộng rãi trong các ngành công nghiệp nhẹ, công nghiệp thực phẩm, nông
nghiệp, y học và nghiên cứu khoa học đã nhanh chóng có những bước tiến dài vàngày càng
có nhiều triển vọng tốt đẹp.
Enzyme pectinase là enzyme xúc tác sự phân hủy của các polymer pectin. Sự phân
hủy pectin trong tự nhiên thường xảy ra khi trái cây chín. Những enzyme này vì vậy có một
vai trò hết sức quan trọng trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả. Việc kiểm soát các
enzyme này trong cà chua chuyển gen là một ví dụ điển hình trong việc ứng dụng RNA đối
mã để thao tác sự biểu hiện gen. Enzyme pectinase cũng được ứng dụng nhiều trong quá
trình chế biến thực phẩm, đặc biệt là khả năng làm trong nước quả.


Hán Thị Hương - Lớp Cao học K14

1


Tiểu Luận
Phần I. HỆ ENZYM PECTINASE
I. Cơ chất pectin
Pectin là hợp chất cao phân tử mạch thẳng có cấu tạo từ sự kết hợp của các acid
galacturonic qua các liên kết –-1,4 glucoside. Tùy thuộc nguồn pectin mà pectin có khối
lượng phân tử 800000-200000. Pectin hoà tan trong nước, ammoniac, dung dịch kiềm,
carbonate natri và trong glycerine nóng. Độ hoà tan của pectin trong nước tăng lên khi
mức độ ester hoá trong phân tử pectin tăng và khi khối lượng phân tử pectin giảm.
Pectin là tên chung được gọi cho các hỗn hợp chứa các thành phần rất khác
nhau, trong đó pectinic acid là thành phần chủ yếu. Các pectin tự nhiên định vị trong
thành phần của tế bào có thể liên kết với các cấu trúc polyssacharide và protein để tạo
thành các protopectim không tan. Có thể phân hủy để làm pectin tan trong nước bằng
cách đun nóng pectin trong môi trường acid. Vì thế, các pectin tan thu nhận được là kết
quả của sự phân hủy phân tử pectin không tan và chúng không đồng dạng với nhau.
Trong thực vật, pectin tồn tại dưới ba dạng: pectin hoà tan, pectin acid và
protopectin.
Pectin hoà tan là ester methylic của acid polygalacturonic pectin, trong tự nhiên
có khoảng 2/3 số nhóm carboxyl của polygalacturonic acid được ester hoá bằng
methanol. Pectin được ester hoá cao sẽ tạo gel đặc trong dung dịch acid và trong dung
dịch đường có nồng độ 65%. Enzyme pectinase tác động lên các hợp chất pectin có khối
lượng phân tử khác nhau và cấu trúc hóa học không đồng dạng. Cấu trúc hoá học cơ bản
của pectin là - D - galacturonan hay – D -galacturonoglycan, mạch thẳng có cấu tạo từ
các đơn vị D - galactopyranosyluronic acid (liên kết theo kiểu -1,4). Mặt khác, mức độ
oxy hoá trong các phân tử polymer này cũng khác nhau, trong đó một số nhất định các
nhóm carboxyl bị ester hoá bởi các nhóm methoxyl. Trong một số trường hợp, chẳng hạn
trong pectin củ cải đường, có sự ester hoá giữa các nhóm carboxyl và các nhóm acetyl.
Pectinic acid là polygalacturonic acid có một phần nhỏ các nhóm carboxyl
được ester hoá bằng methanol. Pectinase là muối của pectinic acid. Pectic acid là

Hán Thị Hương - Lớp Cao học K14

2



Tiểu Luận
polygalacturonic acid đã hoàn toàn giải phóng khỏi một đơn vị galacturonic acid. Pectate
là muối của pectic acid.
Protopectin tạo độ cứng cho quả xanh, không tan trong nước và có cấu tạo hoá
học phức tạp. Trong pectin có các phân tử pectin, các phân tử cellulose và các ion Ca 2+ ,
Mg2+ , các gốc phosphoric acid, acetic acid và đường. Protopectin khi bị thủy phân bằng
acid thì giải phóng pectin hoà tan
II. Pectinase
Enzyme pectinase là enzyme xúc tác sự phân hủy của các polymer pectin. Sự
phân hủy pectin trong tự nhiên thường xảy ra khi trái cây chín. Những enzyme này vì
vậy có một vai trò hết sức quan trọng trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả. Việc
kiểm soát các enzyme này trong cà chua chuyển gen là một ví dụ điển hình trong việc
ứng dụng RNA đối mã để thao tác sự biểu hiện gen. Enzyme pectinase cũng được ứng
dụng nhiều trong quá trình chế biến thực phẩm, đặc biệt là khả năng làm trong nước quả.
Việc kiểm soát hoạt động của enzyme pectinase cũng có thể kiểm soát được độ nhớt của
sản phẩm.
Enzyme pectinase có thể được phân loại theo cơ chế tác dụng của chúng.
•Pectinesterase (PE): xúc tác sự thủy phân của các nhóm methyl ester. Enzyme
thường tấn công vào các nhóm ester methyl của đơn vị galaturonate nằm kề đơn vị không
bị ester hoá, phân cắt các nhóm methoxy (COOCH 3) đứng cạnh các nhóm –COOH tự do,
tạo thành acid pectinic hoặc acid pectic và methanol. Pectinesterase thu được từ các
nguồn khác nhau có giá trị pH tối ưu khác nhau. Nếu thu từ nguồn VSV thì PH tối ưu từ
4,5-5,5, còn nếu từ nguồn thực vật thì có pH tối ưu từ 5,0-8,5. Pectinesterase từ nấm mốc
có nhiệt độ tối ưu là 30-40oC và bị vô hoạt ở 55-62 oC. Pectinesterase thường được hoạt
hoá bởi các ion Ca2+ và Mg2+.
•Polygalacturonase còn có tên gọi là poly -1,4-galacturoniglucanohydrolase, xúc
tác sự phân cắt các mối liên kết –1,4-glycosid. Các exo-PG (exo-poly 1,4--Dgalacturonide) galacturonohydrolase, phân cắt từ các đầu không khử, và endo-PG (endopoly1,4--D-galacturonide) glycanohydrolase, tấn công ngẫu nhiên vào giữa mạch cơ

Hán Thị Hương - Lớp Cao học K14

3


Tiểu Luận
chất. Polygalacturonase ít gặp trong thực vật nhưng có chủ yếu ở một số nấm mốc và vi
khuẩn. Polygalacturonase là một phức hệ enzyme gồm có nhiều cấu tử và thường có tính
đặc hiệu cao đối với cơ chất. Trên cơ sở tính đặc hiệu và cơ chế tác dụng với cơ chất,
enzym polygalacturonase được chia làm bốn loại:
 Polymethylgalacturonase hay còn gọi là-1,4-galacturonite-methylesglucanohydrolase,
tác dụng trên polygalactorunic acid đã được methoxyl hoá (tức là pectin). Enzyme này
lại được phân thành hai nhóm nhỏ phụ thuộc vào khả năng phân cắt ở trong hay cuối
mạch trong phân tử pectin, đó là endo-glucosidáe-polymethyl galacturonase kiểu I và
exo-glucosidase-polymethylgalaturonase kiểu III.
 Polygalacturonase, enzyme tác dụng trên pectic acid hoặc pectinic, cũng được
chia thành hai nhóm nhỏ là endo-glucosidase-polygalacturonase kiểu II và exoglucosidase-polygalacturonase

kiểu

IV.

