Tải bản đầy đủ

Phương pháp điện di

Phương Pháp Điện Di

(Electrophoresis)
PGS.TS. Nguyễn Đức Tuấn

Bộ môn Phân Tích – Kiểm Nghiệm
Khoa Dược – Đại học Y Dược TPHCM

Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Phương Pháp Điện Di
Mục tiêu

- Hiểu được nguyên tắc hoạt động của điện di mao quản
Dàn bài

- Lòch sử
- Đònh nghóa

- Phân loại
- Điện di mao quản

Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Lòch sử
1791
1877
1897
1897
1923
1930
1939
1950
1955
1958
1967
1967
1969
1969
1970
1970
1972
1979
1981

Faraday
Helmholtz
Nernst
Kohlrausch
Kendall, Crittenden
Tiselius
Svenson
Haglund, Tiselius
Smithies
Hjertén
Martin, Everaerts


Hjertén
Giddings
Virtanen
Everaerts,
Arlinger, Routs
Verheggen
Mikkers
Jorgenson

1984 Terabe
1991 Jandik, Jones
1991 Knox

Nguyễn Đức Tuấn

Laws of Electrolysis
Charged Solvent Layer Closed to Surface of a Wall
Properties of Small Ions
Kohlrausch Function describing the Order of Migration of Ions and their Concentration
Rare Earth Metal Separation by "Ion Migraion Method"
Thesis: Moving Boundary Method for Electrophoresis of Proteins (Nobel Price 1948)
Development of Zone and Displacement Electrophoresis
Electrophoresis Tube filled with Glass Beads and Glass Powder
Gel Electrophoresis
Electrophoresis in Free Solution
Displacement Electrophoresis in Glass Tube with Hydroxyethylcellulose
Elimination of Electroosmosis by Coating of Glass Tubes
Non-Diffusional Model of Concentration Distribution in Free Zone Electrophoresis
Glass Capillaries 0.2 - 0.5 mm I.D.
Capillary Isotachophoresis
UV-Detection
Conductivity Detection
Use of High Voltage and TEFLON Capillaries
Use of 75 µm I.D. Open Tubular Glass Capillaries:
"High Performance Capillary Electrophoresis – HPCE"
Combination of electrophoretic and chromatographic Separation:
"Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography – MECC"
Use of Surface Active Electrolyte Additives for Reversal of Electroosmotic Flow
"Capillary Electrochromatography – CEC"

Đại học Y Dược TPHCM


Anion hữu cơ và vô cơ
4

Standard
1...thiosulfate

16..phosphite

2...bromide

17..chlorite

3...chloride

18..galacturate

4...sulfate

19..carnonate

5...nitrite
6...nitrate

20..acetate
21..ethanesulfonate

7...molybdate

22..propionate

8...azide
9...tungstate

23..propanesulfonate
24..butyrate

3
5

8
67
2
1

13
9

10
10

14

11

16
17
15

20

18

22
19

21

12

1.5min

Nguyễn Đức Tuấn

23

24
25

26
28
27

89 seconds

30
29

3.1min

10.fluorophosphate 25..butyrsulfonate
11..chlorate
26..valerate
12..citrate
27..benzoate
13..fluoride
28..glutamate
14..formate
29..pentanesulfonate
15..phospahate
30..D-gluconate

Đại học Y Dược TPHCM


Đònh nghóa
 Quá trình tách các tiểu phân đã ion hóa và hòa tan hay
phân tán trong dung dòch điện giải dưới tác dụng của điện
trường
 Độ dòch chuyển điện di (linh độ điện di: electrophoretic
mobility, EP) phụ thuộc:
 Bản chất tiểu phân: hình dạng, kích thước, điện tích
 Dung dòch điện giải: bản chất, nồng độ, pH, độ nhớt,….

Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Đònh nghóa
 Chiều chuyển dòch các ion phụ thuộc vào điện tích của nó



B


ep (B)

Nguyễn Đức Tuấn

ep (A)

A

 ep(C)

+
D
+

+
C
+

 ep(D)

Đại học Y Dược TPHCM


Phân loại
 Điện di dung dòch tự do (Moving
Boundary Electrophoresis)

-

+

 Không dùng chất mang
 EP phụ thuộc vào điện trường E,
bản chất tiểu phân
 Xác đònh các chất có PTL lớn và
ít khuếch tán

 Kiểm tra độ tinh khiết protein

Nguyễn Đức Tuấn

Moving Boundary
Electrophoresis

Đại học Y Dược TPHCM


Phân loại
 Điện di vệt (điện di vùng:
Zone Electrophoresis)

 Sử dụng chất mang:
giấy, cellulose acetat, gel
agar, gel polyacrylamid
 EP phụ thuộc vào E, bản
chất tiểu phân, dòng bay
hơi (nhiệt Joule), dung
dòch điện giải
 Tách các chất có PTL
nhỏ và kích thước nhỏ,
lượng mẫu ít
Nguyễn Đức Tuấn

Điện di trên gel

Đại học Y Dược TPHCM


Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis)
Capillary
Detector
UV, Fluorescence (direct,
indirect); electrochemical
conductometric
MS

o.d. 200-400µm
i.d. 5-100µm (2µm)
Fused Silica, Teflon
coated (RP, Ion exchange)
or filled (RP, ...)

Pt Electrodes
Separation Electrolyte

Injection

Salt solution (borate,
phosphate); pH 1-12
organic solvent
(0-100%)

hydrostatic,
vacuum,
electromigrative

0-±30 kV
5-150 A

Data Processing

High Voltage Power Supply

Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Điện di mao quản
363µm

a)
12µm 50µm

b)

Fused Silica Capillary

I [µA]

300

Liquid cooling
10m/s air cooling
w/o cooling

250
200

Hydrodynamic flow profile and
chromatographic peak form
a) pressure driven
b) electroosmosis

150

100
50
0

0

10

20

30

U [kV]

Ohm's Law: U=R.I
Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Dòng điện thẩm (Electroosmotic Flow)
Solvated Cations

+ +

Electrolyte

Capillary

+
+

+

Solvated Anions
(van der Waals)
oriented and nonoriented water molecules

r

  Y1  Y2 



eof

4e



Origin of Electroosmotic Flow:
a) Formation of negatively charged silica-surface
b) Hydrated cations at surface
c) Bulk flow of whole capillary contents towards cathode
after application of electric field
Nguyễn Đức Tuấn

 Si-O-

Electroosmotic
 = Zeta-Potential [V]
mobility

outer Helmholtz-Layer (diffuse)
inner Helmholtz-Layer (adsorbed, rigid)

Y2

Hydrolysis:

Silanol groups in fused silica capillaries

+

+

Y1

sekundary
tertiary
primary
H H
HH H
H
H H
O O
OOO
O
O
O
O Si
O Si O
O Si
Si
O Si
O
O
O

Y1 = Stern-Potential [V]
Y2 = Potential of bulk solution [V]
µeof = Mobility of EOF [cm2V-1sec-1]
 = Dielectricity constant of electrolyte
 = Viscosity of electrolyte





Thickness of
Layer


 .k .T

1000.N A .e 2 . zi2 .ci
i

 = Thickness of Layer
 = dielectricity constant
k = Boltzmann-constant
T = temperature
NA = Avogadro-constant
e = charge per unit surface area
z = charge of ion
c = molar concentration

Đại học Y Dược TPHCM


Linh độ điện di (Electrophoretic Mobility)
Mobility in Infinitely Diluted Solutions
ep 
Overlay of Migration of Charged Ions and Molecules
with EOF
a) Cations to Cathode (Detection before EOF).
b) Neutral Moleculese (Detection together EOF).
c) Anions to Anode (Detection for |µAnion| < |µeof| after EOF;
no Detection for |µAnion| > |µeof |)
C+:

N

Cations
Trimethylphenylammonium bromide
Histamine
4-Aminopyridine

A-

C+

N: Neutral Molecules
Benzylalcohol
Phenol

0

1

2

3

Nguyễn Đức Tuấn

4

5

electric Force ( FE )
frictional Force ( FF )

F  6r

F  qE
E

F

ep

qE  6r ep
 
ep

 
ep



qE
6r

ep

E



q
6r

A-: Anions
Syringaldehyde
2-(p-Hydroxyphenyl)acetic acid
Benzoic acid
Vanillic acid
4-Hydroxybenzoic acid

Đại học Y Dược TPHCM


% ion hóa

Linh độ điện di (Electrophoretic Mobility)

Dissociation of Weak Electrolytes
Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Nguyên tắc của điện di mao quản vùng
(Capillary Zone Electrophoresis, CZE)

electroosmotic
flow

very important
parameter!

