Tải bản đầy đủ

bacteriocin trong tp http duongduongth blogspot com pdf

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO 
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM 
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM 

 
 

 
 

Bacteriocin và 
ứng dụng trong bảo quản thực phẩm 
 
Giáo viên hướng dẫn:  

TS. Vũ Thị Lâm An 

Lớp:  

DH08VT 


Nhóm sinh viên thực hiện:   Đỗ Bích Trâm  

08156092 

 

Võ Thị Trúc Linh  

08156041 

 

Huỳnh Thị Thu Vân  

08156106 

 

Nguyễn Thị Thanh Thủy  

08156082 

Tháng 10/2010


 


Mục lục 
I.

II.

Giới thiệu chung về bacteriocin  

 

 

 



 

 

 



1. Mở đầu   

 

 

 

 

 

 

 

 



2. Định nghĩa  

 

 

 

 

 

 

 

 



3. Phân loại    

 

 

 

 

 

 

 

 



4. Sinh tổng hợp  

 

 

 

 

 

 

 

 

11 

Cơ chế hoạt động của bacteriocin    

 

 

 

 

 

15 

1. Cơ chế hoạt động  

 

 

 

 

 

15 

 

 

 

 

16 

Thu nhận và phương pháp chiết tách bacteriocin   

 

 

 

18 

1. Thu nhận bacteriocin bằng pp cố định tế bào lên men   

 

 

18 

2. Chiết tách bacteriocin 

 

 

2. Các nhân tố ảnh hưởng khả năng hoạt động 
III.

 

 

 

 

 

 

22 

 

 

 

 

 

23 

IV.

Ứng dụng bacteriocin trong thực phẩm 

V.

Đánh giá khả năng ứng dụng của bacteriocin 

 

 

 

 

29 

1. Tình hình hiện nay 

 

 

 

 

 

 

 

29 

2. Tương lai   

 

 

 

 

 

 

 

32 

 


 

 


I.

Giới thiệu chung
1. Mở đầu
Ngày nay, người tiêu dùng đã nhận thức rõ hơn về tác động của phụ gia thực phẩm đối
với các vấn đề về sức khỏe và chuộng các loại thực phẩm chế biến không bổ sung chất
bảo quản hóa học tổng hợp vì tính an toàn cho thực phẩm. Những thập niên gần đây, xuất
phát từ yêu cầu cao về chất lượng, tính an toàn của thực phẩm từ phía người tiêu dùng
cũng như những yêu cầu nghiêm ngặt của chính phủ về vấn đề an toàn thực phẩm trong
sản xuất, chế biến, bảo quản đã thúc đẩy nghiên cứu rộng rãi các chất có khả năng bảo
quản thực phẩm có nguồn gốc tự nhiên. Quay trở lại lịch sử, thời kì khai sinh ra vi sinh
học hiện đại ngày nay, vào năm 1929 khi Alexander Fleming tìm ra thuốc kháng sinh
penicillin từ nấm Penicillum notanum, và trước đó nữa, những năm của thế kỉ 18, các nhà
khoa học đã bắt đầu phân lập được các chủng vi sinh vật gây bệnh và hư hỏng trên người
cũng như thực phẩm, mà mở đầu bằng các phát hiện nghiên cứu của Louis Pasteur.
Việc tìm ra thuốc kháng sinh vào năm 1929 đã mở bước ngoặc mới cho y học loài người.
Chỉ với một lượng rất nhỏ nhưng hiệu quả tiêu diệt vi sinh vật của Penicillin rất cao.
Antibiotic không chỉ được ứng dụng trong điều trị bệnh cho người, mà còn dùng cho điều
trị bệnh cho thú, tăng trọng thú và cả trong bảo quản thực phẩm (như chlotetraciclin dùng
để bảo quản thịt). Tuy nhiên do lạm dụng quá mức antibiotic đã dẫn đến khả năng kháng
thuốc ở vi sinh vật nên việc nghiên cứu chất kháng khuẩn để ứng dụng trong bảo quản
thực phẩm phải đi theo một hướng mới, hiệu quả hơn, đó là ứng dụng bacteriocin, một
nhóm các hợp chất có bản chất là peptide, nguồn gốc từ vi khuẩn và có khả năng kháng
khuẩn mà không gây ra tác động kháng thuốc ở vi sinh vật. Bacteriocin đầu tiên được tìm
thấy là colicin bởi Gratia vào năm 1925, đây là một loại peptide có khả năng tiêu diệt
E.coli.
Hiện nay có nhiều tài liệu ghi bacteriocin chính là antibiotic (modern food microbiologysixth edition. James M. Jay) hoặc xếp nó vào peptide antibiotic vì nó có bản chất là
polypeptide, có khả năng kháng khuẩn và do vi sinh vật tạo ra để chống lại các vi sinh vật
cạnh tranh khác, tương tự như với antibiotic (cuốn peptide antibiotics: discovery, modes
of action, and applications của Christopher J. Dutton). Trong khi một số khác, để phân
biệt rõ sự khác nhau giữa bacteriocin và antibiotic dùng trong điều trị và để tránh sự