Enzyme

endo-glucosidase-Polymethyl-

galacturonase kiểu I là enzyme polymethylgalacturonase dịch hoá pectin có mức độ
methyl hoá càng cao thì bị thủy phân bởi enzyme này càng nhanh và càng có hiệu quả.
Trong dung dịch, khi có mặt của enzyme pectinesterase thì hoạt độ của enzyme này
thường bị giảm. Enzyme này rất phổ biến trong các VSV, đặc biệt là nấm mốc A. niger,
A, awamori.
•Pectate lyase (PEL): xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate không bị ester
hoá. Cả hai enzyme exo-PEL (exo-Poly(1,4--D-galacturonide) lyase) và endo-PEL
(endo-poly(1,4--D-galacturonic) lyase) đều tồn tại. Pectate và pectin có lượng methoxyl
thấp là các cơ chất thích hợp hơn cả cho các enzyme này. Nói chung, cả hai enzyme này
đều có khoảng pH tối đa nằm trong khoảng từ 8,0-11, đều cần ion Ca 2+ để hoạt động.
Pectate lyase không được tìm thấy trong cây xanh, nhưng có ở vi khuẩn và nấm. Các
enzyme VSV ngoại bào này đóng một vai trò rất quan trọng trong quá trình gây bệnh ở
thực vật, gây ra sự phân hủy mô của thành tế bào, làm mềm và làm mục mô thực vật.
Ngoài ra còn có:

Hán Thị Hương - Lớp Cao học K14

4


Tiểu Luận
• Pectin-transeliminase hay còn được gọi là poly

–-1,4-galaturonite –

methylesteglucanoliase, là enyme tác dụng trên pectin và pectinic acid.
• Polygalactorunate-transeliminase còn được gọi là poly

-1,4D-galaturonite –

glucanoliase, là enzyme tác dụng trên pectic acid và pectinic acid.
• Pectin lyase (PNL): xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate đã bị ester hoá.

Tất cả các PNL đều là endo-enzyme
III. Đặc điểm của các pectinase từ các nguồn khác nhau
1. Pectinesterase:
Bên cạnh pectineaterase (PE) VSV, hầu hết các loại cây cho trái đều chứa
enyme PE. Enzyme này thường tồn tại dưới nhiều hình thức khác nhau, nằm trong phần
vỏ tế bào. PE ở thực vật nói chung có hoạt độ tối ưu trong khoảng pH hơi kiềm. Các
cation kim loại ở nồng độ thấp, như Ca 2+ chẳng hạn, có khuynh hướng làm tăng nồng độ
hoạt động của enzyme.
1.1. Đặc điểm của pectineaterase thực vật:
Cà chua chứa ít nhất hai loại PE. Cả PE1 và PE2 đều tăng trong giai đoạn đầu của
quá trình chín. Khi bước vào giai đoạn chín, nồng độ enzyme PE1 giảm xuống, nhưng
PE2 tích luỹ dần cho đến khi trái cây có màu đặc trưng của trái chín. PE2 có khối lượng
phân tử 23kD, pH tối ưu 7,6. Enzyme này bị bất hoạt 50% sau 5 phút đun ở 67 oC. Các ion
Ca2+ và Na+ làm tăng hoạt độ của enzyme lên tối đa ở các nồng độ 0,005M và 0,05M, theo
thứ tự.
PE của đậu nành là protein có khối lượng phân tử 33kD, hoạt động tối ưu tại
pH gần 8. Polygalacturonic acid, sản phẩm hình thành do quá trình để methyl hoá, là một
chất ức chế cạnh tranh.
Trong thịt quả chuối có hai isoenzyme PE. Cả hai có cùng khối lượng phân tử
là 30kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau: 8,8 và 9,3. Các enzyme này hoạt động ở
pH tối đa là 7,5. Hoạt độ enzyme tăng lên khi thêm vào dung dịch NaCl ở nồng độ 0,2M,
và đưa pH của dung dịch về 6,0. Các enzyme này bị ức chế bởi nhiều loại polyol có khối
lượng phân tử thấp, như glycerol, sucrose, glucose, maltose và galactose.

Hán Thị Hương - Lớp Cao học K14

5


Tiểu Luận
PE trong quả cam có hai loại: đó là hai isoenzyme PE1 và PE2 có khối lượng
phân tử 36,kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau là 10,05 và ∃11,0, theo thứ tự. pH tối
ưu của PE1 là 7,6, còn của PE2 là 8,0.
Thịt quả cũng chứa hai isoenzymem, một trong hai enzyme này có tính bền
nhiệt hơn, còn enzyme kia thì ít mẫn cảm hơn khi bị tác động của protease. Độ ổn định
của enzyme có thể liên quan đến mức độ glycosyl hoá của các phân tử enzyme. Enzyme
bền nhiệt hơn và enzyme còn lại có khối lượng là 51kD và 36kD, theo thứ tự.
Cả táo và kiwi cũng chứa hai loại isoenzyme. Các isoenzyme của kiwi có
cùng khối lượng phân tử là 57kD và cùng điểm đẳng điện là 7,3. Tuy nhiên, chúng khác
nhau về mức độ bền nhiệt.
1.2. Đặc điểm của pectineaterase vi sinh vật:
Một điểm đáng lưu ý là tất cả enzyme VSV đều không phải là protein kiềm. PE
của Trichoderma reerei có điểm đẳng điện nằm trong khoảng 8,3-9,5 và pH tối ưu là 7,6.
Tuy nhiên, PE của Aspergillus có điểm đẳng điện và pH tối ưu trong khoảng acid. Hoạt
động của enzyme PE sinh ra bởi A. niger đạt tối đa ở pH 4,5 ở 40oC. Các PE acid và
kiềm có thể đề methyl hoá cơ chất pectin theo cùng một kiểu. PE kiềm làm hình thành
các pectin được đề ester hoá và pectin này có thể tạo gel yếu với ion calcium; PE acid tạo
ra pectin bị đề ester hoá có khả năng tạo gel mạnh với ion calcium.
1.3.Trình tự amino acid:
Cấu trúc bậc một của PE cà chua chứa 305 amino acid với khối lượng phân tử 33
239. Enzyme này có chứa hai cầu nối disulfide (Cys98-Cys125 và Cys166-Cys200). Cys
166 có mặt trong tất cả các enzyme pectinesterase. Trình tự amino acid suy luận trên cơ
sở các nucleotide cDNA cho thấy sự không nhất quán, 18 trong 27 vị trí khác nhau, có
thể làm thay đổi điện tích của protein. Mặt khác, chỉ có khoảng 94% trình tự amino acid
trong một phần chuỗi amino acid có tính đồng dạng với toàn bộ trình tự của cDNA. Sự
không nhất quán này có thể phản ánh sự tồn tại của các isoenzyme, mặc dù chỉ có hai
isoenzyme trong cà chua được biết đến. Một số gen mã hoá cho các enzyme PE đã được

Hán Thị Hương - Lớp Cao học K14

6


Tiểu Luận
tách dòng và nghiên cứu đặc điểm. Gen tách dòng từ Pseudomonas mã hoá cho PE có
chứa 396 amino acid với khối lượng phân tử là 41 004.
1.4. Cơ chế để methyl hoá:
PE loại bỏ các nhóm methoxyl trong phân tử pectin bằng tương tác ái nhân của
enzyme lên ester, làm hình thành hợp chất trung gian acyl-enzyme và phóng thích
methanol. Tiếp theo sau là phản ứng deayl hoá, là phản ứng thủy phân của hợp chất trung
gian acyl-enzyme, để giải phóng enzyme và carboxylic acid.
Các PE có nguồn gốc thực vật phản ứng theo kiểu làm hình thành các khối
pectin chứa các nhóm carboxylate dọc theo mạch pectin. Enzyme của Trichoderma
reesei là một protein cơ bản cho kiểu phản ứng tương tự. Enzyme của các loài Asperillus
với pH tối đa trong vùng acid, xúc tác phản ứng từ bên trong.
Anh hưởng của các ion kim loại khi kích hoạt enzyme pectinesterase có thể có
liên quan đến tương tác của nó với cơ chất. Polygalacturonic acid là một chất ức chế
cạnh tranh trong phản ứng thủy phân nhờ sự xúc tác của PE. Pectin chứa các nhóm
cacboxylate được sắp xếp như hình khối có thể tác dụng theo cách tương tự. Sự liên kết
của các ion kim loại vào các nhóm carboxylate trong trường hợp này có khuynh hướng
trung hoà ảnh hưởng ức chế của cơ chất pectin lên enzyme. Tuy nhiên. Lượng dư các ion
này trên thực tế gây ra sự bất hoạt của PE vì các ion kim loại bị vây quanh bởi các nhóm
carboxylate nằm kế cận với các liên kết ester cần thiết cho phản ứng thủy phân xảy ra.
2. Polygalacturonase
Hầu hết các nghiên cứu về PG đều trên cơ sở các nguồn VSV. PG thường
được tìm thấy trong các phần tiết ngoại bào của các loài nấm và vi khuẩn gây bệnh,
chẳng hạn như Sacchromyces gragilis, Aspergillus niger, Lactobacillus plantarum,
Cochiliobolus carbonum, Neurospora crassa, các loài Ascomycete, Phizopus arrchizus,
và Fusarium osyporum. Tuy nhiên, trong thực tế, PG của thực vật bậc cao được nghiên
cứu rất nhiều ở cà chua chín.
2.1.Các enzyme trong cà chua chín:

Hán Thị Hương - Lớp Cao học K14

7


Tiểu Luận
Các enzyme PG trong cà chua chín tồn tại dưới hai dạng, và cả hai đều là endoenzyme. PG1 có khối lượng phân tử 84kD và có khoảng 50% bị bất hoạt ở nhiệt độ 78 oC.
PG2 có khối lượng phân tử 44kD và có khoảng 50% bị bất hoạt ở 57 oC. PG1 có độ ổn
định tối đa ở pH 4,3, trái lại PG2 ổn định tối đa ở pH 5,6. Sự phân tích sử dụng SDSPAGE cho rằng PG1 là một dimer của PG2, tuy nhiên các nghiên cứu khác lại cho rằng
PG1 hình thành là do sự kết hợp của PG2 với một ∃–subunit. Các chuỗi polypeptide của
PG đều bị glycosyl hoá. PG2 chứa 4,6 đường trung tính (D-mannose, L-gucose, Dxylose) liên kết với nhau thông qua cầu nối N-acetylglucosaminylasparaginyl. Có sự
khác nhau chút ít về khối lượng phân tử, chẳng hạn các isoenzyme của PG2, PG2A va
PG2B có khối lượng phân tử tương ứng là 43 và 46kD. Sự khác nhau này có thể là do
quá trình sửa sai hoặc quá trình glycosyl hoá sau dịch mã. Trong thực tế, các nghiên cứu
sau đó cũng đã chứng minh được rằng PG2A và PG2B là các dạng glycosyl hoá khác
nhau của cùng các polypeptide.
2.2. Trình tự amino acid:
Các trình tự amino acid được suy luận trên cơ sở các nucleotic của cDNA phân lập
không những từ trái cà chua mà còn từ phấn của các loài Pseudomonas solanacearum,
Oenothera organesis, phấn hoa bắp, và từ trái bơ. Gen của PG2 phân lập từ trái cà chua
mã hoá cho protein hoàn chỉnh có 373 amino acid, với khối lượng phân tử là 40 279.
Enzyme này được tổng hợp từ một tiền chất, sau đó đi qua quá trình sửa chửa sau dịch
mã, gồm cả các quá trình loại bỏ các peptide tín hiệu, bị glycosyl hoá tại bốn điểm có
khả năng glycosyl, và sửa chữa ở đầu C cuối. Các gen PG đơn mã hoá cho các loại
isoenzyme khác nhau, dẫn đến kết luận rằng PG1 và PG2 đều xuất phát từ cùng một
chuỗi polypeptide, và rằng PG1 được tạo thành nhờ sự kết hợp của PG2 với β-subunit.

β-subunit. Sự chuyển đổi PG2 và PG1 trong quá trình chín của cà chua là một
vấn đề gây được nhiều chú ý. β-subunit, một yếu tố bền nhiệt, đầu tiên được phân lập từ
cà chua xanh, có khả năng chuyển đổi PG2 thành PG1 trong ống nghiệm. Yếu tố này sau
đó được xác minh là một glycoprotein rất đặc trưng với polypeptide PG về mặt miễn

Hán Thị Hương - Lớp Cao học K14

8


Tiểu Luận
dịch. Phân tử PG1 được tạo thành từ một phân tử PG2 và một phân tử β-subunit; tuy
nhiên, chỉ có polypeptide PG có hoạt tính enzyme.
cDNA mã hoá cho –subunit có trong cà chua là một tiền chất có kích thước phân
tử lớn (69kD, 630 amino acid). Trong phân tử này, thêm vào phân tử protein hoàn chỉnh
là một trình tự tín hiệu kị nước (30 amino acid), một polypeptide chứa đầu cuối N-(78
amino acid), và một tiền peptide chứa đầu cuối C-(233 amino acid). Protein hoàn chỉnh
chứa glycosyl hoá là chứa 289 amino acid nặng 31,5 kD, điểm đẳng điện 4,9. Protein này
chứa lượng lớn amino acid gly, tyr, phe, và một motif lặp có cấu trúc liên ứng
FTNYGxxGNGGxxx, trong đó “x” phần lớn là các amino acid phân cực. Chức năng của
motif này trong protein vẫn chưa được biết rõ.
2.3.Vai trò của PG trong quá trình làm chín trái cây.
Hoạt độ của enzyme trong giai đoạn đầu của quá trình làm chín chủ yếu là nhờ
PG1. PG1 tiếp tục tăng trong quá trình chín, và có mặt trong tất cả các giai đoạn của quá
trình chín. PG2 có khối lượng phân tử thấp hơn và ít bền nhiệt, PG2 xuất hiện trong giai
đoạn cuối của quá trình, và chiếm lượng lớn trong giai đoạn chín. Sự xuất hiện kế tiếp
nhau của hai enzyme này là kết quả của hoạt động điều hoà của –subunit, yếu tố này
được tìm thấy với lượng ít trong cà chua xanh, sau đó tăng lên trong giai đoạn chín.
PG2 được coi như một endo-enzyme trong cà chua chín, PG1 được hình thành
trong suốt quá trình chín khi β–subunit được sinh ra để phản ứng với PG2. Bằng cách
điều chỉnh những thay đổi trong các phân tử PG trong các dịch chiết khác nhau có các
nồng độ khác nhau của NaCl và pH đệm khác nhau. Trên thực tế gen mã hoá cho
polypeptide PG trong một số nghiên cứu trước đây đã chứng minh điều này. Gần đây, các
nghiên cứu về các kiểu biểu hiện gen của β–subunit và các phân tử PG cho thấy mRNA
của β–subunit xuất hiện sớm trong quá trình phát triển của trái cây(10 ngày sau khi thụ
phấn) và tăng đến mức tối đa trong 30 ngày, cũng là lúc trái cây chín. Sau đó, lượng
mRNA của β-subunit giảm nhanh chóng, trong khi lượng mRNA của PG tăng một cách
đáng kể.

Hán Thị Hương - Lớp Cao học K14

9


Tiểu Luận
Vì tất cả các kết quả nghiên cứu đạt được ở trên, ta có thể cho rằng endoenzyme PG2 được hình thành trong các giai đoạn sớm của quá trình chín phải được
chuyển về PG1 do sự có mặt của β–subunit. Sự tích lũy của PG2 trong các giai đoạn sau
của quá trình chín là do β–subunit bị cạn kiệt. Vai trò của quá trình chuyển đổi này nhằm
điều hoà hoạt động của PG trong các giai đoạn của quá trình chín. β–subunit phản ứng và
neo phân tử PG2 vào thành tế bào, tạo ra phân tử PG1 dưới dạng hoạt động để phân hủy
pectin. Một số nghiên cứu khác cũng chứng minh được rằng PG1, chứ không phải PG2
có chức năng trong việc làm phân huỷ và ổn định polyuronide, có nghĩa là sự phân hủy
của polyuronide dưới tác động của enzyme PG là nguyên nhân dẫn đến quá trình mềm
của cà chua.Tuy nhiên, khi nghiên cứu về sự xen đoạn và biểu hiện của gen PG trong cà
chua chuyển gen thì kết quả cho thấy polyuronide bị phân hủy nhưng không làm cho trái
cà chua mềm đi.
2.4. Cơ chế và kiểu tác dụng:
Exo-PG thủy phân các đầu không khử của chuỗi polygalacturonic, tạo ra
galacturonic acid là sản phẩm thủy phân chiếm ưu thế(H.6.8). Sự thủy phân polymer này
bị gián đoạn của sự tồn tại của các mạch nhánh trong cơ chất. Mức độ thuỷ phân tăng tỉ
lệ với kích thước cơ chất, đạt tối đa với mức polymer hoá 20 đối với các exo-PG ở cà rốt
và đào. Hoạt động của các exo-enzyme làm tăng nhanh sự tạo thành các nhóm khử và làm
tăng chậm độ nhớt của dung dịch cơ chất. Sự phân hủy polyuronide trong quá trình chín
không gây ra sự tích lũy galacturonic acid, và chỉ có endo-enzyme PG là có liên quan.

