Tải bản đầy đủ

Hóa phân tích quang phổ huỳnh quang

CHỈ SỐ KHÚC XA

QUANG PHỔ PHÁT XẠ PHÂN TỬ
(F.S - Fluorescence spectrophotometry)

QUANG PHỔ PHÁT XẠ PHÂN TỬ
(F.S - Fluorescence spectrophotometry)

MỤC TIÊU:
- Trình bày được cơ chế của qúa trình phát huỳnh quang
của phân tử.
- Nêu được cấu hình máy quang phổ huỳnh quang.
- Nêu được ứng dụng và cách đọc phổ huỳnh quang.

PHÂN TỬ

HẤP THU

UV-VIS

PHÁT XẠ


F.S

I.R

QUANG PHỔ PHÁT XẠ PHÂN TỬ
(F.S - Fluorescence spectrophotometry)

QUANG PHỔ PHÁT XẠ PHÂN TỬ
(F.S - Fluorescence spectrophotometry)
Electron ở trạng thái kích thích có thể ở trạng thái đơn (singlet) hay
trạng thái ba (triplet).
• Trạng thái đơn (singlet): electron ở trạng thái kích thích có spin
đối song với electron ở trạng thái cơ bản, có độ bội
M = 2S + 1 = 2(-1/2+1/2) + 1 = 1 (singlet)
• Trạng thái ba (triplet): chúng có spin song song và độ bội
M = 2S + 1 = 2(1/2+1/2) + 1 = 3 (Triplet)
Theo định luật Hund, electron singlet có mức năng lượng cao hơn
electron triplet

1


CHÆ SOÁ KHUÙC XA

1. Các phân tử hấp thu photon ánh sáng trong
vùng UV-VIS mà không phát quang: phân tử
chuyển từ trạng thái năng lượng cơ bản đơn
(Singlet) S0 sang trạng thái năng lượng kích thích
đơn (Singlet) S1 rồi trở về trạng thái cơ bản mà
không phát xạ (quá trình khử hoạt hay quá trình
phục hồi không bức xa), năng lượng dư được
chuyển thành nhiệt năng cho môi trường.

2. Các phân tử có tính chất phát huỳnh quang :
Khi hấp thu bức xạ l1 trong vùng UV-VIS, phân tử sẽ
chuyển từ trạng thái năng lượng cơ bản S0 sang trạng
thái năng lượng kích thích đơn (Singlet) S1 rồi từ mức
năng lượng cao nhất của trạng thái kích thích đơn trở
về mức năng lượng thấp nhất của trạng thái kích thích


đơn, giải phóng một phần năng lượng do sự TỰ VA
CHẠM, gọi là quá trình bất hoạt hay dao động hồi phục.

2


CHÆ SOÁ KHUÙC XA

 Quá trình chuyển nội hệ : khi electron trở về trạng thái
cơ bản S0 làm phân tử phát bức xạ huỳnh quang l3 do
sự giải phóng năng lượng còn lại. Sự phát huỳnh
quang mất đi sau khi tắt nguồn kích thích (10-8 s). Năng
lượng phát huỳnh quang luôn luôn thấp hơn năng
lượng kích thích (một phần năng lượng mất đi do sự
TỰ va chạm), nghĩa là :
EPX < EKT hay

l3 > l1
lPX > lKT (ĐL Stokes)

3. Các phân tử có tính chất phát lân quang :

3. Các phân tử có tính chất phát lân quang :

• Quá trình vượt nội hệ: electron ở trạng thái năng

• Quá trình chuyển nội hệ: electron Triplet trở về trạng

lượng kích thích đơn (Singlet) S1 chuyển sang trạng thái

thái cơ bản S0 phát bức xạ l4 với bước sóng dài hơn

năng lượng kích thích ba (Triplet) T1 (có mức năng

bức xạ kích thích và bức xạ huỳnh quang. Sự phát bức

lượng thấp hơn)

xạ kiểu này gọi là sự phát lân quang, thời gian phát lân
quang rất dài sau khi tắt nguồn bức xạ kích thích (10-4 –
101 s hoặc dài hơn). Sự phát lân quang chỉ xảy ra ở môi
trường rắn và nhiệt độ thấp.

