Tải bản đầy đủ

Nghiên cứu tạo chế phẩm kháng thể đa dòng nhận biết đặc hiệu kháng nguyên nang f1 của vi khuẩn dịch hạch yersinia pestic và ứng dụng tạo que thử phát hiện nhanh

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

MAI THỊ THU

NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM KHÁNG THỂ ĐA DÒNG NHẬN
BIẾT ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN NANG F1 CỦA VI KHUẨN
DỊCH HẠCH YERSINIA PESTIS VÀ ỨNG DỤNG TẠO QUE THỬ
PHÁT HIỆN NHANH

LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên
ngành: Vi Sinh vật học Mã số:
60420103

HÀ NỘI, 2017


2

LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn TS. Lê Quang Hòa, trưởng phòng Kỹ

thuật Gen, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học
Bách Khoa Hà Nội người thầy đã luôn hướng dẫn, giúp đỡ tôi thực hiện luận văn
này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo Viện Sinh thái và Tài nguyên
sinh vật/Viện hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, đã dạy dỗ, giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình học tập.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cấp Thủ trưởng và cán bộ phòng Sinh học,
Viện Hóa học - Môi trường Quân sự nơi tôi công tác, đặc biệt là đồng chí Nguyễn
Phượng Minh, chủ nhiệm đề tài:“Nghiên cứu chế tạo test phát hiện nhanh vi
khuẩn dịch hạch Yersinia pestis” đã cung cấp kinh phí, tạo mọi điều kiện để tôi
hoàn thành luận văn của mình.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn bạn bè và gia đình, những người đã luôn ủng hộ
tôi trong suốt thời gian qua!
Hà Nội, ngày 30 tháng 10 năm 2017
Học viên

Mai Thị Thu


MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG BIỂU, ĐỒ THỊ......................................................................5
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .....................................................................7
LỜI MỞ ĐẦU ...........................................................................................................8
CHƯƠNGI: TỔNG QUAN ...................................................................................10
I. Bệnh dịch hạch và nguyên nhân gây bệnh dịch hạch ...........................................10
I.1. Bệnh dịch hạch...................................................................................................10
I.2. Tình hình dịch hạch trên thế giới và Việt Nam .................................................11
I.2.1. Tình hình dịch hạch trên thế giới ....................................................................11
I.2.2. Tình hình dịch hạch tại Việt Nam...................................................................12
I.3. Biểu hiện của bệnh dịch hạch ............................................................................14
I.3.1. Dịch hạch thể hạch..........................................................................................14
I.3.2. Dịch hạch thể nhiễm trùng huyết ....................................................................16
I.3.3. Dịch hạch thể phổi ..........................................................................................17
I.4. Cơ chế lây lan bệnh dịch hạch và vi khuẩn Y. pestis .........................................18
I.4.1. Cơ chế lây truyền bệnh dịch hạch...................................................................18
I.4.2. Vi khuẩn gây bệnh dịch hạch Y. pestis ..........................................................20
I.5. Kháng nguyên nang F1 ......................................................................................22
I.5.1. Cấu trúc kháng nguyên nang F1 ....................................................................22
I.5.2. Tính chất của kháng nguyên nang F1 .............................................................23
I.6. Các phương pháp phân tích chẩn đoán kháng nguyên nang F1 của vi khuẩn


Y.pestis .....................................................................................................................23
I.6.1. Phương pháp miễn dịch .................................................................................23
I.6.2. Phương pháp sinh học phân tử........................................................................29
I.7. Sản xuất kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng...........................................................30
I.7.1. Định nghĩa IgY ...............................................................................................30
I.7.2. Sự hình thành kháng thể IgY ở gà ..................................................................30
I.7.3. Cấu trúc của kháng thể IgY ............................................................................31
I.8. Sản xuất kháng thể đơn dòng từ chuột thuần chủng BALB/c ...........................32


I.8.1. Khái niệm, ứng dụng của kháng thể đơn dòng ..............................................32
I.8.2. Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng .......................................................33
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....................36
II.1. Vật liệu nghiên cứu ..........................................................................................36
II.1.1. Động vật thí nghiệm ......................................................................................36
II.1.2. Hóa chất và vật tư tiêu hao ............................................................................36
II.1.3. Thiết bị...........................................................................................................36
II.2. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................37
II.2.1. Sản xuất kháng thể đa dòng IgY kháng F1 ...................................................37
II.2.2. Sản xuất kháng thể đơn dòng kháng F1 trên chuột BALB/c thuần chủng. ..41
II.2.3. Ứng dụng sản xuất que thử sắc ký miễn dịch kẹp đôi phát hiện nhanh
F1.......44
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .....................................................46
III.1. Sản xuất kháng thể IgY kháng F1 từ trứng gà ................................................46
III.1.1. Tạo kháng nguyên F1 dạng dung hợp với MBP (Maltose binding protein)
làm nguyên liệu cho phản ứng ELISA. ....................................................................46
III.1.2. Tối ưu hóa ELISA đánh giá hiệu giá kháng thể IgY kháng F1 ..................48
III.2. Tạo dòng tế bào lai có khả năng sản xuất kháng thể đơn dòng kháng F1 trên
chuột BALB/c thuần chủng......................................................................................52
III.2.1. Gây đáp ứng miễn dịch trên chuột BALB/c thuần chủng. ...........................52
III.2.2. Kết quả tạo tế bào lai tiết kháng thể kháng kháng nguyên F1 .....................54
II.3. Ứng dụng chế phẩm IgY tạo que thử sắc ký miễn dịch kẹp đôi phát hiện
nhanh F1. ..................................................................................................................56
III.3.1. Lựa chọn kháng thể IgY in lên vị trí vạch thử nghiệm. ..............................56
III.3.2. Ảnh hưởng của các loại màng Nitrocellulose đến cường độ tín hiệu vạch
thử nghiệm cố định IgY. ..........................................................................................58
III.3.3. Tối ưu hóa các điều kiện in kháng thể lên vạch kiểm chứng. ......................59
III.3.4. Tối ưu hóa các điều kiện in kháng thể IgY lên vạch thử nghiệm. ...............60
III. 4. Ứng dụng kháng thể đơn dòng thương mại sản xuất que thử. .......................63
III.4.1. Ảnh hưởng nồng độ G20 đến cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm. .....63
III.4.2. Ảnh hưởng của pH đến cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm. ...............64


III.4.3. Ảnh hưởng của nồng độ Isopropanol đến cường độ tín hiệu trên vạch thử
nghiệm. .....................................................................................................................65
III.4.4. Xác định độ nhạy của que thử với chế phẩm thương mại G20....................65
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...............................................................................67
TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................69