 


nhầm lẫn giữa hai loại chất kháng khuẩn này, họ mới đặt tên cho các polypeptide mà có
khả năng kháng khuẩn và do vi khuẩn sinh ra là bacteriocin, và xếp nó vào nhóm
antimicrobial peptide (peptide kháng khuẩn).
Theo Cleveland and Tchikindas - 2001, có sự khác nhau rõ ràng giữa bacteriocin và
antibiotic dùng trong điều trị:
+ Trước khi nisin được dùng như tác nhân bảo quản thực phẩm, đã có nhiều nỗ lực
nghiên cứu để sử dụng nisin trong chữa trị cho người nhưng không thành công. Vì nisin
không có khả năng tiêu diệt vi khuẩn gram âm, bị tiêu hóa nhanh chóng và bị phá vỡ cấu
trúc khi đi vào cơ thể.
+ Nhìn chung, antibiotic là sản phẩm của sự trao đổi chất thứ cấp. Bacteriocin là sản
phẩm của sự đổi chất bậc một (sơ cấp), được tạo ra bằng cơ chế sinh tổng hợp protein
nhờ ribosome, có gene mã hóa bacteriocin trong tế bào vi khuẩn.
+ Nisin không được sử dụng trong điều trị bệnh ở người và động vật, không được sử
dụng làm phụ gia trong thức ăn chăn nuôi và chất làm tăng cường sự sinh trưởng cho
động vật.
+ Có nhiều nghiên cứu khác nhau đã chỉ ra rằng nisin không gây ra sự kháng thuốc kháng
sinh. Ví dụ, chuyển vi khuẩn vào trong môi trường chứa nồng độ gần gây chết của nisin
không làm thay đổi sự nhạy cảm của các VSV đối với các thuốc kháng sinh điều trị và
các loại thuốc hóa học điều trị khác.
Vì những điều nêu trên nên bacteriocin nên được xem là antimicrobial peptide, không
phải là antibiotic.
Ngoài ra còn một sự khác nhau rõ ràng giữa bacteriocin và antibiotic, bacteriocin chỉ do
vi khuẩn tạo ra và có khả năng kháng lại các vi khuẩn cùng loài – gram dương chỉ có thể
kháng gram dương (phổ kháng khuẩn hẹp) hoặc khác loại – gram dương có thể kháng lại
gram âm. Trong khi antibiotic có thể do các loại vi sinh vật tạo ra như vi khuẩn, nấm mốc
và phổ kháng khuẩn của nó rộng, hoạt tính tiêu diệt vi sinh vật cạnh tranh rất cao vì chỉ
cần với một lượng rất nhỏ nhưng đã tỏ ra hiệu quả.
Hiện nay đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng bacteriocin không những chỉ trong lĩnh vực
bảo quản thực phẩm, mà còn có tiềm năng ứng dụng trong cải thiện sức khỏe người, y
học thú, kiểm soát vụ thu hoạch, nông nghiệp, điều trị sinh học (bioremediation). (Theo

 


giới thiệu chung trong cuốn research and applications in bacteriocins của Margaret A.
Riley, Osnat Gillor).
2. Định nghĩa
Bacteriocin là protein hoặc polypeptid có khả năng kháng khuẩn sinh ra bởi vi khuẩn để
chống lại vi khuẩn khác.
Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính
bacteriocin đó. Ngoài ra không gây ra phản ứng dị ứng trong cơ thể con người gây ra các
vấn đề về sức khỏe, nhưng bacteriocin bị ảnh hưởng bởi tác động của các enzyme như
trypsin, pepsin, α-chymotrypsin…
Những sản phẩm do vi khuẩn sinh ra có khả năng gây ức chế những vi khuẩn khác có rất
nhiều như enzyme, antibiotic, bacteriocin... Hiện nay người ta đã phát hiện ra nhiều loại
bacteriocin do vi khuẩn tổng hợp nên như nisin (Lactococcus lactis), subtilin (Bacillus
subtilis), pediocin (Pediococcus acidilactici)…
Người ta đã đưa ra nhiều tiêu chí để định nghĩa bacteriocin, những tiêu chí này được
dùng trong nhiều trường hợp, áp dụng với nhiều mức độ khác nhau để định nghĩa những
loại bacteriocin khác nhau. Những tiêu chí như sau:
- Phạm vi ức chế đối với những loại khác
- Sự có mặt của loại protein hoạt động
- Cách thức hoạt động có tính kháng khuẩn
- Loại tế bào mà nó tác dụng
- Những yếu tố di truyền
- Do quá trình tổng hợp sinh học có tính ức chế
3. Phân loại bacteriocin
Dựa trên hệ thống phân loại bacteriocin của Klaenhammer và Cotter, người ta đã thống
nhất đưa ra bảng phân loại chung theo như sơ đồ sau:


 


Theo hệ thống phân loại bacteriocin rộng rãi (Universal bacteriocin classification
scheme), bacteriocin được phân làm 4 nhóm:
a. Nhóm I (Lantibiotic) được phân thành 3 nhóm phụ Ia, Ib, Ic
Chuỗi peptide ngắn (<6 kDa), thẳng, gồm các amino acid hiếm (lanthionine và/hoặc
methyllanthionine).
Bền nhiệt, lưỡng cực (đầu kị nước và đầu không kị nước), mang điện tích dương, do đó
hoạt động tiêu diệt vi khuẩn khác bằng cách kết hợp với các lipid mang điện tích âm trên
màng hình thành lỗ.


 


Bảng 1: các bacteriocin thuộc nhóm Ia, Ib, Ic và tên các chủng tạo ra chúng
Nhóm Ia

Nhóm Ib

Nisin A – Lactococcus lactis Mersacidin – Bacillus spp

Lacticin 3147 – Lc. lactis

(nhiều chủng)

DPC3147

Nisin Z – L (nhiều chủng)

Plantaricin C - L. plantarum

Mutacin B-Ny266 –

LL441

Streptococcus mutans

Plantaricin W –

Ny266

L.plantarum LMG 2379

Mutacin 1140 – Str.mutans
JH1000
Carnocin U149 –
Carnobacterium piscicola
149
Cytolysin – Enterococcus
faecalis DS16
Lacticin 481 – Lc. Lactis
CNRZ481; ADRIA85LO30
Lactocin S – Lactobacillus

 

Nhóm Ic


sake L45
Salivaricin A – Str.
Salivarius 20P3
Strepococcin A-FF22 – Str.
Pyogenes FF22
b. Nhóm II được phân thành 4 nhóm phụ a, b, c, d


Gồm 20-60 amino acid. Chuỗi peptide thẳng dài, chứa các acid amin không bị biến
đổi.