µeof
µ+ep

µ-ep

-

obs(A

-

N

+
+

)

= EOF +

electrophoretic
mobility

+

cations from the
electrolyte

A+ B+

EP(A+)

EOF

obs(C-) = EOF - EP(C-)
obs(N) = EOF

C- D-

0

1

2

3

4

5 (t) 6


Separation principle of MEKC
capillary wall

µEOF

µmicelle

µobs (M)

µep+eof (A+)

µep (A+)
µep(A+solub)

µobs (A+)
µobs (C)

µep (B-)

µobs (B-) = µep+eof (B-)
+
C A

B-

B-

C
A+

M

EOF

SDS
0

1

2

3

4

5 (t) 6


Thông số thực nghiệm trong CE
Analyte

molecular weight,
structure
geometry

pKA

Electrolyte

effective
charge

ionic strength

solvation
adsorption

ep 

pH
 wall

q
6 r

viscosity 
permittivity 

eof 




ep = µep.E

tot = eof + ep

eof = µeof.E

capillary wall

Instrument

capillary length

field strength
E=V/L

high voltage V
Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Carbohydrat
3
1

EOF

1...mannuronic acid (n.a.)
2...glucuronic acid (3.20)
3...galacturonic acid (3.48)
4...gluconic acid (3.76)
5...N-acetylneuraminic acid (2.60)
6...fructose (12.03)
7...rhamnose (n.a.)
8...glucose (12.35)
9...galactose (12.35)
10...2-deoxy-D-ribose (12.65)
11...sucrose (12.51)

2

4

5

67

9 10

A. Zemann, D.T. Nguyen,
G. Bonn
Electrophoresis 18 (1997) 1142

11
8

Conditions:

1.5

2.0

Nguyễn Đức Tuấn

2.5

3.0

3.5

min

Capillary: uncoated fused silica, i.d. 50M;
L=32cm, l=24.5cm; Electrolyte: 6mM sorbate,
0.001% HDB, pH12.1; Injection: 3sec
hydrostatic (10cm); Detection: indirect UV @
254nm; Instrumentation: WATERS Quanta
4000; U=-10kV, I=29,2A, T=amb.

Đại học Y Dược TPHCM


Carbohydrat
EOF

EOF
1

1

indirect UV detection
analysis of soft drinks

EOF

3
1

2

1..... fructose
2.....

glucose

2 3

3.....
sucrose

A. Zemann, D.T. Nguyen,
G. Bonn
Electrophoresis 18 (1997) 1142

2

Coca Cola

Orange Juice

Conditions:
3

Apple Juice
45

Nguyễn Đức Tuấn

60

75 sec 90

Capillary: uncoated fused silica, i.d. 50M;
L=32cm, l=24.5cm; Electrolyte: 6mM sorbate,
0.001% HDB, pH11.9; Injection: 3sec
hydrostatic (10cm); Detection: indirect
UV@254nm; Instrumentation: WATERS
Quanta 4000; U=-22kV, I=34,4A, T=amb.

Đại học Y Dược TPHCM


Acid amin
counter-electroosmotic CE
nA

Conditions:

1
5

Capillary: 20 µm I.D.; 375 µm
O.D.; l=60 cm; U=30 kV; I=1.3
µA

260
4
2

BGE: 3 mM Tetraborate,
pH 10.5

6

240

Injection: 20 kPa, 7 sec
Detection: amperometric;
Coated-Wire-Cu-Electrode;
U=+1125 mV

220

Sample Concentration: 100 ppm

3

1...Arginine
2...Lysine
3...Proline
4...Histidine
5...Threonine
6...Tyrosine

200

1.0

1.5

Nguyễn Đức Tuấn

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5 min 5.0

Đại học Y Dược TPHCM


Hợp chất carbonyl
-109,44

-110,00

-110,50

-111,00

-111,50

-112,00

-112,50

Capillary, I.D. 50 µm, L=60 cm,
leff=52.5 cm

6

Electrolyte, 20 mM borate, 0.001%
HDB, pH=11.5, 45% acetonitrile,
Detection, UV @ 254 nm
Peak assignments:
1... formaldehyde
2... acetaldehyde
3... benzaldehyde
4... crotonaldehyde
5... m-tolualdehyde
6... acetaldehyde
7... propioaldehyde
8... butyraldehyde
9... valeraldehyde
10... hexaldehyde
11... acetone
12... butanone