DANH MỤC BẢNG BIỂU, ĐỒ THỊ
Hình 1.1: Tình hình dịch hạch trên thế giới từ năm 1954 – 2001
Hình 1.2: Số mắc/chết dịch hạch ở Việt Nam từ năm 1976-2002
Hình 1.3: Số bệnh nhân dịch hạch ở Việt Nam so với thế giới, 1954-2001
Hình 1.4: Bệnh nhân mắc bệnh dịch hạch
Hình 1.5: Sơ đồ lây lan bệnh dịch hạch
Hình 1.6: Hình ảnh Y. pestis bắt màu đậm 2 đầu khi nhuộm Wayson
Hình 1.7: Mô hình lắp ráp các thành phần của bộ kit ICT(I) và đánh giá kết quả (II)
Hình 1.8: Quá trình chuyển IgY vào lòng đỏ trứng
Hình 1.9: Cấu tạo kháng thể IgG và IgY
Hình 1.10: Qui trình sản xuất kháng thể đơn dòng
Hình 2.1: Gây miễn dịch trên chuột với kháng nguyên F1
Hình 3.1: Phổ điện di các phân đoạn rửa giải trong quá trình tinh sạch kháng
nguyên F1 tái tổ hợp từ cấu trúc pET22b-(His)10-MBP-F1
Hình 3.2: Xác định độ pha loãng của kháng thể kháng IgY gắn HRP
Hình 3.3: Xác định độ pha loãng của kháng thể IgY kháng F1
Hình 3.4: Ảnh hưởng của thời gian thu trứng lên hiệu giá của chế phẩm IgY
Hình 3.5: Hiệu giá kháng thể của chế phẩm IgY từ trứng thu tại thời điểm 30, 35
ngày sau gây miễn dịch lần 1
Hinh 3.6: Hiệu giá mẫu huyết thanh chuột trước gây miễn dịch và sau khi gây miễn
dịch ở các độ pha loãng khác nhau
Hình 3.7: Hình ảnh dung nạp tạo tế bào lai có chứa kháng thể đơn dòng có ái
lực F1
Hình 3.8: Que thử sàng lọc 240 dòng tế bào lai tiết kháng thể kháng kháng
nguyên F1
Hình 3.9: Lựa chọn mẫu IgY cần in lên vị trí vạch thử nghiệm
Hình 3.10: Ảnh hưởng của màng Nitrocellulose đến cường độ tín hiệu vạch thử
nghiệm cố định IgY
Hình 3.11: Ảnh hưởng của nồng độ kháng thể M5899 đến cường độ tín hiệu vạch
kiểm chứng


Hình 3.12:Ảnh hưởng của nồng độ Isopropanol bổ sung vào kháng thể M5899 đến
cường độ tín hiệu vạch kiểm chứng
Hình 3.13:Ảnh hưởng của nồng độ IgY đến cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm
Hình 3.14: Ảnh hưởng của pH đến cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm
Hình 3.15: Xác định độ nhạy của que thử phát hiện F1 sử dụng chế phẩm IgY
Hình 3.16: Ảnh hưởng của nồng độ G20 đến cường độ tín hiệu trên vạch thử
nghiệm
Hình 3.17: Ảnh hưởng của pH đến cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm
Hình 3.18: Ảnh hưởng của nồng độ Isopropanol đến cường độ tín hiệu trên vạch
thử nghiệm
Hình 3.19: Xác định độ nhạy của que thử phát hiện F1 sử dụng kháng thể G20 làm
kháng thể bắt cặp
Bảng 3.1: Nồng độ protein trong các phân đoạn rửa giải khi tinh sạch trên cột sắc
ký ái lực NI-NTA
Bang 3.2: Gia tri OD 450 nm cua mẫu huyêt thanh chuôt trươc va sau khi gây miễn
dich.
Bảng 3.3: Kết quả lai giữa tế bào Myeloma Sp2/0 và tế bào lympho


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
IgY

Yolk Immunoglobulin

ELISA

Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

BSA

Bovine Serum Albumin

SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide
Gel Electrophoresis

HTSKMD

Hệ thống sắc ký miễn dịch

kDa

Kilo Dalton

KLPT

Khối lượng phân tử

MBP

Maltose binding protein

LB

Luria – Bertani

ICA

Immunochromatographic assay

NC

Nitrocellulose

TL

Test line

CL

Control line

ICT

immunochromatographic test


LỜI MỞ ĐẦU
Dịch hạch là một bệnh truyền nhiễm tối nguy hiểm do Yersinia pestis gây ra.
Bệnh lây truyền từ động vật sang người qua trung gian truyền bệnh là bọ chét.
Bệnh đã được biết từ thời xa xưa và đã gây ra 3 vụ đại dịch lớn vào các thế kỉ XI,
XIV và XIX với hàng trăm triệu người tử vong. Tuy đã được phát hiện từ lâu
nhưng hiện nay các ổ dịch vẫn còn tồn tại và đang hoạt động trong nhiều khu vực
trên trái đất.
Tuy dịch hạch đã được kiểm soát nhưng công tác điều tra giám sát dịch tễ
học vẫn phải được tiến hành thường xuyên. Bởi vì bệnh dịch hạch có thể xuất hiện
bất cứ khi nào nếu gặp điều kiện thuận lợi và sẽ gây ảnh hưởng to lớn đến cuộc
sống của con người. Đặc biệt vi khuẩn Yesinia pestis vẫn được coi là một trong
những tác nhân dùng để làm vũ khí sinh học.
Trong bối cảnh phức tạp như hiện nay, trên thế giới, khủng bố bằng vũ khí
sinh học đang được các thế lực thù địch tìm cách lợi dụng và phát triển. Trong đó,
vi khuẩn gây bệnh than (Bacillus anthracis) và vi khuẩn gây bệnh dịch hạch (Y.
pestis) là những đối tượng nguy hiểm nhất. So với các loại vũ khí thông thường, thì
vũ khí sinh học rất khó phát hiện, nhưng lại gây chết người hàng loạt trên diện
rộng; gây thiệt hại nặng nề về kinh tế và gây ô nhiễm môi trường một cách trầm
trọng.
Cac phương phap phân tich khang nguyên F1 đặc hiệu cho Y. Pestis đêu la
cac phương phap miễn dich trong đo phô biên nhât la ELISA va săc ky miễn dich
kep đôi (Splettstoesser va đông tac gia, 2004). Que thư phát hiện nhanh kháng
nguyên F1 được tạo ra bằng phương pháp sắc ký miễn dịch kẹp đôi co quy trinh
phân tich rât đơn gian, không cân trang thiêt bi do vây rât thich hơp vơi cac phep
phân tich tai hiên trương; đap ưng nhu câu cuacác phân đội lính trinh sát làm nhiệm
vụ tại các vùng rừng núi hẻo lánh.
Nhiệm vụ của Phòng Sinh học/Viện Hóa học – Môi trường quân sự là
nghiên cứu, chế tạo các trạng thiết bị để thực hiện nhiệm vụ trinh sát, phát hiện
nhanh các tác nhân sinh học. Do vậy việc nghiên cứu sản xuất các test phát hiện