Mang điện tích dương, kị nước và bền nhiệt.

Nhóm Iia

Nhóm IIb

Nhóm IIc

Nhóm IId

Bavaricin A –

Acidocin J1132 – L.

Divergicin A – Cb.

Plantaricin 1.25β – L.

Lactobacillus sake

acidophilus JCM

divergens LV13

plantarum TMW 1.25

MI401

1132

Lactococcin A – Lc.

Bavaricin MN – L.

Lactacin F – L.

lactis subsp. cremoris

sake MN

johnsonii 11088

LMG 2130

Carnobacteriocin B2 – Lacticin 3147 – Lc.

Lactococcin 972 – Lc.

Carnobacterium

lactis DPC3147

lactis OPLA972

pisciocola LV17B

Lactobin A – L.

Plantaricin A – L.

Carnobacteriocin

amylovorus LMG P-

plantarum C11

BM1 – Cb. Piscicola

13139

LV17B

Lactococcin G – Lc.

Curvacin A – L.

latis LMG2081

curvatus LTH1174

Plantaricin EF – L.

Divercin V41 – Cb.

plantarum C11

divergens V41

Plantaricin JK – L.

Enterocin A –

plantarum C11

Enterococcus faecium

Plantaricin S – L.

CTC492/T136

plantarum LPCO10

Enterocin P – E.

Thermophilin T –

faecium P13

Streptococcus


 


Leucocin A/B –Talla

thermophilus ACA-

– Leuconostoc

DC 0040

gelidum UAL187; Ln.
carosum Talla
Mesentericin Y105 Ln. mesenteroides
Y105
Mundticin – E.
mundtii AT06
Pediocin PA1/AcH/SJ-1 –
Pediococcus parvulus
ATO34/ATO77;
Pediococcus
acidilactici H/SJ1/PAC 1.0
Piscicolin 126 – Cb.
piscicola JG126
Sakacin 674 – L. sake
LB764
Sakacin A – L. sake
LB 706
Sakacin P – L. sake
LB 673
Plantaricin C19 – L.
plantarum C19
Plantaricin 423 – L.
plantarum 423
+ Nhóm IIa: giống pediocin. Có khả năng chống lại Listeria nên được chú ý.
+ Nhóm IIb: gồm 2 chuỗi peptide khác nhau.

 


+ Nhóm IIc: cấu trúc vòng. Đầu tận cùng N và C nối với nhau bằng liên kết cộng
hóa trị.
+ Nhóm IId: bacteriocin gồm nhiều nhóm nối lại với nhau.

Nhóm IIc

Nhóm IIb

c. Nhóm 3: chia làm 2 nhóm phụ IIIa và IIIb
Chuỗi peptide dài (>15 kDa).
Protein có khả năng kháng khuẩn và kém bền nhiệt.
Có chứa cấu trúc domain.
+ Nhóm IIIa: làm thủng màng tế bào vi khuẩn
+ Nhóm IIIb: không làm thủng màng tế bào
d. Nhóm IV
Chuỗi peptide hình cầu.

Daptomycin
 

10 

Alpha amanitin 


4. Sinh tổng hợp bacteriocin
Bacteriocin có bản chất là protein hoặc polypeptide do đó được tổng hợp trong tế bào vi
khuẩn theo cơ chế tương tư như sinh tổng hợp protein ở sinh vật nhân sơ.
Trên gene của vi khuẩn có mang các thông tin mã hóa bacteriocin cũng như protein miễn
dịch tránh tác động của chính bacteriocin do vi khuẩn tạo ra. Các đoạn gene này có thể
nằm trên nhiễm sắc thể, plasmid hoặc transposon của tế bào vi khuẩn. Gene bacteriocin
nằm trên nhiễm sắc thể như ở trường hợp subtilin, mersacidin; trên plasmid như
divergicin A, sakacin A; trên transposon như nisin, lacticin 481.
Tổng hợp các chất kháng khuẩn bacteriocin được quy định bởi 4 gene khác nhau:
+ Gene tạo ra chất tiền thân của bacteriocin: pre-bacteriocin.
+ Gene tạo miễn dịch cho chủng sản xuất (immunity gene).
+ Gene mã hóa kênh vận chuyển cho pre-bacteriocin ra khỏi tế bào kích hoạt cơ chế vận
chuyển đặc biệt (kênh vận chuyển ABC – ABC transporter)
+ Gene kích hoạt cơ chế tạo ra protein tiếp nhận thông tin (accessing protein), giữ vai trò
quan trọng vận chuyển và kích hoạt hoạt động kháng khuẩn của bacteriocin khi
bacteriocin được xuất ra khỏi tế bào (từ pre-bacteriocin thành bacteriocin).
Ngoài ra còn có những gene khác trong sinh tổng hợp bacteriocin được tìm thấy ở nhóm
II.
Khi gặp vi khuẩn đối nghịch, để tổng hợp ra Bacteriocin tiêu diệt/ức chế vi khuẩn đối
nghịch cần phải có cơ chế điều hòa tổng hợp bacteriocin, đó chính là operon.