3


CHỈ SỐ KHÚC XA

ĐỊNH LUẬT BEER TRONG SỰ PHÁT HUỲNH QUANG
 Hiệu suất lượng tử huỳnh quang F là tỉ số giữa số phân tử phát

huỳnh quang và tổng số phân tử bị kích thích:
F = Số phân tử phát huỳnh quang / tổng số phân tử bị kích thích
 Cường độ phát xạ huỳnh quang IF tỉ lệ với :
- hiệu suất lượng tử huỳnh quang F
- cường độ bức xạ kích thích bị hấp thu bởi mẫu = Io – It
IF = F (Io – It)
= F.Io(1 – It / Io) = F.Io (1 – T)

Mà: A = -logT = e.C.l
T = 10

IF = F.Io (1 – 10 -e.C.l)
IF = F.Io.(e.C.l ) [1 –

(e.C.l)2

/ 2! +

(e.C.l)3

/ 3! +

(e.C.l)n/

-e.C.l

n!]

Trường hợp dung địch rất lỗng (C rất nhỏ), thì e.C.l rất nhỏ, do
đó có thể viết phương trình trên rút gọn lại như sau :
Nguồn: Quantitative chemical analysis, Daniel C. Harris, 2 nd Ed., Freeman

ĐỊNH LUẬT BEER TRONG SỰ PHÁT HUỲNH QUANG

IF = F.Io.(e.C.l ) = k’.Io.C
(3)
k’ = F. e.l
 Cường độ bức xạ huỳnh quang IF phụ thuộc tuyến tính vào
cường độ bức xạ kích thích Io
 Tăng độ nhạy khi tăng cường độ bức xạ kích thích (dùng đèn
cơng suất lớn) để cho tỷ số tín hiệu/nhiễu lớn,
 Tín hiệu huỳnh quang khơng được đo theo giá trị tuyệt đối mà
chỉ biểu thị theo nghĩa huỳnh quang tương đối, nghĩa là so sánh tín
hiệu huỳnh quang của chuẩn và thử

IF = F.Io.(e.C.l ) (3)

LIÊN QUAN CẤU TRÚC VÀ TÍNH PHÁT HUỲNH QUANG
• Các chất vơ cơ, các hydrocarbon no khơng hấp thu ánh sáng

UV-VIS khơng có tính phát huỳnh quang, trừ một số ngun tố đất
hiếm và các Lantanit.
• Các hydrocarbon thơm có hệ liên hợp - có khả năng phát
huỳnh quang, trong đó các hợp chất thơm đa vòng ngưng tụ phát
huỳnh quang mạnh hơn benzen (bước chuyển p*  p).
• Các nhóm chức cho điện tử làm tăng hiệu suất huỳnh quang (OH, NH2 , alkyl, aryl…), các nhóm chức hút điện tử làm giảm hiệu
suất huỳnh quang ( halogen, NO2 , NH3+, COOH…).
NH2

NH3

O

O
N

Nguồn: các phương pháp phân tích Vật
lý & Hoá lý - Nguyễn Đình Triệu

4


CHỈ SỐ KHÚC XA

LIÊN QUAN CẤU TRÚC VÀ TÍNH PHÁT HUỲNH QUANG

 Các phân tử dị vòng đơn khơng phát huỳnh quang .
O

S

furan

thiophen

H
N

N

pyrol

pyridin

 Hệ vòng ngưng tụ của các dị vòng có hệ số hấp thụ cao hơn và
thời gian sống của trạng thái kích thích ngắn hơn so với các dị vòng
đơn nên khả năng phát huỳnh quang cao hơn.
N
N

