Tải bản đầy đủ

PHÁT HIỆN CÁC YẾU TỐ ĐỘC LỰC CỦA ESCHERICHIA COLI TRONG PHÂN HEO SƠ SINH VÀ CAI SỮA TIÊU CHẢY BẰNG KỸ THUẬT PCR

BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y
****************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÁT HIỆN CÁC YẾU TỐ ĐỘC LỰC CỦA ESCHERICHIA
COLI TRONG PHÂN HEO SƠ SINH VÀ CAI SỮA
TIÊU CHẢY BẰNG KỸ THUẬT PCR

Sinh viên thực hiện: HUỲNH THỊ THANH THANH
Lớp: DH07DY
Ngành: Thú Y chuyên ngành Dược
Niên khóa: 2007 – 2012

Tháng 08/2012


BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y
****************

HUỲNH THỊ THANH THANH

PHÁT HIỆN CÁC YẾU TỐ ĐỘC LỰC CỦA ESCHERICHIA
COLI TRONG PHÂN HEO SƠ SINH VÀ CAI SỮA
TIÊU CHẢY BẰNG KỸ THUẬT PCR
Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Bác sỹ thú y
Chuyên ngành Dược
Giáo viên hướng dẫn
PGS. TS. NGUYỄN NGỌC TUÂN
KS. VĂN NGỌC DUNG

Tháng 08/2012

i


PHIẾU XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN
Họ và tên : HUỲNH THỊ THANH THANH
Lớp : DH07DY
Tên đề tài : “Phát hiện các yếu tố độc lực của E. coli trong phân heo sơ sinh và cai
sữa tiêu chảy bằng kỹ thuật PCR”
Khóa luận đã được thực hiện theo đúng yêu cầu của giáo viên hướng dẫn và các ý
kiến, đóng góp của hội đồng chấm luận văn.
Ngày….. tháng….. năm 2012
Giáo viên hướng dẫn

PGS. TS. NGUYỄN NGỌC TUÂN

ii


LỜI CẢM TẠ
Lời đầu tiên, con cảm ơn cha mẹ và những người thân trong gia đình đã
luôn chăm sóc, nuôi dưỡng và dạy dỗ con cho tới ngày hôm nay.
Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc thầy Nguyễn Ngọc Tuân đã nghiêm khắc, quan
tâm, hướng dẫn, chỉ bảo tận tình cho con trong quá trình thực tập và hoàn thành
luận văn tốt nghiệp.


Tôi xin gửi lời trân trọng cảm ơn:
- Ban giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
- Ban chủ nhiệm khoa Chăn nuôi – Thú y.
- Quý thầy cô khoa Chăn nuôi – Thú y luôn tận tình, hết lòng vì học trò.
Chân thành cảm ơn thầy Lê Hữu Ngọc, cô Văn Ngọc Dung, anh chị và các
em phòng thực hành Kiểm nghiệm Thú sản và Môi trường Sức khỏe Vật nuôi, Viện
Công nghệ Sinh học và Công nghệ Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm TP.
HCM nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành đề tài.
Tôi xin cảm ơn tất cả bạn bè đã động viên, chia sẻ những buồn vui trong
quãng đời sinh viên của tôi.
Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến chị Trần Thị Mỹ Phúc tận tình chỉ bảo
và đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian thực tập.
Và lời cuối cùng, xin kính chúc toàn thể Quý thầy cô trong Khoa Chăn
nuôi – thú y luôn dồi dào sức khỏe và gặt hái được nhiều thành công trong sự
nghiệp giáo dục và hoạt động nghiên cứu của mình.
Xin chân thành cảm ơn!
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 1 tháng 8 năm 2012
Sinh viên

Huỳnh Thị Thanh Thanh

iii


TÓM TẮT
Đề tài “Phát hiện các yếu tố độc lực của Escherichia coli trong phân heo sơ
sinh và cai sữa tiêu chảy bằng kỹ thuật PCR” được thực hiện tại trường Đại Học
Nông Lâm TP. HCM, từ tháng 12/2011 đến tháng 6/2012. Quá trình nghiên cứu bao
gồm thu thập và xử lý 48 mẫu phân heo sơ sinh và cai sữa, xác định tổng số vi
khuẩn E. coli, dùng kỹ thuật PCR để phát hiện gen độc lực. Kết quả thu được:
Số lượng vi khuẩn E. coli trong phân heo sơ sinh tiêu chảy giai đoạn 1 – 21
ngày tuổi là 1,58*108 MPN/g, cao hơn heo con giai đoạn 22 – 45 và 46 – 90 ngày
tuổi.
Tỉ lệ phát hiện các gen độc lực của E. coli trong phân heo sơ sinh và heo cai
sữa tiêu chảy là 43,75 %.
Tỉ lệ phát hiện gen astA cao (37,5 %), cho thấy rằng gen astA sản sinh yếu
tố độc lực EAST1, có thể là yếu tố độc lực quan trọng của dòng E. coli gây bệnh
trong phân heo con tiêu chảy từ 1 – 21 ngày tuổi, và là yếu tố hiệp lực trong sự phát
sinh bệnh tiêu chảy do E. coli trên heo giai đoạn 22 – 90 ngày tuổi (heo sau cai sữa
đến 3 tháng).
Chưa phát hiện được gen lt-I và gen stx1 của E. coli trong 48 mẫu phân heo
sơ sinh và cai sữa.