nhanh kháng nguyên nang F1 của vi khuẩn Y.pestis trong môi trường bằng phương
pháp sắc ký miễn dịch kẹp đôi sử dụng kháng thể đa dòng IgY từ trứng gà là nhiệm
vụ trọng tâm và rất cần thiết.
Vì những lý do và nhu cầu từ thực tế trên, tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu
tạo kháng thể nhận biết đặc hiệu kháng nguyên nang F1 của vi khuẩn dịch
hạch Yersinia pestis và ứng dụng sản xuất que thử phát hiện nhanh.”.
Nội dung nghiên cứu chính của luận văn:
- Tối ưu hóa qui trình gây đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên nang F1 ở gà.
- Tinh sạch kháng thể đa dòng IgY.
- Nghiên cứu thăm dò khả năng sản sản xuất kháng thể đơn dòng IgG có ái
lực cao với kháng nguyên F1.
- Ứng dụng các chế phẩm kháng thể trong sản xuất que thử miễn dịch phát
hiện nhanh kháng nguyên F1.


CHƯƠNGI: TỔNG QUAN
I. Bệnh dịch hạch và nguyên nhân gây bệnh dịch hạch
I.1. Bệnh dịch hạch
Dịch hạch là bệnh truyền nhiễm cấp tính, tối nguy hiểm thuộc diện kiểm
dịch và khai báo quốc tế do Yersinia pestis (Y.pestis) gây nên. Bệnh lưu hành trong
quần thể động vật thuộc bộ gặm nhấm (Rodentia), chủ yếu là chuột và bọ chét ký
sinh trên chúng, từ đó lây truyền sang các loại súc vật khác và sang người. Lịch sử
loài người đã ghi nhận 3 vụ đại dịch vào các thế kỷ thứ VI, XIV và XIX với hàng
trăm triệu người tử vong và bệnh dịch hạch đã trở thành nỗi kinh hoàng của nhân
loại.
Bệnh dịch hạch được biết đến từ thời xa xưa, thời kì đầu khó có thể xác định
được những thông tin chính xác cần thiết để phân biệt hoặc chứng minh dịch hạch
do vi khuẩn hay vi rút.
Trong khoảng hai ngàn năm qua, các vụ dịch hạch lớn đã lây lan rộng khắp
đến các quốc gia trên thế giới. Đại dịch đầu tiên được ghi nhận vào thế kỷ thứ VI,
vào khoảng từ năm 542 đến 546 xảy ra vụ dịch lớn bắt đầu ở Đế quốc La Mã
phương Đông vào triều đại Vua Justinian 1 ở Ai Cập, lây lan sang Châu Âu, ước
tính làm chết khoảng 100 triệu người ở Châu Á, Châu Phi và Châu Âu. Đại dịch
lần thứ hai nổi tiếng với tên “Bệnh chết đen - Black Death” vào thế kỷ XIV,
khoảng từ năm 1347 đến 1350. Đại dịch lần thứ 2 ước tính làm chết khoảng 50
triệu người trên thế giới, trong đó một nửa số nạn nhân là ở Châu Âu, chiếm một
phần ba dân số Châu Âu thời bấy giờ. Tỷ lệ tử vong trong đại dịch này từ 70 - 80%.
Cuối thế kỷ XIX, đại dịch thứ ba bắt đầu ở Canton và Hồng Kông vào năm
1894, nhanh chóng lan truyền đi khắp thế giới. Trong vòng 10 năm (1894-1903),
dịch đã lan đến 77 thành phố cảng trên khắp 5 châu: Châu Á: 31, Châu Âu: 12,
Châu Phi: 8, Bắc Mỹ: 4, Nam Mỹ: 15 và Châu Úc: 7. Trong đại dịch này, dịch
hạch lây lan mạnh mẽ ở Ấn Độ, chỉ riêng ở Bombay đã làm chết khoảng
13.000.000 người [1].


I.2. Tình hình dịch hạch trên thế giới và Việt Nam
I.2.1. Tình hình dịch hạch trên thế giới
Các vùng dịch hạch lưu hành không cố định mà luôn luôn thay đổi, tuỳ
thuộc vào sự thay đổi của nhiều yếu tố tự nhiên, xã hội như: khí hậu, động đất, sự
di chuyển của các quần thể gặm nhấm, di dân,... Hiện nay, các ổ dịch hạch tự nhiên
tồn tại ở Bắc và Nam Mỹ, Châu Phi, Châu Á và Đông Nam Châu Âu, từ 55 vĩ độ
Bắc đến 40 vĩ độ Nam. Tuy nhiên, trong vành đai này có những vùng không có ổ
dịch hạch như các hoang mạc với một số lượng ít hoặc không có loài vật chủ gặm
nhấm, vùng chí tuyến hoặc những dãy núi cao đóng băng quanh năm.
Từ 1954 - 2001, Tổ chức Y tế thế giới ghi nhận có 38 quốc gia trên thế giới
xảy ra bệnh dịch hạch gồm 89.651 trường hợp mắc và 7.715 bệnh nhân tử vong.
Nhiều nhất là năm 1967 có 6014 trường hợp và thấp nhất năm 1981 có 200 trường
hợp. Trong gần nửa thế kỷ qua, có 7 quốc gia trên thế giới có dịch bệnh xảy ra
hàng năm là Brazil, Cộng hoà dân chủ Công Gô, Madagascar, Myanmar, Pê Ru,
Hoa Kỳ và Việt Nam.