Các endo-PG phân hủy pectic acid từ bên trong mạch, làm giảm nhanh độ nhớt
của dung dịch cơ chất. Tính đặc hiệu và kiểu tác dụng của endo-enzyme được xác định
bởi trạng thái của điểm hoạt động. Mức độ thủy phân của endo-PG ở nấm men giảm
cùng với sự giảm độ dài mạch cơ chất. Vị trí liên kết của endo-PG ở Aspergillus niger
được cấu thành từ 4 điểm và sự phân cắt xảy ra giữa các điểm 1 và 2(H.6.9). Một cơ chất
tetramer chịu sự phân cắt(3+1) thành trigalacturonic acid galacturonic. Một cơ chất
pentamer cho ra hai sản phẩm phức tạp hơn, cả hai đều đáp ứng sự chiếm giữ hoàn toàn

Hán Thị Hương - Lớp Cao học K14

10


Tiểu Luận
của 4 điểm liên kết, tạo sự phân cắt (4+1) và (3+2). Cũng tương tự, đối với cơ chất là
hexagalacturonic acid, sản phẩm sẽ tạo thành lối phân cắt (5+1), (4+2) và (3+3).
Trigalacturonic acid bám vào điểm hoạt động để tạo thành các phức hợp hữu ích hoặc
không hữu ích. Liên kết hữu ích trong trường hợp này làm sinh ra sự phân cắt (2+1).
Liên kết không hữu ích được tạo thành khi ba đơn vị đơn lẽ bám vào ba điểm 2, 3 và 4 là
không hề tương tác với các nhóm xúc tác định vị bên trong điểm 1 và 2. Cơ chất trong
trường hợp này đóng vai trò là một chất ức chế cạnh tranh (K = 0,67mM).
3.Pectate lyase:
Pectate lyase (PEL) là các enzyme VSV ngoại bào. Các enzyme của giống
Erwina và Bacillus được biết đến là tác nhân gây ra triệu chứng soft-rod ở thực vật. Tuy
nhiên, chúng cũng được tìm thấy phổ biến ở Aeromonas, Pseudomonas, Xanthomonas,
Aspergillus và Fusarium.
Erwinia chrysanthemi sinh ra các enzyme pectate lyase ở dạng isoenzyme có thể
được phân thành các nhóm trên cơ sở điểm đẳng điện của chúng: acid (pH 4-5), trung
hoà (pH 7-8,5) và kiềm (pH 9-10). Số lượng các isoenzyme trong mỗi nhóm có thể thay
đổi tùy theo loài. Đa số các loài được nghiên cứu cho năm hay ít nhất bốn isoenzyme:
một acid (PELA), hai trung hoà (PELA và C), hai kiềm (PELD và E). Tất cả các
isoenzyme này đều cần Ca++ để làm tăng độ hoạt động và có pH tối ưu 8-10. Các nghiên
cứu trên chủng EC16 cho thấy rằng tất cả 4 isoenzyme trên đều là endo-enzyme
(PELA(pI 4,2), PELA (pI 8,8), PELC (pI 9,0), và PELD (pI 10,0)). Các PEL kiềm rất đặc
hiệu trong việc gây ra sự giầm nước của các mô thực vật, tiếp theo là các isoenzyme
trung hoà, trái lại các PEL acid không gây ảnh hưởng gì.
Ở các chủng Erwinia carotovara, có ít nhất ba PEL được tiết ra, tất cả đều có
điểm đẳng điện ở pH kiềm: PELI (pI 9,7), PELII (pI 10,2), và PELIII (pI 10,35). Cả ba
isoenzyme này đều có pH tối ưu là 9,0. Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của PELII và
PELIII là 50 và 60oC, theo thứ tự. PELI có độ bền nhiệt thấp. Ở chủng GIR726, có bốn
loại endo-PEL isoenzyme với các điểm đẳng điện ở các pH rất kiềm (10,0, 10,6, 10,3 và
10,9) và khối lượng phân tử nằm trong khoảng từ 28-33 kD. pH tối ưu cho hoạt động là

Hán Thị Hương - Lớp Cao học K14

11


Tiểu Luận
9,3 cho PELII 9,5 cho PELIV và 9,7 cho PEL I và III. Cũng như với các PEL từ các
nguồn khác, những isoenzyme này được kích hoạt bởi Ca ++. Hoạt độ enzyme tăng 5070% khi có mặt của Ca++ ồng độ 0,5mM. Isoenzyme với pI>10 chứa 2,5-4.8% đường
trung tính. Các PEL từ một số loài Bacillus cũng có khả năng gây ra sự giảm nước ở mô
thực vật.
IV. Các đặc tính kỹ thuật quan trọng của enzyme pectinase
1. Pectinesterase:
Các PE ở thực vật tấn công vào hoặc đầu không khử hoặc gần với nhóm
carboxyl tự do và tiến dọc theo phân tử bằng cơ chế chuỗi đơn, tạo ra các khối
galacturonic acid không bị ester hoá rất mẫn cảm với calcium. Các cấu trúc khác nhau
của chuỗi galacturonan, chẳng hạn như các monomer acetyl hoá, các nhóm ester bị
chuyển đổi thành amide hay bị khử đến rượu bậc một, hay sự tồn tại của các vùng có
nhiều mạch nhánh, ức chế hoạt động của PE. PE có tính đặc hiệu cao đối với nhóm
methylester của polygalacturonic acid. Các ester khác chỉ bị tấn công rất chậm, còn các
nhóm methylester của polymanuronic acid thì không hề bị tấn công. Tốc độ đề ester hoá
trên mạch pectin phụ thuộc vào độ dài của mạch; trimethyl trigalacturonate không bị tấn
công. Các PE của nấm khác với PE của thực vật theo cơ chế đa mạch, các nhóm
mehtoxyl bị lấy đi một cách ngẫu nhiên.
2. Polygalacturonase:
Việc xác định hoạt tính của enzyme này bằng cách đo độ nhớt của dung dịch
pectic acid gồm methylester và glycolester cho thấy sự giảm nhanh tốc độ và mức độ
thuỷ phân, đồng thới tăng mức độ ester hoá. Các nhóm acetyl có mặt làm giảm mức độ
thủy phân bằng cách giảm ái lực của các phân tử cơ chất qua các khối chứa các điểm liên
kết. Sự thủy phân bị hạn chế do sự có mặt của các nhóm acetyl có thể được xác minh
bằng cách sử dụng pectin củ cải đường làm cơ chất. PG tạo bởi nấm có thể thủy phân đến
70% pectin bị acetyl hoá. Tuy nhiên, kiểu tác dụng lên cơ chất của các PG có từ các
nguồn khác nhau thì khác nhau.