iv


MỤC LỤC
LỜI CẢM TẠ ............................................................................................................ iii
TÓM TẮT ................................................................................................................. iv
MỤC LỤC ...................................................................................................................v
Chương 1 MỞ ĐẦU ....................................................................................................1
1.1 Đặt vấn đề .........................................................................................................1
1.2 Mục đích và yêu cầu .........................................................................................2
1.2.1 Mục đích.....................................................................................................2
1.2.2 Yêu cầu.......................................................................................................2
Chương 2 TỔNG QUAN ............................................................................................3
2.1 Vi khuẩn Escherichia coli .................................................................................3
2.1.1 Định nghĩa ..................................................................................................3
2.1.2 Nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa ..................................................................3
2.1.3 Yếu tố kháng nguyên .................................................................................4
2.1.4 Phân loại E. coli gây bệnh ..........................................................................5
2.2 Nhóm STEC/ VTEC/ EHEC .............................................................................7
2.2.1 Độc tố Shiga (Shiga toxin) .........................................................................7
2.2.2 Yếu tố kết bám intimin...............................................................................7
2.2.3 Độc tố ruột chịu nhiệt EAST1: ..................................................................8
2.3 NHÓM ETEC (Enterotoxigenic E. coli) ...........................................................8
2.3.1 Yếu tố độc lực ............................................................................................8
2.3.2 Tiêu chảy do nhóm ETEC ........................................................................10
2.4 NHÓM EPEC (Enteropathogenic E. coli) ......................................................11
2.5 Kỹ thuật PCR ..................................................................................................12
2.5.1 PCR là gì? ................................................................................................12
2.5.2 Nguyên tắc của PCR ................................................................................13
2.5.3 Các thành phần của một phản ứng PCR ..................................................14

v


2.5.4 Phân tích kết quả PCR .............................................................................15
2.6 Những công trình nghiên cứu liên quan..........................................................16
2.6.1 Trong nước ...............................................................................................16
2.6.2 Thế giới ....................................................................................................16
Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM .................................17
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện......................................................................17
3.1.1 Thời gian thực hiện ..................................................................................17
3.1.2 Địa điểm thực hiện ...................................................................................17
3.2 Nội dung thực hiện ..........................................................................................17
3.3 Phương pháp thực hiện....................................................................................17
3.3.1 Thu thập mẫu............................................................................................17
3.3.2 Nuôi cấy và phân lập vi khuẩn .................................................................18
3.3.3 Ly trích DNA ...........................................................................................19
3.3.4 Xác định gen liên quan đến yếu tố độc lực của E. coli ............................19
3.4 Chỉ tiêu khảo sát ..............................................................................................20
Chương 4 KẾT QUẢ - THẢO LUẬN ......................................................................22
4.1 Tổng số E. coli từ phân heo sơ sinh và cai sữa tiêu chảy theo ngày tuổi .......22
4.2 Tỷ lệ mang gen liên quan đến yếu tố độc lực của các gốc E.coli đã phân lập 23
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................27
5.1 Kết luận ...........................................................................................................27
5.2 Tồn tại .............................................................................................................27
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................28
PHỤ LỤC ..................................................................................................................34

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
A/E:

Attaching - and - Effacing

AMP:

Adenosine 5’ monophosphate

cAMP:

cyclic Adenosine 5’ monophosphate

CF:

Colonization Factor

DAEC:

Diffusely adherent E. coli

DNA:

Deoxyribonucleotide Acid

dNTP:

Deoxyribonucleotide triphosphate

Eae:

E. coli attaching and effacing

EAEC:

Enteroaggregative E. coli

EAST1:

Enteroaggregative Escherichia coli heat-stable toxin

EC:

Enrichment Coli

ED:

Edema Disease

EHEC:

Enterohaemorrhagic E. coli

EIEC:

Enteroinvasive E. coli

EMB:

Eosin Methylen Blue

EPEC:

Enteropathogenic E. coli

ETEC:

Enterotoxigenic E. coli

FAO:

Food and Agriculture Organization

GC-C:

Guanylate Cyclase C

GMP:

Guanosine 5’ monophosphate

HC:

Haemorrhagic Colitis

HUS:

Haemolytic Uraemic Syndrome

IMViC:

Indol, Methyl red, Voges Proskauer, Citrate

LT:

heat-labile toxin

LTB:

Lauryl Tryptose Broth

vii


MR:

Methyl Red

MWM:

Molecular Weight Marker

NA:

Nutrient Agar

PCR:

Polymerase Chain Reaction

SE:

Standard Error

SLTEC:

Shiga Like Toxin producing E. coli

ST:

heat-stable toxin

STEC:

Shiga Toxin producing E. coli

Stx:

Shiga toxin

TBE:

Tris-base Boric acid EDTA

Tm:

Temperature melting

TP.HCM:

Thành Phố Hồ Chí Minh

TSI:

Triple Sugar Iron

UI:

International Unit

UV:

ultraviolet

VP:

Voges Proskauer

VT:

Verotoxin

VTEC:

