Tải bản đầy đủ

Nghiên cứu biểu hiện protein interleukin 7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vật

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN HUY HOÀNG

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN INTERLEUKIN 7
TÁI TỔ HỢP TRONG HỆ THỐNG NUÔI CẤY THỰC VẬT

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN HUY HOÀNG

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN INTERLEUKIN 7
TÁI TỔ HỢP TRONG HỆ THỐNG NUÔI CẤY THỰC VẬT


Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số

: 9 42 01 21

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS. TS. Chu Hoàng Hà
2. PGS. TS. Lê Văn Sơn

THÁI NGUYÊN - 2018


i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự
hướng dẫn của PGS. TS. Chu Hoàng Hà và PGS. TS. Lê Văn Sơn. Các số
liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, một phần đã được công bố
trong các Tạp chí Khoa học; phần còn lại chưa từng được ai công bố trong bất
kỳ công trình nào khác. Mọi trích dẫn, tham khảo đều ghi rõ nguồn gốc.
Thái Nguyên, ngày 10 tháng 2 năm 2018
TÁC GIẢ
Nguyễn Huy Hoàng


ii

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận án này, lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu
sắc tới PGS. TS. Chu Hoàng Hà, PGS. TS. Lê Văn Sơn, là những người thầy
đã tận tình hướng dẫn, động viên khích lệ, tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong
suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận án này.
Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới TS. Phạm Bích Ngọc, TS. La
Việt Hồng, ThS. Lê Thu Ngọc, ThS. Nguyễn Thu Giang cùng toàn thể các cô
chú, anh chị và các bạn Phòng Công nghệ tế bào thực vật và Phòng công nghệ
ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học, là những người đã tận tình truyền
đạt nhiều kinh nghiệm quý báu và giúp đỡ tôi trong quá trình làm thực nghiệm
tại phòng.


Tôi xin chân thành cảm ơn GS. TS. Chu Hoàng Mậu, PGS. TS. Nguyễn
Thị Tâm và các thầy cô giáo khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm - Đại
học Thái Nguyên đã giảng dạy, truyền đạt cho tôi những kiến thức mới và tạo
điều kiện để tôi có thể hoàn thành được khóa học này.
Tôi xin cảm ơn phòng Đào tạo, cán bộ Bộ phận đào tạo Sau đại học,
Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi về mặt quản
lý trong suốt quá trình tôi học tập tại trường.
Tôi xin cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Y Dược, đồng nghiệp
của tôi tại Bộ môn Sinh học, Khoa Khoa học cơ bản và các phòng chức năng
đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong công tác để tôi yên tâm học tập.
Cuối cùng tôi xin gửi tới gia đình, bạn bè, người thân lòng biết ơn sâu
sắc. Những người luôn luôn ở bên, ủng hộ, động viên, giúp đỡ tôi trong quá
trình học tập và nghiên cứu của mình
Thái Nguyên, ngày 10 tháng 2 năm 2018
TÁC GIẢ
Nguyễn Huy Hoàng


iii

MỤC LỤC
Lời cam đoan...................................................................................................... i
Lời cảm ơn ........................................................................................................ ii
Mục lục............................................................................................................. iii
Danh mục chữ viết tắt ...................................................................................... iv
Danh mục các bảng ........................................................................................... v
Danh mục các hình ........................................................................................... vi
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1. Tính cấp thiết của luận án ............................................................................. 1
2. Mục tiêu nghiên cứu...................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2
4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của luận án .......................................................
3
4.1. Ý nghĩa lý luận ........................................................................................... 3
4.2. Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................ 3
5. Đóng góp mới của luận án ............................................................................ 3
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 4
1.1. Vai trò của cytokine và interleukin 7 trong hệ miễn dịch ở người ............
4
1.1.1. Cytokine .................................................................................................. 4
1.1.2. Interleukin 7 .......................................................................................... 10
1.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng các loại cytokine tái tổ hợp trong y
học16
1.2.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trên thế giới................................... 16
1.2.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trong nước..................................... 18
1.3. Một số hệ thống biểu hiện protein người tái tổ hợp................................. 19
1.3.1. Hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp ở vi khuẩn ................................. 19
1.3.2. Dòng tế bào thuốc lá BY2 (Nicotiana tabacum Bright Yellow 2)........ 20
1.3.3. Hệ thống nuôi cấy rễ tơ thực vật ........................................................... 22
1.3.4. Cây chuyển gen biểu hiện cytokine tái tổ hợp ......................................
24


Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................. 29
2.1. Vật liệu ..................................................................................................... 29
2.1.1. Vật liệu thực vật .................................................................................... 29
2.1.2. Các chủng vi khuẩn, tế bào ................................................................... 29
2.1.3. Các gen và vector .................................................................................. 30
2.1.4. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu................................................. 30
2.1.5. Hóa chất và thiết bị máy móc................................................................31
2.1.6 . Địa điểm và thời gian nghiên cứu ........................................................ 32
2.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 32
2.2.1. Phương pháp thay đổi mã di truyền gen hIL-7 tối ưu biểu hiện protein ở
thực vật ............................................................................................................ 34
2.2.2. Thiết kế mồi .......................................................................................... 35
2.2.3. Thiết kế vector chuyển gen mang gen hIL-7 tái tổ hợp ........................ 35
2.2.4. Phương pháp biểu hiện gen ở vi khuẩn, tạo dòng tế bào thuốc lá BY2,
rễ tơ thuốc lá.................................................................................................... 44
2.2.5. Phân tích các chỉ tiêu sinh lý của dòng chuyển gen.............................. 47
2.2.6. Phân tích các dòng chuyển gen bằng ky thuật sinh học phân tử .......... 48
2.2.7. Tinh sạch protein hIL-7 tái tổ hợp ........................................................ 50
2.2.8. Đánh giá hoạt tính protein hIL-7 tái tổ hợp .......................................... 50
2.2.9. Phân tích thống kê kết quả thực nghiệm ............................................... 52
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................ 53
3.1. Thay đổi mã di truyền gen hIL-7 tối ưu biểu hiện ở thực vật .................. 53
3.2. Thiết kế vector chuyển gen hIL-7 tái tổ hợp vào vi khuẩn, dòng tế bào
BY2, rễ tơ thuốc lá và cây thuốc lá ................................................................. 57
3.2.1. Thiết kế vector chuyển gen pET32c(+)/IL7.......................................... 57
3.2.2. Thiết kế vector chuyển gen pENTR221/cal/IL7 ................................... 59
3.2.3. Thiết kế vector chuyển gen pK7WG2D.1/cal/IL7 ................................ 61


3.2.4. Thiết kế vector chuyển gen pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP.. 63
3.3. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp............................................................ 68
3.3.1. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong vi khuẩn ................................ 68
3.3.2. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong dòng tế bào BY2................... 72
3.3.3. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong dòng rễ tơ chuyển gen .......... 83
3.3.4. Biểu hiện protein hIL-7 trong cây thuốc lá bằng Agro-infiltration ...... 91
3.4. Đánh giá hoạt tính sinh học của protein hIL-7 tái tổ hợp ........................ 99
Chương 4. BÀN LUẬN ............................................................................... 101
4.1. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong E. coli rosetta-gami B............ 101
4.2. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong dòng tế bào BY-2, rễ tơ ......... 103
4.3. Biểu hiện tạm thời protein hIL-7 tái tổ hợp ở cây thuốc lá.................... 106
4.4. Tăng cường biểu hiện protein ở thực vật với ELP và tinh sạch mITC .. 107
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................................109
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 110
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 112
PHỤ LỤC ..................................................................................................... 138


iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Ký tự
AIDS

Tiếng Anh

Tiếng Việt

Acquired immunodeficiency

Hội chứng suy giảm miễn dịch

syndrome

mắc phải ở người

A. tumefaciens

Agrobacteria tumefaciens

A. rhizogenes

Agrobacteria rhizogenes

AS

Acetosyringone

bp

Base pairs

Cặp bazơ

BSA

Bovine serum albumin

Huyết thanh bò

BY2

Bright yellow 2

Cal

Calreticulin

cDNA

Complementary DNA

ADN bổ sung

Cetyl trimethyl

Chất hoạt động bề mặt ammonium

ammonium bromide

bromide

DNA

Deoxyribonucleic acid

Axit deoxyribonucleic

dNTP

Deoxyribo nucleotide triphosphate

DTT

Dithiothreitol

E. Coli

Escherichia coli

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

Axit ethylenediaminetetraacetic

Enzyme-linked

xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên

immunosorbent assay

kết với enzyme

CTAB

ELISA
ELP

Elastin-like peptide

FDA

Food & drug administration

FGF8b

Cục quản lý thực phẩm và dược
phẩm Hoa Kỳ

Fibroblast growth factor 8

Yếu tố tăng trưởng nguyên bào

isoform b

sợi 8 isoform b


hIL-7

Human interleukin 7

Interleukin 7 của người

HEV

Hepatitis E virus

Virus viêm gan E

HPV

Human papilloma virus

Virus papilloma ở người

HRP

Horseradish peroxidase

IFN

Interferon

IL

Interleukin

IMAC
IPTG

Immobilized metal ion affinity
chromatography
Isopropyl β-D-1thiogalactopyranoside

kb

Kilo base

kDa

Kilo danton

LB

Luria and Bertani

MHC

Major histocompatibility complex

mITC
mRNA

Sắc kí ion cố định kim loại

Membrane-based inverse transition
cycling
ARN messenger

Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy
vi khuẩn theo Luria và Bertani
Phức hệ phù hợp tổ chức
Đảo ngược theo màng
ARN thông tin
Môi trường dinh dưỡng cơ bản