Hình 1.1: Tình hình dịch hạch trên thế giới từ năm 1954 – 2001[1]

Thực tế tình hình dịch hạch trên thế giới cho đến nay vẫn diễn biến phức tạp,
không thể nói rằng sẽ loại trừ dịch hạch trong tương lai gần. Cũng không thể buông


lỏng sự giám sát dịch hạch. Năm 1995 ở Madagascar bắt đầu nghiên cứu phòng
chống dịch hạch toàn diện và tổ chức mạng lưới nghiên cứu vấn đề này trong các
Viện Pasteur (Acip Peste). Tại Trung Quốc mặc dù tình hình dịch hạch đã được
khống chế mạnh mẽ nhưng hệ thống giám sát phòng chống chủ động bệnh dịch này
vẫn được đẩy mạnh và giải quyết chặt chẽ. Những năm gần đây Hội nghị quốc tế
về nghiên cứu và phòng chống dịch hạch vẫn được tổ chức Y tế Thế giới tổ chức,
thu hút được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu về lĩnh vực này tham dự.
Tại hội nghị quốc tế về giám sát và phòng chống dịch hạch tổ chức ở Bangalore,
Ấn Độ từ 15 - 17 tháng 07 năm 2002, theo Tikhomirov E, chuyên gia của Tổ chức
Y tế Thế giới thì có 6 tiêu chuẩn để đánh giá tính ưu tiên trong nghiên cứu và
phòng chống của một bệnh là: Tác động của bệnh đó (nguyên nhân gây mắc và
chết), nguy cơ tác nhân gây nên dịch, hiệu lực trong dự phòng và điều trị bệnh, tầm
quan trọng đối với quốc tế, ảnh hưởng đến kinh tế và nguy cơ sử dụng có mục đích.
Dịch hạch có đầy đủ 6 yếu tố trên và như vậy nên được xem là bệnh cần ưu tiên
nghiên cứu và phòng chống [1].
I.2.2. Tình hình dịch hạch tại Việt Nam
Hơn 1 thế kỷ trước, bệnh dịch hạch đã có mặt ở Việt Nam, có khả năng từ
Hồng Kông xâm nhập vào năm 1898 trong bối cảnh của đại dịch lần thứ ba. Mầm
bệnh vẫn được duy trì, lưu hành có thời kỳ bùng phát xen kẽ với những thời kỳ
lắng dịu nhưng thực sự chưa bao giờ được loại trừ.
Dịch hạch được ghi nhận lần đầu tiên ở Việt Nam vào năm 1898 tại Nha
Trang trong bối cảnh vụ đại dịch hạch thế giới lần thứ 3. Dịch xâm nhập chủ yếu
theo hàng hóa của người Trung Hoa. Sau khi xâm nhập dịch lây lan đến những nơi
khác như Bắc Ninh, Hòn Gai, Phan Thiết, Phan Rang, Sóc Trăng.... Dịch tại những
nơi xâm nhập đều có tính chất tạm thời trừ Sài Gòn và Phan Thiết có chiều hướng
trở thành vùng dịch lưu hành dai dẳng. Vào năm 1911 tại Châu Đốc, Long Xuyên,
Thủ Dầu Một xảy ra một vụ dịch lớn với nhiều bệnh nhân dịch hạch thể phổi có
886 người tử vong.


Hình1.2: Số mắc/chết dịch hạch ở Việt Nam từ năm 1976-2002
Từ 1961 đến 1975: dịch bùng phát lan tràn ở Miền Nam. Sau đó tiếp tục lây
lan trên diện rộng ở các tỉnh ven biển Miền Trung, Tây Nguyên, Miền Đông Nam
Bộ. Chính quyền miền Nam dưới sự trợ giúp của Mỹ thông qua chương trình quốc
gia phòng chống dịch hạch đã khống chế được một phần, nhưng nhìn chung dịch
vẫn tồn tại với quy mô lớn. Trong giai đoạn này, hầu hết số bệnh nhân mắc phải
dịch trên thế giới đều là Việt Nam.

Hình 1.3: Số bệnh nhân dịch hạch ở Việt Nam so với thế giới, 1954-2001


Từ 1975 đến 1990: Sau 1975 dịch bùng phát, số ca mắc - chết tăng vọt tại các vùng
dịch lưu hành như ở các tỉnh ven biển Miền Trung, Tây Nguyên, Miền Đông Nam
Bộ. Đặc biệt trong thời gian này, dịch hạch đã xuất hiện và gây ra một số vụ dịch
nhỏ tại 9 tỉnh/thành phố phía Bắc do có sự giao lưu về lương thực hàng hóa và các
phương tiện giao thông. Đặc biệt chuột và tác nhân gây bệnh Y. pestis theo gạo và
lương thực từ Miền Nam xâm nhập vào Miền Bắc qua cảng biển Hải Phòng. Trong
giai đoạn từ năm 1991 đến 2002 số mắc - chết có chiều hướng giảm và phạm vi
dịch thu hẹp dần, tập trung chủ yếu ở Miền Trung và Tây Nguyên. Trong 4 năm
(1999-2002), dịch chỉ còn ghi nhận tại một số địa phương 2 tỉnh Đắc Lắc và Gia
Lai với diện dịch tập trung dai dẳng vào một số xã thuộc 2 huyện: Đắc Đoa, tỉnh
Gia Lai và EaH’leo, tỉnh Đắk Lắk.
Từ tháng 3/2003 đến nay không ghi nhận bệnh dịch hạch trên người, ca mắc
gần nhất ghi nhận vào tháng 08 năm 2002 tại tỉnh Đắk Lắk. Giám sát dịch động vật
tại các trọng điểm, từ tháng 4/2004 không còn phân lập được Y. pestis từ vật chủ và
trung gian truyền bệnh. Từ năm 2005 xét nghiệm huyết thanh động vật tìm kháng
thể kháng F1 của vi khuẩn Y. pestis đều cho kết quả âm tính.
I.3. Biểu hiện của bệnh dịch hạch
Tùy theo vị trí thương tổn giải phẫu bệnh lý, có thể gặp nhiều thể lâm sàng với tỷ lệ
khác nhau nhưng phổ biến nhất là thể hạch. Thể nhiễm khuẩn huyết và thể phổi
tiên phát hiếm gặp hơn. Các trường hợp nhiễm khuẩn huyết và viêm phổi thứ phát
có thể xem là biến chứng của thể hạch không được điều trị sớm và tích cực. Ngoài
ra còn gặp các biểu hiện khác như viêm màng não mủ, việm họng, thể xuất huyết,
thể da … Tuy nhiên các biểu hiện này thường gặp trong bệnh cảnh hoặc xảy ra thứ
phát sau thể hạch.
I.3.1. Dịch hạch thể hạch
Thể lâm sàng của bệnh dịch hạch không hằng định và nhiều thể. Tuỳ vào
từng vùng và vụ dịch mà tỷ lệ gặp có khác nhau, nhưng nhìn chung thể hạch vẫn
phổ biến nhất.