Verotoxigenic E. coli

viii


DANH SÁCH CÁC BẢNG, SƠ ĐỒ
Bảng 2.1 Các type của ETEC gây tiêu chảy hoặc phù thũng trên heo sau cai sữa ...11
Bảng 2.2 Tóm tắt nhóm E. coli quan trọng gây bệnh trên heo từ sơ sinh đến cai sữa
...................................................................................................................................12
Sơ đồ 3.1 Qui trình phân lập, định lượng vi khuẩn E. coli .......................................18
Bảng 4.1 Tổng số E. coli trong phân heo tiêu chảy theo ngày tuổi ..........................22
Bảng 4.2 Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli từ phân heo 1 – 21 ngày tuổi ..23
Bảng 4.3 Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli từ phân heo 22 – 45 ngày tuổi 24
Bảng 4.4 Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli từ phân heo 46 – 90 ngày tuổi 24
Bảng 4.5 Tổng kết kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli đã phân lập ...............25

ix


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Cách xâm nhập và tấn công của vi khuẩn E. coli .......................................6
Hình 2.2 Nguyên tắc hoạt động của phản ứng PCR .................................................14
Hình 3.1 E. coli cho khuẩn lạc tím ánh kim trên môi trường thạch EMB ................19
Hình 3.2 E. coli cho phản ứng IMViC ......................................................................19
Hình 3.3 Kết quả điện di đối chứng dương ...............................................................20
Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR ..................................................................21

x


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Ngành chăn nuôi ở nước ta đóng vai trò quan trọng trong đời sống kinh tế
xã hội, đặc biệt là chăn nuôi heo. Ngành chăn nuôi heo đã không ngừng phát triển
và tiến bộ, từ quy mô nhỏ trong phạm vi hộ nuôi gia đình đến hình thức chăn nuôi
công nghiệp với quy mô lớn và mật độ tập trung của đàn heo khá cao. Tuy nhiên,
đây cũng là điều kiện thuận lợi cho sự tồn tại, phát triển và lây lan của nhiều mầm
bệnh, trong đó đáng chú ý là bệnh tiêu chảy.
Tiêu chảy là hội chứng bệnh lý ở đường tiêu hóa, bệnh xảy ra cho các lứa
tuổi heo, đặc biệt thời kỳ heo con theo mẹ, và tỷ lệ chết cao. Bệnh thường xảy ra với
triệu chứng chung là tiêu chảy, mất nước – chất điện giải, suy kiệt, trụy tim mạch,
có thể dẫn đến tử vong. Có nhiều nguyên nhân gây bệnh, trong đó có vai trò của vi
khuẩn Escherichia coli (E. coli). E. coli là vi khuẩn sống cộng sinh chiếm ưu thế,
tồn tại tự nhiên trong hệ vi sinh vật đường ruột của người và động vật. Khi có điều
kiện thích hợp, một số nhóm E. coli gây độc tăng sinh mạnh, trở thành nguyên nhân
gây tiêu chảy, đặc biệt là gia súc non (tiêu chảy trên bê nghé, tiêu chảy phân trắng ở
heo con theo mẹ, tiêu chảy phù thũng trên heo cai sữa). Dựa trên đặc điểm gây
bệnh, E. coli được chia thành nhiều nhóm. Mỗi nhóm đều có những yếu tố độc lực
khác nhau được qui định bởi những gen độc lực.
Việc phân lập được vi khuẩn E. coli trong phân để tìm nguyên nhân gây
bệnh hay xác định được số lượng vi khuẩn hoàn toàn không phản ánh được khả
năng gây độc của chúng. Do vậy việc xác định các gen độc lực của E. coli là một

1


bước rất cần thiết phục vụ cho việc đánh giá nguy cơ gây bệnh trên vật nuôi và con
người. Các kỹ thuật sinh học phân tử, đặc biệt là kỹ thuật PCR thường được áp
dụng để phát hiện các gen độc lực này. Với mục tiêu xác định tổng số E. coli, phát
hiện một số gen mã hóa protein gây độc của E. coli phân lập được từ phân heo sơ
sinh và cai sữa, đề tài “Phát hiện các yếu tố độc lực của E. coli trong phân heo sơ
sinh và cai sữa tiêu chảy bằng kỹ thuật PCR” được tiến hành dưới sự hướng dẫn của
thầy Nguyễn Ngọc Tuân và cô Văn Ngọc Dung.
1.2 Mục đích và yêu cầu
1.2.1 Mục đích
Góp phần chẩn đoán bệnh do E. coli gây ra cho heo sơ sinh và cai sữa.
1.2.2 Yêu cầu
E. coli được phân lập định lượng theo qui trình của FAO (1992) đối với
mẫu phân heo sơ sinh và heo cai sữa tiêu chảy.
Ly trích DNA từ vi khuẩn E. coli phân lập được.
Phát hiện một số gen độc lực (eae, stx1, stx2, stx2e, sta, stb, lt-I, astA) của
E. coli phân lập được bằng kỹ thuật PCR.

2


Chương 2
TỔNG QUAN
2.1 Vi khuẩn Escherichia coli
2.1.1 Định nghĩa
Vi khuẩn E. coli được phân lập và mô tả đầu tiên vào năm 1885 bởi bác sĩ
nhi khoa người Đức Theodor Escherich. Theo hệ thống phân loại của Bergey, vi
khuẩn E. coli thuộc họ Enterobacteriaceae, giống Escherichia. E. coli là trực khuẩn
Gram âm, di động, kích thước khoảng 1,5 x 1 – 3 μm, không hình thành bào tử và
có giáp mô, có lông quanh tế bào (Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên, 2001).
2.1.2 Nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa
E. coli là vi khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí tùy nghi. Có thể sinh trưởng ở
nhiệt độ 15 – 400C, nhiệt độ tối hảo là 370C, pH thích hợp 6,4 - 7,5 (tối ưu 7,2 7,4). Trong môi trường lỏng, sau 4 - 5 giờ E. coli làm đục nhẹ môi trường, càng để
lâu càng đục, có mùi hôi thối; sau vài ngày có thể có váng mỏng trên mặt môi
trường. Trên môi trường thạch dinh dưỡng, sau 24 giờ E. coli hình thành những
khuẩn lạc dạng S (smooth) màu xám trắng, tròn, ướt, bề mặt bóng, kích thước
khoảng 2 - 3 mm. Trên môi trường thạch chuyên biệt EMB, E. coli cho khuẩn lạc
tím ánh kim. Trên môi trường thạch Mac Conkey, E. coli cho khuẩn lạc đỏ hồng.
Trên môi trường thạch nghiêng TSI, E. coli tạo acid/acid (vàng/vàng).
Để phân biệt E. coli và các vi khuẩn đường ruột khác, người ta dùng thử
nghiệm IMViC. E. coli cho kết quả IMViC là +/-, +, -, -.