Hán Thị Hương - Lớp Cao học K14

12


Tiểu Luận
Cơ chất tốt nhất cho sự phân hủy của endo-pectin-lyase ở pH>7 là pectin hoàn
toàn bị ester hóa. Tuy nhiên,ở các giá trị pH nhỏ hơn, enzyme này vẫn hoạt động đối với
pectin bị ester hóa ít hơn, đồng thời cần Ca ++ để kích hoạt. Điều này có ý nghĩa thực sự
đối với các quá trình chế biến trái cây. Những enzyme này cần các nhóm methylester để
hoạt động, trái lại chúng bị bất hoạt khi có mặt các nhóm glycolester và các pectate bị
amidate hóa.
3.Endo-pectate lyates:
Trái lại, endo-pectate lyates không phân biệt methylester và glycolester của
pectic acid. Điều thú vị là pectate không phải là cơ chất tốt nhất cho vi khuẩn PAL từ vi
khuẩn. Chúng có hoạt độ cực đại (tốc độ ban đầu và mức độ phân hủy) nên pectin có
hàm lượng methoxyl thấp.
4.Rhamno-galacturonase:
Gần đây, rhamno-galacturonase là enzyme được phát hiện có khả năng phân cắt
liên kết glucoside trong các vùng phân nhánh nhiều của phân tử galacturonic rhamnose
acid có trong pectin của quả táo với hoạt tính rất cao khi những phân tử này bị đề ester
hoá và arabinose bị lấy đi do bị thủy phân bởi acid (vùng phân nhánh nhiều bị sửa chữa).
Enzyme này có mặt trong các chế phẩm thương mại của pectinase và chắc chắn phải
được phân loại là pectinase. Sản phẩm cuối là các oligomer có các đơn vị rhamnose và
galacturonic acid, trong đó rhamnose làm hình thành đầu không khử.
5. Pectinase thương mại:
Enzyme thương mại là các chế phẩm enzyme của nấm mốc, được điều chế chủ
yếu từ các loại Aspergillus. Chúng thường là hỗn hợp của các PE, PG và Pl,
hemicellulase và endo-β -glucanase (C-x-cellulase). Hoạt tính của ba chế phẩm thương
mại khác nhau được trình bày ở bảng 6.13. Các enzyme đều được thu nhận từ nấm mốc
được sử dụng để sản xuất chế phẩm pectinase, trừ enzyme C-1-dellulase
(cellobiohydrolase) là được thêm vào để chế phẩm đạt được mục đích kỹ thuật. Enzyme
arabinanase đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình chế biến nước ép trái cây.

Hán Thị Hương - Lớp Cao học K14

13


Tiểu Luận
Có một điều chắc chắn là kỹ thuật gen sẽ được sử dụng nhằm mục đích sản xuất
các chế phẩm enzyme, mở ra những khả năng mới cho các ứng dụng công nghiệp của
các chế phẩm enzyme này.
Phần II. ỨNG DỤNG CỦA HỆ ENZYM PECTINASE
I. Giới thiệu về ứng dụng của hệ enzym Pectinasa
Trong sản xuất thực phẩm, người ta thường sử dụng các chế phẩm pectinase
dưới dạng tinh khiết. Người ta không dùng chế phẩm dưới dạng canh trường nấm mốc
sấy khô. Tỉ lưởng chế phẩm pectinase cô đặc trên lượng nguyên liệu đem chế biến vào
khoảng từ 0.03 – 0.05 đến 0.10%.
Pectinase thường được sử dụng trong các ngành công nghiếp thực phẩm sau:
-sản xuất rượu vang;
-sản xuất nước quả và nước uống không có cồn;
-sản xuất các mặt hàng từ quả: nước quả cô đặc, mứt nhừ, mứt đông, … ;
-sản xuất nước giải khát;
-sản xuất cà phê và cà phê hòa tan.
Trong sản xuất rượu vang, cũng như trong sản xuất nước quả và các nước uống
không rượu, đều có thể sử dụng pectinase một cách rất hiệu quả. Nhờ tác dụng của
pectinase mà các quá trình ép, làm trong và lọc dịch quả rất dễ dàng, do đó làm tăng hiệu
suất sản phẩm. Chẳng hạn đưa pectinase vào khâu nghiền quả, sẽ làm tăng hiệu suất
nước quả sau khi ép lên tới 15 – 25%. Bởi lẽ khi có pectin thì khối quả nghiền sẽ có
trạng thái keo, do đó khi ép dịch quả không thoát ra được. Nhờ pectinase phân giải các
chất pectin di mà dịch quả trong suốt không bị vẩn đục và lọc rất dễ dàng. Không nhũng
vậy, enzym pectinase còn góp phần chiết rút được các chất màu, tanin và những chất hòa
tan nữa, do đó làm tăng thêm chất lượng của thành phẩm.
Trong sản xuất các mặt hàng từ quả (mứt nhừ, mứt đông, …) pectinase cũng có
vai trò quan trọng. Nhờ pectinase mà có thể thu được dịch quả có nồng độ đậm đặc.
Chẳng hạn như dịch táo cô đặc đến 72 độ Brix, nếu không tách các pectin tự nhiên chứa
trong đó đi thì sản phẩm sẽ bị keo tụ một cách mạnh mẽ và không thể cô đặc hơn nữa. Đa

Hán Thị Hương - Lớp Cao học K14

14


Tiểu Luận
số trường hợp, người ta khử pectin đi, sau đó mới lọc rồi cô đặc, nhưng đôi khi người ta
cho pectinase tác dụng trong suốt thời gian cô đặc.
Trong sản xuất cà phê, người ta dùng pectinase để tách lớp keo ở trên bề mặt của
hạt cà phê. Trước đây người ta dùng ngay vi sinh vật để làm công việc này, nhưng
thường quá trình xảy ra không đồng đều và khó kiểm tra. Hiện nay người ta thường dùng
các chế phẩm pectinase.
Pectin là hợp chất polyme của axit galaturonic, ester methyl và một số thành
phần nhỏ khác chỉ tồn tại trong tế bào thực vật. Carbohydrat tồn tại cùng pectin bao gồm:
araban, arabinoxylan, gaclactan. Pectin chia ra làm hai loại: loại tan trong nước và loại
không tan trong nước. Loại không tan trong nước còn được gọi là protopectin và chúng
thường liên kết với cellulose để tạo thành pectinocellulose.
Tồn tại 3 nhóm enzym pectinase phân giải pectin:
-Pectin methyl esterase
-Depolymease
-Exoenzym pectinase
Pectin methyl esterase (EC.3.1.1.11): Enzym này tham gia phân giải pectin
thành axit pectic và methanol. Enzym này còn có tên khác là pectiestenase (PE). Hiệu
suất thủy phân pectin của enzym này rất cao, có thể đạt được 98%.
Pectinesterase của nấm sợi hoạt đông mạnh ở pH 3 – 5.
Cả hai loại pectinase này bị biến tính ở nhiệt độ 80OC.
Enzym pectin methyl esterase tham gia tác động vào COOCH 3 theo cơ chế sau:
Pectin depolymease: Enzym này có trong tế bào thực vật. Tuy nhiên hiện nay
người ta sản xuất enzym này theo qui mô công nghiệp từ nấm sợi và từ vi khuẩn. Chúng
được phân ra làm 4 loại như sau:
1- Endo pectin traseliminase (EC.4.2.2.3). viết tắt là PTE – pectiliase.
2- Endo pectin axit traseliminase (EC.4.2.2.1). viết tắt là PATE.
3- Endo - poly galacturonase (EC.3.2.1.15). viết tắt PG.
4- Endo - poly methyl galacturonase. viết tắt PMG.