MS

Murashige and Skoog

nuôi cấy mô thực vật theo
Murashige và Skoog

NK cell

Natural killer cell

tế bào giết tự nhiên

Neomycin phosphotransferase

Gen kháng kháng sinh

II gen

kanamycine

OD

Optical density

Mật độ quang

PBS

Phosphate buffer saline

dung dịch muối đệm phosphate

nptII


PBST

Phosphate buffer saline + tween 20

PCR

Polymerase chain reaction

Phản ứng chuỗi polymerase

PVDF

Polyvinylidene difluoride

Màng sử dụng trong western blot

Ri - plasmid

Hairy root inducing plasmid

Plasmid gây bệnh rễ tơ ở thực vật

RNAi

RNA interference

ARN can thiệp

RNase

Ribonuclease

phân giải ARN

Rpm

Revolutions per minute

Vòng/phút

scFv

Single-chain variable fragment

SDS

Sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulfate
polyacrylamide gel electrophoresis

siRNA

small interfering RNA

TAE

Tris acetate EDTA

TCR

T-cell receptor

Thụ thể kháng nguyên tế bào T

T-DNA

Transfer DNA

Đoạn DNA chuyển

TNF

Tumor necrosis factor

yếu tố hoại tử khối u

TMB

3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine

UV

Ultraviolet

Tia tử ngoại

vir

Virulence region

Vùng gây độc

v/v

Volume/volume

thể tích/thể tích

WPM

Woody plant medium

WT

Wild type

Chủng hoang dại

w/v

weight/volume

khối lượng/thể tích

YEB

Yeast extract broth

YMB

Yeast malnitol broth

Môi trường nuôi cấy theo
Mccown


1

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1

Phân nhóm IL ở người.........................................................

7

Bảng 1.2

21

Bảng 2.2

Một số cytokine biểu hiện thành công ở tế bào
BY2............
Một số cytokine tái tổ hợp biểu hiện ở thực vật
...................
Thống kê các trình tự mồi sử dụng trong luận
án.................
Danh sách kháng sinh sử dụng trong luận án.......................

Bảng 2.3

Thành phần phản ứng LR....................................................

40

Bảng 2.4

Thành phần gel SDS-PAGE................................................

49

Bảng 3.1

Xử lý mẫu protein với DTT.................................................

71

Bảng 3.2

Kết quả tạo và chọn dòng tế bào BY2 mang gen hIL7........
Nồng độ DNA tổng số của 20 dòng tế bào
BY2...................
Khối lượng tươi và khối lượng khô của một số dòng tế bào
BY2.
Kết quả chuyển gen pK7WG2D.1/cal/IL7 vào mô lá thuốc

74

lá trên môi trường chọn lọc..................................................

84

Bảng 3.6

Kết quả tạo dòng rễ tơ chuyển gen hIL-7.............................

84

Bảng 3.7

Đánh giá khối lượng tươi và khối lượng khô các dòng rễ

Bảng 1.3
Bảng 2.1

Bảng 3.3
Bảng 3.4
Bảng 3.5

Bảng 3.8
Bảng 3.9
Bảng 3.10

25
30
31

75
78

tơ chuyển gen hIL-7............................................................

87

Đánh giá chiều dài một số dòng rễ tơ chuyển gen
(cm)........
Hiệu suất thu hồi protein hIL-7 tái tổ hợp băng phương

89

pháp mITC..........................................................................

97

Kết quả hoạt hoá dòng tế bào 2E8 bằng protein hIL7..........

99


DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1

Cấu trúc protein hIL-7.......................................................................

11

Hình 1.2

Thụ thể hIL-7....................................................................................

12

Hình 1.3

Vai trò của hIL-7...............................................................................

15

Hình 1.4

Dòng tế bào thuốc lá BY2 (Nicotiana Bright Yellow 2).....................

22

Hình 2.1

Sơ đồ nghiên cứu tổng quát...............................................................

33

Hình 2.2

Cấu trúc attL1_cal/SacI và HindIII/attL2 trong vector pENTR/cal...

38

Hình 3.1

Sự phân bố tỷ lệ % phù hợp của các nhóm mã bộ ba gen hIL-7 biểu
hiện trong hệ thống thực vật ..............................................................

Hình 3.2

54

Biểu đồ phân bố tần suất sử dụng codon theo chiều dài gen hIL-7
khi biểu hiện trong hệ thống thực vật.................................................

55

Hình 3.3

Trình tự gen hIL-7 trước và sau tối ưu mã di truyền...........................

56

Hình 3.4

Cấu trúc vector pET32c(+)/IL7.........................................................

57

Hình 3.5

Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen
pET32c(+)/IL7...................................................................................

58

Hình 3.6

Cấu trúc vector pENTR221/cal/IL7...................................................

59

Hình 3.7

Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen
pENTR221/cal/IL7.............................................................................

60

Hình 3.8

Kết quả colony PCR pK7WG2D.1/cal/IL7.........................................

62

Hình 3.9

Kết quả cắt pK7WG2D.1/cal/IL7 bằng enzyme SacI và HindIII........

62

Hình 3.10

Cấu trúc vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP...................

63

Hình 3.11

Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen
pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP............................................