3


2.1.3 Yếu tố kháng nguyên
E. coli có cấu trúc kháng nguyên rất phức tạp. Trước kia, kỹ thuật xác định
kháng nguyên bề mặt là phương tiện chính để phân biệt các dòng E. coli gây bệnh.
Năm 1947, Kauffmann đưa ra hệ thống phân nhóm serotype mà vẫn còn được sử
dụng đến ngày nay. Hệ thống phân nhóm này dựa vào việc xác định kháng nguyên
bề mặt O, H, K.
* Kháng nguyên thân O (somatic antigen): có bản chất là lipopolysaccharid của
thành tế bào, bền với nhiệt và cồn. Khi đun nóng ở 1000C trong 2 giờ vẫn giữ được
tính kháng nguyên. Kháng nguyên O có thể được phát hiện bằng phản ứng ngưng
kết. Kháng nguyên O giữ vai trò nhất định đối với khả năng gây bệnh của dòng vi
khuẩn và có tính chất chuyên biệt cho từng loài vật chủ, tạo nền tảng cho việc phân
loại serogroup của E. coli. Hiện nay đã phát hiện được 174 type kháng nguyên O
(Nguyễn Ngọc Hải, 2007). Trong mỗi serogroup có 1 hay nhiều serotype được phân
loại dựa vào kháng nguyên lông H.
* Kháng nguyên lông H (flagellar antigen): có bản chất là protein, tạo khả năng
di động của E. coli, kém chịu nhiệt. Có khoảng 56 type kháng nguyên H (Nguyễn
Ngọc Hải, 2007).
* Kháng nguyên giáp mô K (capsular antigen): Kháng nguyên K lúc đầu được
xác định bằng phản ứng ngưng kết. Người ta xác định sự hiện diện của kháng
nguyên K ở vi khuẩn nếu vi khuẩn chỉ ngưng kết với kháng huyết thanh O khi bị
đun nóng. Dựa vào khả năng chịu nhiệt người ta chia kháng nguyên K thành 3 type
là A, L và B. Về sau người ta phân loại kháng nguyên K dựa vào thành phần hóa
học của chúng và đã có hơn 80 type kháng nguyên K đã được xác định (Nguyễn
Ngọc Hải, 2007).
* Kháng nguyên tiêm mao F (fimbrial antigen): Tiêm mao (fimbriae) dài khoảng
4 μm, đường kính 2,1 - 7,0 nm, dạng thẳng hay xoắn. Tiêm mao không tham gia
vào sự di chuyển, ngắn hơn và nhiều hơn flagella. Tiêm mao giúp vi khuẩn kết dính

4


vào tế bào niêm mao ruột nên rất quan trọng trong khả năng gây bệnh của vi khuẩn
(Lê Thị Mai Khanh, 2004).
2.1.4 Phân loại E. coli gây bệnh
Dựa trên đặc điểm gây bệnh, các dòng E. coli gây bệnh đường ruột có thể
được chia thành 6 nhóm (Kaper và cs, 2004).
(1) EPEC (Enteropathogenic E. coli): E. coli thuộc nhóm EPEC sẽ bám chặt vào
tế bào ruột non, phá hủy cấu trúc bình thường của vi nhung mao, tấn công và làm
tổn thương bằng cách bào mòn nhung mao ruột. Kết quả là làm biến đổi cấu trúc
khung bên trong tế bào vật chủ, đồng thời kèm theo đáp ứng viêm và tiêu chảy.
(2) STEC (Shiga-toxin producing E. coli) hoặc VTEC (Verotoxigenic E. coli)
hoặc EHEC (Enterohaemorrhagic E. coli): E. coli thuộc nhóm này sẽ tấn công và
phá hủy niêm mạc kết tràng. Đặc trưng của EHEC là tiết độc tố giống như độc tố
của Shigella (Stx). Độc tố Stx được hấp thu vào máu dẫn đến nhiều phản ứng phức
tạp xảy ra, gây nguy hiểm cho tính mạng của vật chủ như viêm ruột kết xuất huyết
(HC: haemorrhagic colitis) hoặc hội chứng huyết niệu (HUS: haemolytic uraemic
syndrome) hoặc bệnh phù thũng sau cai sữa (ED: edema disease).
(3) ETEC (Enterotoxigenic E. coli): E. coli nhóm ETEC bám vào tế bào ruột non
nhờ yếu tố bám. Kháng nguyên lông bám liên kết với ETEC của heo được đặt tên
K88 (F4), K99 (F5), 987P (F6), và F41 (Runnel và Moon, 1984). Vi khuẩn tiết độc
tố ruột kém chịu nhiệt (LT: heat-labile) và / hoặc độc tố chịu nhiệt (ST: heat-stable,
bao gồm STa và STb). LT sẽ liên kết với các thụ thể GM1 hay GM1b để thâm nhập
vào bên trong tế bào ruột, hoạt hóa enzyme adenylyl cyclase, làm gia tăng AMP
vòng (cAMP) trong tế bào, kích thích tế bào nhung mao ruột tiết Cl-, ngăn cản hấp
thu NaCl từ lòng ruột, dẫn đến hàm lượng ion trong lòng ruột gia tăng, nước được
vận chuyển thụ động từ tế bào vào lòng ruột, và gây tiêu chảy nhiều nước. Trong
khi đó, ST lại liên kết với enzyme xuyên nửa màng guanylyl cylase để vào bên
trong tế bào. Tại đó, nếu là STa sẽ làm gia tăng GMP vòng trong tế bào, kích thích
tiết Cl-, ngăn cản hấp thu NaCl và gây tiêu chảy tương tự LT; trong khi STb không