Cấu trúc của một operon gồm
Gene điều hòa (Promoter) – trình tự nucleotide để 1 gene được phiên mã. Promoter
được nhận diện bởi RNA polymerase, bắt đầu quá trình phiên mã mRNA. Trong tổng
hợp RNA, promoter chỉ thị gene nào cần được sử dụng để tạo mRNA, do đó kiểm soát tế
bào tạo ra protein nào, protein ức chế để gắn vào gene chỉ huy hay protein cần cho tế bào
hoạt động.
11 
 


Gene chỉ huy (Operator) – một đoạn DNA để protein kiềm hãm gắn vào, do đó ngăn
cản RNA polymerase phiên mã gene.
Gene cấu trúc (Structural gene) – các gene được điều hòa tổng hợp bởi operon.
Quay trở lại cơ chế sinh tổng hợp bacteriocin, trên gene cấu trúc có mang thông tin để
phiên mã tạo mRNA chứa thông tin tạo ra pre-bacteriocin (tiền bacteriocin) cũng như các
gene khác như gene miễn dịch (giúp bảo vệ vi khuẩn khỏi tác động tiêu diệt/ức chế của
bacteriocin do chính nó tạo ra)... mRNA sau đó cùng với ribosome, tRNA đi vào quá
trình dịch mã tạo ra pre-bacteriocin, protein miễn dịch...
Sau khi quá trình phiên mã, dịch mã tạo ra pre-bacteriocin, dưới tác động của các enzyme
trong tế bào chất, pre-bacteriocin khi được giải phóng ra khỏi màng tế bào được cắt bỏ
leader peptide để tạo thành bacteriocin hoàn chỉnh có khả năng kháng khuẩn và được vận
chuyển ra khỏi màng thông qua hệ thống vận chuyển ABC. Vai trò của leader peptide
trong pre-bacteriocin là để bảo vệ vi khuẩn chính nó khỏi tác động tiêu diệt của
bacteriocin trong khi tạo ra nó.

Sơ đồ 1: sinh tổng hợp bacteriocin nhóm I (lantibiotic)
12 
 


Mỗi nhóm phân loại bacteriocin sẽ có cơ chế sinh tổng hợp bacteriocin khác nhau, nhưng
nhìn chung sau khi phiên mã, dịch mã tạo ra pre-bacteriocin, sau khi được giải phóng ra
khỏi màng tế bào cùng với việc cắt bỏ leader peptide tạo khả năng kháng khuẩn hoàn
chỉnh cho bacteriocin, bacteriocin hoặc IF (một peptide có cấu trúc giống bacteriocin
nhưng không có hoạt tính kháng khuẩn) sẽ tác động vào HPK (histidine protein kinase)
truyền tín hiệu xuống RR (response regulator) để kích hoạt tiếp quá trình phiên mã của
các gene như gene cấu trúc, gene miễn dịch… Tùy vào bacteriocin thuộc nhóm I hay
nhóm II mà HPK sẽ nhận biết sự hiện diện của bacteriocin (nhóm I) hay IF (nhóm II)
(xem sơ đồ 1 và 2).

Sơ đồ 2: sinh tổng hợp bacteriocin nhóm II
Sự miễn dịch - bảo vệ vi khuẩn khỏi tác động tiêu diệt của bacteriocin do chính nó tạo
ra
Hoạt động kháng khuẩn của bacteriocin đã thúc đẩy vi khuẩn sản xuất phát triển một hệ
thống bảo vệ chính nó khỏi tác động của bacteriocin.
Ở nhóm I - lantibiotic có các protein miễn dịch, LanI và các protein vận chuyển ABC
chuyên dụng (dedicated ABC-transport proteins), LanFEG (sơ đồ 1). Hai hệ thống này
13 
 


cùng hoạt động để bảo vệ tế bào sản xuất khỏi tác động bacteriocin của chính nó. Lan I,
gắn với màng tế bào phía bên ngoài, ngăn cản hình thành lỗ trên màng tế bào dưới tác
động của bacteriocin do chính vi khuẩn tạo ra. LanFEG có vai trò vận chuyển các phân tử
bacteriocin vào ra màng tế bào và do đó duy trì nồng độ bacteriocin trong màng dưới
điểm tới hạn.
Ở nhóm II, protein miễn dịch gắn trên màng tế bào, mang điện tích dương, từ 51-254
amino acid, tạo ra sự miễn dịch hoàn toàn bacteriocin do nó sản xuất ra.
Vậy, nhìn chung vi khuẩn tự nó hình thành hệ thống miễn dịch bảo vệ chính nó khỏi tác
động kháng khuẩn của bacteriocin sau khi bacteriocin được giải phóng ra khỏi màng,
bằng cách hình thành protein miễn dịch đính trên màng tế bào.
II. Cơ chế hoạt động
1. Cơ chế hoạt động

Cơ chế hoạt động của bacteriocin
Sự phân loại bacteriocin ngoài dựa vào cấu trúc còn dựa vào cơ chế hoạt động của
bacteriocin.
Quá trình tác động của bacteriocin có thể được phân làm hai giai đoạn:
‐ Giai đoạn I: bacteriocin hấp thụ lên bề mặt tế bào vi khuẩn nhờ vào các thụ thể trên bề
mặt. Giai đoạn này chưa có tác động tích cực trong việc tiêu diệt vi khuẩn.
14 
 