N
H

LIÊN QUAN CẤU TRÚC VÀ TÍNH PHÁT HUỲNH QUANG

 Các phân tử có cấu tạo cứng nhắc có khả năng phát huỳnh
quang cao hơn các phân tử có cùng khung cấu trúc nhưng quay tự
do quanh liên kết C-C..
Φbiphenyl = 0,2
Φfloren = 1
biphenyl

quinolin

Indol

>

CH2

isoquinolin

LIÊN QUAN CẤU TRÚC VÀ TÍNH PHÁT HUỲNH QUANG

• Thay đổi hố học
Adrenaline



adrenochrome

Thiamin



thiochrome



Thay đổi dung mơi:



Thay đổi pH:

Floren
O
O

-

O

O

O

C
COO-

pH= 7, phenol, anisol phát quang

COO-

Florescen
Phenolphtalein

pH= 12, phenolat khơng phát quang
OH

OCH3

Phổ phát xạ của 6-bromoacetyl-2dimethylaminonapthalen (lKT 380 nm)

N

O
Zn

-

N

N

O

OH

8-oxyquinolin

phức Zn 8-oxyquinolin

phenol

anisol

5


CHỈ SỐ KHÚC XA

LIÊN QUAN CẤU TRÚC VÀ TÍNH PHÁT HUỲNH QUANG

CÁC YẾU TỐ KHÁC ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ PHÁT HUỲNH QUANG

• Quencher: chất làm tắt huỳnh quang
Phản ứng giữa chất phát huỳnh quang và Quencher
được giải thích là do sự va chạm giữa phân tử ở trạng thái
kích thích và Quencher.
Đây là tính đặc hiệu của hợp chất phát huỳnh quang
được ứng dụng trong định tính và định lượng

Sự phân cực
Liên kết
hydro

Điện
thế
Phân tử phát
huỳnh quang
Quencher

Áp suất
Nhiệt độ

CÁC YẾU TỐ KHÁC ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ PHÁT HUỲNH QUANG

Độ nhớt

MÁY QUANG PHỔ HUỲNH QUANG

• Nhiệt độ và dung mơi

Hiệu suất lượng tử của sự phát huỳnh quang bị giảm khi
nhiệt độ tăng (tần số va chạm tăng) làm cho khả năng khử hoạt
thuận lợi hơn.
Dung mơi chứa kim loại nặng, cũng làm giảm sự phát huỳnh
quang của phân tử.

(3)
(1)

(2)

(4)
(6)
(5)

• Oxy khơng hòa tan

Oxy khơng hòa tan thường làm giảm cường độ phát huỳnh
quang trong dung dịch. Hiệu ứng này có thể do sự oxi hóa cảm ứng
quang hóa của vật phát huỳnh quang hoặc do tính thuận từ của oxi
phân tử (số proton và số neutron cùng chẵn) đã chuyển hóa phân
tử bị kích thích sang trạng thái ba (triplet).

 Nguồn sáng
Có cường độ mạnh hơn nguồn sáng trong quang phổ hấp thu UV.
Đèn hồ quang thủy ngân phát xạ các vạch phổ ở 254, 366, 405, 436, 546,
577, 691 và 773 nm (HQ kế)
Đèn hồ quang xenon áp suất cao, phát bức xạ liên tục từ 300 – 1300 nm,
công suất mạnh từ 75 – 450 W (QP HQ)

6


CHỈ SỐ KHÚC XA

MÁY QUANG PHỔ HUỲNH QUANG

MÁY QUANG PHỔ HUỲNH QUANG
 Bộ tạo đơn sắc

• Kính lọc hấp thụ và
kính lọc giao thoa
trong huynh quang
kế
• Cách
tử
1200
vạch/mm
trong
quang phổ huỳnh
quang.
Có hai bộ tạo đơn
sắc dùng cho nguồn
sáng kích thích và
dùng cho bức xạ
huỳnh quang
Nguồn: các phương pháp phân tích Vật lý & Hoá lý - Nguyễn Đình Triệu

MÁY QUANG PHỔ HUỲNH QUANG

Nguồn: các phương pháp phân tích Vật lý & Hoá lý - Nguyễn Đình Triệu

MÁY QUANG PHỔ HUỲNH QUANG
 Detector

• Đặt vng góc với
tia kích thích nên
chỉ có 1 phần bức
xạ huỳnh quang đến
được detector,
• Detector có độ
nhạy cao, thường
dùng
ống
nhân
quang
điện
(photomultiplier) hay
detector dãy diode
quang (Diode array)
cho
quang
phổ
huỳnh
quang
3
chiều.