5


làm gia tăng AMP vòng hay GMP vòng mà kích thích tiết bicarbonat vào lòng ruột
và gây tiêu chảy (Nataro và Kaper, 1998; Hitotsubashi và cs, 1992).
(4) EAEC (Enteroaggregative E. coli): bám dính biểu mô ruột non lẫn ruột già,
hình thành màng biofilm dày, bài tiết độc tố ruột và độc tố tế bào.
(5) EIEC (Enteroinvasive E. coli): xâm lấn tế bào biểu mô ruột kết, phân giải thể
thực bào (phagosome), sau đó di chuyển xuyên qua tế bào nhờ vào việc hình thành
sợi actin giống như cái đuôi để giúp vi khuẩn di cư sang tế bào khác. Vi khuẩn có
thể di chuyển trực tiếp từ tế bào biểu mô này sang tế bào biểu mô khác, cũng có thể
thoát ra và xâm nhập trở lại màng tương của tế bào kế cận. EIEC bao gồm các
serogroup như sau: O28, O29, O124, O136, O143, O144, O147, O152, O164, và
O167 (Taylor và cs, 1988).
(6) DAEC (Diffusely adherent E. coli): thường làm cho tế bào biểu mô ruột non
biến dạng thành hình giống như ngón tay bao quanh vi khuẩn.

Hình 2.1 Cách xâm nhập và tấn công của vi khuẩn E. coli (Kaper và cs, 2004)

6


2.2 Nhóm STEC/ VTEC/ EHEC
Tên gọi STEC (Shiga toxin-producing E. coli, trước đây gọi là Shiga like
toxin producing E. coli: SLTEC) chỉ rõ khả năng sản sinh độc tố gây độc tế bào
giống như độc tố Shiga (Calderwood và cs, 1996). Nhóm STEC còn có những tên
gọi khác như VTEC (Verotoxigenic E. coli hoặc Vero cytotoxin producing E. coli)
được Konowalchuk và cs (1977) đặt cho nhóm này khi phát hiện chúng sản xuất
độc tố gây độc cho dòng tế bào Vero, EHEC (Enterohaemorrhagic E. coli) bắt
nguồn từ triệu chứng gây viêm ruột kết xuất huyết (HC: haemorrhagic colitis) và
hội chứng huyết niệu (HUS: haemolytic uraemic syndrome) (Nataro và Kaper,
1998). Ở thú, VTEC liên kết với bệnh phù thũng ở heo, một bệnh thường xảy ra ở
heo cai sữa.
STEC có các yếu tố độc lực như độc tố shiga (Stx), yếu tố bám (Eae), độc
tố xuất huyết ruột (enterohemolysin = Ehly). Trong thực tế chỉ cần 1 – 1000 CFU /
liều gây nhiễm là có thể gây bệnh (Paton and Paton, 1998).
2.2.1 Độc tố Shiga (Shiga toxin)
STEC sản xuất độc tố Shiga-like toxin (Slt), hay còn gọi là Shiga toxin
(Stx) hoặc Verotoxin (VT). Độc tố Stx gồm hai nhóm chính không phản ứng chéo
với nhau là Stx1 và Stx2, chúng giống nhau khoảng 55% trình tự acid amin, được
mã hóa bởi gen stx1 và gen stx2. STEC có thể chỉ sản xuất độc tố Stx1 hoặc Stx2,
hoặc cả hai, hoặc nhiều dạng Stx2. Ba loại Stx2 được xác định là Stx2, Stx2c, và
Stx2e (Pierard và cs, 1998). Có thể thay thế thuật ngữ Stx và VT với nhau
(Calderwood và cs, 1996).
2.2.2 Yếu tố kết bám intimin
Yếu tố bám dính của nhóm STEC đóng vai trò rất quan trọng trong việc
giúp vi khuẩn bám chặt vào tế bào nhung mao ruột. Cho nên yếu tố bám dính còn
được xem là yếu tố độc lực của vi khuẩn. Intimin, một loại protein màng ngoài,
được mã hóa bởi gen eae (E. coli attaching và effacing) nằm trên nhiễm sắc thể.
Intimin gây tổn thương dạng bám dính và phá hủy (attaching and effacing, A/E) ở