‐ Giai đoạn II : bacteriocin tạo ra các kênh để thâm nhập vào bên trong màng nguyên
sinh hoặc cũng có thể chúng tác động trực tiếp lên thành peptidoglycan.
Nhóm I - điển hình là nisin: các bacteriocin khác nhau thì cơ chế tác động có thể là lên
thành peptidoglycan hoặc màng nguyên sinh, hoặc kết hợp cả hai cơ chế. Ví dụ: nisin có
cả hai cơ chế trong khi đó thì lacticin thì chỉ có khả năng tác động lên thành
peptidoglycan .
‐ Đối với thành peptidoglycan: lipid II giữ vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển
các đơn vị tổng hợp nên thành peptidoglycan từ trong tế bào chất. Bacteriocin thuộc
nhóm này có khả năng liên kết với lipid nằm trên màng nguyên sinh, sự liên kết này
được giải thích rằng do phần lớn bacteriocin mang điện tích (+) và lipid màng mang
điện tích (-) vì thế sự liên kết được dễ dàng tạo ra trên màng nguyên chất. Sau khi tạo
liên kết, bacteriocin sẽ khóa lipid làm chúng mất khả năng vận chuyển các tiểu đơn vị
cấu tạo nên thành peptidoglycan.
‐ Đối với màng sinh chất: bacteriocin liên kết và sử dụng lipid trên màng nguyên sinh
thực hiện quá trình oxi hóa khử, lúc này lipid có tác dụng như những con dao cắt tạo
nên những lỗ hỏng trên màng nguyên sinh. Những lỗ hỏng này làm thất thoát nhiều các
ion, các chất hòa tan trong nguyên sinh chất (muối khoáng, amino acid, acid
nucleics…), làm thủy phân và thất thoát nhiều ATP dẫn đến tế bào chết nhanh chóng
hơn.
Nhóm II - điển hình Sakacin: do thuộc nhóm kỵ nước sau khi tạo ra kênh dẫn vào được
bên trong màng nguyên sinh bacteriocin thuộc nhóm này sẽ liên kết với lipid trong thành
phần phospholipid màng, chúng sẽ gắn trực tiếp vào màng như một thành phần của màng,
sau đó thực hiện các phản ứng oxi hóa khử tạo nên những lỗ hỏng và tác động như nhóm
I.
Nhóm III - điển hình lysostaphin: tác động trực tiếp lên thành tế bào, làm phân hủy tan
thành tế bào và phá vỡ tính thẩm thấu.
Nhóm IV: hiện nay các nhà khoa học vẫn chưa đưa ra một kết luận cụ thẻ rõ rang nào
cho cơ chế tác động của nhóm này. Theo sự giả định của các nhà khoa học, họ cho rằng
nhóm này tác động chủ yếu lên DNA, RNA, sự tổng hợp protein. Các bacteriocin nhóm
này có thể tạo phức hợp không tan với DNA ngăn cản DNA tổng hợp nên RNA và
15 
 


protein, hoặc liên kết với DNA làm dịch mã ra các protein không bình thường, cũng có
thể nó liên kết trực tiếp và phong bế hoạt động của protein.
2. Các nhân tố ảnh hưởng khả năng hoạt động
™ Các nhân tố lý hóa liên quan đến thực phẩm:
- Trạng thái vật lí của thực phẩm: bacteriocin có tác dụng tốt trong môi trường thực
phẩm lỏng hơn trong môi trường thực phẩm rắn. Do trong môi trường lỏng bacteriocin
có khả năng hòa tan và phân tán tốt hơn làm tăng hiệu quả hoạt động.
- Thành phần của thực phẩm, pH thực phẩm: một số thành phần của thực phẩm có thể
liên kết được với bacteriocin do đó nó có thể hạn chế sự biến tính của bacteriocin trong
quá trình xử lí nhiệt. Nhưng nếu thực phẩm có hàm lượng lipid càng cao thì khả năng
mất hoạt tính của bacteriocin càng cao do nó có khả năng liên kết tốt với bacteriocin vì
thế hoạt lực của chúng giảm đi đáng kể.
- Các chất phụ gia thêm vào và các ion (+) đa hóa trị : các chất phụ gia thêm vào cũng có
khả năng làm mất đi đáng kể hoạt lực của bacteriocin do sự liên kết với bacteriocin
hoặc sự lien kết của chúng với phospholipid của tế bào vi khuẩn lúc này chúng là
những tác nhân bảo vệ tế bào vi khuẩn đặc biệt là các chất mang điện tích đa hóa trị
như : Ca2+, Mg2+ …
- Chế độ xử lí nhiệt : chế độ xử lý nhiệt không phù hợp (quá cao) sẽ làm mất tác động
của bacteriocin do có bản chất protein nên chúng sẽ bị biến tính trong quá trình xử lý
nhiệt. ví dụ UHT làm mất 40% hoạt lực của bacteriocin.
- Các hợp chất hợp lực với bacteriocin: một là bản thân những chất này có khả năng
kháng lại vi khẩn vì thế có thể hỗ trợ cho bacteriocin, hai là có tác dụng liên kết với các
thành phần lipid hoặc các muối trong thực phẩm vì thế làm giảm sự tương tác của
chúng với bacteriocin. ví dụ lysozym, chất nhũ hóa, đường sucrose…
™ Các nhân tố vi sinh liên quan đến thực phẩm:
- Các nhân tố tác động của bacteriocin trong quá trình bảo quản: nhiệt độ ảnh hưởng đến
tính ổn định chúng có thể làm biến tính, thất thoát protein, việc tăng pH có thể làm
giảm khả năng hòa tan và phân tán của bacteriocin trong thực phẩm.
- Số lượng vi sinh vật và bào tử ban đầu.