 Cốc đo (cuvette)

Hình trụ tròn (HQ
kế) hay chữ nhật
(QP HQ) bằng thủy
tinh hay bằng silic
oxit
tinh
khiết
(thạch anh
Vị trí của cuvet
trong máy được đặt
sao cho nằm trên
đường đi của tia
kích thích.
Nguồn: các phương pháp phân tích Vật lý & Hoá lý - Nguyễn Đình Triệu

Nguồn: các phương pháp phân tích Vật lý & Hoá lý - Nguyễn Đình Triệu

7


CHặ SO KHUC XA

ệNG DUẽNG

nh tớnh :

lKT = ?

PHN TCH HUNH QUANG CC HP CHT Vễ C
lBX = ?

nh lng : so sỏnh cng phỏt quang tng i
gia mu chun v mu th.
Cng phỏt quang tng i thay i theo mụi
trng o, nờn mụi trng o phi tht n nh (nhit o
n nh, dung mụi tinh khit quang hc, mỏy phi chun
hoỏ thng xuyờn vi cht chun)
Phõn tớch hunh quang cỏc hp cht vụ c
Da trờn vic to ra cỏc phc cht chelat ca cỏc
ion kim loi vi thuc th hu c ri o s phỏt hunh
quang ca chỳng

PHN TCH HUNH QUANG CC HP CHT Vễ C
Ag

2,3-napthotriazol
Eosin + 1,10-phenanthrolin
Acid 8-hydroxy-quinolin-5-sulfonic

0,02
0,004
0,01

Al

Acid 3-hydroxy-napthoic

0,0002

Cu

2-amino-1-propen
Thiamin

0,01
3,0

Fe

Luminol + H2O2

0,0008

Hg

Rhodamin B

0,002

Mg

N,N-bissalicyliden-2,3-diaminobenzofuran

0,002

Mn
Zn

8-hydroxy-quinolin

0,002

g/ml

Mt s kim loi chuyn tip cú tớnh thun t (e- phõn
lp d cú spin song song) lm tng tc ca s giao
nhau gia cỏc h sang trng thỏi ba (triplet), dn n s
phỏt lõn quang
Thuc th o hunh quang phn ln cú cu to vũng
thm cha hai hoc nhiu nhúm chc cho electron d
to ra chelat vi cỏc ion kim loi
OH
N

OH

OH

HO
O

O
ON

N

N

OH
SO3Na

O

8-oxyquinolin

Flavanol

lizavin

benzoin

PHN TCH HUNH QUANG CC HP CHT Vễ C

Xỏc nh cỏc acid amin thm pH = 7
+ phenylalanin (Phe) cú lKT = 280 nm, lBX = 348 nm
+ tyrosin (Tyr) cú lKT = 274 nm, lBX = 303 nm
+ triptophan (Trp) cú lKT = 254 nm, lBX = 282 nm
Chuyờn lun trong USP XXIII
+ nh lng vitamin B1 : chuyn thnh thiochrome,
o hunh quang trong iso-BuOH vi lKT = 365 nm, lBX
= 450 nm

8


CHÆ SOÁ KHUÙC XA

PHÂN TÍCH HUỲNH QUANG CÁC HỢP CHẤT VÔ CƠ
CH2

N
H3C

N

CH3
N
S

NH2

K3[Fe(CN)6]

CH2CH2OH

OH-

CH2

N
H3C

N

N

CH3
N
S

CH2CH2OH

Chuyên luận trong USP XXIII
+ Định lượng vitamin B2 : đo huỳnh quang trong CH3COOH
0,02 M với lKT = 440 nm, lBX = 530 nm.