Hán Thị Hương - Lớp Cao học K14

15


Tiểu Luận
Các enzym thường phân cắt liên kết glucozit trong cấu tạo của pectin:
Enzym polygalacturonase tham gia tác động vào glucoside cuối cùng để tạo ra
những phân tử cấu thành.
Tùy theo nguồn thu nhận enzym depolymease mà chúing có pH tối ưu khác
nhau. Ta có thể tham khảo pH tối ưu của các enzym này trong bảng sau:

Bảng 1: Giá trị pH tối ưu của depolymease
Stt
1
2
3
4
5
6
7

Nguồn Enzym
Aspergillus niga
Flavobacterium pectinovorum
Aspergillus niger
Aspergillus sp.
Coniothyrum diplodiela
Aspergillus sojae
Bacterium polymyxa

Loại Enzym
Endo - PMG
Endo - PMG
Endo - PG
Endo - PG
Endo - PG
Endo PTE
Endo PTE

pH tối ưu
5,2
7,4 – 8,2
4,7 – 4,8
3,7 – 4,2
4,4
5,5
8,9 – 9,1

5- exoenzym là những enzym giải phóng axit galacturonic bắt đầu từ điểm cuối
của phân tử pectin. Enzym pectinase được ứng dụng chủ yếu để phá vỡ thành tế bào của
quả nhằm giải phóng các chất có trong tế bào của quả ra ngoài.
Việc ứng dụng pectinase để thu nhận nước quả được áp dụng lần đầu tiên vào
năm 1930. Từ đó đến nay việc áp dụng enzym này đã trở nên rất phổ biến ở nhiều nước
trên thế giới.

Hán Thị Hương - Lớp Cao học K14

16


Tiểu Luận
Việc thu nhận nước quả từ trước đến nay chủ yếu bằng phương pháp ép. Nếu
pectin còn nhiều sẽ theo nước quả và gây ra hiện tượng nước quả bị đục, có độ keo cao
và rất khó lọc trong.
Trong tế bào của quả nước chiếm khoảng 90 – 95%. Nếu ta chỉ nghiền sau đó ép
thì ta chỉ có thể thu nhận được khoảng 60 – 70% là tối đa. Khi ta cho enzym pectinase
vào, hiệu suất ép sẽ tăng 15 – 30%. Nhiều trường hợp, hiệu suất ép tăng đến 50%. Liều
lượng chế phẩm enzym tinh khiết cho vào là 0,03 – 0,05% hoặc chế phẩm thô là 0,5 –
2%. Nhiệt độ duy trì cho quá trình thủy phân là 43 – 45 oC. Thời gian thủy phân là 4 – 8h.
dịch quả thu được bằng pectinase sẽ trong hơn, khả năng lọc sẽ tốt hơn và hiệu quả kinh
tế thấy rõ.
II.Các ứng dụng cơ bản:
1. Ứng dụng enzym pectinase sản xuất nước quả và rượu vang:
1.1. Các chế phẩm enzym
Trong sản xuất nước quả và rượu vang, việc sử dụng enzym là một tiến bộ khoa
học rất lớn. Các chế phẩm enzym được sử dụng trong sản xuất nước quả và rượu vang có
thể là một hỗn hợp nhiều loại enzym và cũng có thể chỉ là một loại enzym riêng biệt.
Việc sử dụng hỗn hợp enzym hay từng loại enzym riêng biệt phụ thuộc vào nguyên liệu
và sản phẩm cần đạt tới. Ngoài ra, việc sử dụng các loại chế phẩm enzym như trình bày
trên còn phụ thuộc vào công nghệ sản xuất (các yếu tố kỹ thuật).
Trong sản xuất nước quả và rượu vang, người ta thường sử dụng một trong sáu
nhóm enzym sau.
•Nhóm chế phẩm enzym dùng để sản xuất nước quả đục. Mục đích sử dụng
nhóm chế phẩm enzym này là làm tăng hiệu suất trích ly để thu được lượng sản phẩm
lớn.
•Nhóm chế phẩm enzym dùng để sản xuất nước quả trong, không chứa pectin.
Mục đích sử dụng nhóm chế phẩm enzym này là làm tăng hiệu suất trích ly và thủy phân
hoàn toàn các chất protein, pectin, làm giảm độ nhớt và làm triệt tiêu nguyên nhân làm
đục nước quả.

Hán Thị Hương - Lớp Cao học K14

17


Tiểu Luận
•Nhóm chế phẩm enzym dùng để làm tăng khả năng đồng hóa nước quả và thịt
quả, làm tăng khả năng trích ly nước quả.
•Nhóm chế phẩm enzym dùng để sản xuất bán sản phẩm rượu vang, nhằm làm
tăng hiệu suất trích ly của bán sản phẩm.
•Nhóm chế phẩm enzym dùng để ngăn cản quá trình oxy hóa và làm cản trở sự
phát triển của vi sinh vật hiếu khí phát triển trong nước quả, trong rượu vang.
•Nhóm chế phẩm enzym dùng vào mục đích chống lại sự lại đường trong sản
xuất siro thành phẩm.
Việc sử dụng các chế phẩm enzym phải được xem xét kỹ lưỡng trên cơ sở đặc
điểm nguyên liệu trái cây cần xử lý. Trong các đặc điểm của trái cây, người ta quan tâm
rất nhiều đến đặc điểm màu sắc tự nhiên của sản phẩm. Trong nhiều trường hợp, việc sử
dụng enzym phải đảm bảo giữ được màu sắc tự nhiên ban đầu hoặc tạo ra những màu sắc
theo ý muốn bằng cách điều khiển những phản ứng enzym. Theo màu sắc tự nhiên, các
loại trái cây được chia làm hai loại:
Trái cây có màu nhạt: táo, lê, nho trắng, chuối, cam, xoài, bưởi …
Trái cây có màu sẫm do chứa nhiều antoxian: anh đào, mận đỏ, nho đỏ, mận
đen, dâu …
Để xử lý quả nghiền có màu nhạt, người ta thường sử dụng một loạt các enzym sau:
- Enzym endo-PMG để làm giảm độ nhớt của dịch quả
- Enzym PE làm tăng hiệu suất trích ly
- Enzym khác như cellulase, hemicellulase, protease không bắt buộc.
Tuy nhiên, nếu cho thêm những enzym này vào sẽ làm tăng khả năng trích ly vật
chất hòa tan trong tế bào quả.
Riêng enzym PTE, cần lưu ý là enzym này phân hủy protopectin, thường không
có lợi cho việc thoát các chất có trong tế bào quả. Do đó trong trường hợp này, người ta
không sử dụng enzym PTE.
Sự có mặt của enzym ascorbinatoxidase thường gây ra sự phân giải vitamin C.

Hán Thị Hương - Lớp Cao học K14

18


Tiểu Luận
Các enzym tham gia quá trình oxi hóa như poly phenoloxidase, peroxidase,
catalase thường làm biến màu nước quả và làm giảm giá trị cảm quan khác. Do đó, trong
chế biến nước quả không nên dùng những loại enzym này.
Khi chế biến nước quả có màu đỏ cần lưu ý phải bảo tồn chất màu antocian.
Chính vì thế không được dùng những loại enzym có khả năng phân giải antocian.
Ascorbic acid là một trong những chỉ tiêu quan trọng của nước quả, do đó trong
khi chế biến nước quả tuyệt đối không được sử dụng enzym ascorbicnatoxidase.
Trong nhiều trường hợp, enzym protease đóng vai trò quan trọng trong quá trình
làm trong nước quả. Chính vì thế khi cần làm trong nước quả, người ta thường kết hợp
protease acid với enzym phân hủy pectin.
Khi chế biến nước quả có thịt quả, người ta thường sử dụng chế phẩm enzym
bao

gồm

pectintrancelinutase,

hemicellulase,

cellulase.