Thống kê của một số bệnh viện ở Việt Nam như sau: Bệnh viện Chợ Quán từ
năm 1977 đến 1986 gặp 94 - 98%; Bệnh viện Đắc Lắc từ năm 1976 đến 1986 gặp
97% và Bệnh viện Phú Khánh từ 1982 đến 1986 gặp 98% . Ở New Mexico từ năm
1980 - 1984 gặp 74,7% là thể hạch. Theo qui định của Tổ chức Y tế Thế giới, thời
gian ủ bệnh trong vòng 6 ngày, thời kỳ này kéo dài hơn ở những người đã được
chủng ngừa vắc xin. Thời kỳ ủ bệnh không có triệu chứng gì, sau đó bệnh thường
khởi phát đột ngột với hai nhóm dấu hiệu đặc trưng của bệnh dịch hạch là nhiễm
khuẩn - nhiễm độc và viêm hạch.
* Hội chứng nhiễm trùng - nhiễm độc.
Sốt cao đột ngột là triệu chứng tương đối phổ biến và thường xuất hiện trước
khi viêm hạch. Nếu được điều trị bằng kháng sinh đặc hiệu thì nhiệt độ hạ, trong
vòng 18 - 24 giờ có thể giảm đến 1,5 đến 2oC, ngày sau có thể hết sốt hoặc sốt nhẹ
thêm 2 - 3 ngày rồi hết hẳn.
Các dấu hiệu nhiễm trùng, nhiễm độc thần kinh biểu hiện mức độ nặng nhẹ
của bệnh và là yếu tố quyết định tiên lượng bệnh. Cần đặc biệt quan tâm khi thấy
xuất hiện sớm trong vòng 24 giờ đầu. Ở thể nhẹ, bệnh nhân mệt mỏi, biếng ăn
nhưng vẫn tươi tỉnh. Bệnh càng nặng, biểu hiện nhiễm độc càng rõ. Mặt đỏ, kết
mạc mắt xung huyết, môi khô, lưỡi bẩn, đau nhức nhiều nơi. Người bứt rứt khó
chịu, vẻ mặt lo âu sợ hãi, hoặc hốt hoảng, vật vã, kích động, nói nhảm hoặc lừ đừ,
mắt đờ đẫn, nằm yên không cử động, không ngủ. Đôi khi gặp ảo giác, trả lời chậm
chạp, khi đúng khi sai, tiếng nói không rõ ràng. Hiếm gặp hơn là động tác bất
thường, thỉnh thoảng gồng người co giật, vã nhiều mồ hôi. Có trường hợp ói mửa,
ỉa chảy. Khó thở nhanh mà không có tổn thương bệnh lý ở phổi.
* Viêm hạch.
Viêm hạch thường xuất hiện đồng thời hoặc sau sốt vài giờ đến 24 giờ, một
số ít trường hợp nổi hạch trước sốt. Viêm hạch dịch hạch là một loại viêm cấp tính
với triệu chứng đau là tính chất nổi bật lên hàng đầu. Đau là triệu chứng sớm nhất
và thường xuất hiện trước khi nổi hạch (87%). Đau tăng lên khi bệnh nhân cử động
hay sờ nắn và bệnh nhân thường ở tư thế nhằm làm giảm sức căng lên vùng đó.
Thuốc giảm đau không hoặc có tác dụng rất ít. Đau tự nhiên, càng nhiều và càng


sớm, đi đôi với sốt cao thường tiên lượng nặng hơn. Đau giảm rõ rệt và nhanh
chóng trong vòng 24 đến 48 giờ sau khi bệnh nhân được điều trị bằng kháng sinh
đặc hiệu.
Thường có một vài hạch và vị trí có hạch liên quan đến vị trí đốt của bọ chét,
phổ biến nhất là vùng đùi bẹn: 62 - 80%. Kế đó là: hạch nách 14 - 20%, hạch cổ,
hạch dưới hàm: 15-18%. Có thể gặp hai hoặc nhiều hạch xuất hiện lần lượt hoặc
cùng một lúc. Biểu hiện này cũng như vị trí hạch vùng cao (cổ, nách, thượng đòn
… ) thường là một biểu hiện nặng cần được chú ý.

Hình 1.4: Bệnh nhân mắc bệnh dịch hạch
Hạch viêm tiến triển nhanh với sưng tấy, nóng, đỏ và rất đau. Kích thước hạch tuỳ
vào thời điểm phát hiện. Ban đầu nhỏ, di động, màu da ngoài bình thường, trong
vòng 1 hoặc 2 ngày đã sưng to có khi đến 10 cm nhưng thường dưới 3 cm. Tổ chức
xung quanh hạch bị viêm, phù nề và dính vào nhau thành 1 khối không di động,
màu da bên ngoài hạch đỏ tía. Trong trường hợp được điều trị sớm, đúng thì hạch
giảm đau nhanh, teo nhỏ lại và “mất đi” trong vòng 2 - 3 tuần hoặc trở nên xơ hoá
để lại một khối rắn trong một thời gian dài sau khi khỏi bệnh [1,2].
I.3.2. Dịch hạch thể nhiễm trùng huyết
Quan niệm về thể nhiễm khuẩn huyết có nhiều ý kiến khác nhau. Theo
Pollitzer, dịch hạch thể nhiễm khuẩn huyết tiên phát là do sự xâm nhập vào máu
của một số lượng lớn vi khuẩn dịch hạch không qua giai đọan khu trú ở hạch. Một
số tác giả khác (Girard, Dujardin, Beaumetz, Joltrain) cho rằng thể nhiễm khuẩn