Hình 3.12

65

Kết quả điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen
pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP...........................................

66


Hình 3.13

Kết quả kiểm tra vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP
bằng enzyme NcoI..............................................................................

67

Hình 3.14

Kết quả kiểm tra chủng biểu hiện pET32c(+)/IL7/Rosetta.................

69

Hình 3.15

Kết quả kiểm tra khả năng biểu hiện hIL-7 từ vi khuẩn E.coli Rosetta
gami B nuôi ở 37oC và 28oC................................................................

70

Hình 3.16

Kiểm tra biểu hiện protein hIL-7 pha tan bằng Western blot............... 72

Hình 3.17

Kết quả kiểm tra colony PCR pK7WG2D.1/IL7/Cv58.......................

73

Hình 3.18

Chọn lọc dòng tế bào BY2 sau chuyển gen.........................................

74

Hình 3.19

Kết quả PCR các dòng BY2 chuyển gen bằng IL7_F và IL7_R.......... 76

Hình 3.20

Kết quả PCR các dòng BY2 chuyển gen bằng cặp mồi gen virC......... 77

Hình 3.21

Các dòng tế bào huyền phù BY2 sau 21 ngày nuôi cấy.......................

Hình 3.22

Đồ thị sinh trưởng của một số dòng tế bào huyền phù thuốc lá BY2
chuyển gen (theo khối lượng tươi)......................................................

Hình 3.23

80

Kiểm tra sự biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong các dòng tế bào
huyền phù BY2 bằng Western blot.....................................................

Hình 3.25

79

Đồ thị sinh trưởng của một số dòng tế bào huyền phù thuốc lá BY2
chuyển gen (theo khối lượng khô)......................................................

Hình 3.24

77

82

Biểu đồ so sánh hàm lượng hIL-7 tái tổ hợp trong các dòng BY2
chuyển gen..........................................................................................

83

Hình 3.26

Kết quả quá trình tạo và chọn dòng rễ tơ chuyển gen hIL-7…………. 85

Hình 3.27

Kết quả PCR 5 dòng rễ tơ bằng cặp mồi IL7_F và IL7_R................... 85

Hình 3.28

Đồ thị sinh trưởng của các dòng rễ tơ (tính theo khối lượng tươi)....... 88

Hình 3.29

Đồ thị sinh trưởng của các dòng rễ tơ (tính theo khối lượng khô)........ 88

Hình 3.30

Kết quả biểu hiện protein hIL-7 ở các dòng rễ tơ bằng Western blot... 90

Hình 3.31

Biểu đồ so sánh hàm lượng protein hIL-7 trong 5 dòng rễ tơ chuyển
gen
Kết quả colony PCR bằng cặp mồi
IL7_BamHI_F/IL7_BamHI_R........
Kết quả cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn
NcoI......................................

Hình 3.32
Hình 3.33

90
91
92


Hình 3.34
Hình 3.35
Hình 3.36
Hình 3.37
Hình 3.38

Kiểm tra biểu hiện protein hIL-7 trong lá thuốc lá bằng Western
blot......
Kết quả tinh sạch và định lượng protein hIL-7 bằng phương pháp
IMAC
Kết quả tinh sạch protein hIL-7 bằng phương pháp
mITC.........................
Kết quả định lượng protein hIL-7 tái tổ hợp bằng Western
blot.................
Khả năng hoạt hóa dòng tế bào 2E8 của protein hIL-7 tái tổ
hợp...............

94
95
97
98
100


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Interleukin là một nhóm các cytokine tiết và các phân tử tín hiệu được
tìm thấy đầu tiên trong các tế bào bạch cầu, đóng vai trò quan trọng trong hệ
thống miễn dịch. Chức năng của hệ thống miễn dịch ở người phụ thuộc chủ
yếu vào các Interleukin, thiếu hụt interleukin sẽ dẫn đến các bệnh tự miễn và
thiếu hụt miễn dịch.
Interleukin 7 (hIL-7) là một cytokine có vai trò chính trong sự tăng
trưởng của các dòng tế bào B và T [13]. Đây là những dòng tế bào có chức
năng quan trọng trong hệ miễn dịch của con người, cũng là đích tấn công của
các virus, mầm bệnh khi xâm nhập vào cơ thể con người.
Trong y học ngày nay, các protein có hoạt tính sinh học được sử dụng
rộng rãi để làm thuốc điều trị như các loại hormone, enzyme tái tổ hợp...
Trước đây, nguồn nguyên liệu để sản xuất các loại protein này chủ yếu là
tách chiết từ các bộ phận của động vật. Tuy nhiên, do nhu cầu ngày càng cao
trong khi nguồn cung từ động vật rất hạn chế, giá thành lại đắt và dễ nhiễm
các mầm bệnh nguy hiểm cho con người, nên việc nghiên cứu tổng hợp
protein tái tổ hợp được đặt ra một cách cấp thiết.
Trong những thập niên gần đây, với những bước tiến lớn trong lĩnh vực
công nghệ sinh học phân tử, việc tổng hợp protein không còn khó khăn như
trước nhờ phương pháp tổng hợp sinh học. Thực tế hiện nay phương pháp này
đã được áp dụng rộng rãi không những để tổng hợp một số loại protein làm
thuốc như insulin, hormone tăng trưởng v.v…. mà còn để tổng hợp rất nhiều
hợp chất khác trong khi nguồn nguyên liệu hạn chế hoặc con đường tổng hợp
hoá học gặp khó khăn [11].
Hiện nay, biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật đang được quan tâm
nghiên cứu vì những ưu điểm vượt trội so với các hệ thống biểu hiện khác như