PHÂN TÍCH HUỲNH QUANG CÁC HỢP CHẤT VÔ CƠ
 Xét nghiệm sinh hoá
+ Định lượng phenothiazin trong nước tiểu, sau khi ly
trích, đo huỳnh quang trong môi trường H2SO4 0,02 M với
lKT = 310 nm, lBX = 460 nm
+ Định lượng salycylat trong máu, sau khi ly trích, đo
huỳnh quang trong môi trường kiềm với lKT = 370 nm, lBX
= 460 nm
 Miễn dịch huỳnh quang
+ Acridine là chất nền trong chẩn đoán các tổ chức bị ung
thư bằng kính hiển vi huỳnh quang

+ Định lượng reserpin trong HNO3 cho phát quang vàng với
lKT = 390 nm, lBX = 510 nm [Szalkowski và Mader ]
N

acridin

PHÉP ĐO QUANG PHỔ HUỲNH QUANG
• Định nghĩa
+

Phép đo quang phổ huỳnh quang là sự đo cường độ

phát quang tương đối (relative intensity) của một hợp chất
khi nó được kích thích bằng nguồn ánh sáng trong vùng
UV-VIS. Nguồn sáng kích thích và phát xạ có bước sóng
tuân theo định luật Stock và phương trình của cường độ
phát quang tương đối tuân theo phương trình:
IF = F.Io.(e.C.l )
Trong phép đo quang phổ huỳnh quang ta thu nhận
được 2 loại phổ : phổ kích thích và phổ huỳnh quang

PHÉP ĐO QUANG PHỔ HUỲNH QUANG
 Phổ kích thích
+ Đường biểu diễn sự phụ thuộc của cường độ phát quang
tương đối theo bước sóng của nguồn sáng kích thích :
IF = f(lKT).
+ Cố định bước sóng phát xạ (lBX) bằng cách chọn lBX trên bộ
tạo đơn sắc của nguồn phát xạ (phải có giá trị lớn hơn cho lKT)
và ghi phổ khi thay đổi bước sóng kích thích.
+ Bước sóng mà tại đó ta có IF lớn nhất là bước sóng kích thích
tối ưu của mẫu đo
 Phổ phát xạ
+ Đường biểu diễn sự phụ thuộc của cường độ phát quang
tương đối theo bước sóng của nguồn sáng phát xạ
IF = f(lBX)

9


CHÆ SOÁ KHUÙC XA

PHÉP ĐO QUANG PHỔ HUỲNH QUANG

PHÉP ĐO QUANG PHỔ HUỲNH QUANG

IF
Phổ kích thích

+ Cố định bước sóng kích thích (lKT) bằng cách chọn lKT trên
bộ tạo đơn sắc của nguồn kích thích (thông thường có giá trị
trong vùng 220 – 380 nm, hoặc dựa vào giá trị lKT đã biết
trước) và ghi phổ khi thay đổi bước sóng phát xạ.
+ Bước sóng mà tại đó ta có IF lớn nhất là bước sóng phát xạ
tối đa của mẫu đo

Phổ phát xạ

l
Đường biểu diễn sự phụ thuộc của cường độ phát quang
tương đối theo bước sóng của nguồn kích thích
IF = f(lKT) = F.Io.(e.C.l )

PHÉP ĐO QUANG PHỔ HUỲNH QUANG

lKT = 369 nm

Vit. B1 oxy hoá

lPX = 449 nm

PHÉP ĐO QUANG PHỔ HUỲNH QUANG

• Phổ huỳnh quang 3 chiều:
+ xác định lKT và lBX đồng thời trong một lần đo mà
không phải thăm dò trong 2 lần đo
+ Phổ đường viền:
+ Phổ 3D

10


CHặ SO KHUC XA

254

Traựi:ZnS, phaỷi: Sr aluminate

Trong toỏi

Trong toỏi sau 4
365

Kunzite phỏt quang UV
http://en.wikipedia.org/wiki/File:Phosphorescent.jpg#filelinks

11



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×