16 
 


- Loại vi sinh vật: ảnh hưởng khả năng nhạy cảm, loại, hàm lượng bacteriocin. Tùy vào
loại thực phẩm thì sẽ có hệ vi sinh vật nhất định gây ra quá trình hư hỏng của chúng
chính vì thế cần lựa chọn loại bacteriocin và hàm lượng cho thích hợp. Tùy vào loại
bacteriocin mà chúng có thể có gây tác động với loại vi sinh vật này mà không tác động
lên vi sinh vật khác, và mỗi loài vi sinh vật có một khả năng nhạy cảm nhất định.
- Trạng thái sinh lý của vi sinh vật: giai đoạn phát triển (trong pha lag của vi sinh vật
bacteriocin có tác động mạnh nhất), sư hình thành bào tử, khuẩn lạc, biofilm (có thể
làm cản trở sự tác động của bacteriocin lên tế bào vi sinh vật).
- Enzym: sự tác động của enzyme nội tại (trong thực phẩm) và ngoại lai (do vi sinh vật
tiết ra) có thể gây biến tính và làm giảm hoạt lực của bacteriocin.
III. Thu nhận và phương pháp chiết tách bacteriocin:
1. Thu nhận bacteriocin bằng phương pháp lên men bởi tế bào lactococcus lactis cố
định trên chất mang cellulose vi khuẩn (BC).


Kỹ thuật cố định tế bào đang được đề cập và quan tâm nhiều, đặc biệt trong các lĩnh vực
lên men sản xuất các sản phẩm trao đổi chất.



Bacteriocin được sản sinh bởi vi khuẩn lactis là tác nhân sinh học an toàn trong bảo quản
thực phẩm.

ƒ

Phương pháp bẫy - hấp phụ
Quy trình thu nhận:



Hoạt hoá chủng vi khuẩn phân lập trong môi trường MT1 ở 30oC, kỵ khí, 6 giờ.



Bổ sung chất mang BC vô trùng vào dịch tế bào đã hoạt hoá.
Quá trình cố định trên chất mang BC sẽ trải qua 2 giai đoạn liên tiếp:



Giai đoạn hấp phụ: trong khoảng 30 phút đầu tiên sau khi ngâm BC trong dịch tế bào,
lúc này BC sẽ hút nước trong môi trường để trương nở về trạng thái ban đầu. Khi nước đi
vào cấu trúc BC, nó sẽ mang cả tế bào vi khuẩn đi vào. Tại đây, tế bào sẽ được hệ thống
sợi cellulose trong chất mang BC giữ lại. Đồng thời trên bề mặt BC cũng có tế bào được
hấp phụ.



Giai đoạn bẫy tăng sinh: kế tiếp giai đoạn hấp phụ. Các tế bào đã được hấp phụ giai
đoạn trên sẽ sử dụng cơ chất khuếch tán từ môi trường để sinh trưởng và phát triển trên
giá đỡ BC, tiếp tục ủ ở điều kiện tối ưu của vi sinh vật cố định.
17 

 


Lên men tế bào cố định ở quy mô phòng thí nghiệm trong fermenter (8 lít) để thu nhận
bacteriocin.
Dịch bacteriocin thô được thu hồi từ lên men sử dụng chủng Lactococcus lactis 1 bằng
phương pháp ly tâm thu dịch nổi và trung hoà về pH 6.0 bằng CaCO3.
Chiết tách được bacteriocin.
ƒ

3 yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình cố định là: chế độ khuấy đảo trong quá
trình hấp phụ, thời gian ủ và nhiệt độ trong thời gian ủ
+ Ảnh hưởng của chế độ khuấy đảo trong quá trình cố định bằng phương pháp hấp
phụ:
Việc kết hợp sử dụng cánh khuấy (phương pháp B) và máy lắc (200 vòng/ phút) (phương
pháp C) trong quá trình này để gia tăng hiệu suất hấp phụ
Hai phương pháp cải tiến nhằm gia tăng khả năng hấp phụ tế bào vi khuẩn trên chất mang
đều đạt được kết quả. Mật độ gia tăng từ 3,28x108 tế bào/ g lên đến 3,84x108 (phương
pháp B) và 3,86x108 tế bào/ g (phương pháp C).

A: Phương pháp cổ điển (ngâm)

B: Sử dụng cánh khuấy

C: Sử dụng máy lắc

Biểu đồ 1. Mật độ tế bào vi khuẩn cố định trên chất mang qua các phương pháp hấp phụ.
+ Ảnh hưởng của thời gian ủ trong quá trinh cố định bằng phương pháp bẫy – hấp
phụ:
Thời gian ủ chính là thời gian vi khuẩn tăng sinh trên giá thể BC để nhốt thêm một lượng
lớn tế bào vi khuẩn trong mạng lưới cellulose sau quá trình hấp thụ.
Khảo sát khả năng hấp phụ của tế bào vi khuẩn Lc.lactis 1 trên giá thể BC, nhận thấy mật
độ tế bào trên chất mang đạt giá trị cao sau 1 ngày cố định (3,46 x 109 tế bào/g) và đạt
18 
 


giá trị cực đại vào ngày thứ 2 (6,41 x 109 tế bào/g); càng kéo dài thời gian bẫy tăng sinh
thì mật độ tế bào trên chất mang càng có xu hướng giảm (đồ thị 1).
Vậy, thời gian ủ tối ưu để cố định tế bào Lc.lactis 1 trên chất mang BC là 2 ngày.

Đồ thị 2. Sự biến đổi mật độ tế bào vi khuẩn theo thời gian ủ trên chất mang BC
+ Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ đến lượng tế bào cố định trong quá trình bẫy – hấp
phụ:
Nhiệt độ trong thời gian ủ của quá trình bẫy-hấp phụ chính là nhiệt độ cần thiết để tăng
sinh khối vi khuẩn trên giá thể BC
Với 6 mức khảo sát nhiệt độ từ 40C đến 400C, lượng tế bào phát triển trong chất mang
BC cao nhất khi ủ ở 300C đạt 7,67x109 tế bào/ g (biểu đồ 2).