chúng có thể sinh trưởng trên môi trường tương đối đơn giản, protein được tiết
ra môi trường nhiều hơn phần tích luy trong tế bào nên việc thu hồi và tinh
sạch dễ thực hiện [105], đặc biệt protein tái tổ hợp có nguồn gốc thực vật an
toàn cho con người hơn so với các protein có nguồn gốc từ các hệ thống nuôi
cấy khác do các mầm bệnh và virus thực vật không phải là tác nhân gây bệnh
ở người.
Nhăm mục đích nâng cao chất lượng điều trị bệnh theo hướng sử dụng
liệu pháp sinh học và góp phần hoàn thiện các phương pháp nghiên cứu sản
xuất các cytokine nói chung và hIL-7 nói riêng một cách tối ưu. Căn cứ vào
điều kiện phòng thí nghiệm cho phép và với phương pháp khả thi, chúng tôi
quyết định lựa chọn thực hiện đề tài luận án: “Nghiên cứu biểu hiện protein
interleukin 7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vật”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Xác định được hệ thống nuôi cấy thực vật biểu hiện tối ưu protein hIL-7
tái tổ hợp.
Thu nhận và tinh sạch được protein hIL-7 tái tổ hợp từ hệ thống nuôi
cấy thực vật.
3. Nội dung nghiên cứu
Đổi mã di truyền gen hIL-7 phù hợp biểu hiện ở hệ thống thực vật.
Thiết kế vector chứa cấu trúc gen mã hóa hIL-7 tái tổ hợp phù hợp với
các hệ thống nuôi cấy thực vật.
Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vật:
huyền phù, rễ tơ và cây thuốc lá chuyển gen.
Phân tích, kiểm tra và đánh giá chất lượng hIL-7 tái tổ hợp thu được
qua hệ thống nuôi cấy thực vật.


4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của luận án
4.1. Ý nghĩa lý luận
Luận án cung cấp cơ sở khoa học cho các nghiên cứu về biểu hiện, sản
xuất protein tái tổ hợp dùng trong y học ở thực vật thông qua biến đổi mã di
truyền và các hệ thống nuôi cấy thực vật.
Nội dung luận án có thể được sử dụng làm tài liệu giảng dạy, tham khảo
cho giảng viên và sinh viên các trường khối khoa học tự nhiên nói chung và
sinh học nói riêng.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Luận án cung cấp quy trình biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp ở các hệ
thống nuôi cấy dòng tế bào huyền phù BY2, rễ tơ, cây thuốc lá chuyển gen
trong quy mô phòng thí nghiệm, phục vụ cho mục đích nuôi cấy thu sinh khối
tế bào.
Bước đầu đánh giá được hoạt tính sinh học của protein hIL-7 tái tổ hợp
thu được sau khi tinh sạch ở các hệ thống nuôi cấy, là tiền đề cho các nghiên
cứu sâu hơn.
5. Đóng góp mới của luận án
Luận án đã thiết kế thành công 3 cấu trúc vector biểu hiện protein hIL-7
ở tế bào thuốc lá BY2, rễ tơ và cây thuốc lá chuyển gen.
Đã biểu hiện thành công protein hIL-7 tái tổ hợp trong: dòng tế bào
BY2, rễ tơ và cây thuốc lá chuyển gen. Trong đó, protein biểu hiện cao nhất ở
lá cây thuốc lá sau 5 ngày xâm nhiễm với vi khuẩn A. tumefaciens với hàm
lượng 36,7 ng/µg protein tan tổng số, có hoạt tính sinh học cao.
Đây là công trình nghiên cứu mới ở Việt Nam và trên thế giới về biểu
hiện protein hIL-7 trong hệ thống nuôi cấy thực vật.


Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. VAI TRÒ CỦA CYTOKINE VÀ INTERLEUKIN 7 TRONG HỆ
MIỄN DỊCH Ở NGƯỜI
1.1.1. Cytokine
1.1.1.1. Vai trò trong hệ miễn dịch người
Cytokine là các polypeptide được sản xuất khi có kích thích của vi sinh
vật hay các kháng nguyên khác nhăm điều hòa các phản ứng miễn dịch và
viêm của cơ thể. Những phân tử này điều hòa các hoạt động chức năng của
từng tế bào riêng biệt và của cả tổ chức trong trường hợp sinh lý và bệnh lý.
Các protein này cũng làm trung gian điều hòa trực tiếp sự tương tác giữa các
tế bào và kiểm soát các quá trình xảy ra trong khoang ngoại bào. Cytokine
hoạt động như những yếu tố giúp tế bào sống sót bằng cách ngăn hiện tượng
apoptosis xảy ra.
Cytokine gồm một số nhóm có mối liên hệ mật thiết, tác động qua lại
với nhau trong hệ thống miễn dịch của người để thực hiện chức năng của
chúng. Thuộc các cytokine này có chemokine, họ yếu tố hoại tử khối u (TNF),
họ các interferon và họ interleukin. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy, cytokine
tham gia vào nhiều quá trình sinh học trong cơ thể như tạo phôi, sinh sản, tạo
máu, đáp ứng miễn dịch, viêm; chúng có vai trò khá quan trọng trong các
bệnh lý như: bệnh tự miễn, nhiễm trùng huyết, ung thư, viêm gan siêu vi,
nhiễm HIV v.v… Ngoài ra, cytokine còn được dùng làm các tác nhân trị liệu
(yếu tố tạo khóm tế bào hạt sử dụng trong huyết học) hay các đích điều trị
(như các loại TNF trong bệnh Crohn, viêm đa khớp dạng thấp v.v…) [64],
[164].
1.1.1.2. Cơ chế hoạt động
a. Chemokine
Chemokine là những cytokine được sản xuất trong giai đoạn sớm nhất
của nhiễm trùng. Chúng phát huy tác dụng hóa ứng động đến các tế bào có
khả


năng đáp ứng gần đó. Cơ chế hoạt động của chemokine thể hiện ở khả năng
tập trung các loại tế bào bạch cầu của cơ thể chủ đến vị trí nhiễm trùng.
Chemokine hiện diện trên tế bào nội mô tác động lên các bạch cầu đi qua làm
cho các integrin bạch cầu tăng ái lực kết gắn với ligand của chúng. Điều này
rất quan trọng để giữ bạch cầu lại nội mô của mao mạch vùng tổn thương.
Ngoài ra, chemokin còn kích thích sự di chuyển của bạch cầu đến nơi có tổn
thương trên cơ sở sự chênh lệch nồng độ của chemokin tại nơi tổn thương và
các nơi khác. Các chemokin khác nhau kích thích các tế bào khác nhau nhờ
thế mà kiểm soát được thành phần của các tế bào tại ổ viêm. Chemokin điều
hòa sự lưu thông của tế bào lympho và các bạch cầu khác trong các mô
lympho ngoại biên. Các chemokin có khả năng thúc đẩy các tế bào đã được
hoạt hóa và tế bào T di chuyển đến các mô không phải thuộc hệ lympho bao
gồm cả da và niêm mạc [64], [152].
b. Họ các yếu tố hoại tử khối u (TNF)
TNF có khả năng kích thích tập trung tế bào trung tính và tế bào mono
đến nơi nhiễm trùng và hoạt hoá những tế bào này để tiêu diệt vi khuẩn. Ngoài
ra, TNF còn có khả năng kích thích tế bào nội mô và đại thực bào tiết ra
chemokine nhăm tăng cường ái lực của integrin bạch cầu đối với ligand của
chúng, tạo nên sự tập trung bạch cầu; đặc biệt chúng còn kích thích thực bào
đơn nhân tiết interleukin 1 - là chất có tác dụng rất giống với TNF [82].
TNF tác động lên tế bào gan làm tăng tổng hợp protein huyết thanh,
dưới tác động của TNF, interleukin 1 và interleukin 6 tạo nên đáp ứng pha cấp
của phản ứng viêm. Với nồng độ thấp, TNF tác động lên bạch cầu và nội mô
để khởi động phản ứng viêm. Ở nồng độ trung bình, TNF làm trung gian cho
các tác động toàn thân của phản ứng viêm. Đặc biệt, với nồng độ cao TNF có
thể gây ra các bất thường bệnh lý của sốc nhiễm trùng có thể gây tử vong
[154], [158].