7


ruột do vi khuẩn bám chặt vào tế bào biểu mô (Donnerberg và cs, 1993). Gen eae
cũng có thể được tìm thấy ở nhóm EPEC, tồn tại ở hầu hết các dòng STEC, nhưng
không phải tất cả các dòng STEC đều có gen eae (Nataro và Kaper, 1998). Sandhu
và cs (1996) cho biết có sự liên quan chặt chẽ giữa gen eae của nhóm STEC với
những ca viêm kết tràng xuất huyết và hội chứng huyết niệu.
2.2.3 Độc tố ruột chịu nhiệt EAST1:
Lần đầu tiên được mô tả ở nhóm EAEC, do gen astA mã hóa, cũng được tìm
thấy ở nhiều dòng STEC. Tầm quan trọng của EAST1 đối với khả năng gây bệnh
của STEC vẫn chưa được biết tường tận. Có thể phát hiện gen này ở một vài trường
hợp tiêu chảy không có máu của những ca nhiễm STEC (Nataro và Kaper, 1998).
2.3 NHÓM ETEC (Enterotoxigenic E. coli)
2.3.1 Yếu tố độc lực
* Độc tố ruột enterotoxin
Nhóm ETEC gồm những E. coli tạo ra ít nhất một trong hai loại độc tố
đường ruột là độc tố ruột chịu nhiệt (ST) và độc tố ruột kém chịu nhiệt (LT). ETEC
được xem là nhóm đại diện cho cơ chế gây bệnh bằng cách vi khuẩn bám vào bề
mặt màng nhầy ruột non và tiết ra độc tố ruột, làm gia tăng tình trạng tiết dịch.
Nhóm này gây tiêu chảy thông qua sự tiết độc tố đường ruột ST và LT. E. coli
nhóm này có thể chỉ tiết 1 loại độc tố LT hoặc ST, hoặc có thể tiết cả hai LT và ST.
(1) Độc tố kém chịu nhiệt (Heat-labile toxin, LT)
Độc tố LT của E. coli là oligopeptid có liên hệ gần gũi về mặt cấu trúc và
chức năng với độc tố gây bệnh tả trên người (cholera toxin - CT) do Vibrio cholerae
tiết ra. LT có 2 serogroup chính là LT-I và LT-II. Chúng không có phản ứng chéo
về mặt miễn dịch.
- LT-I: Sau khi bám vào màng tế bào niêm mạc ruột của vật chủ, LT-I thâm
nhập qua màng trong tế bào, kích thích enzyme adenylyl cyclase hoạt động dẫn đến
làm tăng AMP vòng (cAMP) trong tế bào. cAMP hoạt hóa protein kinase (A
kinase) thành dạng hoạt động, dẫn đến sự phosphoryl hóa những kênh chloride ở
màng tế bào biểu mô ruột hoạt động trên mức bình thường. Kết quả là kích thích tế

8


bào ruột tiết ra Cl- một cách tích cực, đồng thời ức chế sự hấp thu NaCl của những
tế bào nhung mao. Hàm lượng ion trong lòng ruột gia tăng kéo theo sự di chuyển
thụ động của nước từ tế bào vào lòng ruột. Đây chính là nguyên nhân dẫn đến tiêu
chảy dữ dội (Nataro và Kaper, 1998).
- LT-II: có cấu trúc giống với LT-I và CT, LT-II cũng làm gia tăng cAMP
trong tế bào qua cơ chế tương tự như LT-I, nhưng LT-II không có liên quan đến
bệnh trên người và thú.
(2) Độc tố chịu nhiệt (Heat-stable toxin - ST)
Ngược với LT, ST có trọng lượng phân tử nhỏ và những cầu nối disulfit của
nó giải thích cho khả năng chịu nhiệt của độc tố này. ST được chia thành STa và
STb, hai nhóm này khác nhau về cấu trúc và cơ chế hoạt động. Gen mã hóa cho cả 2
nhóm được tìm thấy chủ yếu trên plasmid. Độc tố STa (hay còn gọi là ST-I) do
ETEC sản sinh và một vài vi khuẩn Gram âm khác gồm Yersinia enterocolitica và
V. cholerae không phải O1. ST giống 50% trình tự acid amin với độc tố chịu nhiệt
EAST1 của EAEC. Một số báo cáo gần đây cho rằng một vài dòng thuộc ETEC
ngoài việc sản sinh ra STa, còn có thể sản sinh độc tố EAST1. Trong khi đó STb chỉ
được tìm thấy ở ETEC.
- STa: STa được chia thành 2 loại là STp (ST porcine hay STIa) từ E. coli
phân lập được trong phân heo và STh (ST human hay STIb) của E. coli phân lập
trên người. Thụ thể chính của STa là enzyme xuyên nửa màng guanylyl cyclase C
(GC-C). STa kết hợp với thụ thể GC-C làm hoạt hóa enzyme này, dẫn đến việc gia
tăng lượng cGMP nội bào. Hoạt động này cuối cùng dẫn đến sự gia tăng tiết Cl- và/
hoặc ngăn cản sự hấp thụ NaCl, dẫn đến tăng lượng tiết chất lỏng trong ruột, gây
tiêu chảy (Hitotsubashi, 1992).
- STb: STb chủ yếu được tạo ra bởi những dòng ETEC được phân lập từ
heo, vài chủng ETEC được phân lập từ người. Không giống như STa, STb gây ra
những tổn thương về mặt mô học trên lớp biểu mô ruột như mất hoặc teo một phần
tế bào nhung mao của biểu mô ruột. Thụ thể của STb chưa được biết rõ, mặc dù gần
đây người ta cho rằng độc tố kết hợp không đặc hiệu với màng tế bào chất trước khi