Biểu đồ 2. Sự biến đổi mật độ tế bào vi khuẩn cố định theo nhiệt độ ủ

19 
 


ƒ

Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến thu nhận bacteriocin

ƒ

Ứng dụng chế phẩm vi khuẩn Lc. lactis cố định trên chất mang BC để lên men thu
nhận bacteriocin:
Hoạt tính bacteriocin trong 9 lần lên men tái sử dụng khoảng 800 AU/ml và không có sự
khác biệt so với đối chứng khi lên men bằng tế bào tự do. Từ lần lên men tái sử dụng thứ
10, hoạt tính có xu hướng giảm (biểu đồ 3).
Lượng bacteriocin thô thu được trong 10 lần lên men tái sử dụng khoảng 3,5 g/l, không
có sự khác biệt so với đối chứng. Từ lần tái sử dụng thứ 11, lượng bacteriocin giảm
nhanh còn 2,85 g/l.
Xét về cả số lượng và chất lượng bacteriocin tạo thành, có thể tái sử dụng chế phẩm tế
bào cố định khoảng 9-10 lần.

20 
 


Biểu đồ 3. Hoạt tính bacteriocin của các lần tái sử dụng chế phẩm tế bào cố định trên BC
Có thể tái sử dụng 9-10 lần mà vẫn đảm bảo về mặt thời gian lên men, số lượng và chất
lượng bacteriocin
2. Phương pháp chiết tách bacteriocin
Bacteriocin có bản chất là protein nên việc chiết tách bacteriocin chính là chiết tách
protein. Các phương pháp chiết tách và tinh sạch protein đều dựa trên những tính chất
hoá lý của protein như độ tích điện, kích thước phân tử, độ hoà tan của protein cần chiết
rút. Nhiều protein còn liên kết với các phân tử sinh học khác nên việc chiết rút các
protein này còn phụ thuộc vào bản chất của các liên kết. Muốn thu nhận protein nguyên
thể tức là protein có tất cả tính chất tự nhiên đặc trưng của nó, cần sử dụng các biện pháp
khác nhau.


Phương pháp nhiệt độ:
Để tách các protein khác nhau dựa trên khả năng kết tủa của chúng người ta có thể sử
dụng phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt. Phương pháp này chỉ nên
dùng với các protein bền với nhiệt. Dịch protein được giữ ở 50-70oC trong thời gian xác
định, sau đó protein tạp đã bị biến tính được loại bỏ bằng cách lọc hoặc ly tâm. Như vậy,
dịch chiết protein thô bền với nhiệt có thể được thu nhận bằng cách cho kết tủa không
thuận nghịch.
Để thu nhận chế phẩm protein theo phương pháp kết tủa thuận nghịch bằng các muối
trung tính, cần tiến hành ở nhiệt độ thấp, đối với dung môi hữu cơ cần tiến hành ở nhiệt
độ dưới 0oC để tránh biến tính.



Phương pháp nồng độ proton
Ở giá trị nồng độ ion H + cố định, các protein khác nhau trong hỗn hợp sẽ có tổng điện
tích khác nhau. Các phân tử protein mang điện tích tổng số cùng dấu đẩy nhau ra xa nên
dễ tan vào dung dịch. Các phân tử protein mang điện tích trái dấu sẽ hút nhau và loại
nước ra sau đó kết tủa trong dung dịch.
Mỗi một protein có một giá trị pH nhất định mà ở đó tổng số điện tích âm và điện tích
dương trong phân tử bằng nhau. Giá trị đó gọi là điểm đẳng điện của protein. Điểm đẳng
điện của các axit amin trung tính có giá trị pH tử 5.6-7.0, đối với các axit amin có tính
axit là từ 3.0-3.2, đối với các axit amin có tính kiềm là từ 9.7-10.8. Ở điểm đẳng điện độ
21 

 


hoà tan của protein là thấp nhất, protein dễ bị kết tủa. Dựa vào tính chất này người ta có
thể tách từng phần protein trong hỗn hợp.
Dùng phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của pH môi trường. Dịch protein
được giữ ở pH<5 trong thời gian xác định. Protein tạp cũng được loại bỏ bằng cách lọc
hoặc ly tâm.


Phương pháp dùng tác nhân hoá học
Có thể dùng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ để tách chiết các protein. Phương
pháp này tiến hành dựa trên cơ sở: độ hoà tan của protein phụ thuộc vào sự tương tác của
các nhóm tích điện trong phân tử protein với các phân tử nước. Sự tương tác đó (còn gọi
là sự hydrat hoá) sẽ bị giảm xuống khi thêm vào dung dịch protein các dung môi hữu cơ
hoặc các muối trung tính. Dung môi hữu cơ thường dùng là ethanol, isopropanol, acetone
hoặc hỗn hợp các loại rượu.
Khi sử dụng các dung môi hữu cơ, cần chú ý tiến hành ở nhiệt độ thấp (từ 5oC trở
xuống). Dùng dung môi hữu cơ có thể tiến hành tách phân đoạn dưới 0oC và có thể đến 20oC như vậy có tác dụng tốt đến độ ổn định của protein. Khi đã có kết tủa, chú ý lấy
nhanh kết tủa ra khỏi dung môi bằng cách dùng máy ly tâm lạnh.
Các muối trung tính có thể dùng là (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4… Tuy nhiên người ta
nhận thấy muối (NH4)2SO4 là tốt nhất vì nó không làm hại và làm ổn định hầu hết các
loại protein. Loại muối này lại rẻ tiền và phổ biến. Độ hòa tan của nó rất lớn ngoài ra
nồng độ (NH4)2SO4 cần thiết để kết tủa protein khác nhau thì khác nhau rất nhiều.
Khái niệm về số phần trăm của độ bão hoà hoàn toàn đã được đề cập đến. Protein có thể
bị kết tủa ở 50% hoặc 70% của độ bão hoà hoàn toàn của (NH4)2SO4. Khi cho dung dịch
(NH4)2SO4 bão hoà vào dịch chiết protein thì nồng độ (NH4)2SO4 không tăng đột ngột,
sau khi kết tủa xong người ta thường để lắng 2 giờ hoặc qua đêm, mục đích là tạo kết tủa
hoàn toàn (ở phương pháp dùng dung môi hữu cơ thì không cần để lâu. Kết tủa được lấy
ra bằng cách ly tâm lạnh hoặc lọc qua phễu Buchner. Khi hoà tan kết tủa lại người ta
thường thêm ion Ca++ để làm bền protein.