Trong

đó,

enzym

pectintrancelinutase đóng vai trò quan trọng nhất. Trong hỗn hợp chế phẩm enzym trên,
tuyệt đối không được có mặt enzym polygalacturonase, đặc biệt không được chứa enzym
endopolygalacturonase. Những enzym này thường làm giảm độ nhớt của nước quả và
phá vỡ độ đồng nhất của nước quả.
Việc ứng dụng enzymvào chế biến nước quả và trong sản xuất rượu vang bắt
đầu từ năm 1930. Khi đó, Z,J.Kertesz và A.Meilliz được xem như những người đầu tiên
đưa ra ý tưởng sử dụng enzym trong chế biến rau quả. Từ đó đến nay, trên thế giới có rất
nhiều loại chế phẩm thương mại được sản xuất và ứng dụng trong chế phẩm rau quả.
1.2. Cơ chế tác động của enzym pectinase
Trong chế biến nước quả, người ta sử dụng các chế phẩm enzym nhằm hai mục
đích cơ bản.
- Phá vỡ thành tế bào thức vật nhằm nâng cao hiệu suất thu nước quả.
- Làm trong và ổn định chất lượng nước.
Phá vỡ thành tế bào. Tế bào thực vật được cấu tạo bằng vỏ tế bào (thành tế bào).
Vỏ tế bào như một lớp thành bảo vệ rất hữu hiệu và tạo hình cho tế bào. Ở vỏ tế bào thực
vật có nhiều chất pectin, các chất pectin được xem như chất ciment gắn các tế bào với

Hán Thị Hương - Lớp Cao học K14

19


Tiểu Luận
nhau. Phá vỡ sự gắn kết này sẽ tạo điều kiện cho các vật chất trong tế bào thoát ra khỏi tế
bào. Các chế phẩm enzym có chứa không chỉ pectinase mà còn chứa các enzym trong
nhóm cellulase. Các loại enzym này sẽ làm phá vỡ thành tế bào và giúp quá trình thu
nhận dịch tế bào tốt hơn.
Làm trong nước quả. Nước quả sau khi được tách khỏi tế bào thường chứa nhiều
chất khác nhau. Trong đó chất pectin chiếm lượng đáng kể và pectin thường gây hiện
tượng độ nhớt cao và gây đục nước quả.
Các chất protein có trong bào tương, màng tế bào và gian bào. Pectin chứa
polygalacturonic acid, araban và galactan. Trong đó lượng polygalacturonic acid chiếm
tới 40-60%. Khi bị thủy phân, pectin tách thành hai phần:
- Phần trung tính – phức chất galactanoraban
- Phần acid – acid pectic.
Trong bào tương, pectin nằm ở dạng hòa tan. Trong màng tế bào và gian bào,
chúng nằm ở dạng không hòa tan gọi là protopectin. Protopectin ở màng gian bào có
chứa lượng kim loại khá lớn và một lượng nhóm metocyl đủ để làm protopectin bền
vững. Còn protopectin ở màng tế bào chứa một lượng kim loại không nhiều, có độ
metocyl hóa cao. Vì thế, tế bào thực vật có khả năng trương nở tốt.
Nếu enzym tham gia phân giải pectin ở gian bào sẽ làm các tế bào khó liên kết
với nhau và thịt quả dễ dàng bị mềm ra. Pectin thường có mối liên kết hydro và liên kết
nguyên tử yếu hơn so với cellulose. Tham gia phân hủy pectin gồm nhiều loại enzym.

Hán Thị Hương - Lớp Cao học K14

20


Tiểu Luận

Bảng 2: Các loại enzym pectinase
STT

1
2

Enzym
(tên gọi theo hệ thống)
Pectin-pectinhydrolase

glycano hydrolase-PG

galacturonid trong galacturonid
không theo một trật tự nào
Thủy phân liên kết α-1,4-Dgalacturonic với sự đứt mạch của

Poly-α-1,4-D-

Endopolymetil-

acid galacturonic
Thủy phân liên kết α-1,4-D-

galacturonidmetilester-

galacturonase

galacturonid trong pectin không

glycanohydrolase

(Endo-PMG)

theo một trật tự nhất định.
Thủy phân liên kết α-1,4-D-

Exo-pectatliase

galacturonid trong pectat với sự tạo

(exo-PKTE)

thành ∆-4,5 aciddegalacturonic

galacturonid

Poly-α-1,4-Dgalacturonid
glicanoliase
Poly-α-1,4-D-

7

acid
Thủy phân liên kết α-1,4-D-

(exo-PG)

digalacturonoliase

6

(endo-PG)

Pectin + H2O = n metanol + pectic

galacturonid trong pectat, trong

Poly-α-1,4-D-

5

pectinesterase

Phản ứng xúc tác

Exopoly galacturonase

galacturonidgalacturonhydrolase

4

(tên thường gọi)

Poly-α-1,4 galacturonid- Endopolygalacturonase

Poly-α-1,4-D-

3

Enzym

galacturonid
metylester glicanoliase

không theo một trật tự nhất định.
Thủy phân liên kết α-1,4-DEndopectatliase

galacturonid trong pectat, trong

(PETE)

galacturonic với sự tạo thành nối đôi
không theo một trật tự nhất định
Thủy phân liên kết α-1,4-D-

Endopectinliase

galacturonid trong pectin với sự tạo

(Endo-PTE)

thành nối đôi không theo một trật tự
nhất định

1.3 Hiệu quả của việc sử dụng enzym pectinase

Hán Thị Hương - Lớp Cao học K14

21


Tiểu Luận
 Những bất lợi khi sử dụng enzym
Nước quả được sử dụng enzym có nhiều ưu điểm, tuy nhiên việc sử dụng enzym
cũng có những nhược điểm như xảy ra những biến đổi bất lợi về VSV.
Nếu xử lý trong thời gian ngắn, quá trình oxy hóa và sự nhiễm VSV không
thành vấn đề lớn. Nhưng nếu xử enzym trong thời gian dài sẽ xảy ra quá trình oxy hoá và
sự nhiễm VSV.
Người ta ngăn ngừa quá trình oxy hoá trong nước quả bằng một trong ba cách sau:
- Cho ascorbic acid
- Cho anhydric sulfur
- Cho enzym glucose oxidase.
Trước khi dùng những chất chống oxy hóa trên, người ta phải đun nóng dịch
quả. Khi đun nóng dịch quả, các enzym có trong nước quả sẽ bị ức chế. Theo đó, nước
quả được ly tâm để làm sạch cơ học, sau đó nước quả được đun nóng tới 80 OC và sau đó
hạ nhiệt đến nhiệt độ tối ưu của họat động enzym. Người ta thường cho lượng ascorbic
acid tới 5mg/100g nước quả để hạn chế quá trình oxy hoá.
Để hạn chế sự phát triển của VSV trong tường hợp sử dụng enzym để xử lý
nước quả, người ta thường áp dụng những biện pháp sau.
Sử dụng sorbic acid, ascorbic acid, benzoate natri. Sorbic acid thường được sử
dụng trong nước quả với liều lượng là 0,03%. Acid này hoạt động ở pH rất rộng (pH 3,99,2).Sorbic acid ức chế sự phát triển của nấm men và nấm sợi, không làm thay đổi vị và
mùi của sản phẩm. Benzoate natri thường được sử dụng trong nước quả với liều lượng là
0,15%.
Sử dụng anhydric sulfur. Người ta thường sử dụng anhydric sunfurơ để bảo quản
nước quả bán thành phẩm. Chất này vừa có khả năng tiêu diệt VSV, vừa có khả năng
chống oxy hoá. Khi cho chất anhydric sunfurơ vào dịch quả, chúng dễ dàng bị oxy hóa.
Khi đó lượng oxy có trong dịch quả ít dần và đến mức triệt tiêu, gây ra trạng thái thế hiệu
oxy hóa-khử trong dịch quả thay đổi và VSV sẽ bị ức chế hoặc tiêu diệt. Tuy nhiên cần
phải lưu ý rằng, nếu lượng anhydric sunfurơ quá nhiều sẽ dẫn đến ức chế các hoạt động

Hán Thị Hương - Lớp Cao học K14

22


Tiểu Luận
của enzym. Các thí nghiệm cho thấy, nếu hàm lượng anhydric snfur 0,1% làm giảm hoạt
tính của chế phẩm enzym, nếu 0,5% thì enzym hoàn toàn bị ức chế.
Xử lý nhiệt. Người ta có thể đun nóng dịch quả để bảo quản nước quả. Tuy
nhiên, việc đun nóng dịch quả không thể quá cao vì chính nhiệt độ sẽ làm thay đổi tính
chất cảm quan, thành phần hóa học và hoạt tính enzym.
Đa số enzym phân giải pectin bị mất hoạt tính ở 70 OC và chúng hoạt động mạnh
ở 45-50OC. Tuy nhiên, ở nước quả lên men, người ta sử dụng enzym để xử lý nước quả
ngay ở nhiệt độ thường (trùng với nhiệt độ lên men).