9


vào bên trong tế bào. Không gây ra sự tiết Cl- nhưng STb kích thích tế bào ruột tiết
bicarbonat (HCO3-). STb không làm tăng cAMP hay cGMP nội bào. STb còn kích
thích phóng thích PGE2 và serotonin, từ đó người ta cho rằng hệ thần kinh ruột
cũng có thể liên quan đến đáp ứng tiết dịch gây ra bởi độc tố này (Hitotsubashi,
1992).
*Yếu tố bám (colonization factor - CF): Để gây tiêu chảy, ETEC đầu tiên phải kết
bám vào tế bào ruột non nhờ vào lông trên bề mặt của vi khuẩn, có tính kháng
nguyên mạnh, gọi là yếu tố bám (CF). CF có thể được phân loại dựa trên đặc tính
hình thái. Có 3 loại chính gồm loại lông hình que cứng, lông hình que mềm dạng
bó, lông có cấu trúc mảnh mềm. Yếu tố F bám vào thụ thể đặc hiệu trên màng tế
bào biểu mô ruột. Nhóm ETEC với yếu tố bám F5, F6, F41 hầu như định vị ở phía
sau không tràng và hồi tràng trái lại F4 định vị theo chiều dài không tràng và hồi
tràng.
2.3.2 Tiêu chảy do nhóm ETEC
Tiêu chảy là một bệnh quan trọng đối với heo con, được phân làm ba loại:
tiêu chảy ở heo sơ sinh (ở vài ngày đầu tiên khi sinh), tiêu chảy ở heo con (từ tuần
đầu tiên khi sinh đến cai sữa), và tiêu chảy ở heo con cai sữa.
Tiêu chảy ở heo sơ sinh: thường gặp từ 0 đến 6 ngày tuổi. ETEC gây tiêu chảy ở
heo sơ sinh chỉ sản sinh độc tố ruột STa. Các ETEC này bám vào niêm mạc ruột
non bằng một hoặc nhiều yếu tố bám như F4 (K88), F5 (K99), F6 (987) và F41.
Hầu hết các dòng ETEC gây bệnh trên heo sơ sinh thuộc serogroup O8, O9, O64 và
O101 với F5, F6 và hoặc F41 dương tính.
Tiêu chảy ở heo con sau cai sữa do ETEC: ETEC gây tiêu chảy trên heo sau cai
sữa hoặc heo con bú mẹ từ 7 ngày tuổi trở lên, chúng sản sinh một hoặc nhiều loại
độc tố ruột, bao gồm STa, STb và LT, gần đây người ta còn thừa nhận độc tố
EAST1. Những dòng ETEC này thường có yếu tố bám F4 lẫn F18. Tuy nhiên cũng
có những dòng không có hai yếu tố bám này. Hầu hết những dòng gây tiêu chảy
thuộc F4ac (K88ac) nên chúng thường được gọi một cách giản đơn là F4. F18 cũng
có hai biến chủng là F18ab và F18ac. F18ac liên quan nhiều với các dòng gây tiêu

10


chảy sau cai sữa, còn F18ab gây bệnh phù thũng trên heo sau cai sữa. Hiện nay, tiêu
chảy trên heo sau cai sữa phân lập được chủ yếu là O149 mà hầu hết có F4. Trong
khi đó, gây phù thũng trên heo sau cai sữa chủ yếu là O138, O139, O141, O147 và
O157 với F18 dương tính. Các type của ETEC gây tiêu chảy hoặc phù thũng trên
heo sau cai sữa được trình bày trong bảng 2.1.
Vài dòng ETEC sản sinh độc tố ruột lẫn độc tố Stx2e, chúng đều có yếu tố
bám F18. Khuynh hướng sau này xếp chúng vào nhóm ETEC hơn là STEC vì gây
ra các triệu chứng tiêu chảy sau cai sữa hơn là gây phù thũng. Nếu nhiễm hỗn hợp
STEC có F18 và ETEC dương tính với F4 thì triệu chứng trội hẳn là tiêu chảy do
F4, mặc dù bệnh lý mô học của bệnh phù thũng.
Bảng 2.1 Các type của ETEC gây tiêu chảy hoặc phù thũng trên heo sau cai sữa
Yếu tố bám

Chủng huyết thanh (Serovirotype)
O149: LT:STb:EAST-1
F4 (K88)
O149:LT:STa:STb:EAST-1
O149:LT:STb
O149:LT:STb:EAST-1
O138:STa:STb
O139:LT:STb:EAST1:Stx2e
F18
O139: Stx2e:(AIDA)
O147:STa:STb:AIDA
O?:STa:STb
O?:STa:STb:Stx2e
(Nguồn: Fairbrother, 2012)
2.4 NHÓM EPEC (Enteropathogenic E. coli)
Nhóm EPEC có đặc điểm gây những thương tổn “gắn kết và gây hư hại”
(“attaching and effacing” – A/E) ở biểu mô ruột, có thể quan sát được trên mẫu sinh
thiết ruột từ những bệnh nhân hay thú bị nhiễm bệnh và trong nuôi cấy tế bào (dẫn
liệu Nataro và Kaper, 1998). Đặc điểm đặc trưng của thương tổn A/E cho biết vi
khuẩn gắn vào bề mặt biểu mô ruột, gây hư hại vi nhung mao (Afset và cs, 2006).
EPEC không sản xuất Stx và không liên kết với HUS. Gen cần thiết cho việc tạo ra
tổn thương A/E là gen eae mã hóa protein intimin. Protein này là yếu tố độc lực cần
thiết của EPEC (Donnerberg, 1993). Theo Nataro và Kaper (1998), gen eae hiện