IV.

Ứng dụng bacteriocin trong thực phẩm
Yêu cầu đối với việc sử dụng chất bảo quản sinh học trong thực phẩm trên thị
trường:
22 

 




Chất bảo quản sinh học được sử dụng không có tính độc và kích thích sự kháng thuốc của
vi sinh vật khác.



Được cơ quan thẩm quyền công nhận và cho phép sử dụng.



Phải được sử dụng một cách hợp kinh tế trong công nghiệp.



Sản phẩm có bổ sung chất bảo quản sinh học phải không bị ảnh hưởng. Ví dụ: chất bảo
quản sinh học không gây tác động xấu đối với đánh giá cảm quan của sản phẩm.



Vẫn tỏ ra hiệu quả khi được dùng ở nồng độ tương đối thấp.



Chất bảo quản sinh học phải đủ bền khi được cất trữ.



Không được sử dụng trong chữa bệnh hoặc dùng làm phụ gia thực phẩm cho thú hay bổ
sung vào thức ăn giúp tăng sự phát triển của thú.

1. Nisin
Hiện nay tuy đã phát hiện nhiều loại bacteriocin và một số loại cũng đã ứng dụng trong
bảo quản thực phẩm, nhưng loại bacteriocin được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay là nisin.
Định nghĩa nisin
+ Là polypeptide có cấu trúc gần giống với subtilin, nhưng khác nhau ở đầu tận cùng N.
+ Là 1 hợp chất kị nước và có thể bị tác động bởi metabisulfite, titanium oxide, các
enzyme thủy phân protein.
Đặc điểm của nisin
+ Không gây độc.
+ Được tạo ra từ các chủng Lactococcus lactis.
+ Bền nhiệt và ổn định bảo quản tốt.
+ Bị phá hủy bởi enzyme tiêu hóa.
+ Không gây ra mùi khó chịu.
+ Dãy hoạt động kháng khuẩn hẹp.
Tác dụng: chống lại vi khuẩn gram dương hình thành bào tử sơ khai và không có hiệu
quả đối với nấm và vi khuẩn gram âm.
Nisin lần đầu tiên được sử dụng để ngăn chặn sự hư hỏng ở phomai Thụy Sĩ (Swiss
cheese) gây ra do Clostridium butyricum. Sau đó khả năng sử dụng của nó trong thực
phẩm được mở rộng ra nhiều nước trên thế giới.

23 
 


Bảng 1. Bảng quy định nồng độ Nisin có trong thực phẩm ở một số nước.
24 
 


2. Các sản phẩm thực phẩm
2.1 Các sản phẩm từ sữa
Muối Nitrate thường được dùng để ức chế sự phát triển của clostridia gây ra các hư hỏng
trong phomai như Clostridium tyrobutyricum. Ngoài ra L. monocytogenes cũng là một
mối bận tâm khác, vì pH tăng trong suốt quá trình chín của phomai.
Bacteriocin, cụ thể là nisin được sử dụng rộng rãi để thay thế muối nitrate.
2.2 Thực phẩm đóng hộp
Người ta dùng nisin thay thế muối nitrate/nitrite trong các sản phẩm thịt đóng hộp vì
nisin ngăn chặn sự nảy mầm quá nhanh của bào tử C.botulinum không gây hại đối với
sức khỏe.
Đối với thực phẩm đóng hộp thường xử lý nhiệt trong thời gian Fo = 6 -8 phút để bất hoạt
bào tử C.botulinum và các vi khuẩn gây hư hỏng khác. Thêm nisin xử lý nhiệt giảm
xuống Fo = 3 phút là bất hoạt bào tử C.botulinum làm tăng chất lượng sản phẩm. Nisin
ngăn chặn sự nảy mầm của bào tử bằng cách tác động lên chu trình nảy mầm ở giai đoạn
sớm.
2.3 Các sản phẩm thịt
Nisin được dùng để thay thế muối nitrate/nitrite trong quá trình chế biến thịt. Tuy nhiên
hiệu quả sử dụng không cao như trong các sản phẩm từ sữa, vì nisin hòa tan kém trong
môi trường pH tăng lên ở sản phẩm thịt.
Để tăng hiệu quả, người ta sử dụng bacteriocin được tạo ra từ các chủng phân lập trong
sản phẩm thịt như Pediococcus, Leuconostoc, Carnabacterium và Lactobacillus spp.
Ngoài ra, các bacteriocin như sakacin, pediocin, curvaticin hay mesenterocin được thêm
vào các sản phẩm như xúc xích hun khói (bologna), frankfurter và các loại thịt đùi muối
hun khói… Các bacteriocin này giúp chống lại hoặc làm giảm sự phát triển của
L.monocytogenes.
Ngoài ra người ta ngâm màng BC vào trong dịch bacteriocin thô trong 30 phút, màng
BC được trương nở và hấp phụ bacteriocin tạo thành màng mỏng. Màng BC trong suốt

25 
 


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×