 Hiệu quả của việc sử dụng enzym
Đã có nhiều nghiên cứu và kết quả áp dụng trong sản xuất nước quả và rượu
vang cho thấy khi sử dụng enzym pectinase cho hiệu suất nước quả và chất lượng rượu
vang rất cao.
Khi tiến hành ứng dụng enzym trong sản xuất nước quả và rượu vang, người ta
đặc biệt quan tâm đến hai yếu tố có tính chất quyết định đến hiệu quả enzym.
- Nguyên liệu
- Khả năng xay, nghiền và làm nhỏ nguyên liệu.
Nguyên liệu. Không phải tất cả các loại quả đều cho hiệu suất cao khi xử lý
enzym. Khi sử dụng enzym trong chế biến nước quả và rượu vang người ta phải đưa ra
độ chín kỹ thuật cho phù hợp. Khái niệm này hoàn toàn khác với khái niệm độ chín kỹ
thuật khi trong công nghệ người ta không sử dụng enzym. Độ chín kỹ thuật để sản xuất
nước quả là giai đoạn chín của quả, đảm bảo tách dịch quả được tốt với sự tích tụ tối đa
các chất có giá trị dinh dưỡng cao và hương vị thích hợp.
Tuy nhiên cũng cần biết rằng, phần lớn nguyên liệu, hiệu suất dịch quả cao
không trùng hợp với sự tích tụ các chất có giá trị dinh dưỡng. Ở nhiếu loại quả, khả năng
thoát dịch quả không trùng với mức độ chín. Nhiều khi quả thật chín, khả năng tích tụ
chất dinh dưỡng cao nhưng lại không thuận lợi cho việc tách nước quả. Chính vì thế,
từng loại quả, người ta phải tiến hành phân loại và xác định độ chín kỹ thuât riêng, sao
cho phù hợp với việc sử dụng enzym và thu hồi dịch quả.

Hán Thị Hương - Lớp Cao học K14

23


Tiểu Luận
Công việc thứ hai sau khi phân loại quả, việc nhất thiết phải làm trước khi sử
dụng enzym là quả phải được làm sạch bằng cách rửa nhiều lần để loại bỏ những tạp
chất, VSV. Sau đó là các quá trình kỹ thuật như xé nhỏ, nghiền, … để tăng khả năng tác
động của enzym và tăng hiệu suất thu dịch quả.
Khả năng làm nhỏ nguyên liệu. Làm nhỏ nguyên liệu là khâu kỹ thuật rất quan
trọng, nó quyết định đến hiệu quả tác động của enzym và hiệu suất thu nhận dịch quả
cũng như chất lượng dịch quả.
Tùy theo tính chất cơ lý và đặc điểm cấu tạo của từng loại quả người ta chọn
những phương pháp xử lý quả thích hợp như nghiền cắt, chà hay xé nhỏ.
Khi thực hiện một trong những phương pháp cơ học trên, một số tế bào bị phá
hủy, mất tính chất bán thấm, do đó việc chọn phương pháp cơ học làm nhỏ quả phù hợp
với từng loại quả rất có ý nghĩa công nghệ.
1.4-Ứng dụng chế phẩm pectinase trong sản xuất nước quả
Từ các loại quả khác nhau, người ta thường chế biến thành các dạng nước quả
trong, nước quả đục và phẩm, trước tiên phải chiết rút được dịch quả từ mô cơ bản, mô bì
đôi khi mô cơ học nữa. Do đó, hiệu suất chiết rút dịch quả sẽ phụ thuộc vào khả năng
thấm của tế bào, cấu tạo giải phẩu và tính chất cơ lý của nguyên liệu, độ nhớt của chính
dịch quả, độ chắc của thịt quả, cũng như thành phần định tính và định lượng của pectin
chứa trong dịch bào và trong thành tế bào của mô quả.
Để sử dụng vào việc chế biến nước quả trong thì chế phẩm pectinase phải có
enzym endo và exo-polygalacturonse, enzym pectinesterase và proteinaza. Trong chế
phẩm loại này thì những enzym vừa kể trên là những enzym quyết định hiệu quả tác
dụng của chế phẩm. Vì endo và exo-PG sẽ làm giảm độ nhớt của dịch quả; còn enzym
PE cũng góp phần vào tác dụng của enzym này. Enzym proteinase của chế phẩm sẽ thủy
phân vỏ protein của vỏ nguyên sinh tế bào, kết quả là làm cho sự thoát của dịch quả dễ
dàng. Sự có mặt của xenluase và hemixenlulase ở trong chế phẩm cũng tốt nhưng không
bắt buộc. Khi sử dụng cho các loại quả như táo, lê thì trong chế phẩm không được phép
có enzym pectinaseliminase, và enzym này sẽ phân hủy protopectin vốn gắn các tế bào

Hán Thị Hương - Lớp Cao học K14

24


Tiểu Luận
riêng biệt của mô quả lại với nhau, do đó gây mủn hoá mô quả, làm tăng độ nhớt của
dịch quả và kết quả là làm giảm hiệu suất dịch quả. Ngược lại, khi sử dụng cho các loại
quả mọng như dâu tây thì sự có mặt trong chế phẩm enzym PTE lại cần thiết vì enzym
này sẽ làm mủn hoá tế bào làm cho tính chất thoát nước của tế bào tăng lên còn độ nhớt
của dịch quả lại giảm xuống.
Ngoài ra, đối với các chế phẩm pectinase dùng trong sản xuất nước quả trong
cũng không được phép có các enzym oxydase (ascohatoxydase, poliphenoloxydase).
Trong chế biến nước quả có thịt thì các enzym PTE, hemixenlulase và xenlulase
lại là những enzym quyết định hiệu quả tác dụng của chế phẩm. Trong đó vai trò dẫn
động là enzym PTE có tác dụng phân hủy protopectin của mô quả. Hemixenlulase và
xenlulase sẽ cùng với PTE làm cho độ đồng thể của nước quả có thịt tốt hơn. Trong
trường hợp này sự có mặt trong chế phẩm enzym PG đặc biệt là endo-PG là không cho
phép vì lẽ độ đồng thể của nước quả sẽ phụ thuộc vào độ nghiền mịn của mô quả và độ
nhớt của dịch quả. Trong chế phẩm loại này có mặt proteinase cũng tốt nhưng không bắt
buộc. Ngoài ra khi dùng các nguyên liệu có màu sáng thì trong chế phẩm không được
chứa enzym oxi hoá, còn cho các nguyên liệu có carotenoid và antoxian thì không được
chứa enzym phá hủy các chất này.
Để thu được nước quả, trong trường hợp có sử dụng enzym pectinase, người ta
cũng phải nghiền nhỏ nguyên liệu quả. Bã nghiền nhận được đem xử lý bằng enzym, sau
đó mới đem ép hoặc ly tâm. Trong trường hợp có sử dụng enzym, người ta có thể nghiền
nhỏ tới mức tối đa, cốt sao thuận lợi cho tác dụng của enzym mà khôpng sợ bị tắc nghẽn
kênh dẫn dịch quả trong quá trình ép sau này. Vì lẽ sau khi đã kinh qua tác dụng của
enzym, dịch quả dễ dàng thoát ra khỏi bã nghiền, nên khi ép hoặc ly tâm, chỉ làm công
việc tách dịch khỏi các tiểu phần của mô quả mà thôi.
Thực tế sản xuất đã chứng tỏ khi xử lý bã táo nghiền bằng 0,03% chế phẩm
pectinase hiệu suất của dịch quả được nâng lên từ 20-25%. Hoặc khi thu nước nho mà
không sử dụng chế phẩm pectinase thì hiệu suất dịch chỉ đạt được tối đa là 65% so với

Hán Thị Hương - Lớp Cao học K14

25


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×