huyết chỉ thứ phát sau thể hạch nằm trong sâu, thăm khám bên ngoài không sờ thấy
được. Các tổ chức hạch này vẫn chứa nhiều vi khuẩn[1].
Dịch hạch thể nhiễm trùng huyết tiên phát là những trường hợp nhiễm khuẩn
huyết được xét nghiệm kết luận là do Y. pestis mà lâm sàng không phát hiện được
triệu chứng viêm hạch. Thể bệnh này không có triệu chứng viêm hạch đặc hiệu nên
rất dễ bị bỏ sót và tử vong cao.
Bệnh nhân đột ngột sốt cao 40 - 410C, rét run, đau đầu dữ dội, tiêu chảy và
ói mửa nhiều lần. Hốt hoảng, vật vã, kích động, nói sảng, tím tái, thở nhanh nông
…sau đó đi vào sốc nhiễm trùng nhiễm độc. Soi tươi các bệnh phẩm sẽ thấy vi
khuẩn dạng dịch hạch. Thường bệnh nhân tử vong nhanh chóng trong vòng 1 vài
ngày nếu không được điều trị sớm và hồi sức tích cực ngay từ những giờ đầu của
bệnh [2].
I.3.3. Dịch hạch thể phổi
Bệnh dịch hạch đáng sợ nhất là thể phổi vì tiến triển nhanh và tỷ lệ tử vong
rất cao. Thể tiền phát là do tác động trực tiếp của vi khuẩn trên tổ chức phổi theo
đường hô hấp trên, bệnh xuất hiện dưới dạng viêm đặc thùy phổi và diễn biến rất
cấp tính. Thời gian nung bệnh của thể phổi thường ngắn hơn, chỉ trong một vài
ngày, thậm chí chỉ trong vòng vài giờ sau khi nhiễm bệnh. Sau đó bệnh khởi phát
rất đột ngột với sốt cao, rét run, đau đầu, hoa mắt, chóng mặt, mạch nhanh, huyết
áp thấp, bệnh nhân bứt rứt. Trong vòng 24 giờ sau, các dấu hiệu của tổn thương hô
hấp xuất hiện nhanh chóng, có rối loạn chức năng hô hấp như đau tức ngực, thở
nhanh nông, khó thở. Lúc đầu ho có đờm nhầy, loãng. Sau đó đờm đặc dần, có vết
máu, có khi có bọt. Triệu chứng thực thể ở phổi rất nghèo nàn: Gõ bình thường
hoặc đục một vài nơi, âm phế bào và rung thanh không thay đổi. Đôi khi tìm thấy
dấu hiệu 3 giảm hoặc tiếng cọ màng phổi. X quang phổi biểu hiện rất sớm, có thể
thấy hình ảnh đông đặc phổi thông thường hoặc nhiều bóng mờ rải rác hoặc hình
ảnh bong bóng giống viêm phổi tụ cầu[1,2]. Ngoài ba thể hay gặp trên còn có các
thể khác ít phổ biến hơn như: thể màng não, thể xuất huyết, thể hầu học…


I.4. Cơ chế lây lan bệnh dịch hạch và vi khuẩn Y. pestis
I.4.1. Cơ chế lây truyền bệnh dịch hạch
Dịch hạch là bệnh truyền nhiễm, lây truyền trong quần thể gặm nhấm. Bệnh
duy trì trong các ổ dịch thiên nhiên của các loài gặm nhấm và lây truyền qua trung
gian bọ chét sống ngoại ký sinh trên chúng. Phần lớn các loài động vật hoang dại
đều bị nhiễm vi khuẩn dịch hạch nhưng chúng có tính đề kháng tương đối với bệnh
nên không đóng vai trò quan trọng trong vật chủ bệnh dịch hạch.
Trên thế giới bộ gặm nhấm (Rodentia) có khoảng 6.000 loài, trong đó họ
chuột (Muridae) có 150 loài chuột. Ở Việt Nam có 56 loài gặm nhấm và họ chuột
có 43 loài phân bố trên toàn lãnh thổ.
Dịch hạch là bệnh của động vật, chủ yếu là các loài gặm nhấm hoang dại và
chuột, người chỉ là vật chủ ngẫu nhiên, thứ yếu. Có nhiều yếu tố trong cơ chế lan
truyền bệnh dịch hạch, trong đó bọ chét đóng vai trò quan trọng. Bọ chét phải
nhiễm vi khuẩn dịch hạch khi hút máu. Tiếp theo là thời gian sống phải đủ dài để
quá trình nhân lên vi khuẩn đủ số lượng nhiều và sau đó lây truyền vi khuẩn dịch
hạch sang vật chủ khác. Bên cạnh đó, số lượng và thành phần bọ chét cũng như
quần thể vật chủ cũng là yếu tố cần thiết để gây nên nhiễm trùng và lan truyền dịch
bệnh. Trong tự nhiên, bệnh dịch hạch lan truyền theo các con đường sau:
* Phổ biến nhất là lây truyền qua trung gian bọ chét: Theo cơ chế lây truyền
này thì bệnh dịch hạch ở người thường xuất hiện sau dịch hạch ở vật chủ vài ngày
đến một vài tuần. Bọ chét hút máu vật chủ mắc bệnh trong đó có vi khuẩn dịch
hạch, vi khuẩn nhân lên sẽ tạo thành nút nghẽn ở tiền dạ dày (proventriculus). Khi
vật chủ bị bệnh chết, bọ chét bị tắc nghẽn này mất nguồn thức ăn sẽ rời bỏ vật chủ
chết đi tìm ký chủ mới để hút máu nhưng vì ống tiêu hoá bị tắc nghẽn ở tiền dạ
dày, máu không vào được và mỗi lần hút máu lại bị đẩy ra, vi khuẩn dịch hạch theo
vết đốt vào cơ thể vật chủ này và như vậy xảy ra sự lây truyền bệnh.
* Lan truyền trực tiếp từ vật chủ bệnh sang vật chủ lành không qua trung
gian của bọ chét như:


- Vi khuẩn Y.pestis xâm nhập trực tiếp qua da có hoặc có thể không có tổn
thương khi tiếp xúc trực tiếp vào động vật bị bệnh, nhân viên các phòng xét nghiệm
về vi khuẩn Y.pestis hoặc do động vật nuôi trong nhà cắn hoặc cào.
- Hít vào trực tiếp vi khuẩn Y.pestis tồn tại trong không khí do tiếp xúc trực
tiếp với vật chủ bị bệnh hoặc chết vì dịch hạch, nhất là dịch hạch thể phổi. Đây là
một phương thức lây truyền cực kỳ nguy hiểm vì xảy ra rất nhanh cho người tiếp
xúc.
Vi khuẩn dịch hạch xâm nhập qua da, ở nơi bọ chét đốt và theo đường bạch
huyết đến hạch khu vực, sinh sản phát triển mạnh tại đó gây nên dịch hạch thể
hạch. Sau đó, nếu không được điều trị thích hợp vi khuẩn dịch hạch xâm nhập vào
máu gây nên thể nhiễm khuẩn thứ phát. Đối với thể nhiễm khuẩn huyết tiên phát
hoặc thứ phát, ngoài vai trò truyền bệnh của bọ chét còn có thêm yếu tố độc lực của
mầm bệnh và sức đề kháng của cơ thể vật chủ[1].