c. Họ interferon (IFN)
IFN là những protein kháng virus được tế bào sản xuất khi bị nhiễm
virus gây bệnh nào đó. Chúng có khả năng bảo vệ cơ thể chống lại nhiễm
trùng virus và thúc đẩy đáp ứng miễn dịch tế bào chống lại các vi sinh vật nội
bào. IFN ức chế sự nhân lên của virus bằng cách kích thích tế bào sản xuất ra
nhiều loại enzyme như 2’,5’- oligoadenylate synthetase ngăn cản sự sao chép
của virus DNA hoặc RNA và sự nhân lên của chúng [106].
IFN có tác dụng làm bộc lộ phân tử MHC lớp I. Tế bào T CD8+ có khả
năng nhận diện kháng nguyên lạ liên kết với MHC lớp I, qua đó tế bào gây
độc nhận ra tế bào chứa virus và tiêu diệt chúng. Ngoài ra, IFN còn có khả
năng kích thích sự phát triển của tế bào Th1 trong hệ miễn dịch của người,
giúp gia tăng hoạt tính ly giải tế bào của tế bào NK [64], [142].
d. Họ Interleukin
Interleukin (IL) là một trong các nhóm chính của cytokine, đóng vai trò
quan trọng nhất trong hệ miễn dịch của con người. Chúng có chức năng điều
hoà miễn dịch, bao gồm cả phát triển tế bào, sự trưởng thành, di chuyển và
bám dính. Ngoài ra, chúng còn có khả năng kích hoạt các phản ứng miễn dịch
của cơ thể [25], [82].
Interleukin được chia thành nhiều loại khác nhau từ IL-1 đến IL-36 dựa
vào đặc điểm cấu trúc của chúng. Ví dụ, IL-1 được phân biệt với các IL khác
bởi sự gấp nếp nhiều hơn ở chuỗi  [158]. Ngoài ra, chúng còn được xếp vào
các nhóm khác nhau gọi là cytokine nhóm I và cytokine nhóm II. IL-10 và IL28 được xếp vào cytokine nhóm II vì có cấu trúc phân tử gần giống nhau, đều
có sáu hoặc bảy xoắn  xếp song song nhau [39], [76], [170]. IL-28 cũng có
cấu trúc intron-exon tương tự IL-10 [135].


Bảng 1.1. Phân nhóm IL ở người [9], [19], [26], [34], [60], [63], [83], [84],
[156]
IL
IL-1

Nguồn gốc
Tế

bào

Thụ thể
B, CD121a/IL1R1

monocytes

CD121b/IL1R2
CD25/IL2RA,

IL-2

Tế bào Th1

CD122/IL2RB,
CD132/IL2RG

IL-3
IL-4
IL-5

Vai trò
Kích thích tế bào T hỗ trợ; bảo
vệ và kích hoạt tế bào B, tế bào
NK.
Tham gia kích hoạt tế bào B, T
và NK.

Tế bào T hỗ trợ, CD123/IL3RA, Hỗ trợ tế bào mast tổng hợp
tế
NK

bào

mast, CD131/IL3RB

Tế

bào CD124/IL4R,

Th2, đại thực CD132/IL2RG
bào

histamin
Tham gia kích hoạt tế bào B,
hỗ trợ tăng sinh tế bào T

CD125/IL5RA, Tham gia sản xuất eosinophils

Tế bào Th2, tế CD131/IL3RB

và IgA.

bào mast
IL-6

Tế bào Th2, tế CD126/IL6RA, Gây phản ứng cấp tính, viêm ở
bào B, tế bào CD130/IL6RB

tế bào T

hình sao, nội
mạc
IL-7

Các tế bào mô CD127/IL7RA,
đệm



tuỷ CD132/IL2RG

xương và tuyến
ức
IL-8

Tế bào lympho,
biểu mô, nội
mô, đại thực

CXCR1/IL8R,
CXCR2/IL8RB
/CD128

Hỗ trợ và bảo vệ các tế bào B,
T và NK; cân băng nội môi,
cytokine tiền viêm.

Tác động hướng hoá lên bạch
cầu trung tính, tế bào lympho.

bào
IL-9

Tế bào Th2

CD129/IL9R

Kích thích tế bào mast.


Tế bào Th2, CD210/IL10R
IL-10

IL-11

monocytes,

A, CDW210B/ chế tế bào Th1 sản xuất các

CD8+ T

IL10RB

Tuỷ xương

IL11RA

Tế bào đuôi gai,
IL-12

Kích hoạt tế bào lympho B, ức

tế bào lympho CD212/IL12R
B, T, đại thực B1IL12RB2
bào

yếu tố IFN-γ, TNF-β, IL-2
Sản xuất protein pha cấp, kích
thích tạo máu
Tham gia kích hoạt tế bào T,
kích thích tế bào NK sinh IFNγ, TNF-α
Kích thích sự tăng trưởng và

Tế bào NK, tế
IL-13

bào

mast,

tế

bào Th2 đang

biệt hoá của tế bào B (IgE), ức
IL13R

hoạt động

chế tế bào Th1 và sản xuất các
cytokine gây viêm đại thực bào
(IL-1, IL-6) và giảm IL-8, IL10, IL-12.

IL-14

Tế bào T và

Kiểm soát sự tăng trưởng và

một số tế bào B -

phát triển của các tế bào B, ức

ác tính

chế tiết Ig

Thực bào đơn
IL-15

nhân, các đại

Kích thích sản xuất các tế bào

thực bào sau IL15RA

miễn dịch tự nhiên (tế bào

nhiễm trùng bởi

NK), tế bào T CD8+.

virus
Tế bào lympho,
biểu mô, bạch
IL-16

cầu ái toan, tế
bào CD8+ T

CD4

Thu hút CD4+


IL-17

IL-18

IL-19
IL-20

Tế bào Th17

Đại thực bào

Bạch cầu đơn
nhân

CDw217/IL7R

Tăng nồng độ các cytokine

AIL7RB

trong phản ứng viêm.