11


diện ở tất cả các chủng EPEC, EHEC, Clostridium rodentium và Hafnia alvei;
nhưng không hiện diện ở những dòng E. coli thuộc hệ vi khuẩn đường ruột thông
thường.
Ở heo, EPEC liên quan đến trường hợp tiêu chảy sau cai sữa do độc tố
intimin. Nhóm EPEC không chiếm hữu các yếu tố độc lực như STEC gây bệnh phù
thũng và ETEC gây tiêu chảy trên heo sau cai sữa.
Bên cạnh đó, việc phát hiện các gen độc lực của E. coli thường được thực
hiện dựa trên những kỹ thuật sinh học phân tử, đặc biệt là kỹ thuật PCR.
Bảng 2.2 Tóm tắt nhóm E. coli quan trọng gây bệnh trên heo từ sơ sinh đến cai sữa
Nhóm Yếu tố bám

Độc tố

ETEC F5, F6, F41

STa

Serogroup O

EPEC Eae

Tiêu chảy
sơ sinh
Tiêu chảy
sơ sinh
Tiêu chảy
sau cai sữa
STa, STb, LT, O8, O138, O139, Tiêu chảy
EAST1,
O141, O147,
sau cai sữa
O149,O157, O?:K48
-hemolysin
STa, STb, LT, O8, O138, O139,
Stx,
O141, O147,
EAST1,
- O149, O157
hemolysin
O45, O103

STEC F18, AIDA

Stx2e, EAST-1

F4

F4, AIDA
F18, AIDA

O8, O9, O20, O64,
O101
STa, STb, LT, O8, O138, O141,
EAST1,
O147
O149, O157
-hemolysin

Bệnh
heo
heo
heo
heo

O138, O139, O141, Bệnh phù thũng
O147

2.5 Kỹ thuật PCR
2.5.1 PCR là gì?
PCR là thử nghiệm nhân bản 1 đoạn DNA trong ống nghiệm dựa vào các
chu kỳ nhiệt. Thử nghiệm được thực hiện trong ống nghiệm chứa các thành phần
tham gia phản ứng (gọi là PCR mix) có thể tích từ 10 μl đến 50 μl. Các thành phần
chủ yếu là (1) enzyme polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase), (2) 4 loại
desoxyribonucleotid (dNTP), (3) DNA mẫu (chứa các đoạn DNA đích cần nhân

12


bản), (4) Các đoạn mồi (primer) xuôi và ngược, (5) ion Mg2+ và (6) dung dịch đệm
Tris-KCl (Phạm Hùng Vân, 2009).
2.5.2 Nguyên tắc của PCR
Phản ứng PCR là một chuỗi chu kỳ nhiệt độ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ nhiệt
độ gồm 3 giai đoạn:
(1) Giai đoạn biến tính (denaturation): Đầu tiên nhiệt độ sẽ được đưa lên 94oC,
cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử DNA. Ở nhiệt độ này các liên kết
hydro của mạch đôi DNA sẽ bị phá vỡ, nhờ vậy hai mạch của phân tử DNA tách rời
nhau thành hai mạch đơn.
(2) Giai đoạn bắt cặp (anealing): nhiệt độ sẽ được hạ đến 55oC – 65oC (thấp hơn
Tm của mồi) là nhiệt độ thích hợp để các đoạn mồi bắt cặp bổ sung vào hai đầu của
đoạn DNA đích.
(3) Giai đoạn kéo dài (extension): nhiệt độ được đưa lên 72oC là nhiệt độ thích
hợp cho hoạt tính của enzyme Taq polymerase để kéo các dNTP lại đầu 3' của đoạn
mồi đang bắt cặp trên đầu 5' của sợi DNA đích để bắt nguồn cho sự tổng hợp nên
mạch bổ sung.
Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân bản thành hai
bản sao; và nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30 đến 40 lần thì từ một
DNA đích đã nhân bản được thành 230 đến 240 bản sao (Phạm Hùng Vân, 2009).
Tổng DNA khuếch đại được tính theo công thức:
Tổng DNA khuếch đại = m * 2n
Với n là số chu kỳ, m là số bản DNA đích có trong mẫu đưa vào phản ứng.
* Số lượng chu kỳ của phản ứng PCR:
Trong thực tế, số chu kỳ cho một phản ứng tùy thuộc số lượng bản mẫu ban
đầu. Nếu số lượng bản mẫu là 105 thì cần khoảng 25 - 30 chu kỳ, nếu số lượng bản
mẫu là 102 - 103 thì số chu kỳ phải là 35 – 40, nhưng không vượt quá 40 chu kỳ
trong một phản ứng, bởi vì phản ứng PCR diễn ra qua hai giai đoạn: giai đoạn đầu,
số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân so với lượng mẫu ban đầu; giai đoạn sau đó,
hiệu quả khuếch đại giảm hẳn do:

13


+ Sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng.
+ Xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế lại phản ứng.
+ Các bản sao vừa tổng hợp không kết hợp với mồi mà lại bắt cặp với nhau.

Hình 2.2 Nguyên tắc hoạt động của phản ứng PCR
2.5.3 Các thành phần của một phản ứng PCR
DNA mẫu: là thành phần cần khuếch đại.
Mồi (primer): Mồi là những đoạn oligonucleotid mạch đơn, có trình tự bổ
sung với trình tự base của hai đầu mạch khuôn để khởi đầu quá trình tổng hợp
DNA. Việc chọn mồi là giai đoạn quyết định của phản ứng PCR. Các mồi được
chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình tự
lặp lại trên đoạn gen, không có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi xuôi và mồi ngược và
cũng không có những cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp bổ sung trong cùng một mồi.
Chiều dài các mồi tối thiểu cho hầu hết các ứng dụng PCR là 18 nucleotid (thường
là 18 - 24 nucleotid). Trình tự nằm giữa hai mồi "xuôi" và "ngược" không quá lớn,
phản ứng PCR sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 1Kb.

14


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×