1

2

4
11

3

7
5

8
910

12

-113,00

-113,50

2.0

Nguyễn Đức Tuấn

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

min

5.0

Đại học Y Dược TPHCM


Anion hữu cơ và vô cơ
4

Standard
1...thiosulfate

16..phosphite

2...bromide

17..chlorite

3...chloride

18..galacturate

4...sulfate

19..carnonate

5...nitrite
6...nitrate

20..acetate
21..ethanesulfonate

7...molybdate

22..propionate

8...azide
9...tungstate

23..propanesulfonate
24..butyrate

3
5

8
67
2
1

13
9

10
10

14

11

16
17
15

20

18

22
19

21

12

1.5min

Nguyễn Đức Tuấn

23

24
25

26
28
27

89 seconds

30
29

3.1min

10.fluorophosphate 25..butyrsulfonate
11..chlorate
26..valerate
12..citrate
27..benzoate
13..fluoride
28..glutamate
14..formate
29..pentanesulfonate
15..phospahate
30..D-gluconate

Đại học Y Dược TPHCM


Các thuốc kháng HIV
protease inhibitors
mAU (195nm)

EOF

IDV

4
SQV

Capillary, L=48.5 cm, leff=40 cm, 50
µm; electrolyte, 16 mM phosphate,
0.001% HDB, pH 2.5

NFV

Injection, 20 sec @ 10 mbar; standard
concentration, 5 ppm;

3
AMP

Separation, -30 kV
RTV

Detection, UV @ 195 ± 5 nm (bubble
cell 200 µm).

2

AMP...amprenavir; RTV...ritonavir;
SQV...saquinavir; NFV...nelfinavir;
IDV...indinavir

1

Nguyen D.T., A. Zemann
J. Chromatogr. A, 922
(2001) 313 – 320

0
1

Nguyễn Đức Tuấn

2

3

4

5

min

6

Đại học Y Dược TPHCM


Các thuốc kháng HIV
protease and reverse transcriptase inhibitors
20

Capillary, L=42.5 cm, leff=34 cm,
i.d.=50 µm
Electrolyte, 16 mM H3PO4,
0.001% HDB, pH 2.2

mAU
16

285 nm

Injection, 20 sec @ 10 mbar;
standard concentration, 5 ppm;
Separation, U=-30 kV
Detection, UV (bubble cell 200
µm).

12

240 nm
8
EOF

NVP

AMP

NFV
SQV

4

DLV

NVP...nevirapine; DLV...delavirdine;
ABC...abacavir; 3TC...lamivudine;
DDC...zalcitabine

ABC
IDV
3TC DDC

RTV

AMP...amprenavir; RTV...ritonavir;
SQV...saquinavir; NFV...nelfinavir ;
IDV...indinavir

195 nm
D.T. Nguyen, A. Zemann
Journal of Chromatography A,
982 (2002) 153 – 161.

0
1

2

Nguyễn Đức Tuấn

3

4

5

6

7

8

min

Đại học Y Dược TPHCM


Group 1: Chemical structure of CDs
• ACE inhibitors
COOH

O
HS

Captopril
(CAP)

N
CH3
H
N

H3C

• Diuretics

O

O
H
N

O

COOH
N

CH3

O

Enalapril
(ENA)
COOH

N

HOOC
H2 N

Lisinopril
(LI)

O O
S
H2N
Cl

O O
S
NH
N
H

Hydrochlorothiazide
(HCT)
O O
S
H2N
Cl

COOH
N
H

O

Furosemide
(FURO)


Group 1: ACE inhibitors and diuretics
• Optimized electrophoretic conditions
mAU
12
10
8
6
4
2
0
240

260

280

300

320

340

nm

HCT
LI
ENA
FURO
CAP

Electrophoretic conditions: 60 mM orate buffer at pH 8.6;
fused-silica capillary (57 cm x 50 m i.d., 48.5 cm); injection:
5s at 50 mbar; 18 kV; 25oC; detection wavelength: 214 nm


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×