CDw218a/IL18
R1
IL20R
IL20R

IFN, tăng hoạt động của tế
bào NK.
Điều khiển sự tăng sinh và biệt
hoá của tế bào sừng.
Tham gia hoạt hoá CD8+ T,

Tế bào NKT và
IL-21

Kích thích sản xuất yếu tố

tế bào T hỗ trợ IL21R
đang hoạt động

tăng cường NK độc tế bào,
thúc đẩy sự phân hoá của các
tế bào Th17.
Sản xuất defensins từ các tế
bào biểu mô. Hoạt hoá STAT1

IL-22

Tế bào hỗ trợ
Th17

IL22R

và STAT3, làm tăng protein
pha cấp như amyloid huyết
thanh A và haptoglobin trong
tế bào gan.

IL-23

IL-24

Đại thực bào, tế
bào đuôi gai
Tế bào T, bạch
cầu đơn nhân

IL23R

IL20R

cầu ái toan, đại LY6E
thực bào

17, làm giảm xâm nhập CD8
T. Tham gia ức chế khối u,

Tế bào T, bạch
IL-25

Bảo vệ các tế bào sản xuất IL-

làm lành vết thương và bệnh
vẩy nến, biểu hiện cytokine
viêm.
Kích thích sản xuất IL-4, IL-5,
IL-13.


IL-26
IL-27

Tế bào T, tế
bào mono
Đại thực bào, tế
bào đuôi gai

IL20R1
IL27RA

IL-28

-

IL28R

IL-29

-

-

IL-30

-

-

IL-31

Tế bào Th2

IL31RA

Tăng tiết IL-10 và IL-8; biểu
hiện CD54 trên tế bào biểu mô.
Điều hoà hoạt động của tế bào
lympho B và T.
Có vai trò trong miễn dịch
chống lại virus.
Có vai trò trong miễn dịch
chống lại vi khuẩn.
Là một chuỗi của IL-27
Có thể đóng vai trò trong viêm
da.
Kích thích bạch cầu đơn nhân

IL-32

-

-

và đại thực bào tiết TNF-, IL8 và CXCL2.

IL-33

-

-

IL-35

Tế bào T

-

IL-36

-

-

Hỗ trợ các tế bào lympho T
sản xuất cytokine typ 2.
Ức chế hoạt hoá tế bào T hỗ
trợ.
Điều chỉnh phản ứng tế bào
đuôi gai và tế bào lympho T.

1.1.2. Interleukin 7
1.1.2.1. Cấu trúc gen hIL-7
hIL-7 gồm một chuỗi glycoprotein xoắn 4α, có khối lượng phân tử 17,4
kDa và được ổn định bằng gốc N - glycosyl hóa hoặc O - glycosyl hóa và cầu
nối disulfide nội phân tử [169]. Ở người, gen hIL-7 có kích thước 33Kb, gồm
có 6 exon và 5 intron năm trên nhiễm sắc thể số 8, ở vị trí 8q21.13. Cấu trúc


phân tử của hIL-7 được giữ vững ngay cả khi nồng độ pH có sự biến động
mạnh (2,1 - 8,0) [33]. Tuy nhiên, hIL-7 sẽ mất hoạt tính sinh học khi bổ sung
2- mercaptoethanol, điều này cho thấy tầm quan trọng của các liên kết cầu nối
disulfide có trong cấu trúc phân tử hIL-7 [14].

Hình 1.1. Cấu trúc protein hIL-7 [65]
hIL-7 cấu tạo gồm một chuỗi glycoprotein xoắn 4α, liên kết với nhau
bằng gốc N-glycosyl hóa hoặc O-glycosyl hóa và các cầu nối disulfide
hIL-7 lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1988 bởi công ty Immunex
[102] và cDNA được nhân bản đầu tiên vào năm 1989 [103]. hIL-7 có vai trò
quan trọng trong hệ bạch huyết do có khả năng thúc đẩy sản sinh các tế bào
bạch cầu lympho ở chuột bị nhiễm bệnh [97], [98].
hIL-7 chủ yếu được sản xuất bởi tuyến ức [102], [163]. Ngoài ra, các tế
bào khác như các tế bào tủy [47], nội mạc ruột [162] và tế bào sừng trên da
[57] cũng có thể sản xuất hIL-7. Gần đây, các nghiên cứu đã chỉ ra răng hIL-7
còn được sản xuất bởi các tế bào nguyên bào sợi lưới (FRC) trong vùng tế bào
T của hạch bạch huyết [84].
1.1.2.2. Thụ thể của hIL-7
hIL-7 có hai thụ thể là IL-7Rα và thụ thể γc. Trong đó, thụ thể IL-7R
(CD127) cũng là thụ thể của các lymphoprotein mô đệm tuyến ức (TSLP)
[175] và chuỗi  (CD132) là thụ thể của IL-2, IL-4, IL-9, IL-15 và IL-21
[29], điều


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×