Hình 1.5: Sơ đồ lây lan bệnh dịch hạch


I.4.2. Vi khuẩn gây bệnh dịch hạch Y. pestis
Dịch hạch là bệnh truyền nhiễm cấp tính, tối nguy hiểm thuộc diện kiểm
dịch và khai báo quốc tế do vi khuẩn Y. pestis gây nên. Bệnh lưu hành trong quần
thể động vật thuộc bộ gặm nhấm (Rodentia), chủ yếu là chuột và bọ chét ký sinh
trên chúng, từ đó lây truyền sang các loại súc vật khác và sang người.
Vi khuẩn dịch hạch trải qua nhiều danh pháp khác nhau, đầu tiên khi mới
được phát hiện có tên là Bacterium pestis, đến năm 1900 gọi là Bacillus pestis, sau
năm 1923 đổi thành Pasteurella pestis và tại Hội nghị Sinh vật học Quốc tế lần thứ
10 vào năm 1970 mới có danh pháp như hiện nay là Y. pestis.
Yersinia pestis do Alexandre Yersin phát hiện ra tại Hồng Kông vào ngày 20
tháng 6 năm 1894, trong thời gian đại địch lần thứ 3 đang hoành hành ở đây.
Yersinia pestis trước đây được xếp vào họ Pasteurellaceae, nhưng dựa trên
cơ sở so sánh mã di truyền bằng lai tạo DNA-DNA và RNA ribosom 16S/5S thì
tương tự như Escherichia coli nên chi Yersinia được xếp lại vào họ
Enterobacteriaceae. Chi Yersinia có 11 loài nhưng chỉ có 3 loài được quan tâm vì
có khả năng gây bệnh cho người là Y. pestis, Y.pseudotuberculosis và Y.
enterocolitica.
Yersinia pestis có hình dạng cầu trực khuẩn (0,5 x 1- 2 µm), bắt màu Gram
âm, nhuộm Wayson có màu xanh tím bắt màu ở 2 đầu, ở giữa trống nên gọi là “bắt
màu lưỡng cực”. Vi khuẩn không di động, không hình thành nha bào và không sinh
axít. Y. pestis là vi khuẩn hiếu khí, dễ mọc trên các môi trường nuôi cấy thông
thường, mọc tốt nhất ở nhiệt độ 28 - 300C và độ pH từ 7,2 đến 7,6. Trên môi trường
canh thang, khuẩn lạc mọc không làm đục môi trường. Trên môi trường thạch,
khuẩn lạc dạng R điển hình (lồi ở giữa, xung quanh sáng và có mép viền không đều
kiểu đăng ten). Vi khuẩn lên men đường glucose và mannitol, không lên men
đường rhamnose, lactose và sucrose.


Hình1.6: Hình ảnh Y. pestis bắt màu đậm 2 đầu khi nhuộm Wayson.
Dựa vào khả năng khử hóa nitrat thành axít nitric và lên men glycerin, Y.
pestis được chia thành 3 type sinh học là Orientalis, Antiqua và Medievalis. Ba
type này không có sự khác nhau về độc lực cũng như bệnh học đối với người và
động vật, nhưng chúng có phân bố địa lý cũng như tính chọn lọc vật chủ rất khác
nhau nên có vai trò quan trọng về mặt dịch tễ học [2].
Yersinia pestis thuộc nhóm vi khuẩn có sức đề kháng yếu với môi trường
bên ngoài. Ánh sáng, nhiệt độ cao, làm sấy khô có thể phá hủy vi khuẩn. Các chất
sát trùng, tẩy uế như lysol và các chế phẩm chứa Chlorin diệt vi khuẩn trong vòng
10 phút.
Yersinia pestis có cấu trúc kháng nguyên phức tạp và khả năng gây bệnh
phụ thuộc vào nhiều yếu tố, những chủng có độc lực cao có từ 16 đến 18 kháng
nguyên. Kháng nguyên quan trọng thường được chú ý là F1, V, W và 2 yếu tố là P
và Pu. Kháng nguyên nang F1 (capsular antigen): có độc lực cao và mang tính
kháng nguyên mạnh, có tác dụng bảo vệ vi khuẩn sinh trưởng chống lại thực bào;
kháng nguyên thân V: là một phần của nội độc tố; kháng nguyên W: là yếu tố độc
lực liên quan đến khả năng chống lại hiện tượng thực bào.
Burrows và Bacon đã xác định tính kháng thực bào của Y. pestis nhờ kháng
nguyên gọi là V và W có thể hoạt động liên kết hay độc lập với kháng nguyên F1.


Những chủng không độc đều thiếu kháng nguyên F1. Y.pestis tạo ra cả nội độc tố
và ngoại độc tố. Các độc tố dịch hạch có tác động làm tan hồng cầu, tan tơ huyết và
làm đông huyết tương, những yếu tố này giúp vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể vật
chủ. Nội độc tố có tính chất ái thần kinh, gây nên bệnh cảm li bì, u ám, thâm nhiễm
xuất huyết ở các nội mạc tĩnh mạch và những tổn thương thoái hóa của phủ tạng.
Vi khuẩn dịch hạch có thể lây truyền qua cả 4 con đường: đường máu (là chủ yếu),
đường tiêu hóa, đường hô hấp và đường da, niêm mạc [2].
I.5. Kháng nguyên nang F1
I.5.1. Cấu trúc kháng nguyên F1
Kháng nguyên F1 có tính đặc hiệu loài cao, chỉ có chủng Y. pestis mới có
kháng nguyên F1. William và cộng sự đã nghiên cứu trên 300 chủng Y. pestis độc
và không độc cho thấy tất cả các chủng đều có kháng nguyên F1, bởi vậy kháng
nguyên F1 được dùng cho chẩn đoán dịch hạch [6]. Ở Y. pestis, quá trình tổng hợp
và tiết kháng nguyên F1 được mã hóa bởi operon F1 bao gồm 4 gen caf1, caf1M,
caf1A và caf1R nằm trên plasmid pMT1, trong đó caf1 mã hóa kháng nguyên F1,
caf1M và caf1A đóng vai trò trong việc tạo cấu trúc và tiết protein ra bên ngoài tế
bào, caf1R đóng vai trò trong điều hòa quá trình phiên mã các gen trên operon. Vê
măt câu truc, kháng nguyên F1 là chuỗi polypeptide, kích thước 17 - 17,6 kDa,
điểm đẳng điện 4,1 - 4,4. F1 là protein kị nước vơi cấu trúc bậc hai gâp nếp β [7].
Kháng nguyên nang F1 là một dấu hiệu cụ thể để có thể xác định vi khuẩn Y. pestis.
Khi nuôi cấy ở 370C thì kháng nguyên F1 được hình thành nhiều nhất trên bề mặt
tế bào, dễ dàng hòa tan trong môi trường nuôi cấy.
Protein F1 có cấu trúc bậc 4, tương tác kị nước, có cấu trúc bên trong kiểu
hàng rào không gian 3 nhịp với các lỗ thấm có tác dụng như một màng sinh học hỗ
trợ cho thành phần tế bào. Kháng nguyên F1 có thành phần hóa học và cấu trúc đặc
biệt nên ít chịu tác động của các nhân tố hóa lí: bền với nhiệt, đun nóng 80-100oC
trong 15phút mới làm biến đổi một phần tính kháng nguyên và chỉ bị phân hủy
hoàn toàn khi nung nóng 100oC trong 1 giờ. Kháng nguyên F1 có tính sinh miễn
dịch, có khả năng chống lại thực bào của các bạch cầu trung tính và bạch cầu đơn
nhân và có thể kích thích tạo ra kháng thể chống lại nhiễm trùng ở động vật. Một


tính chất quan trọng khác nữa đã được Janssen và Sunrgalla nhấn mạnh là kháng
nguyên F1 trợ giúp cho Y. pestis trốn được thực bào [8].
Các nghiên cứu sơ bộ đã chứng minh kháng nguyên F1 tồn tại trong mô
động vật và huyết thanh của bệnh nhân dương tính dịch hạch. Sử dụng kĩ thuật
miễn dịch để phát hiện kháng nguyên F1 trên bệnh nhân nghi ngờ mắc dịch hạch
thông qua mẫu hạch, huyết thanh, nước tiểu cho kết quả xác định được 100% các
ca nhiễm bệnh [9]. Do đó kháng nguyên F1 đã được sử dụng rộng rãi trong chẩn
đoán huyết thanh bệnh dịch hạch [10].
I.5.2. Tính chất của kháng nguyên nang F1
Kháng nguyên F1 được sử dụng để nghiên cứu trong các thí nghiệm tiếp
theo của chúng tôi là kháng nguyên F1 được tạo ra bằng phương pháp tái tổ hợp
dung hợp với MBP và kháng nguyên F1được tinh sạch từ chủng Y.pestis tự nhiên.
I.6. Các phương pháp phân tích chẩn đoán kháng nguyên F1 của vi
khuẩn Y.pestis
Để phát hiện kháng nguyên F1 thường sử dụng một số nhóm phương pháp
chính như phương pháp sinh học phân tử, phương pháp miễn dịch (phổ biến nhất là
ELISA va sắc ky miên dich kep đôi).

I.6.1. Phương pháp miễn dịch
I.6.1.1 Phương pháp ELISA kẹp đôi (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
Sandwich)
Phương pháp này dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và các
kháng thể (kháng thể bắt cặp và kháng thể phát hiện). Trong đó kháng thể bắt cặp
được sử dụng là kháng thể đơn dòng hoặc kháng thể đa dòng, kháng thể phát hiện
thường là kháng thể đơn dòng. Nguyên lý của phương pháp gồm: (1) gắn kháng thể
bắt cặp lên giếng; (2) bổ sung mẫu (kháng nguyên liên kết với kháng thể bắt cặp);
(3) bổ sung kháng thể phát hiện (kháng thể phát hiện sẽ liên kết với kháng nguyên);
(4) bổ sung kháng thể cấp hai liên kết với enzym (kháng thể này liên kết với kháng
thể phát hiện); (5) bổ sung cơ chất (nhằm chuyển hóa thành dạng có thể phát hiện
được nhờ enzym).


Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với
kháng nguyên và thông qua cường độ màu phản ánh nồng độ kháng nguyên cần
phát hiện. Hiện nay, trên thế giới thường sử phương pháp ELISA kẹp đôi để phát
hiện kháng thể kháng F1 trong huyết thanh hoặc các dịch tiết (nước bọt, nước tiểu).
Ưu điêm cơ ban cua cac phương phap ELISA kẹp đôi la co đô nhay phat hiên cao
va co kha năng đinh lương. Nồng độ kháng thể kháng F1 tối thiểu có thể phát hiện
được là 4 ng/ml. Độ nhạy là 90,1% đối với huyết thanh và 100% đối với dịch tiết
như nước bọt. Phương pháp chẩn đoán kháng thể kháng F1 bằng ELISA thích hợp
cho việc phát hiện sớm bệnh dịch hạch. Tuy nhiên, điểm hạn chế của các phương
pháp này là đòi hỏi trang thiêt bi cung trinh đô ky thuât cao đê tranh hiên tương
dương tinh gia va do đo chi thich hơp vơi cac phân tich tai phong thi nghiêm,
không co kha năng ưng dung tai hiên trương.
I.6.1.2. Sắc ký miễn dịch kẹp đôi
Phương pháp sắc ký miễn dịch (immunochromatographic assay (ICA) dựa
trên nguyên lý kết hợp kháng nguyên - kháng thể mà một trong hai thành phần này
được gắn cộng hợp (conjugate) để phát hiện thành phần kia, sau đó nhờ phức hợp
này chuyển dịch do tác dụng mao dẫn trên màng, để rồi được tóm bắt bằng kháng
thể (hoặc kháng nguyên) đã bố trí sẵn tại vạch phát hiện (Hình 1.7). Đây là phương
pháp phân tích nhanh, dễ thực hiện, được phát triển từ năm 1956. Trong 20 năm
gần đây, nhờ ứng dụng công nghệ kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody) và
cải tiến nguyên liệu thành phần trong đó có việc sử dụng hạt nano kim loại làm
thành phần cộng hợp (ví dụ: hạt vàng (Au) [14] và cải tiến chất lượng màng
nitrocellulose (NC), cũng như ứng dụng tự động hóa trong sản xuất, ICA đã được
ứng dụng để chế tạo nhiều sinh phẩm chẩn đoán các tác nhân gây bệnh khác nhau,
bao gồm độc tố, dư lượng kháng sinh, vi sinh vật gây bệnh.Ưu điểm của sắc ký
miễn dịch bao gồmtính đơn giản trong sử dụng, thời gian thực hiện nhanh, kết quả
chính xác, giá thành rẻ, có thể dùng như một phương tiện lưu động, không cần máy
móc quy mô và đắt tiền. Có thể sử dụng sắc ký miễn dịch để phát hiện kháng


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×